CN102159235A - 包括mg29核酸、多肽的组合物和相关使用方法 - Google Patents
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Abstract
本文公开的是治疗肌肉功能失调(包括少肌症)和涉及骨骼肌的其它疾病的组合物和方法,包括年龄相关的肌肉功能失调。此外,本发明涉及包括本发明的核酸和/或多肽与药物可接受载体组合的治疗组合物,其中该组合物有助于治疗骨骼肌失调,包括与正常老化过程相关的失调。此外,本发明涉及治疗和/或预防与胞内Ca2+调控改变和当MG29表达水平降低时发生的膜结构破坏相关的病理状况。
Description
相关申请的参考
根据35U.S.C.§119(e),本申请要求以下美国临时专利申请的优先权:于2008年7月18日提交的题为“MG29and Muscle Function in Stress and Disease”的序列号61/135,325;和于2009年4月8日提交的题为“Compositions Comprising MG29 Nucleic Acids,Polypeptides and Associated Methods of Use”的序列号61/212,275,将其全部内容以引用方式结合到本文中用于所有目的。
引用加入
根据37C.F.R.§1.52(e)(5),随同本文提交序列表的电子化CRF:文件名:MG29_seqlist_ST25.txt;大小:67KB;创建于2009年7月14日;使用PatentIn-3.5,Checker 4.4.0的全部内容通过引用结合到本文中作为参考。随同提交的序列表的计算机可读形式的数据不包含新内容,受到优先权申请美国临时专利申请第61/135,325号和第61/212,275号的完全支持。美国联邦政府赞助的研究的相关声明
依照美国国立卫生研究院(NIH)给予Dr.Jianjie Ma的基金:RO1-AG15556,美国政府具有本发明的某些权利。
技术领域
本发明涉及重组核酸和多肽组合物和其用于调节肌肉功能和治疗疾病的使用方法。
背景技术
骨骼肌的三联体由伸入与肌质网(SR)的终池的两个部分并列的细胞质(横向管和T-管)的单一的质膜内陷组成。通过免疫染色筛选抗体库寻找定位三联体的新型蛋白质发现了涉及骨骼肌的兴奋收缩(E-C)偶联和Ca2+运作的其它方面的蛋白质。在筛选该库的过程中发现的一个蛋白质是新型的跨膜蛋白,被称为突触素类似2蛋白质(Sypl2)或mitsugumin 29(MG29)。
MG29基本上是专一在骨骼肌纤维中表达的,尽管在肾脏中可解决某些低水平的表达,MG29含有四个跨膜结构域,这可以使蛋白质同时定位于横(T-)管膜和三联体的SR膜。这种亚细胞分布暗示MG29可能调节T-管和连接SR膜之间的通信。MG29的蛋白质结构与神经传递素释放必须的跨膜蛋白突触素家族的成员在氨基酸序列上是同源的并且具有共同的特征性结构特征。
突触素初始被识别为小突触小泡的丰富的和高度免疫原性膜蛋白,其也在致密核心的嗜铬神经分泌颗粒中被发现。突触素和其同源物,突触孔蛋白(或突触素II)和泛有小泡蛋白具有共同的跨膜结构,具有四个跨膜区和细胞质氨基和羧基端。
突触素的独特的特征是它具有低聚结构,导致认为突触素可能是神经传递素释放过程中形成的融合孔的组件。此外,Alder等已显示互补于突触素mRNA的反义寡核苷酸降低通过注射总脑mRNA引起的爪蟾***的Ca2+-依赖性谷氨酸盐的分泌。将突触素抗体显微注射入运动神经元阻断神经肌肉传递。这些数据与神经传递素分泌必须的突触素是一致的。但是,用于识别突触素功能的遗传学方法还未成功;缺乏突触素的突变小鼠显示出正常的表型。这可能反映了通过突触孔蛋白或其它突触素家族成员的补偿。确实,在突触素和突触孔蛋白(synaptogyrin)两方面有缺陷的小鼠显示出突触可塑性缺陷。
突触素已被认为在小泡形成中起结构性作用。基于其高度结合胆固醇的能力,突触素涉及突触小泡生物发生过程中的膜曲率的产生。还已知突触素与突触小泡膜的其它蛋白紧密相互作用,即小突触泡蛋白和液泡H+-ATP酶。认为这些相互作用调节SNARE复合物水平的胞吐膜融合或融合孔形成。通过对酵母液泡融合的研究支持了后一观点,其认为液泡ATP酶直接参与膜融合。
MG29和突触素之间的相似性促使了对MG29是否在调节骨骼肌的膜结构中具有重要作用的研究。骨骼肌是自然的最具有塑性的组织之一,正常的肌肉生理必需复合膜结构的形成和保持。在发育的整个过程中,老化和包括疲劳的其它过程必需骨骼肌***的持续适应,因此识别和鉴定涉及骨骼肌膜结构的塑性的基因和蛋白对于理解肌肉生理以及治疗和诊断与肌肉功能失调相关的病理是至关重要的。因此,具有对于发展用于治疗与肌肉功能失调相关的状况的肌肉功能药物调节剂的持续需要。
发明内容
本发明涉及令人惊奇和意外的发现,发现了参与肌肉细胞的兴奋-收缩(EC)偶联的基因、蛋白和过程。尤其是,本发明提供了编码MG29和/或MG29受体多肽和其部分(在本文中为“MG29多肽)的核酸,与编码MG29和/或MG29受体多肽和其部分互补的核酸,包括其的载体和/或宿主细胞,MG29和/或MG29受体多肽和融合蛋白,对MG29的抗原决定簇具有特异性的抗体或抗原结合域,外源MG29和/或MG29受体基因或外源MG29和/或MG29受体转基因受到调节的宿主细胞和转基因生物。
在其它方面,本发明涉及诊断检测和调节MG29和/或MG29受体的活性、转录和/或翻译(即表达)的化合物的筛选方法,和其使用方法。
在其它方面,本发明还涉及用作治疗和预防与肌肉功能失调相关的疾病和紊乱的治疗剂的组合物。本发明的治疗组合物包括MG29和MG29受体多肽和融合蛋白,编码MG29或MG29受体多肽的核酸,和与编码MG29或MG29受体的核酸互补的核酸,包括含核糖的核酸。本发明的这个方面还包括MG29和MG29受体突变体、同源物、片段、截短片段(truncations)、伪肽、肽类似物和拟肽。
在另一方面,本发明包括可调节MG29基因表达、蛋白水平和/或活性;和/或MG29受体基因表达、蛋白水平和/或活性中的至少一个的化合物。如本文所述,MG29是正常肌肉功能的关键性细胞结构和生理过程的重要组成。因此,靶向和调节MG29和/或MG29受体基因表达、多肽合成、活性或蛋白-蛋白相互作用代表了用于治疗与肌肉功能失调相关的病理(包括,例如少肌症、疲劳以及多种其它病理)的新型干预治疗。
在某些其它方面,本发明涉及与诊断、治疗或改善肌肉相关病理相关的组合物和方法。在某些示例性实施方式中,本发明包括,例如,给药有效量的本发明的治疗组合物用于预防和/或治疗肌肉相关病理;包括治疗和/或预防与年龄相关的作为老化过程的自然副作用(包括少肌症)发生的肌肉功能缺陷;治疗和/或预防任何类型的肌肉组织的损伤,如,例如患有心血管疾病和/或运动损伤的主体中发生的那些;治疗和/或预防肌营养不良、心脏缺血、心力衰竭、衰老退化等。在某些实施方式中,治疗组合物包括核酸,包括调节MG29基因表达、蛋白水平和/活性;和/或MG29受体基因表达、蛋白水平和/或活性中的至少一个的干扰核酸;和/或能够调节MG29基因表达、蛋白水平和/或活性;和/或MG29受体基因表达、蛋白水平和/或活性的小分子。
在其它实施方式中,本发明涉及用于诊断或监控与肌肉功能相关的疾病或状况的诊断组合物,其包括与至少部分的MG29或MG29受体编码核酸互补或能够与其杂交的核酸(例如,MG29或MG29受体基因或mRNA)。
只是以实施例的方式提供了前述的一般功用领域,而不是要限定本公开和所附权利要求的范围。所属领域的一般技术人员根据本权利要求书、说明书和实施例会认识到本发明的其它目的和优势。例如,可以多种组合来应用本发明的各种方面和实施方式,本说明书明确涵盖了其所有组合(情况)。其它的目的和优势都被明确地包括在本发明的范围内。
附图说明
被并入到说明书中并且形成其一部分的附图说明了本发明的几个实施方式,其与说明书一起用于解释本发明的原则。附图只是为了说明本发明的实施方式的目的,而不能被理解为限制本发明的范围。
图1(A)产生MG29表达调控的新型转基因***。示意图表示了包括可被用于控制各种cDNA(在本情况中是MG29 cDNA)表达的转基因构建体的序列元件。使用精确的探针序列可识别产生的转基因动物。探针1以GFP为目标,长度为720bp,探针2以rtTA序列为目标,长度为1008bp。通过在EcoRI限制性内切酶消化的基因组DNA上进行DNA印迹法(Southernblot)可进行基因分型。(B)与前述形式相比(左),GFP盒相对于剩余构建体的倒置导致当转染到HEK293细胞中时产生的荧光信号的显著提高(右)。
图2.使用转基因***通过多西环素的MG29表达的剂量和时间依赖性活化。(A)以MG29 cDNA转基因构建体转染HEK293细胞,并且以各种剂量的多西环素处理HEK293细胞。在接触了多西环素24小时之后,裂解细胞用于生化检测。MG29 cDNA上的Flag标签的蛋白质印迹法(Western blot)显示了MG29表达可响应于多西环素剂量的升高而被诱导。提供β-肌动蛋白水平作为凝胶上样的对照。(B)以MG29 cDNA转基因构建体转染HEK293细胞,并且以0.1ug/mL多西环素处理HEK293细胞多个时间段。在所示时间之后,裂解细胞用于Western印迹法分析。通过该转基因***可观察MG29表达活化的时间依赖性。
图3.利用tet-ON可诱导***控制microRNA表达盒表达的新型转基因***。该方法的应用可以产生首建小鼠,其中通过应用Cre-重组技术microRNA表达被特异性地限定于肌肉组织。通过tet-ON***的rtTA和tTS蛋白控制microRNA表达的活化,可以可诱导地和可逆地抑制感兴趣的基因表达。
图4.用于通过tet-ON***可诱导地敲除MG29基因表达的第二代microRNA方法。
图5.使用转基因***的基因表达的多西环素的剂量依赖性抑制。(A)以含有junctophillin-1(mJP1)的质粒和含有以mJP1 cDNA为目标的siRNA序列的转基因质粒共转染HEK293细胞。然后以各种剂量的多西环素处理这些细胞。在暴露于多西环素24小时之后,裂解细胞用于mJP1表达的Western印迹法。印迹法显示mJP1表达可对多西环素剂量的升高做出反应从而被抑制。提供了肌动蛋白水平作为凝胶上样的对照。(B)以含有junctophillin-2(mJP2)的质粒和含有以mJP2 cDNA为目标的siRNA序列的转基因质粒共转染HEK293细胞。然后以各种剂量的多西环素处理这些细胞。在暴露于多西环素24小时之后,裂解细胞用于mJP2表达的Western印迹法。印迹法显示mJP2表达可对多西环素剂量的升高做出反应从而被抑制。
图6.在老化过程中MG29蛋白表达被下调,通过锻炼可被上调。(A)随着小鼠老化,骨骼肌中的MG29蛋白水平降低(来自Weisleder,et al.,2006,J Cell Biol.,174:5,639的图像)。(B)小鼠进行单次跑台锻炼,然后解剖肌肉并在停止锻炼后的各个时间点检测MG29表达。MG29表达迅速升高,其持续并在锻炼后24小时达到峰值。随着时间前进,MG29水平开始回复至基线。提供肌动蛋白水平作为上样变化的对照。
图7.在翻译后水平控制肌肉细胞内的MG29表达。(A)C2C12肌原细胞分化成肌管,然后如所示在不同的时间点进行收获。通过使用抗MG29的单克隆抗体的Western印迹法测量MG29蛋白水平。在C2C12细胞中未观察到蛋白质表达,而可从转染了pcDNA-MG29(含有完整的鼠MG29mRNA序列的表达质粒,包括3’UTR (+))的HEK93非肌肉细胞可观察到MG29蛋白。(B)当通过实时PCR检测相同细胞样本的MG29 mRNA表达时,可检测到MG29mRNA的实质性水平。这表示在转录后水平在肌肉细胞中MG29表达受到控制。
