CN102162792B - 基于表面等离激元共振的hprt体基因突变检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于一种酶的定量检测方法，具体基于表面等离激元共振的HPRT体基因突变检测方法。一种基于表面等离激元共振的HPRT体基因突变检测方法，其特征在于如下步骤实现：野生型HPRT酶敏感SPR金膜的制备：野生型HPRT标准品的SPR检测（3）样品制备及SPR检测将收集的哺乳动物细胞用hanks液反复清洗后，直接加入组织细胞裂解液，4℃条件下振荡，使样品裂解充分，裂解产物低温离心，收集含有蛋白质的上清液；将上清液中裂解液成分用PBS置换后，4℃冰箱保存，SPR检测。本方法的检测灵敏度高，可以检测ngmL-1数量级的野生型HPRT含量。
Description
技术领域
本发明属于一种酶的定量检测方法，具体基于表面等离激元共振的HPRT体基因突变检测方法。
背景技术
流行病学调查和实验研究表明环境物理化学因素是肿瘤发病的主要原因，诱变剂和致癌剂的符合率为80%。因此，建立适当方法检测物理化学因素性的诱变对减少致癌风险具有重要意义。哺乳动物细胞次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase，HPRT)是一种细胞浆酶。国内外研究表明其基因位点对化学诱变剂和电离辐射较敏感。根据这一特点建立的体外哺乳动物细胞HPRT基因突变检测方法被用来评估各种突变因素（辐射、各种化学因子等）对生物体所造成的损伤。该方法的原理如下：在正常情况下，由于6-硫代鸟嘌呤(6-TG)的结构与次黄嘌呤和鸟嘌呤相似，HPRT可催化6-TG与5-磷酸核糖-1-焦磷酸(5-Phosphoribosyl-1-Pyrophosphate，PRPP)生成6-硫代鸟嘌呤单核苷酸(6-TGMP)。6-TGMP可掺入DNA的合成，阻断半保留复制，造成细胞的死亡。而当细胞HPRT基因突变后，不能编码生成野生型HPRT酶，就不能催化6-TG形成6-TGMP影响DNA的复制。因此，在含6-TG的选择性培养基中，HPRT基因突变的细胞存活，非突变型细胞则死亡。HPRT基因突变检测方法就是利用计数6-TG选择性培养基中存活的细胞数来估计HPRT基因是否发生突变及突变发生的程度，从而确定生物体是否损伤及损伤的程度。
检测体外哺乳动物细胞HPRT基因突变的方法有多核细胞法、放射自显影法、5-溴脱氧尿嘧啶法和克隆法，它们的基本原理如前所述都是一致的。均是以细胞是否存活（即HPRT酶的功能是否正常）来反映HPRT基因是否突变，只是表征细胞存活的方法不同。
多核细胞法：将细胞松弛素-B加入含6-TG的选择性培养基中，计数该选择性培养基中存活的双核细胞。具体步骤为：将哺乳动物淋巴细胞接种于生长培养液中(内含90%PR-MI1640,10%灭活小牛血清、庆大霉素100IU/ml)。其中一个样品加入6-TG，使其终浓度为1×10-5mol/l。37.0±0.3℃条件下培养33h后，加入细胞松弛素-B（终浓度为6 ug /ml），再继续培养至72h。培养物离心、低渗、固定、制片。每个样本计数6000个转化淋巴细胞(其中加与不加6-TG各计数3000个)。统计其中在同一胞浆内具有完整核膜的双核或多核淋巴细胞数(包括相压、相切和分离的双核或多核细胞)。将含6-TG的1000个转化淋巴细胞中双核或多核淋巴细胞数除以不含6-TG的1000个转化淋巴细胞中双核或多核淋巴细胞数，所得结果为HPRT基因位点突变率(‰)。
放射自显影法、5-溴脱氧尿嘧啶法与多核细胞法方法类似，只是放射自显影法是计数6-TG选择性培养基中存活的具有3H标记的细胞（实验须接触放射性物质），而5-溴脱氧尿嘧啶法是计数5-Brdu标记的存活细胞（需Gemsia染色）。
