CN102160553A - 一种抗植物病毒病Ba制剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了抗植物病毒病Ba制剂,是由以下组分组成的:解淀粉芽孢杆菌Ba培养液和硅藻土,其中,解淀粉芽孢杆菌Ba培养液中,Ba的活菌数为1000亿cfu/ml,硅藻土的质量占制剂总质量的8%;所述解淀粉芽孢杆菌Ba命名为Bacillus amyloliquefaciens,已于2010年08月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其保藏编号为CGMCCNO.4127。本发明的抗植物病毒制剂具有钝化病毒颗粒、抑制病毒复制增殖和诱导寄主抗性的能力;温室防效80%以上,大田防效49.09%。在作物(烟草为主)病毒病防治方面,具有很高的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗植物病毒病Ba制剂及其应用。
背景技术
病毒病是农作物的重要病害之一。目前,抗植物病毒剂的防治效果,远远不能满足农业生产的需求,急需开发新型抗病毒制剂。尽管化学农药现在仍占主体,但从可持续发展的角度考虑,发展能产生高效、高活性的生物源抗病毒剂是实现产业化生物防治的关键。
中国文献“生防菌Ba33抑制烟草花叶病毒RNA在叶片内积累的研究,植物保护,2010,36(3):82-84.”以及“解淀粉芽孢杆菌Ba33对烟草的促生及抗TMV作用,吉林农业大学学报,2010,32(4):383-386.”记载了解淀粉芽孢杆菌Ba33对烟草花叶病毒(TMV)具有抑制作用,但其仅是机理研究,并未将其制成适用于工业化生产和应用的制剂,其实际应用存在难题。
发明内容
针对上述现有技术,本发明提供了一种抗植物病毒病Ba制剂,及其应用。
本发明是通过以下技术方案实现的:
一种抗植物病毒病Ba制剂,是由以下组分组成的:解淀粉芽孢杆菌Ba培养液和硅藻土,其中,解淀粉芽孢杆菌Ba培养液中,Ba的活菌数为1000亿cfu/ml,硅藻土的质量占制剂总质量的8%;所述解淀粉芽孢杆菌Ba命名为Bacillus amyloliquefaciens,已于2010年08月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其保藏编号为CGMCCNO.4127。
所述抗植物病毒病Ba制剂的制备方法为:将解淀粉芽孢杆菌Ba培养液添加到硅藻土中,混匀即可。
所述抗植物病毒病Ba制剂能够用于防治作物病毒病,特别是烟草的TMV病毒病。
所述抗植物病毒病Ba制剂还能够对农事操作工具上的病毒进行消杀,降低病害传播。
所述抗植物病毒病Ba制剂还能够促进作物的生长,尤其是烟草。
本发明所涉及的解淀粉芽孢杆菌Ba33,其培养方法、生物特性、活性物质等,已经公开,记载在中国文献“生防菌Ba33抑制烟草花叶病毒RNA在叶片内积累的研究,植物保护,2010,36(3):82-84.”以及“解淀粉芽孢杆菌Ba33对烟草的促生及抗TMV作用,吉林农业大学学报,2010,32(4):383-386.”上,在此不再赘述。
本发明的抗植物病毒制剂具有钝化病毒颗粒、抑制病毒复制增殖和诱导寄主抗性的能力;温室防效80%以上,大田防效49.09%。在作物(烟草为主)病毒病防治方面,具有很高的应用价值。虽然解淀粉芽孢杆菌Ba33能够抗TMV的特性已经公开,但本发明将其制备成适于工业化应用的制剂,配方中,硅藻土对Ba33有较好的吸附作用,Ba33在硅藻土中以芽孢形式存在,活性稳定。室温下可放置8个月,对TMV仍有60%的防效。
附图说明
本发明的解淀粉芽孢杆菌Ba33命名为Bacillus amyloliquefaciens,已于2010年08月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其保藏编号为CGMCCNO.4127,保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所,邮编:100101。图1为实施例1中Ba33菌株对TMV的抑制作用示意图,其中,左:无菌水;右:Ba33。图2为实施例3中Ba制剂对TMV的抑制作用示意图。