图8.鼠和人MG29mRNA的3’UTR显著比平均长。表(Mignone,et al.Genome Biology 2002,3(3))显示了鼠或人mRNA中的区域的平均长度。表下的数字表示鼠和人mRNA中的每一区域的长度。在人和鼠中,MG29的3’UTR都比这些生物的3’UTR的平均长度长得多。
图9.MG29的UTR区域存在的主要二级结构。通过生物信息学方法检测了5’和3’UTR的序列从而解析这些区域的二级结构。尽管预测在5’UTR(A)中有一些发夹结构,3’UTR(B)的结构高度复杂,并提供了多个结合辅助因子的位点,其可影响MG29基因表达的转录后调控。
图10.3’UTR可显著改变mg29 mRNA.的特征。虽然mg29编码基因(A)本身具有预计的-201.0 kcal/mol的自由能和相对简单的二级结构,mg29 3’UTR(B)的自由能显著变化(-518.5 kcal/mol)并具有更加复杂的结构。当两个序列组合时(C),提高的复杂程度和自由能的变化甚至进一步增加,产生的自由能是-797.3 kcal/mol。
图11.用于MG29表达实验的重组质粒载体构建体的示意图:pFLAG-MG29(不含有UTR)或pcDNA-MG29(含有UTR)。pFLAG-MG29是只含有合并了FLAG标签(DYKDDDDK)的鼠MG29基因的编码序列的表达载体。pcDNA-MG29是含有全长cDNA和同时具有鼠MG29mRNA的5’和3’非翻译区(UTR)的表达质粒。注意,两个质粒使用相同的启动子来促进表达盒表达。
图12.肌肉细胞中控制MG29蛋白产生必需UTR序列。以pFLAG-MG29(不含有UTR)或pcDNA-MG29(含有UTR)转染C2C12细胞。实验以加载到分离道中的不同孔进行两次重复。通过Western印迹法(WB)测量蛋白表达(A),通过半定量RT-PCR(RT)测量mRNA水平(B)。虽然两种质粒都能产生mRNA,只有pFLAG-MG29在这些条件下可产生蛋白表达。这说明用于转录后控制MG29表达的序列元件存在于MG29 mRNA的UTR序列。提供了β-肌动蛋白水平用于样品之间的等效实验条件的对照。
图13.MG29表达的转录后调控限定于非肌肉细胞。在没有胎牛血清(FBS)的情况下,以pFLAG-MG29(不含有UTR)或pcDNA-MG29(含有UTR)转染HEK293细胞。通过Western印迹法(WB)测量蛋白表达(A),通过半定量RT-PCR(RT)测量mRNA水平。虽然两种构建体都产生MG29 mRNA和蛋白质,MG29UTR序列的存在显著降低MG29表达的量。提供了β-肌动蛋白水平用于样品之间的等效实验条件的对照。
图14.在培养基中加入FBS可降低MG29表达抑制。在FBS的存在下,以pFLAG-MG29(不含有UTR)或pcDNA-MG29(含有UTR)转染HEK293细胞。通过Western印迹法(WB)测量蛋白表达(A),通过半定量RT-PCR(RT)测量mRNA水平。在所有情况下,在培养基中加入FBS产生了更高水平的MG-29蛋白,显著降低了pFLAG-MG29和pcDNA-MG29之间的基因表达的差异。这表示FBS中存在的因素可调节影响MG29表达的翻译后表达的途径。提供了β-肌动蛋白水平用于样品之间的等效实验条件的对照。
图15.mg29 mRNA的3’UTR中的特异性元件是转录后调控所必需的。(A)完整长度的鼠mg29 mRNA的3’UTR组装了一系列删除构造(构建体)。这些白殴打质粒包含MG29编码序列和3’UTR的各种缺失(或删除)。(B)将这些删除构造转染进C2C12肌管细胞,3天后裂解该细胞用于Western印迹法分析。虽然mg29编码序列(Fg-MG29)容易在C2C12细胞中表达,完整长度(FL)的mRNA在C2C12细胞中不产生MG29蛋白质。删除构造F1和F2不产生MG29蛋白质,但是F3和F4构造可产生大量的蛋白。这表示mg29 mRNA的UTR的3’末端上的特异性区域是MG29表达的转录后调控所必需的。
图16.多个共有结合位点位于MG293’UTR中。计算机数据库分析显示鼠MG29 mRNA的3’UTR含有多个与应激相关的基因表达转录后控制的蛋白质因子的结合位点。例如,HuR位点响应应激(如氧化应激)调控mRNA的稳定性和翻译。ARE(富AU元件)与mRNA的去稳定化相关。15-LOX-DICE(15-脂氧合酶分化控制元件)与hnRNP E1和K结合从而抑制翻译起始。
图17.人MG29基因的上游序列含有高度保守区域。将人MG29基因的转录起始位点上游序列2kb用于GenBank中的非重复基因组数据库的BLAST搜索。该搜索显示转录起始位点的-702至-422区域对于几种灵长目种类是高度保守的,包括黑猩猩、狨猴和大猩猩。
图18.人MG29启动子的保守区域包含与肌肉萎缩相关的共有结合位点。将人MG29基因的转录起始位点的-702至-422区域进行针对共有转录因子结合位点的数据库分析(http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)。我们发现了几个与肌肉特异性基因表达控制相关的位点,包括GATA、RUNX1、SREBP1、C/EBP和p300。RUNX1特别引人关注,因为其直接与老化骨骼肌中观察到的与少肌症相似的肌肉萎缩的发展相关。
具体实施方式
现在描述的是与令人惊奇和意外的发现即MG29是控制肌肉功能和可塑性的兴奋-收缩(E-C)偶联过程中的重要结构和功能组成相关的组合物和方法。
以下的美国临时专利申请:2008年7月18日提交的、名称为《MG29and Muscle Function in Stress and Disease》的申请,序列号61/135,325;和2009年4月8日提交的、名称为《Compositions Comprising MG29 Nucleic Acids,Polypeptides and Associated Methods of Use》的申请,序列号61/212,275,将其全部内容以引用方式结合到本文中用于所有目的。
除非另有说明,否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的一般技术人员通常理解的相同的含义。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献以其全部内容通过引用结合到本文作为参考。在有争议的情况下,将以包括定义的本说明书为准。此外,材料、方法和实施例只是为了说明,而不用于限制。
本发明描述了组合物和方法,其令人惊奇地和意外地有利于肌肉疾病和功能失调的诊断、治疗和/或预防。虽然肌肉功能的老化效果与肌肉纤维去神经、运动单元丧失和运动单元变形相关,在显著的肌肉萎缩变得明显之前就发生了功能性改变。因此,E-C偶联机制和细胞内Ca动态平衡的变化可能充当肌肉老化的起因或对肌肉老化的适应反应。已显示几种三联体蛋白质(包括DHPR、隐钙素和SERCA)的功能改变有助于扰乱老化骨骼肌中的钙动态平衡。近来,识别肌肉老化的分子标记和它们对于老化相关的肌肉功能失调的作用已成为E-C偶联研究和一般老年医学研究的主要关注点。
因此,在一些方面,本发明涉及本文所述的几个与MG29功能相关的发现。例如,已发现mg29(-/-)敲除的动物不能维持长时间的身体活力并且显著比野生型的同窝对照跑得少。随后观察到mg29(-/-)小鼠的肌肉比野生型的对照小鼠的疲劳程度更高,在疲劳之后恢复程度低,产生的力更小,即使存在咖啡因。
使用生化检测,观察到MG29的表达在老化的骨骼肌中显著降低。此外,在mg29(-/-)幼鼠和老化wt小鼠中都检测到骨骼肌的三联体周围的膜超微结构的异常。例如,t管肿胀并且有时从A-I接头消失,SR网络形成不良具有空泡和片段化结构,导致三联体未对准。而且,如下文所述,内源MG29 mRNA的UTR序列包括多个用于转录后调控的共有位点。实验观察显示MG29 UTR序列实际上是MG29基因表达的转录后调控所必需的,显示出UTR是肌肉中控制MG29表达的调控途径的目标。因此,MG29 mRNA的转录后调控的调节作为用于诊断、治疗和预防肌肉相关病理的干预治疗的另外一种方法存在。
还描述了MG29在钙火花中的功能性作用。横纹肌细胞中的SR的钙释放的基本单元是被称为钙火花的不连续、局部事件。首先在心脏肌中发现作为源于SR表面上的RyR通道的类晶格排列的局部量子化钙释放事件的钙火花,因此代表了钙诱导的钙释放(CICR)的基本单位。钙火花的发现革新了我们对于心脏和平滑肌中的钙信号的生理学和病理学的理解。自从发现心肌中的钙火花,研究者在完整的成年哺乳动物骨骼肌中检测这些局部钙释放具有困难。很快也在新生哺乳动物骨骼肌中检测到了钙火花,其归因于3RyR类型(胚胎发育过程中骨骼肌高度表达的一种亚型)的活动。虽然在静止的完整哺乳动物纤维中很少进行钙火花的观察,直到最近,只在其肌纤维膜完整性被各种物理或化学剥皮法破坏的骨骼纤维中观察到大量事件。由于监控完整哺乳动物肌纤维中的钙火花信号活性的固有困难,可使用钙火花确定的骨骼肌中的钙火花信号调控的基础细胞机制和分子机制和其中的功能状态的信息仍然大部分是未知的。
在某些方面,本发明涉及编码MG29蛋白或其生物活性部分(例如只编码突触素结构域或MARVEL结构域的截短部分)的分离的和重组的核酸。如此,该方面的任意实施方式,编码MG29蛋白的核酸包括缺失、取代、截短、融合蛋白质等。在其它实施方式中,本发明包含包括与人MG29突触素结构域多肽具有至少30%同源性的第一多肽结构域(“突触素样结构域”)和可选的与人MG29 MARVEL结构域多肽具有至少30%同源性的第二多肽结构域(“MARVEL样结构域”)的重组多肽。在某些其它实施方式中,本发明包括重组多肽,其中突触素或突触素样结构域与MARVEL结构域或MARVEL样结构域并列。本发明的重组多肽还可包括融合蛋白质结构域,和/或***多肽结构域之间的氨基酸连接序列,其可以,例如,使具有空间柔性和/或包括用于酶改性的共有序列(例如,磷酸化、蛋白酶裂解、泛素化等)。可使用标准的分子生物学技术来构造重组多肽用于操控DNA序列;在下文中更详细地描述了其中的一些。
例如,在某些方面,本发明包括分离的或重组的核酸,其编码通过表达由组合编码MG29家族的其它成员(例如表1和表2中规定的)的氨基酸或肽成分的核苷酸形成的基因或cDNA构建体而形成的多肽。可使用标准的分子生物学技术从任何理想的亲本基因克隆编码各个氨基酸或肽结构域的核酸,并且组合在一个单一邻近的核酸中。而且,因为一般认为进化保守性氨基酸序列的功能相似,根据本说明来产生其它的蛋白质,和无需过度实验评价重组蛋白质促进E-C偶联和肌肉可塑性的能力是所属领域的一般技术人员的能力范围内的。因此,由MG29家族成员的结构域组装的重组蛋白,例如上文所确定的那些,被明确地考虑为在本发明的范围内。
如本文所用,“衍生物”是由原始化合物直接形成,通过修饰,或通过部分取代形成的组合物。如本文所用,“类似物”是具有与原始化合物相似的结构,但是与原始化合物不相同的组合物。
本文所用的与数值或范围相关的术语“约”反映了由于实际和/或理论限制存在所属领域中被公认和容忍的某些水平的变化的事实。例如,容忍由于某些装置运行和/或测量采取的方式中的固有差异造成的微小变化。例如,根据上述,短语“约”通常被用于包括标准偏差或标准误差内的值。
如上所述,在某些方面,本发明涉及核酸和本发明的核酸编码的多肽,其可单独或与其它成分组合来调节肌肉生理,包括E-C偶联。本发明还涉及组合物,例如多肽,编码细胞质、核、膜结合的和分泌的多肽的核酸;以及载体、抗体、重组蛋白质、伪肽、融合蛋白质、化合物、宿主细胞、转基因动物和其生产方法。
生物聚合物
“核苷酸”表示以N-糖苷键与磷酸化糖连接的杂环含氮碱基。在所属领域中核苷酸被公认为包括天然碱基(标准)和所属领域中熟知的被修饰的碱基。这样的碱基通常位于核糖部分的1’位置。核苷酸通常包括碱基、糖和磷酸(酯)基团。核苷酸可以在糖、磷酸和/或碱基部分是未被修饰的或被修饰的,(也可互换地被称为核苷酸类似物,修饰核苷酸、非天然核苷酸、非标准核苷酸和其它;见,例如Eckstein等,国际PCT公开第WO92/07065号;Usman等,国际PCT公开第WO 93/15187号;Uhlman &Peyman,上述所有都通过引用结合到本文中作为参考)。