克隆法：将哺乳动物淋巴细胞分为正常细胞克隆和突变细胞筛选两个实验部分。正常细胞克隆板的每孔加200 ul含1000 U/ml人重组白细胞介素-2(IL-2)，来自自体的20%淋巴细胞刺激液和1×106个滋养细胞， 20%小牛血清的RPMI 1640培养液，每孔种2个靶细胞，每个样本共种10个细胞。同时为使每孔种的细胞数相当，克隆孔的每孔中再加2×104个经100 Gy 60Coγ射线照射后的靶细胞；在筛选板中，每孔加200 ul含1000 U/ml IL-2，0.5 mg/l 6-TG，来自自体的20%淋巴细胞刺激液和1×106个滋养细胞， 20%小牛血清的RPMI 1640培养液，种2×104个靶细胞,每个样本共种1×106个细胞。另一组则不加滋养细胞，其余均同上。随后克隆板和筛选板均置于37℃，5% CO2培养箱中，6天半量更换含淋巴细胞刺激液的培养液，培养15-18天后计数克隆。
上述用于检测HPRT基因突变的各种方法以所培养的细胞存活作为HPRT酶功能是否正常的标准，进而判断HPRT基因是否存在突变。所获得的数据缺乏准确性，因为体外培养的细胞活性受多种不可控因素影响。此外，这种方法的灵敏度也比较低。操作繁琐，需要制备相应的切片并需要染色(多核细胞法和5-溴脱氧尿嘧啶法)，有时还需要接触放射性物质（放射自显影法）。影响因素多，耗时长，样本检测至少需要3天，甚至可需25天（克隆法）。实验结果分析困难，对实验技术人员的要求高。
基于表面等离激元共振（SPR）技术是一种光电现象，其原理如下：共振角是引起金属表面等离子发生共振的入射光角度，共振角随着金属表面折射率变化而变化的。而折射率的变化又和金属表面结合的生物分子的质量成正比。SPR生物传感器主要通过特异性结合(底物-酶、抗原-抗体、DNA-DNA的结合等)导致共振角的变化定量检测被结合的生物大分子物质。它具有免标记（检测对象为受体-配体结合本身固有的物理性质折射率的变化），实时检测（可研究受体-配体结合的动力学变化）和灵敏度高的优点，其生物大分子物质的最低检测限可达ng mL-1。目前，还没有文献报道利用基于SPR技术检测HPRT体基因突变，本发明首次提供一种基于SPR技术的HPRT体基因突变检测的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供基于SPR技术的HPRT体基因突变检测方法，即通过6-硫代鸟嘌呤（野生型HPRT的底物）和野生型HPRT酶的结合定量检测野生型HPRT酶的含量，从而反应HPRT体基因突变情况，其理论基础是底物只能特异性的结合相应的野生型酶，而无法和突变的相应酶结合。
技术方案
一种基于表面等离激元共振的HPRT体基因突变检测方法，其特征在于如下步骤实现：
（1）野生型HPRT酶敏感SPR金膜的制备：
Pirrahan溶液（H2O2：浓硫酸=3：1）清洗SPR金膜15s。20 mM的半胱氨酸覆盖于Pirrahan溶液清洗过的金膜表面，然后将金膜避光放置过夜；过夜后的金膜经蒸馏水彻底清洗以去除没有结合的半胱氨酸，氮气吹干；半胱氨酸修饰的金膜表面再覆盖以10 mg/ml羧甲基葡聚糖，15mM N-羟基琥珀酰亚胺NHS和75 mM 1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐EDC的混合液，避光放置2.5小时；2.5小时后，蒸馏水冲洗并氮气吹干；经蒸馏水冲洗3次后，放入6-硫代鸟嘌呤0.3 mg/ml的溶液中，通过酰胺键化学偶联反应，将6-硫代鸟嘌呤固定在金膜表面，1M的乙醇胺100 ul封闭未与6-硫代鸟嘌呤结合的羧甲基葡聚糖，取出玻片经蒸馏水冲洗得到6-硫代鸟嘌呤敏感SPR金膜，这种敏感金膜可放置在4℃冰箱保存备用（保存时间可达一周）。
（2）野生型HPRT标准品的SPR检测
利用BI2000 SPR生物传感器(Biosensoring Inc, USA)检测不同浓度的野生型HPRT，确定其最低检测限。将不同浓度的野生型HPRT从低到高分别取100 ul注入SPR仪器的进样器，记录SPR共振角度随时间变化的过程并根据SPR信号的标准差计算SPR仪器检测HPRT的最低检测限。
（3）样品制备及SPR检测
将收集的哺乳动物细胞用hanks液反复清洗后，直接加入组织细胞裂解液，4℃条件下振荡，使样品裂解充分，裂解产物低温离心，收集含有蛋白质的上清液。将上清液中裂解液成分用PBS置换后，4℃冰箱保存，SPR检测。在制备SPR检测样本时，淋巴细胞裂解后蛋白质抽提实验步骤要求比较高，需按照实验步骤严格控制实验条件，防止蛋白质变性。通过步骤（3）检测足够样本量的正常细胞野生型HPRT含量，从而获得正常细胞野生型HPRT含量的正常值；通过检测物理化学因素诱变的细胞的野生型HPRT含量，经过与正常值的比较，确定该细胞是否发生HPRT基因的突变，从而获知该细胞是否发生物理化学因素诱导的损伤。