图3为实施例4中Ba制剂对三生NN烟诱导1-6d的枯斑抑制症状示意图,其中,A:Ba-1d:B:Ba-2d;C:Ba-3d;D:Ba-4d;E:Ba-5d;F:Ba-6d;G:NB-1d;H:NB-2d;I:NB-3d;J:NB-4d;K:NB-5d;L:NB-6d;M:CK-1d;N:CK-2d;O:CK-3d;P:CK-4d;Q:CK-5d;R:CK-6d。
图4为实施例5中Ba灌根对NC89的促生作用示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1防治TMV拮抗细菌Ba33菌株的筛选
挑取纯化菌株接种于NB液体培养基,28℃恒温,140rpm振荡培养48h,取20ml与等体积80倍TMV汁液混合15min后,摩擦接种TMV的枯斑寄主三生NN烟,每株接种上部2片叶,以无菌水与TMV混合为对照,3~5d调查枯斑抑制率。经初步测试有拮抗活性的菌株采用相同方法重复测试,每处理3株,三次重复。结果如表1、图1所示。
表1不同菌株对烟草普通花叶病毒的抑制作用
枯斑抑制率调查显示:菌株Ba33对TMV的抑制效果最好,对TMV的枯斑抑制率达到91.3%,生防细菌在生长代谢过程中产生了具有抑制病毒活性的抗生物质(见表1、图1)。
实施例2抗植物病毒病Ba制剂的配置
粉剂流程图:Ba33菌种活化、培养液制备---种子液接种---菌体发酵3次---与填料硅藻土混合---喷雾干燥去水分---菌体原粉---添加填料---菌体制剂(10亿/克)。所得菌体制剂中,填料硅藻土的质量占制剂总质量的8%。
Ba制剂稀释150倍,与80倍TMV汁液等体积混合15min后,摩擦接种三生NN烟,每株接种上部2片叶,以无菌水与TMV混合为对照,同时以Ba33培养液、NB培养基代替Ba制剂液为比较。计算枯斑抑制率。
表2不同硅藻土添加量对制剂抑制TMV作用的影响
通过表2看出,硅藻土含量8%时,即不影响发酵液的活性,又能很好的吸附菌液,对TMV的防效达到86.77%。说明选择硅藻土作为填料,不影响Ba33活菌对TMV的抑制作用,硅藻土作为填料,具有吸附性好、价格便宜等优点,可以在生产上使用。
实施例3Ba制剂对TMV的抑制作用
5-6叶期三生NN烟,做如下处理:①叶面喷雾制剂150倍稀释液,每株10ml,24h后,接种160倍TMV汁液;②80倍的TMV汁液与等体积的制剂液混合,摩擦接种;③接种160倍TMV汁液,24h后,叶面喷雾制剂液,每株10ml。以上每处理3株,接种上部3片叶。分别以NB培养基、清水代替Ba制剂液为对照CK。统计平均枯斑数。结果如表3、图2所示。
表3生防菌Ba制剂对TMV的作用方式(平均枯斑数)
通过表3看出,生防菌制剂Ba对TMV的①预防、②钝化、③治疗,三种作用方式的枯斑数均显著小于NB培养基和CK(清水)处理。与CK相比,Ba对TMV的预防、钝化和治疗作用分别为89.6%、96.3%和54.4%。以钝化作用最为显著,其次为预防作用和治疗作用,NB培养基对TMV没有抑制作用(表3、图2)。
实例4Ba制剂对三生NN烟的诱导抗性
5-6叶期三生NN烟,接种160倍TMV前1d、2d、3d、4d、5d、6d,叶面喷雾制剂150倍稀释液,每株10ml。以喷清水为对照,每处理3株,接种上部3片叶,统计枯斑数,计算枯斑抑制率,结果如表4、图3所示。
表4Ba制剂对植株的诱导抗性
通过表4看出,喷施Ba制剂150倍稀释液,有提高三生NN烟抗TMV侵染的作用。三生NN烟接种TMV前1-6d喷施Ba制剂,平均枯斑数为8.0,均显著低于NB(59.4)和清水(61.1)处理。与CK相比,接种前1-6d,喷施Ba制剂,对TMV的诱导抗性在78.1~89.9%,说明在接种TMV前一周内喷施Ba制剂均能提高三生NN烟的抗性,是一种良好的病毒预防剂(表4、图3)。
实施例5Ba制剂对植株的促生作用
2-3叶期普通烟NC89,移栽至直径10cm的小花盆,移栽时用Ba制剂液灌根,每株10ml,间隔3d,再连续灌根2次,以NB培养基、无菌水灌根为对照,每处理6株,3次重复。末次灌根3d后,调查鲜重,最大叶长、宽(如表5、图4所示)。
表5Ba制剂液灌根对NC89的促生作用
备注:小写字母表示5%水平差异,大写字母表示1%水平的差异
由表5看出,普通烟NC89,连续三次灌根,Ba处理其鲜重,最大叶长、宽均高于NB培养基和清水处理,与清水处理差异极显著。其中Ba制剂150倍稀释液、NB培养基灌根处理其烟株生长好于清水处理,以Ba制剂150倍稀释液处理的植株长势最好(图4)。