在这个方面“修饰碱基”表示除了位于1’位置的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶以外的核苷酸碱基或其相等物;这样的碱基可用于任何位置,例如位于酶核酸分子的催化核心中和/或核酸分子的底物结合区域中。
具有所属领域中已知的一些修饰核酸碱基的实例,如Limbach et al.,1994,Nucleic Acids Res.22,2183总结的。一些可被引入核酸的化学修饰的或其它天然核酸碱基的非限定性实例包括,例如,次黄嘌呤核苷、嘌呤、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2,4,6-三甲氧苯基、3-甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶核苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如,5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(例如胸腺嘧啶核糖核苷)、5-卤尿苷(例如5-溴尿苷)或6-氮杂嘧啶或6-烷基嘧啶(例如,6-甲基尿苷)、丙炔、Q(核)苷(quesosine)、2-硫尿核苷、4-硫尿核苷、怀丁苷(wybutosine)、wybutoxosine、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿苷、5’-羧甲基氨甲基2-硫尿核苷、5-羧甲基氨甲基尿苷、β-D-半乳糖Q核苷、1-甲基腺苷、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟苷、3-甲基胞苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿核苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲基羰基乙基尿苷、5-甲氧基尿苷、5-甲基-2-硫尿核苷、2-甲硫基-N6-异戊烯腺苷、β-D-甘露糖化Q核苷、尿苷-5-羟乙酸、2-巯基胞苷、苏氨酸衍生物和其它(Burgin et al.,1996,Biochemistry,35,14090;Uhlman & Peyman,supra)。
如本文所用,术语“核酸”是要包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)、RNA分子、DNA或RNA类似物,包括锁核酸和肽核酸,和其衍生物。
“下调”表示基因表达,或编码一个或多个蛋白质的RNA或等同RNA的水平,或一种或多种蛋白质的活性(如MG29或MG29受体多肽基因)被降低至低于在没有本发明的核酸分子情况下所观察到的(水平)。
“上调”表示基因的表达,或编码一个或多个蛋白质亚基的RNA或等同RNA的水平,或一个或多个蛋白质亚基的活性(如MG29或MG29受体)高于在没有本发明的核酸分子情况下所观察到的(水平)。例如,基因的表达被提高从而治疗、预防、改善或调节由于没有基因表达或基因表达水平低造成的或恶化的病理状况。
“调节”表示基因表达,或编码一个或多个蛋白质的RNA或等同RNA的水平,或一个或多个蛋白质的活性被上调或下调,从而表达、水平或活性高于或低于在没有本发明的核酸分子的情况下所观察到的。
“基因”表示编码RNA的核酸,例如,核酸序列包括但是不限定于编码多肽的片段。
“互补性”表示核酸与另外一个RNA序列通过传统的Watson-Crick碱基配对或其它的非传统类型形成氢键的能力。
“RNA”表示包括至少一个核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”或“2’-OH”表示在D-呋喃核糖部分的2’位置具有羟基的核苷酸。
“同源性”表示两个或多个核酸分子的核苷酸序列部分或完全相同。在某些实施方式中,同源性核酸具有30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的与MG29核酸的同源性,例如SEQ ID NO.:20-26中的至少一个。
“载体”表示用于传递需要的核酸的基于核酸的技术,例如细菌质粒、病毒核酸、HAC、BAC等。
本发明包括的生物聚合物组合物在本文中共同地、可互换地分别表示“MG29核酸”、“MG29受体核酸”、“MG29多核苷酸”或“MG29受体多核苷酸”,相应的编码多肽分别是指“MG29多肽”、“MG29受体多肽”、“MG29蛋白质”或“MG29受体蛋白质”。除非另有说明,认为这些术语是被广义解释的从而包括生物活性部分、片段、缺失或取代、截短、氨基或羧基末端或两个末端同时的基因融合,和其组合。而且,除非另有说明,“MG29”和“MG29受体”通常被用于表示如本文明确地、暗示或固有地描述的任意相关的和/或衍生的生物聚合物。如本文所用,术语“MG29受体”等包括结合于MG29多肽和/或MG29mRNA或基因的蛋白质。如本文所用,术语“核酸”或“基因”还可包括基因的5’UTR、3’UTR、启动子序列、增强子序列、内含子和外显子DNA以及mRNA或cDNA序列。
在另外一个实施方式中,本发明包括编码上述MG29多肽的分离或重组核酸,或SEQ ID NO.:1-19中列出的,和/或其同源物或片段,其中该多肽有助于肌肉功能。
在其它方面,本发明涉及将有效量的编码MG29和/或MG29受体多肽的核酸,例如MG29和/或MG29同源物、片段和其衍生物,给予个体的方法,用于试管内、体内或活体外治疗和/或预防肌肉相关的病理或状况。如本文所证明的,本发明的MG29多肽能够调节肌肉和肌肉细胞中的各种过程,并且可提供涉及肌肉功能缺陷的多种病症的有效治疗方法。在某些实施方式中,该细胞包括,例如骨骼肌或心肌细胞。
在其它方面,本发明涉及治疗和/或预防肌肉相关疾病或病理状况的方法,包括将有效量的包括编码MG29和/或MG29受体多肽、同源物、片段或其衍生物的核酸,与药物可接受载体(或称药用载体)组合的组合物给药于个体,其中该组合物对于治疗和/或预防所述的肌肉相关病理或状况是有效的。在某些实施方式中,肌肉相关的病理或状况包括疲劳、萎缩、恶病质、少肌症、肌营养不良、心脏缺血、心力衰竭、老化相关的疲劳或衰退、COPD、伤口愈合、离子通道病和其组合。
在本文所述的任意方法中,本发明的核酸或多肽可以通过下文更详细介绍的任意药物可接受的方式和药物可接受的途径被传递或给药。例如,本发明的包括核酸和/或多肽的组合物可全身传递或直接给药于细胞或组织,用于治疗和/或预防细胞膜损伤。在某些其它的实施方式中,本发明的核酸和/或多肽包括载体部分,其提高生物药效率,提高药物半衰期,将治疗剂靶向于特殊的细胞或组织类型或其组合。
在其它方面,本发明包括调节MG29和/或MG29受体的蛋白质表达、活性或转录的方法。在某些实施方式中,该方法包括试管内、体内或活体外将编码MG29多肽或MG29受体的重组核酸给药于细胞或组织。如下文详细讨论的,重组核酸可以是顺反子,即在单独的开放式阅读框(ORF)中包括需要的编码序列;或其可含有一个或多个内含子序列。在某些其它的实施方式中,该方法包括将能够特异性杂交编码MG29和/或MG29受体多肽的核酸的重组核酸在试管内、体内或活体外给药于细胞或组织。重组核酸还可整合到载体核酸中,例如,质粒、病毒载体、人造染色体等。在其它的实施方式中,考虑到了包括重组MG29或MG29受体编码核酸的载体。本发明的核酸还包括一个或多个可操作地连接于编码核酸的转录或复制调控元件、选择标记或翻译修饰序列。
在一方面,本发明提供了与SEQ ID NOS:20-26中公开的任意核酸具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%一致性的编码MG29多肽的分离的核酸。在某些实施方式中,本发明的分离的核酸分子在严格的条件下会与与包括MG29核酸序列的蛋白质编码序列的核酸分子互补的核酸序列杂交。本发明还包括编码MG29多肽,或片段、同源物、类似物、融合蛋白、伪肽、模拟肽或其衍生物的分离核酸。例如,核酸可编码与包括SEQ ID NO:1-19的氨基酸序列的多肽具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%一致性的多肽。核酸可以是,例如,基因组DNA片段或包括SEQ ID NO:20-26中任一个的核酸序列的cDNA分子。
在另外一个方面,本发明包括检测样品中MG29或MG29受体核酸或多肽存在的方法。在该方法中,样品接触在可以使试剂和核酸或多肽之间形成复合物的条件下,分别选择性结合于目标核酸或多肽的检测剂(例如,核酸探针、抗体或小分子)。如果存在的话,检测到该复合物,从而识别样品中的MG29或MG29受体核酸或多肽。本发明的方法还可用于根据MG29或MG29受体核酸或多肽的表达,识别特异性的细胞或组织类型。
在某些其它的实施方式中,本发明包括编码包括“标签”或指示物部分和MG29或MG29受体部分的融合蛋白的核酸,以及同源融合蛋白。在某些方面中,标签或指示物部分可以是适用于纯化目的的肽,例如,FLAG标签、6xHis标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)标签等。在其它方面,标签肽包括适合于提供信号的肽,如抗体抗原决定簇或荧光肽。仍然是另外一个方面包括MG29或MG29受体与适合于调节亚细胞定位或穿过细胞膜转移的肽的融合,例如HIV病毒的TAT融合蛋白,从而有助于细胞穿透或改变细胞定位标签而将MG29或MG29受体结合于特殊的细胞器。
此外,本发明涉及核酸,包括以MG29或MG29受体核酸为目标的干扰核酸。例如,本发明以核酸分子为特征,如诱骗RNA、dsRNA、siRNA、shRNA、microRNA、适体和/或反义核酸分子,其下调编码MG29或MG29受体蛋白的序列的表达。在另一方面,本发明的核酸分子具有核酸内切酶的活性或者是核酸酶复合物的成分,***具有MG29或MG29受体核酸序列的RNA。在任意的干扰核酸的实施方式中,核酸分子包括互补于具有MG29或MG29受体核酸序列的RNA的12个至100个碱基。在另一实施方式中,核酸分子包括与具有MG29或MG29受体核酸序列的RNA互补的14个至24个碱基。在本文所述的任意实施方式中,可通过所属领域中熟知的方法化学合成核酸分子。一些参考文献描述了产生RNA的有用方法和方式,包括:6900187、6383808、7101991、7285541、7368436、7022828;其通过引用结合到本文中。
“反义核酸”表示通过RNA-RNA或RNA-DNA或RNA-PNA(蛋白核酸;Egholm et al.,1993,Nature 365,566)相互作用的方式结合于目标RNA并且改变目标RNA活性的非酶核酸分子(回顾见Stein and Cheng,1993Science 261,1004 and Woolf et al.,U.S.Pat.No.5,849,902)。一般,反义分子沿着反义分子的单个连续(contiguous)序列互补于目标序列。但是,在某些实施方式中,反义序列可结合于底物,从而底物分子形成环或发夹,和/或反义分子可结合从而反义分子形成环或发夹。因此,反义分子可互补于两个(甚至更多个)非连续的底物序列,或两个(甚至更多个)反义分子的非连续序列部分可互补于目标序列,或两者皆有。为了回顾目前的反义策略,见Schmajuk et al.,1999,J.Biol.Chem.,274,21783-21789;Delihas et al.,1997,Nature,15,751-753;Stein et al.,1997,Antisense N.A.Drug Dev.,7,151;Crooke,2000,Methods Enzymol.,313,3-45;Crooke,1998,Biotech.Genet.Eng.Rev.,15,121-157,Crooke,1997,Ad.Pharmacol,40,1-49,其全部内容通过引用结合到本文中作为参考。此外,反义DNA可被用于通过DNA-RNA相互作用靶向于RNA,从而激活RNase H,其消化双股中的目标RNA。反义寡核苷酸可包括一个或多个RNAse H激活区,其能够激活RNAse H裂解目标RNA。可化学合成反义DNA或通过使用单链DNA表达载体或其等同物来表达反义DNA。