通过上述检测获得，步骤（2）所得的SPR信号拟合的线性曲线，其线性方程为y=0.03x +0.89 ，r=0.9812。
有益效果：
1、基于SPR技术的HPRT体基因突变检测方法，即通过6-硫代鸟嘌呤（野生型HPRT的底物）和野生型HPRT酶的结合定量检测野生型HPRT酶的含量，从而反应HPRT体基因突变情况，其理论基础是底物只能特异性的结合相应的野生型酶，而无法和突变的相应酶结合
建立基于SPR技术的HPRT体基因突变检测方法以达到简便，快速，灵敏地检测HPRT体基因突变的目的。本方法可广泛的应用与环境物理化学因素所导致的致突变检测。在本发明中，我们选取60Co伽马射线作为突变诱发因素。整个方法检测时间为5小时左右（此时间包括样品制备和SPR检测所需的时间，而单样品SPR检测仅需20 min左右。）。本方法的检测灵敏度高，可以检测ng mL-1数量级的野生型HPRT含量。
2、SPR技术检测HPRT体基因突变体系基于底物只能特异性的俘获相应野生型酶的原理，采用6-硫代鸟嘌呤俘获野生型HPRT，根据野生型HPRT与6-硫代鸟嘌呤结合产生的SPR信号来定量检测野生型HPRT的含量，从而判断HPRT基因是否发生突变及发生突变的程度。这种检测体系操作简单，只需将样品通过SPR仪器的液流***注入流动池，无需繁琐的细胞培养和制片过程；实验结果直观（观察共振角度的变化），无需复杂的实验结果判断（原有的方法需要具备一定实验技能的人员对检测的细胞进行判断。且因为计数细胞工作量大，只能计数其中一部分来代表全体。）；耗时短，单样本检测只需20分钟（原有技术最短需要3天才能获得检测结果）；灵敏度高，可以检测ng mL-1数量级的物质含量；所获得的数据准确性高，因为SPR信号反应的受体-配体结合本身固有的物理性质的变化。
附图说明
图1.不同浓度野生型HPRT的SPR信号。
图2.野生型HPRT标准品与其SPR信号的线性关系。
图3.不同剂量60Co伽马射线辐照后小鼠淋巴细胞野生型HPRT的SPR信号相对于时间的变化。箭头为样品注射的时间；a为基线的SPR信号；b为样品注射后特异性吸附在敏感金膜表面的物质信号。
图4. 不同剂量60Co伽马射线辐照后小鼠淋巴细胞野生型HPRT的SPR信号，(*) 与 0 Gy 组相比，(** p< 0.01；*** p< 0.001)。
具体实施方式
实施例１
基于表面等离激元共振技术的60Co伽马射线辐照诱导的HPRT体基因突变检测方法：
第一部分：SPR方法检测野生型HPRT标准品
1．6-硫代鸟嘌呤敏感的SPR金膜制备：20 ul的半胱氨酸（20 mM）覆盖于Pirrahan溶液（H2O2：浓硫酸=3：1）清洗过的金膜表面（清洗时间为15s），然后将金膜避光放置过夜；过夜后的金膜经蒸馏水彻底清洗以去除没有结合的半胱氨酸，氮气吹干；半胱氨酸修饰的金膜表面再覆盖以羧甲基葡聚糖，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)的混合液（15mM NHS, 75 mM EDC 和 10 mg/ml 的羧甲基葡聚糖），避光放置2.5小时。2.5小时后，蒸馏水冲洗并氮气吹干。
2. 将羧甲基葡聚糖修饰的金膜固定于SPR棱镜上（香柏油匹配），以流动池模块压紧构成密闭的流动池。打开SPR电源及激光源开关，打开注射载流液（蒸馏水）的注射泵开关。液流模式为“并联”，注射阀转向“Injection”,设置载流液流速为150 ul/min润洗SPR液流管道2 min，SPR检测温度为25℃。充分润洗完管道后，载流液蒸馏水的流速改为30 ul/min。基线跑平后，将注射阀转向“load”， 液流模式为“single”，取15mM NHS和 75 mM EDC混合液100 ul注入流动池以活化羧甲基葡聚糖的羧基。在活化液注射后，相同注射条件下注射6-硫代鸟嘌呤溶液（0.3 mg/ml，溶于70℃的蒸馏水）100 ul（6-硫代鸟嘌呤通过其氨基与羧甲基葡聚糖的羧基形成酰胺键而固定于金膜）。1M的乙醇胺100 ul封闭未与6-硫代鸟嘌呤结合的羧甲基葡聚糖。