实施例6Ba制剂对剪叶剪刀的消毒作用
灭菌剪刀在80倍TMV汁液中浸泡1min,取出后分别在下述①~④液体中浸泡30sec,在5~6叶期普通烟NC89上,剪上部3片叶。每处理9株,3次重复。15d调查病情指数。①Ba制剂150倍稀释液,②NB培养基,③清水,④不浸泡,直接剪NC89叶片,结果如表6所示。
表6Ba制剂对剪叶剪的消毒作用
由表6看出,剪刀浸泡在TMV汁液中,沾取了病毒汁液,再在Ba制剂150倍稀释液中浸泡,能杀死绝大部分病毒,发病率仅为7.41%,病情指数也远低于其他处理,因此,生产上可以用Ba制剂液来消毒剪叶剪等操作器械。试验中还观察到浸泡在NB培养基和清水中的处理,发病率也低于④不浸泡的处理,是因为溶液稀释了沾取在剪刀上的病毒浓度,降低了侵染力。
实施例7Ba制剂的温室和大田防效
温室防效:3-4叶期普通烟NC89(三生NN烟),喷施Ba制剂150倍稀释液3次,间隔6天,末次喷施后6h接种160倍TMV稀释液。NC89每处理25株,2次重复,15d后调查病情指数。三生NN烟,每处理10株,2次重复,调查枯斑抑制率,结果表7、8所示。
大田防效:普通烟NC89,移栽在即墨试验农场,移栽后1周叶面喷雾150倍稀释液,间隔1周,连续喷雾3次,每处理40株,3次重复,以宁南霉素为对照药剂,以清水为空白对照。调查病情指数,结果如表9所示。
表7Ba制剂在NC89对TMV的温室防效(病情指数)
表8Ba制剂在三生NN对TMV的温室防效(枯斑抑制率)
表9Ba对TMV的大田防效
通过表8、表9看出,普通烟NC89和三生NN烟,连续喷施Ba制剂能提高植株对TMV的抗性。Ba处理NC89的病情指数为20.23,低于CK处理43.56,抑制率为53.56%;Ba处理三生NN烟的平均枯斑数为14.65,低于CK处理79.75,枯斑抑制率为81.63%。
通过表10大田试验看出,Ba制剂对TMV的大田平均病指为17.40,与宁南霉素500倍的病指17.18无显著差异,而显著低于清水对照的病指34.18,防效为49.09%。
实施例7菌体制剂的稳定性试验
Ba制剂,室温下放置,每隔30d,稀释150倍,与TMV等体积混合,温室接种三生NN烟,检测对病毒的枯斑抑制率,结果如表11所示。
表11Ba制剂室温下活性降解规律
时间 | 30d | 60d | 90d | 120d | 135d | 180d | 210d | 240d | 270d | 300d | 330d | 360d |
Ba枯斑数 | 5 | 7 | 13 | 14 | 10 | 23 | 31 | 35 | 45 | 40 | 60 | 74 |
CK枯斑数 | 86 | 93 | 84 | 105 | 110 | 99 | 86 | 89 | 112 | 88 | 96 | 120 |
抑制率 | 94.19 | 92.47 | 84.52 | 86.67 | 90.91 | 76.77 | 63.95 | 60.67 | 59.82 | 54.55 | 37.5 | 38.33 |
通过表11看出,Ba制剂在室温下保存,随着时间的延长,活性逐渐降解,保存6个月,活性降解为76.77%,保存8个月,仍有60.67%的活性,保存12个月,对TMV的活性下降到38.33%。说明,Ba制剂在室温下,降解缓慢,可能主要是形成了芽孢,易于贮存和运输,具有开发为生防制剂的潜质。
Claims (3)
1.一种抗植物病毒病Ba制剂,其特征在于,是由以下组分组成的:解淀粉芽孢杆菌Ba培养液和硅藻土,其中,解淀粉芽孢杆菌Ba培养液中,Ba的活菌数为1000亿cfu/ml,硅藻土的质量占制剂总质量的8%;所述解淀粉芽孢杆菌Ba命名为Bacillus amyloliquefaciens,已于2010年08月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其保藏编号为CGMCCNO.4127。
2.权利要求1所述的一种抗植物病毒病Ba制剂在防治作物病毒病中的应用。
3.权利要求1所述的一种抗植物病毒病Ba制剂在促进作物生长中的应用。
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