长双链RNA(dsRNA;通常>200nt)可被用于沉默各种生物和细胞类型中(例如,蠕虫、果蝇和植物)的目标基因的表达。通过引入,长dsRNA进入通常被称为RNA干扰(RNAi)途径的细胞途径。首先,dsRNA被称为Dicer的类似于RNase III的酶加工成20-25个核苷酸(nt)的小干扰RNA(siRNA)(起始步骤)。然后,siRNA装配成被称为RNA诱导沉默复合物(RISC)的含有核糖核酸内切酶的复合物(在该过程中解链)。siRNA链随后引导RISC来与RNA分子互补,其中它们裂解和破坏同源RNA(效应(effecter)步骤)。同源RNA的裂解发生在siRNA链结合的区域中部的附近。在哺乳动物细胞中,长dsRNA的引入(>30nt)开始强抗病毒反应,例证为非特异性蛋白质合成的抑制和RNA降解。但是,可通过引入或表达siRNA来避开哺乳动物抗病毒反应。
将dsRNA注射入并转染进细胞和生物已成为传递siRNA的主要方法。虽然沉默效应持续几天并且确实表现为转移给子代细胞,但最终会减小。但是,近来,多个小组已发展了在瞬时或稳定转染的哺乳动物细胞中持续表达siRNA的表达载体(参见,例如Brummelkamp TR,Bernards R,and Agami R.(2002).A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.Science 296:550-553;Lee NS,Dohjima T,Bauer G,Li H,Li M-J,Ehsani A,Salvaterra P,and Rossi J.(2002).Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells.Nature Biotechnol.20:500-505;Miyagishi M,and Taira K.(2002).U6-promoter-driven siRNAs with four uridine 3′overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells.Nature Biotechnol.20:497-500;Paddison PJ,Caudy AA,Bernstein E,Hannon GJ,and Conklin DS.(2002).Short hairpin RNAs(shRNAs)induce sequence-specific silencing in mammalian cells.Genes & Dev.16:948-958;Paul CP,Good PD,Winer I,and Engelke DR.(2002).Effective expression of small interfering RNA in human cells.Nature Biotechnol.20:505-508;Sui G,Soohoo C,Affar E-B,Gay F,Shi Y,Forrester WC,and Shi Y.(2002).A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(6):5515-5520;Yu J-Y,DeRuiter SL,and Turner DL.(2002).RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(9):6047-6052,将其全部内容通过引用结合的本文中作为参考)。
“双链RNA”或“dsRNA”表示与能够激活降解相应的基因的信使RNA转录物的细胞酶的预定基因序列相匹配的双链的RNA。这些dsRNA被称为短干扰RNA(siRNA),可被用于抑制基因表达(参见,例如Elbashir et al.,2001,Nature,411,494-498;and Bass,2001,Nature,411,428-429)。本文所用的术语“双链RNA”或“dsRNA”表示能够进行RNA干扰(RNAi),包括短干扰RNA(siRNA)的双链RNA分子,参见,例如Bass,2001,Nature,411,428-429;Elbashir et al.,2001,Nature,411,494-498;和Kreutzer et al.,国际PCT公开第WO 00/44895号;Zernicka-Goetz et al.,国际PCT公开,第WO 01/36646号;Fire,国际PCT公开,第WO 99/32619号;Plaetincket al.,国际PCT公开,第WO 00/01846号;Mello和Fire,国际PCT公开第WO 01/29058号;Deschamps-Depaillette,国际PCT公开第WO 99/07409号;和Li et al.,国际PCT公开第WO 00/44914号。
使用所属领域中已知的方案合成寡核苷酸(例如,反义、GeneBlocs),如Caruthers et al.,1992,Methods in Enzymology 211,319,Thompson et al.,国际PCT公开第WO 99/54459号,Wincott et al.,1995,Nucleic Acids Res.23,2677 2684,Wincott et al.,1997,Methods Mol.Bio.,74,59,Brennan et al,1998,Biotechnol Bioeng.,61,33 45,and Brennan,美国专利第6,001,311号所描述的。所有这些参考文献都通过引用结合到本文中。在非限定性实例中,在394 Applied Biosystems,Inc.的合成仪上进行小规模的合成。或者本发明的核酸分子可通过分别合成并且合成后连接在一起,例如通过连接(ligation)(Moore et al.,1992,Science 256,9923;Draper et al.,国际PCT公开第WO 93/23569号;Shabarova et al.,1991,Nucleic Acids Research 19,4247;Bellon et al.,1997,Nucleosides & Nucleotides,16,951;Bellon et al.,1997,Bioconjugate Chem.8,204)。
在一个实施方式中,本发明涉及通过上调编码MG29或MG29受体多肽的基因的表达、转录和/或活性来治疗或预防肌肉相关的病理或状况的方法。在一个实施方式中,用核酸分子的抑制或下调优选是低于在具有无活性或减弱的、能够结合于目标RNA上相同位点的分子的情况下观察到的水平。在另一实施方式中,用反义寡核苷酸的抑制或下调优选是低于在,例如具有错义(scrambled)序列或具有错配的寡核苷酸的存在下观察到的水平。在另一实施方式中,在核酸分子的存在的情况下通过本发明的核酸分子的MG29或MG29受体基因的抑制和下调要高于其不存在的情况。
在某些方面,本发明涉及诊断寡核苷酸和诊断寡核苷酸系列,对于其在个体的健康状况和个体响应于核苷酸序列的RNA或蛋白质产物表达之间存在相关性。在一些例子中,只有一个寡核苷酸是这样的检测所必需的。可通过能够检测RNA或蛋白质产物表达或多态性的方法识别诊断寡核苷酸系列的成员,包括但是不限于差异表达筛选、PCR、RT-CR、SAGE分析、高通量测序、微阵列、液体或其它阵列、蛋白质检测(例如,western印迹法、蛋白质组学、质谱和本文所述的其它方法)和数据挖掘方法,如本文进一步描述的。
在本文的情况下,根据熟知的分子生物学技术来操作核酸和/或蛋白质。在例如Ausubel et al.Current Protocols in Molecular Biology (supplemented through 2000)John Wiley & Sons,New York(″Ausubel″);Sambrook et al.Molecular Cloning-A Laboratory Manual(2nd Ed.),Vol.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989(″Sambrook″),和Berger and Kimmel Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology volume 152Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.(″Berger″)中描述了多个这样程序的详细方案。
下文中提供了关于本发明的示例性核酸的各个方面和实施方式的描述。但是,该各个方面和实施方式也是针对于编码其它MG29或MG29受体蛋白的同源物、直系同源物和旁系同源物的基因,和基因,并且包括所有的亚型、拼接变体和多态性。可使用对于MG29或MG29受体核酸或基因描述的方法来分析那些其它基因的目标位点。因此,可如本文所述的进行其它基因的抑制和这样的抑制的效应。
本发明的某些方面包括通过一种或多种DNA分子检测基因表达或多态性的方法,其中一种或多种DNA分子具有检测对应于序列表(参见表1和2)中描述的寡核苷酸的基因表达的核苷酸序列。在一个方式中,寡核苷酸检测差异表达的基因表达。基因表达***可以是候选物库、诊断试剂、诊断寡核苷酸系列或诊断探针系列。DNA分子可以是基因组DNA、RNA、蛋白质核酸(PNA)、cDNA或合成寡核苷酸。遵循本文所教述的程序,可识别分析基因表达或多态性的感兴趣的序列。这样的序列可预测疾病状态。已识别了与疾病严重性相关的多态性。(参见Zhong et al.,Simultaneous detection of microsatellite repeats and SNPs in the macrophage migration inhibitory factor gene by thin-film biosensor chips and application to rural field studies.Nucleic Acids Res.2005 Aug 2;33(13):e121;Donn et al.,A functional promoter haplotype of macrophage migration inhibitory factor is linked and associated with juvenile idiopathic arthritis.Arthritis Rheum.2004May;50(5):1604-10;所有这些以其全部内容引用到本文中作为参考用于所有目的)。如一般技术人员会理解的,MG29基因多态性与肌肉功能失调相关,因此可用作本发明的方法的诊断标记,可出现在MG29基因的任意核酸区或调控区。识别和监控多态性的技术在所属领域中是已知的,并且在Wohlgemuth的美国专利第6,905,827号中进行了详细的讨论,其通过引用结合到本文中作为参考用于所有目的。
本发明的核酸分子单独地或与其它药物组合或协同地用于治疗上文讨论的疾病或状况。例如,如对所属领域的一般技术人员来说显而易见的,可单独或与一种或多种药物组合在适合治疗的条件下治疗主体(subject,受治疗者),或可治疗其它合适的细胞。