3．将野生型HPRT标准品以蒸馏水配置成不同浓度，这些浓度分别为0, 1,10,100,200,500,1000 ng ml-1。
4. 将上述浓度的野生型HPRT溶液从低到高分别通过注射阀注入SPR流动池进行SPR检测。每个浓度检测后由甘氨酸盐酸（0.05M，pH2.2）再生。
实验结果：
图1为不同浓度野生型HPRT的SPR信号。每一浓度的样本SPR检测3次。从图1我们可以看出SPR信号随着野生型HPRT标准品浓度的增加而增加（-0.023 ～30.025 mdeg）。图2为根据所得的SPR信号拟合的线性曲线，其线性方程为y=0.03x +0.89 ( r=0.9812)。最低检测限为检测信号标准差的3倍。根据这一原则，SPR检测野生型HPRT的最低检测限为37ng/ml。
第二部分：SPR方法检测60Co伽马射线辐照的小鼠淋巴细胞野生型HPRT含量
1. 60Co伽马射线用来照射ICR小鼠（4周龄）。剂量率为0.01Gy/min，剂量为0,0.005,0.01,3和5Gy。
2. 辐照7天后（7天时间可让突变的HPRT充分表达），采用淋巴细胞分离液辐照小鼠的淋巴细胞。提取的淋巴细胞以PBS稀释成1×105/ml。取1ml此浓度的细胞离心后弃上清，在相应的细胞沉淀中加入100ul组织细胞裂解液，4℃条件下充分振荡裂解后10000转/min低温离心5min，取上清液，SPR检测（检测条件与野生型HPRT标准品相同，只是将载流液蒸馏水换成PBS）。
实验结果：
图3为60Co伽马射线辐照后小鼠淋巴细胞野生型HPRT的SPR信号相对于时间的变化。图中野生型HPRT的SPR信号为b-a的差值。在这一部分实验中，每一剂量组有3只辐照小鼠，每只小鼠样本SPR检测3次。图4是不同剂量60Co伽马射线辐照后小鼠淋巴细胞野生型HPRT的SPR信号。从图4我们可以发现0.01,3和5Gy的野生型HPRT信号显著低于0Gy；而0.005Gy野生型HPRT信号与0Gy组相比无明显差异，这说明了基于SPR技术的HPRT基因突变检测方法的可以检测60Co伽马射线诱导HPRT基因突变，其最低可分辨的导致突变的剂量为0.01Gy。
结论：基于6-硫代鸟嘌呤与野生型HPRT相结合的SPR技术可以检测60Co伽马射线诱导HPRT基因突变。此种方法最低可分辨0.01Gy的伽马射线诱导HPRT基因突变。
Claims (2)
1.一种基于表面等离激元共振的HPRT体基因突变检测方法，其特征在于如下步骤实现：
（1）野生型HPRT酶敏感SPR金膜的制备：
Pirrahan溶液清洗SPR金膜15s；20 mM的半胱氨酸覆盖于清洗过的金膜表面，然后将金膜避光放置过夜；过夜后的金膜经蒸馏水彻底清洗以去除没有结合的半胱氨酸，氮气吹干；半胱氨酸修饰的金膜表面再覆盖以10 mg/mL羧甲基葡聚糖，15mM N-羟基琥珀酰亚胺NHS和75 mM 1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐EDC的混合液，避光放置2.5小时；2.5小时后，蒸馏水冲洗并氮气吹干；经蒸馏水冲洗3次后，放入6-硫代鸟嘌呤0.3 mg/mL的溶液中，通过酰胺键化学偶联反应，将6-硫代鸟嘌呤固定在金膜表面，1M的乙醇胺100 uL封闭未与6-硫代鸟嘌呤结合的羧甲基葡聚糖，取出金膜经蒸馏水冲洗得到6-硫代鸟嘌呤敏感SPR金膜，这种敏感金膜放置在4℃冰箱保存备用一周；
（2）野生型HPRT标准品的SPR检测：
从低到高将不同浓度的野生型HPRT分别取100uL注入SPR仪器的进样器，记录SPR共振角度随时间变化的过程并根据SPR信号的标准差计算SPR仪器检测HPRT的最低检测限；
（3）样品制备及SPR检测：
将收集的哺乳动物细胞用hanks液反复清洗后，直接加入组织细胞裂解液，4℃条件下振荡，使样品裂解充分，裂解产物低温离心，收集含有蛋白质的上清液；将上清液中裂解液成分用PBS置换后，4℃冰箱保存，SPR检测。
2.根据权利要求1所述的根据一种基于表面等离激元共振的HPRT体基因突变检测方法，其特征在于步骤（2）所得的SPR信号拟合的线性曲线，其线性方程为y=0.03x +0.89 ，r=0.9812。
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