在另外一个方面,本发明包括药用组合物,其包括治疗或预防有效量的治疗剂和药用载体。治疗剂可以是核酸,例如MG29或MG29受体核酸,例如肽核酸、cDNA或RNA,如,例如小抑制RNA;包括MG29或MG29受体部分的多肽;或对MG29或MG29受体多肽特异性的抗体。在其它方面中,本发明包括在一个或多个容器中的治疗或预防有效量的这种药物组合物。本发明还包括的是寡核苷酸,例如包括MG29或MG29受体核酸的至少6个连续核苷酸的寡核苷酸或所述寡核苷酸的互补物。
本发明的核酸分子可被广泛修饰,从而通过抗核酸酶基团的修饰提高稳定性,例如2’-氨基、2’-C-烯丙基、2’-氟、2’-O-甲基、2’-H(回顾见Usman and Cedergren,1992,TIBS 17,34;Usman et al.,1994,Nucleic Acids Symp.Ser.31,163)。
虽然通过磷硫酰、磷硫酰和/或5’-甲基磷酸键的寡核苷酸的核苷酸间连接的化学修饰提高稳定性,过多这样的修饰会造成一定程度的毒性。因此,当设计核酸分子时,这样的核苷酸间连接的量应该被降到最低。这样的连接的浓度降低可能降低毒性从而导致这些分子的效率增大和特异性提高。
提供了具有保持或提高活性的化学修饰的核酸分子。这样的核酸通常比未修饰的核酸还更抗核酸酶。核酸分子优选抗核酸酶从而作为有效的细胞内治疗剂起作用。RNA和DNA化学合成上的发展(Wincott et al.,1995Nucleic Acids Res.23,2677;Caruthers et al.,1992,Methods in Enzymology211,3-19(通过引用结合到本文中))已扩展了通过引入核苷修饰来修饰核酸分子的能力,从而如上所述提高其核酸酶稳定性。通过提供可能的组合疗法(例如,针对于不同基因的多个反义或酶核酸分子,与已知的小分子抑制剂结合的核酸分子或与分子和/或其它化学或生物分子组合的间歇疗法),本发明的核酸基分子的应用可更好地治疗疾病的发展。通过核酸分子对主体的治疗还可包括不同类型的核酸分子的组合。
在一个实施方式中,本发明的特征为具有包括一个或多个磷硫酰、二硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、吗啉、酰胺化氨基甲酸盐、羧甲基、亚氨逐乙酸酯(乙酰基酰胺化物,acetamidate)、聚酰胺、磺酸酯、磺胺、氨基磺酸盐、甲缩醛(formacetal)、硫甲缩醛和/或烷基甲硅烷基取代的磷酸酯骨架修饰的修饰核酸分子。回顾寡核苷酸骨架修饰,可参见Hunziker and Leumann,1995,Nucleic Acid Analogues:Synthesis and Properties,in Modern Synthetic Methods,VCH,331 417,和Mesmaeker et al.,1994,Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides,in Carbohydrate Modifications in Antisense Research,ACS,24 39。这些参考文献通过引用结合到本文中。可对核酸(例如反义和核酶)结构进行各种修饰从而提高这些分子的功用。例如,这样的修饰可提高保存期限、体外半衰期、生物药效率、稳定性和这样的寡核苷酸引入目标位点的方便性,包括,例如提高对细胞膜的穿透和赋予识别和结合目标细胞的能力。
给药核酸分子。在Akhtar et al.,1992,Trends Cell Bio.,2,139;和Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics,ed.Akhtar,1995中描述了核酸分子的传递方法,这两篇文献都通过引用结合到本文中作为参考。Sullivan等人的PCT WO 94/02595进一步描述了传递酶RNA分子的一般方法。可利用这些方案来传递事实上的任意核酸分子。可通过对熟悉所述领域的人已知的各种方法将核酸分子给药于细胞,包括,但不限于包裹在脂质体中、通过离子电渗疗法或通过整合到别的载体中,如水凝胶、环式糊精、生物可降解纳米胶囊和生物粘附微球。或者,可通过直接注射或通过使用灌注泵局部传递核酸/载体组合。传递的其它途径包括,但是不限定于口服(药片或药丸形式)和/或鞘内传递(Gold,1997,Neuroscience,76,1153-1158)。其它的方法包括使用各种运输和载体***,例如,通过使用共轭结合物和生物可降解聚合物。包括CNS递送的药物递送策略的综述可见Ho et al.,1999,Curr.Opin.Mol.Ther.,1,336-343 and Jain,Drug Delivery Systems:Technologies and Commercial Opportunities,Decision Resources,1998 and Groothuis et al.,1997,J.NeuroVirol.,3,387-400。
本发明的分子可被用作药剂。药剂预防、抑制主体的疾病出现,或治疗疾病(一定程度减轻症状,优选所有症状)。已知一些以核酸为基础的治疗方法,在Patil et al.,AAPS Journal,2005;7(1):E61-77中进行了讨论,其全部内通过引用结合到本文中作为参考。
本发明的带负电荷的多核苷酸(例如,RNA、DNA或蛋白质)可通过任意标准方法被给药于并引入主体,具有或不具有稳定剂、缓冲剂等从而形成药用组合物。当理想的是使用脂质体传递机制,可遵循形成脂质体的标准方案。还可配制本发明的组合物并且被用作口服的药片、胶囊或酏剂;直肠给药的栓剂;无菌溶液;注射给药的悬浮液;和所属领域已知的其它组合物。
本发明还包括所述化合物的药物可接受配方。这些配方包括上述化合物的盐,例如酸加成盐,例如盐酸盐、氢溴酸盐、乙酸盐和苯磺酸盐。
本发明的核酸分子还可以以栓剂的形式被给药,例如用于药物的口服给药或通过导尿管直接至膀胱本身。可通过将药物和合适的无刺激性的赋形剂进行混合来制备这些组合物,该赋形剂常温下是固体,但是在直肠的温度下是液体并且因此在直肠中会融化从而释放该药物。这样的材料包括可可脂、聚乙二醇。本发明的核酸分子可在无菌的介质中被非肠道给药。根据使用的介质和浓度,该药物可悬浮在或溶解在介质中。如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂的辅助剂可优选地溶解在介质中。可与载体材料组合从而产生单剂量形式的活性成分的量可根据治疗的宿主和给药的特殊模式改变。剂量单位形式通常含有约1mg至约5000mg的活性成分。应理解任意特殊患者或主体的特异性剂量水平取决于各种因素,包括使用的特异性化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、日常饮食、给药时间、给药途径和***速率、药物组合和进行治疗的特殊疾病的严重性。
或者,本发明的某些核酸分子可通过真核生物启动子在细胞中表达(例如,Izant and Weintraub,1985,Science,229,345;McGarry and Lindquist,1986,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 83,399;Scanlon et al.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88,10591 5;Kashani-Sabet et al.,1992,Antisense Res.Dev.,2,3 15;Dropulic et al.,1992,J.Virol.,66,1432 41;Weerasinghe et al.,1991,J.Virol.,65,5531 4;Ojwang et al.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,108026;Chen et al.,1992,Nucleic Acids Res.,20,4581 9;Sarver et al.,1990Science,247,1222 1225;Thompson et al,1995,Nucleic Acids Res.,23,2259;Good et al.,1997,Gene Therapy,4,45;所有这些参考文献以其全部内容通过引用结合到本文中作为参考)。所属领域的一般技术人员会认识到通过合适的DNA/RNA载体任意核酸可在真核细胞中表达。
在一个方面,本发明的特征是包括编码本发明的核酸分子中的至少一个的核酸序列的表达载体。以可以使该核酸分子被表达的方式可操作地连接编码本发明的核酸分子的核酸序列。
真核RNA聚合酶I(pol I)、RNA聚合酶II(pol II)或RNA聚合酶III(pol III)的启动子驱动核酸分子序列的转录。通过pol II或pol III启动子的转录在所有细胞中都高水平表达;特定细胞类型中的特定pol II启动子的水平取决于近旁基因调控序列(增强子、沉默子等)的性质。如果在合适的细胞中表达原核RNA聚合酶,还使用原核RNA聚合酶启动子(Elroy-Stein and Moss,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87,6743 7;Gao and Huang 1993,Nucleic Acids Res.,21,2867 72;Lieber et al.,1993,Methods Enzymol.,217,4766;Zhou et al.,1990,Mol.Cell.Biol.,10,452937)。所有这些参考文献通过引用结合到本文中作为参考。几个研究者已证实核酸分子,如由这样的启动子表达的核酶,可在哺乳动物细胞中起作用(例如,Kashani-Sabet et al.,1992,Antisense Res.Dev.,2,315;Ojwang et al.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,10802 6;Chen et al,1992,Nucleic Acids Res.,20,4581 9;Yu et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90,6340 4;L′Huillier et al.,1992,EMBO J.,11,4411 8;Lisziewicz et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,90,8000 4;Thompson et al.,1995,Nucleic Acids Res.,23,2259;Sullenger & Cech,1993,Science,262,1566)。
在另外一个方面,本发明的特征是包括编码本发明的核酸分子中的至少一个的核酸序列的表达载体,以可以使该核酸分子表达的方式。在一个实施方式中,表达载体包括a)转录起始区;b)转录终止区;c)编码至少一个所述核酸分子的核酸序列;和其中所述序列以可以使所述核酸分子表达和/或递送所述核酸分子的方式被可操作地连接到所述的起始区和所述的终止区。
在另外一个实施方式中,本发明的分离的核酸分子包括互补于MG29核酸的核苷酸序列的核酸分子。本文所用的术语“互补”表示核酸分子的核苷酸单元之间的Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对,术语“结合”表示两个多肽或化合物或相关的多肽或化合物或其组合之间的物理或化学相互作用。结合包括离子的、非离子的、范德华、疏水相互作用等。物理相互作用可以是直接或间接的。
本文所用的“片段”被定义为至少6个(连续的)核苷酸或至少4个(连续的)氨基酸的序列,长度足以使在核酸的情况下进行特异性杂交或在氨基酸的情况下进行表位的特异性识别,并且最多是小于全长序列的某些部分。
本发明的核酸或蛋白质的衍生物或类似物包括,但是不限定于包括与本发明的核酸或蛋白质基本同源的区域的分子,在各个实施方式中,为整个相同尺寸的核酸或氨基酸序列的至少约30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的一致性(优选为80%-95%的一致性),或当与其中通过所属领域已知的计算机同源程序进行比对的比对序列进行比较时,至少约30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的一致性(优选为80%-95%的一致性),或其编码核酸在严格、适度严格或低严格度条件下能够与编码本发明的蛋白质的互补序列杂交。见,例如Ausubel,et al.,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley & Sons,New York,N.Y.,1993。核酸衍生物或修饰包括通过基因替换、位点特异性突变、缺失、***、重组、修复、移动(shuffling)、核酸内切酶消化、PCR、亚克隆和相关技术。
“同源性”可自然产生,或通过一个或多个具有相关序列的核酸人工合成,或通过一个或多个核酸的修饰从而产生相关的核酸。当它们天然地或人工地起源于相同的祖序列,核酸是同源的(例如,直系同源或旁系同源)。如果未清楚描述两个核酸之间的同源性,可通过两个或多个序列之间的核酸比较来推知同源性。如果序列显示了一定程度的序列相似性,例如,在基本氨基酸结构水平上超过30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90%,可得出它们具有相同祖先的结论。基于本发明的目的,如果核酸序列相似性足以使在低严格条件下重组和/或杂交,则基因是同源的。
本文所用的“杂交”表示在低、中或高严格条件下分子仅结合、双接(duplexing)或杂交于特定的核苷酸序列,包括当该序列以复杂的混合物(例如总细胞的)DNA或RNA存在时。
此外,一般技术人员会认识到“保守突变”还包括改变、增加或缺失编码序列中的单个氨基酸或少数氨基酸的核酸的取代、缺失或增加,其中核酸的改变导致化学相似的氨基酸的取代。可互相用作保守取代的氨基酸包括以下:碱性的:精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H);酸性的:天门冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酸盐(Q);亲水的:氨基乙酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I);疏水的:苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);含硫的:甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)。此外,通过保守变异而不相同的序列通常是同源的。
对用于操作本发明的包括突变、PCR、克隆的分子生物学技术的描述包括Berger and Kimmel,GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES,METHODS IN ENZYMOLOGY,volume 152,Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.(Berger);Sambrook et al.,MOLECULAR CLONING--A LABORATORY MANUAL(2nd Ed.),Vol.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,1989,and CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,F.M.Ausubel et al.,eds.,Current Protocols,a joint venture between Greene Publishing Associates,Inc.and John Wiley & Sons,Inc.;Berger,Sambrook,and Ausubel,以及Mullis等的美国专利第4,683,202号(1987);PCR PROTOCOLS A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS(Innis et al.eds),Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.(1990)(Innis);Arnheim & Levinson(Oct.1,1990)C&EN36-47。
仍然在另一实施方式中,使用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达本发明的核酸。对于原核和真核细胞都合适的表达***见,例如Sambrook,et al.,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL.2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989的第16和17章。
多核苷酸可以是DNA分子、cDNA分子、基因组DNA分子或RNA分子。如DNA或RNA的多核苷酸可包括其中T(胸腺嘧啶脱氧核苷)还可以是U(尿嘧啶)的序列。如果多核苷酸的某一位置的核苷酸能够与反平行的DNA或RNA链的相同位置上的核苷酸形成Watson-Crick配对,则多核苷酸以及该DNA或RNA分子在该位置互相互补。当每一分子的足够量的对应位置被可互相杂交的核苷酸所占据从而影响目标过程时,该多核苷酸和DNA或RNA分子基本是互补的。
在另一实施方式中,重组哺乳动物表达载体能够优选在特殊的细胞类型中直接表达核酸(例如,组织特异性表达元件被用于表达核酸)。组织特异性调控元件在所属领域中是已知的。合适的组织特异性启动子的非限定性实例包括白蛋白启动子(肝脏特异性;Pinkert,et al.,1987.Genes Dev.1:268-277),淋巴特异性启动子(Calame and Eaton,1988.Adv.Immunol.43:235-275),尤其是T细胞受体的启动子(Winoto and Baltimore,1989.EMBO J.8:729-733)和免疫球蛋白的启动子(Banerji,et al.,1983.Cell 33:729-740;Queen and Baltimore,1983.Cell 33:741-748),神经细胞特异性启动子(例如,神经丝启动子;Byrne and Ruddle,1989.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5473-5477),胰腺特异性启动子(Edlund,et al.,1985.Science 230:912-916),和乳腺特异性启动子(例如,乳清启动子;美国专利第4,873,316号和欧洲申请公开第264,166号)。还包括发育调控启动子,例如鼠hox启动子(Kessel and Gruss,1990.Science 249:374-379)和甲胎蛋白启动子(Campes and Tilghman,1989.Genes Dev.3:537-546)。
在任意实施方式中,编码MG29或MG29受体的核酸可以存在为:一个或多个裸DNA;一个或多个被安排在合适的表达载体中的并且保持游离的核酸;一个或多个整合到宿主细胞基因组中的核酸;编码复合物成分的外源基因的修饰形式;与一个或多个的调控核酸序列组合的一个或多个核酸;或其组合。核酸可可选地包括位于5’端、3’端或在ORD内的任意位置的连接肽或融合蛋白成分,例如His-标签、FLAG-标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)-标签、荧光蛋白、GST、TAT、抗体部分、信号肽等。
本发明的核酸分子可***到载体中并且被用作基因疗法载体。可通过,例如静脉注射、局部给药(参见,例如美国专利第5,328,470号)或通过立体定位注射(参见,例如Chen,et al.,1994.Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:3054-3057)将基因疗法载体传递给主体。基因疗法载体的药用制剂可包括在可接受的稀释剂中的基因疗法载体,或可包括其中嵌入基因传递载体的缓释基质。或者,其中可通过重组细胞产生完整的基因传递载体,例如逆转录病毒载体,药用制剂可包括一种或多个产生基因传递***的细胞。药用组合物可与给药使用说明一起被包括在容器、包装或分装器中。
可通过使用所属领域中的一般技术人员熟知的标准分子生物学或遗传学方法来实现本文所述的任意实施方式。
在其它方面,本发明包括通过细胞内表达内源或外源MG29或MG29受体核酸来产生多肽的方法。在另外一个方面,本发明包括通过培养含有安排在外源调控元件(例如,启动子、增强子或阻抑序列)的上游或下游的、编码MG29或MG29受体核酸的的外源核酸的细胞来产生多肽的方法。在某些实施方式中,外源调控元件通过本领域中众所周知的同源重组、链断裂或错配修复机制被整合到宿主细胞的基因组中。
在其它方面,本发明提供了调节MG29或MG29受体多肽的活性或表达的方法,通过使包括MG29或MG29受体多肽的细胞样品接触足量的结合MG29或MG29受体多肽的化合物,MG29或MG29受体RNA结合蛋白和/或MG29或MG29受体相互作用因子,从而调节所述多肽的活性。化合物可以是,例如小分子,如核酸、肽、多肽、拟肽、碳水化合物、脂质或其它有机(含有碳的)或无机分子。如本文进一步描述的。
在某些其它方面,本发明涉及包括分离的或重组的本发明的多肽与药物可接受载体组合的组合物。该方面的某些实施方式包括含有本发明的多肽,例如MG29,与药用载体组合的治疗组合物,其中***性给予该治疗组合物,并且其中***给予的组合物有效治疗涉及骨骼肌的疾病。
在其它方面,本发明涉及包括本发明的多肽与至少一个其它的能够调节肌肉功能的作用剂(agent,药剂,剂)组合的组合物。在某些实施方式中,该作用剂通过与本发明的多肽的直接或间接相互作用来协同增效起作用,从而有助于肌肉功能或减轻肌肉相关的或其它病理。在其它实施方式中,本发明的治疗剂可包括一个或多个生物活性成分,如镇痛药、抗酸药、抗焦虑药、抗心律失常药物、抗菌药物、抗生素、抗凝血剂和溶栓、抗惊厥药、抗抑郁药、止泻药、止吐药、抗真菌剂、抗组胺药、抗高血压药、消炎药、抗肿瘤药、抗精神病药物、解热剂、抗病毒药、巴比妥类、β-阻断剂、支气管扩张剂、冷疗法、皮质类固醇、止咳药、细胞毒素、减充血剂、利尿剂、祛痰药、激素、降糖药(口服)、免疫抑制剂、轻泻剂、肌肉松弛剂、镇静剂、性激素、睡眠药物、镇静剂、维生素或其组合。
仍然在另一方面,通过本领域中通常使用的几种方法中的任一种,本发明可用于识别本发明的细胞受体或下游效应物的方法。这些包括,但不限于双杂交***、亲和纯化、与抗体或其它相互作用特异性分子的共沉淀。
本文所用的术语“MG29拮抗剂”或“MG29受体拮抗剂”等通常被用于表示能够直接或间接抑制MG29表达、翻译和/或活性;或MG29受体表达、翻译和/或活性的作用剂。本文所用的术语“MG29激动剂”或“MG29受体激动剂”通常被用于表示能够直接或间接提高MG29表达、翻译和/或活性;或MG29受体表达、翻译和/或活性的作用剂。
在其它方面,本发明涉及分离的或重组的MG29多肽或多肽复合物。MG29多肽具有与其自身以及几个其它细胞蛋白质相互作用(例如,非共价结合)并且形成复合物的能力。在本方面的实施方式中,本发明包括分离的或重组的MG29多肽、同源物、片段或其衍生物,与至少一个其它的多肽组合(例如,MG29受体),其中该组合形成蛋白质复合物,其中该复合物可用作提高肌肉功能的治疗剂,用于确定肌肉生理状况或功能的诊断标记,和/或用于筛选通过激动剂或拮抗剂与该复合物相互作用调节肌肉功能的化合物的工具。本发明还包括治疗或预防肌肉相关病理的方法,包括将有效量的具有至少一种其它的蛋白质的蛋白质复合物中的分离或重组MG29多肽给予细胞,其中该复合物能够提高肌肉功能。例如可根据标准方法使用肽合成仪来形成复合物的多肽;或通过在单个细胞中表达每个多肽;或分别在细胞或细胞裂解***中,然后分离和纯化多肽。
本发明还包括具有在SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:19中列出的序列或其功能部分的基本纯化的MG29多肽。在某些实施方式中,本发明的MG29多肽包括与人MG29多肽(SEQ ID NO.:3)的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。
本发明的特征还在于免疫选择性结合MG29、多肽、片段、同源物、类似物、伪肽、拟肽或其衍生物的抗体。因此,在其它实施方式中,本发明涉及编码MG29多肽结合蛋白、抗体多肽或其生物活性部分的分离核酸分子。
本文所用的术语“抗体”表示免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分,也就是含有特异性结合抗原(与抗原免疫相互作用)的抗原结合位点的分子,包括至少一个并优选两个的重链(H)可变区(在本文中缩写为VH)和至少一个并优选两个的轻链(L)可变区(在本文中缩写为VL)。这样的抗体包括,但不限于多克隆、单克隆、嵌合、单链、Fab、Fab’和F(ab′)2片段和Fab表达库。VH和VL区进一步被细分为被命名为“互补决定区”(″CDR″)的高度可变区,其散布于更加保守的被命名为“框架区”(FR)的区域。已精确确定了框架区和CDR的范围(参见Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242,和Chothia,C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917,其通过引用结合到本文中作为参考)。每一个VH和VL由三个CDR或四个FR构成,从氨基末端至羧基末端被排列成以下次序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。总的来说,从人获得的抗体分子涉及IgG、IgM、IgA、IgE和IgD中的任意类别,其相互差异在于分子中存在的重链的性质。某些类别还具有亚类,如IgG1、IgG2和其它。此外,在人中,轻链可以是κ(kappa)链或λ(lambda)链。本文对抗体的指示包括所有这样的类别、亚类和人抗体种类类型的指示。
可由完整多肽或含有感兴趣的肽的片段来制备抗体作为免疫剂。优选的抗原多肽片段是15-100个连续氨基酸。在一个实施方式中,该肽位于多肽的非跨膜结构域,例如在胞外或胞内结构域。示例性抗体或抗体片段结合于可从胞外环境接触的并且改变蛋白质功能性的抗原决定簇。在某些实施方式中,本发明包括识别MG29和/或MG29受体蛋白、变体、部分和/或其组合的一个或多个抗原决定簇并且对其具有特异性的抗体。在可选的实施方式中,本发明的抗体可靶向于并且干扰MG29/MG29受体相互作用。
单克隆抗体的制备在本领域中是熟知的;参见,例如Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,第726页(Cold Spring Harbor Pub.1988),USPNs:Cabilly的6331415;Carter的6407213和6639055;6562622;6693176;6881557;Morrison的5807715;Winter的5225539;Queen的5585089,5693761,6180370,和7022500;Doyle的20070202105,其全部通过引用结合到本文中作为参考。可通过本领域中熟知的技术,用包括抗原的组合物注射小鼠或兔子,通过去除血清样本来证实抗体产生,移除脾脏从而获得B淋巴细胞,将淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合从而产生杂交瘤细胞,克隆杂交瘤细胞,选择可产生抗抗原的抗体的阳性克隆,和从杂交瘤细胞培养物分离抗体。可通过本领域中熟知的技术从杂交瘤细胞培养物中分离和纯化单克隆抗体。
在其它实施方式中,可通过例如噬菌体显示或通过组合方法来重组产生抗体。噬菌体显示和组合方法可被用于分离结合MG29多肽或MG29结合蛋白或其片段的重组抗体(如,例如Ladner et al.U.S.Pat.No.5,223,409;Fuchs et al.(1991)Bio/Technology 9:1370-1372;Hay et al.(1992)Hum Antibod Hybridomas 3:81-85;Huse et al.(1989)Science 246:1275-1281;Clackson et al.(1991)Nature 352:624-628;Gram et al.(1992)PNAS89:3576-3580中所述的)。还可使用携带人免疫球蛋白基因而不是鼠***的转基因小鼠产生人单克隆抗体。用感兴趣的抗原免疫的转基因小鼠的脾细胞被用于产生分泌对人蛋白的抗原决定簇具有特异性亲和力的人mAbs的杂交瘤细胞(参见,例如Wood et al.International Application WO91/00906;Lonberg,N.et al.1994 Nature 368:856-859;Green,L.L.et al.1994 Nature Genet.7:13-21;Morrison,S.L.et al.1994 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855)。对于本发明的复合物成分或复合物本身的治疗有用的抗体可以来源于“人源化”或“超人源化”的单克隆抗体。可通过将来自小鼠免疫球蛋白的重可变链和轻可变链的小鼠互补决定区(CDR)转染进人的可变区,将人的残基取代到鼠对应部分的框架区中来产生人化的单克隆抗体。
使用源于人源化单克隆抗体的抗体成分消除了与鼠恒定区的免疫原性相关的潜在问题。在Jones et al.,Nature 321:522,1986和Singer et al.,J.Immunol.150:2844,1993;Wu T.T.and Kabat,E.A.(1970)J.Exp.Med.,132:,211-250;and Johnson G.,Wu,T.T.and Kabat,E.A.(1995)In Paul,S.(ed.),Antibody Engineering Protocols.Humana Press,pp.1-15中可以找到产生人源化单克隆抗体的技术,其通过引用结合到本文中作为参考。抗体还可来源于从组合免疫球蛋白库分离的人抗体片段;参见,例如Barbas et al.,Methods:A Companion to Methods in Enzymology 2,119,1991。此外,可通过拼接具有合适的抗原特异性的小鼠抗体分子的基因和具有合适的生物特异性的人抗体分子的基因来获得嵌合抗体;参见,例如Takeda et al.,Nature 314:544-546,1985。嵌合抗体是这样的抗体,其中不同的部分来源于不同的动物物种。
抗个体基因型技术可被用于产生模拟抗原决定簇的单克隆抗体。针对于第一单克隆抗体制造的抗个体基因型单克隆抗体在高度可变区会具有结合结构域,其是被第一单克隆抗体结合的抗原决定簇的“影像”。或者,用于产生单链抗体的技术可被用于产生单链抗体。通过以氨基酸桥将Fv区的重链和轻链片段连接起来形成单链抗体,从而产生单链多肽。可通过所属领域熟知的技术来产生识别特异性抗原决定簇(例如胞外抗原决定簇)的抗体片段。这样的片段包括通过蛋白质水解消化产生的Fab片段,和通过还原二硫键产生的Fab片段。当用于免疫治疗时,单克隆抗体、其片段或两者同时可以是未标记的或标记了治疗剂。通过本领域中熟知的技术,这些作用剂可直接或间接结合于单克隆抗体,并且包括如药物、放射性同位素、凝集素和毒素这样的作用剂。
单克隆抗体给药的剂量范围大到足以产生理想的效果,并且会随着年龄、状况、体重、性别、年龄和被治疗状况的程度进行变化,本领域的普通技术人员可容易地确定该剂量范围。剂量可以是约0.1mg/kg至约2000mg/kg。可静脉内、腹膜内、肌肉内和/或皮下给予该单克隆抗体。
在本发明的某些实施方式中,抗原肽包括的至少一个抗原决定簇是位于蛋白质表面上的MG29多肽或MG29结合蛋白的区域,例如亲水区域。蛋白质序列的疏水性分析会显示多肽的哪个区域是尤其亲水的,因此可能编码用于靶向抗体产生的表面残基。作为靶向抗体产生的方法,可通过所属领域中任意熟知的方法产生显示疏水性和亲水性区域的亲水性曲线图,包括,例如Kyte Doolittle或Hopp Woods方法,通过或未通过傅里叶转换。参见,例如Hopp and Woods,1981,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 78:3824-3828;Kyte and Doolittle 1982,J.Mol.Biol.157:105-142,每一个都以其全文被引用到本文中作为参考。在本文中还提供了对抗原蛋白中一个或多个结构域,或衍生物、片段、类似物或其同源物具有特异性的抗体。本发明的蛋白质,或衍生物、片段、类似物、同源物或其直系同源物可被用做产生免疫特异性结合这些蛋白成分的抗体的免疫原。
人源抗体
完全的人源抗体主要涉及其中轻链和重链的完整序列(包括CDR)都来源于人基因的抗体分子。这样的抗体在本文中被命名为“人源抗体”或“完全的人源抗体”。可通过三体杂交瘤技术来制备人源单克隆抗体;人B细胞杂交瘤细胞技术(见Kozbor,et al.,1983 Immunol Today 4:72)和EBV杂交瘤技术从而产生人源单克隆抗体(参见Cole,et al.,1985 In:MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96)。可在本发明的应用中使用人源单克隆抗体,并且可使用人杂交瘤细胞(参见Cote,et al.,1983.Proc Natl Acad Sci USA 80:2026-2030)或通过体外以Epstein Barr病毒转化人B细胞(参见Cole,et al.,1985 In:MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96)产生人源单克隆抗体。
此外,还可使用其它的技术来产生人源抗体,包括噬菌体显示库(Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.227:381(1991);Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581(1991))。同样,可通过将人免疫球蛋白位点引入转基因动物(例如其中内源免疫球蛋白基因已部分或完全失活的小鼠)来制造人源抗体。通过激发,可观察到人源抗体的产生,其在各个方面非常类似于在人中所见到的,包括基因重排、组装和抗体谱。例如,在美国专利第5,545,807号;第5,545,806号;第5,569,825号;第5,625,126号;第5,633,425号;第5,661,016号,和在Marks et al.(Bio/Technology,10:779-783(1992));Lonberg et al.(Nature,368:856-859(1994));Morrison(Nature,368:812-13(1994));Fishwild et al,(Nature Biotechnology,14:845-51(1996));Neuberger(Nature Biotechnology,14:826(1996));和Lonberg and Huszar(Intern.Rev.Immunol.,13:65-93(1995))中描述了该方法。
还可使用转基因非人动物来产生人源抗体,其是被修饰了的从而产生完全的人源抗体而不是对抗原的激发做出反应的动物内源抗体。编码非人宿主内的免疫球蛋白重链和轻链的内源基因被失活(失去能力),编码人免疫球蛋白的重链和轻链的活性位点被***到宿主基因组中。例如使用含有必需的人DNA片段的酵母人工染色体来整合人基因。然后,通过与含有少于完整补充(full complement)的修饰的中间转基因动物杂交,从而获得作为后代的具有所有需要的修饰的动物。这样的非人动物的优选实施方式是小鼠,并且如PCT公开的WO 96/33735和WO 96/34096公开的被命名为XenomouseTM。
本发明的抗体的治疗有效量通常涉及实现治疗目标所需要的量。如上所述,这可以是抗体和其靶抗原(其在特定情况下,干扰目标的功能,在其它情况下,提高生理反应)的结合相互作用。给药所需要的量还取决于抗体对其特异性抗原的结合亲和性,而且还取决于给药的抗体从其所给药的其它主体的自由体积被耗尽的速率。作为非限定性实施例,本发明的抗体或抗体片段的治疗有效剂量的一般范围是约0.1mg/kg体重至约500mg/kg体重。一般的剂量频率的范围可以是,例如,每天两次至一周一次。
特异性结合本发明的蛋白的抗体,以及通过本文公开的筛选检测识别的其它分子可以以药用组合物的形式被给药,从而治疗各种疾病。例如,在Remington:The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed.(Alfonso R.Gennaro,et al.,editors)Mack Pub.Co.,Easton,Pa.:1995;Drug Absorption Enhancement:Concepts,Possibilities,Limitations,和Trends,Harwood Academic Publishers,Langhorne,Pa.,1994;和Peptide And Protein Drug Delivery(Advances In Parenteral Sciences,Vol.4),1991,M.Dekker,New York中提供了涉及制备这样的组合物的原则和考虑,以及成分选择的指导。活性成分还可包裹在通过,例如凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中,例如分别为胶状药物传递***(例如,脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或粗乳液中的羟甲基纤维素或凝胶-微胶囊和聚甲基丙烯酸甲酯微胶囊。被用于体内给药的配方必须是无菌的。这可通过无菌过滤膜的过滤被方便地实现。
可制备缓释制剂。合适的缓释制剂的实施例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半渗透性基质,其基质是塑型制品的形式,例如薄膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如,聚甲基丙烯酸-2-羟基乙酯或聚乙烯醇)、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物,非降解的乙烯-醋酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物,如LUPRON DEPOTTM(乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体),和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然如乙烯-醋酸乙烯和乳酸-乙醇酸的聚合物能够释放分子超过100天,某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。
ELISA检测
用于检测被分析蛋白的作用剂是能够结合被分析蛋白的抗体,优选是具有可检测标记的抗体。抗体可以是多克隆的,更优选是单克隆的。可使用完整的抗体,或抗体片段(例如,Fab或F(ab)2)。针对探针或抗体的术语“标记的”是要包括通过将可检测物质结合于(即,物理连接)探针或抗体的直接标记探针或抗体,以及通过与直接标记的其它试剂的反应的间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的二级抗体检测一级抗体,和使用生物素末端标记的DNA探针从而可以用荧光标记的抗生蛋白链菌素检测它。术语“生物样品”包括从主体分离的组织、细胞或生物液,以及主体内存在的组织、细胞和液体。因此,包括在术语“生物样品”应用中的是血液或包括血清、血浆或淋巴液的血液组分或成分。也就是,本发明的检测方法可被用于检测体外和体内生物样品中的被分析的mRNA、蛋白质或基因组DNA。例如,体外检测被分析的mRNA的技术包括Northern杂交和原位杂交。体外检测被分析的蛋白质技术包括免疫酶联检测(ELISA)、Western印迹法(blot)、免疫沉淀和免疫荧光。体外检测被分析的基因组DNA技术包括Southern印迹法。在例如《ELISA:Theory and Practice:Methods in Molecular Biology》,Vol.42,J.R.Crowther(Ed.)Human Press,Totowa,N.J.,1995;″Immunoassay″,E.Diamandis and T.Christopoulus,Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.,1996;和《Practice and Thory of Enzyme Immunoassays》,P.Tijssen,Elsevier Science Publishers,Amsterdam,1985中描述了进行免疫检测的程序。此外,体内检测被分析的蛋白质的技术包括将标记的抗被分析蛋白抗体引入主体。例如,该抗体可标记了放射性标记,通过腔内或透皮的标准成像技术(单独的或与效应细胞一起)可检测该放射性标记在主体内的存在和位置。
宿主细胞
本文所用的“细胞”被以其通常的生物学意义使用,不是指完整多细胞生物。例如,细胞可以是试管内、体内或活体外的,例如细胞培养物中的,或存在于多细胞生物中,包括,例如鸟、植物或动物,如灵长目、人、牛、羊、猿、猴子、猪、狗、小鼠、大鼠和猫的哺乳动物。细胞可以是原核的(例如,细菌细胞)或真核的(例如,哺乳动物或植物细胞)。术语“宿主细胞”包括可被用于运载异源或外源核酸,或表达异源或外源(即外来的)核酸编码的肽或蛋白质的细胞。宿主细胞可以含有未在原始形式(未转化的)细胞中发现的基因,其中基因被修饰并通过人工方法被重新引入细胞的原始形式细胞中发现的基因,或被人工修饰而未从细胞去除该核酸的细胞的外源核酸。宿主细胞可以是真核的或原核的。在如BERGEY′S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY,Vol.1,N.R.Krieg,ed.,Williams and Wilkins,Baltimore/London(1984)的文献中可以找到培养细菌必需的一般生长条件。“宿主细胞”还可以是其中外源基因或启动子或两者都被修饰从而产生本发明的多肽成分中的一个或多个。
可通过所属领域的一般技术人员熟知的常规技术进行以重组DNA转化宿主细胞。“转化”表示在引入、修饰和/或提取核酸物质(例如,DNA或RNA)之后在细胞中引起的永久的或暂时的遗传变化。
当宿主是原核生物时,如大肠杆菌,可在指数生长阶段之后收获细胞并通过所述领域中熟知的程序以CaCl2法处理细胞来制备能够摄入DNA的感受态细胞。或者可使用MgCl2、RbCl、脂质体或脂质体-蛋白质结合物。还可在形成宿主细胞的原生质体或通过电穿孔之后进行转化。这些实例未限定本发明;存在许多所属领域的一般技术人员熟知的用于转染宿主细胞的技术,这些技术被考虑在本发明的范围内。
当宿主是真核生物时,这样的转染DNA的方法包括钙磷共沉淀、如微注射的常规机械手段、电穿孔、***脂质体中包入的质粒或病毒载体,以及可使用所属领域中已知的其它方法。真核细胞可以是酵母细胞(例如,酿酒酵母)或者可以是哺乳动物细胞,包括人细胞。对于长期、高产重组蛋白,优选稳定表达。
在另外一个方面,本发明包括包含本发明的任意MG29和/或MG29受体核酸的宿主细胞。在某些实施方式中,宿主细胞包括含有重组MG29和/或MG29受体核酸、或互补于MG29或MG29受体编码核酸的核酸、或调控外源MG29或MG29受体基因表达的外源或重组启动子的载体。
在另外一个方面,本发明包括转基因生物,例如含有至少一个重组MG29或MG29受体等位基因;或包括MG29或MG29受体转基因;或包括含有重组MG29或MG29受体核酸的载体;或包括MG29或MG29受体核酸或互补于MG29或MG29受体编码核酸或其部分的核酸前体的小鼠。在某些实施方式中,转基因生物可包括可操作地连接于诱导启动子/增强子,和/或组织特异性启动子(例如,肌肉特异性启动子)的重组MG29或MG29受体核酸。
仍然在另一方面,本发明包括确定主体(如,人主体)中肌肉相关病理或肌肉功能失调相关的疾病的存在或倾向。该方法包括通过以对MG29或MG29受体多态性或突变具有特异性的检测探针来处理个体的组织样品,并且检测探针/目标复合物的形成(其中复合物的形成表示存在特殊基因型)来检测MG29或MG29受体基因的基因型。或者,测定主体测试样品中的MG29或MG29受体核酸或多肽的量,并将该测试样品中的多肽的量与对照样品中的MG29或MG29受体核酸或多肽的存在量进行比较。与对照样品相比的测试样品中的水平变化显示出主体中疾病的存在或倾向。优选,倾向包括,例如以上公开的疾病和失调和/或类似的其它病理和失调。而且,本发明的新多肽的表达水平被用于筛选各种失调和确定特定失调的阶段的方法中。
在另外一个方面,本发明涉及诊断或监控失调或疾病或发展的方法,包括通过检测MG29或MG29受体核酸、蛋白或两者的存在;MG29或MG29受体核酸、蛋白或两者的转录;或MG29或MG29受体核酸、蛋白或两者的表达水平来检测与疾病相关的MG29或MG29受体基因的核苷酸多态性。
在实施方式中,本发明包括筛选调节MG29或MG29受体中的至少一个的活性、蛋白质水平或基因表达的作用剂的方法,包括提供细胞或组织;测量外源MG29或MG29受体中的至少一个的活性、蛋白质水平或基因表达量从而建立对照值;使测试作用剂接触细胞或组织;测量或检测MG29或MG29受体中至少一个的活性,MG29或MG29受体蛋白的量,或者MG29或MG29受体基因表达量从而建立测试值;比较对照值和测试值,其中测试值和对照值之间所观察到的变化表示作用剂能够调节MG29或MG29受体的至少一个的活性、蛋白质水平或基因表达。
本发明还包括筛选失调或综合症(例如,上文公开的疾病和失调和/或相似的其它病理和失调)的调节剂的方法。该方法包括使测试化合物接触MG29或MG29受体核酸或多肽,确定该测试化合物是否结合于所述的MG29或MG29受体核酸或多肽。测试化合物对MG29或MG29受体核酸或多肽的结合表示该测试化合物是活性、转录、翻译或上述失调或综合症的潜在性或倾向的调节剂。
在其它方面,本发明涉及通过使MG29或MG29受体中的至少一个的核酸或多肽接触测试化合物;并测量该测试化合物的结合和/或肌肉功能的效果(例如,E-C偶联;Ca++移动、收缩强度、疲劳等)来筛选调节肌肉功能的化合物。
可用于本发明的方法的潜在化合物库是广为已知的并且容易获得。此外,本文描述了用于测量作用剂对MG29或MG29受体多肽的结合,MG29或MG29受体蛋白的量,和/或MG29或MG29受体基因转录和/或翻译水平的技术。可常规使用其它的可用于操作本发明的方法,并且可进行改造适合于在使用所属领域的常规实验方法的权利要求的方法中的应用。
干细胞应用
在另外一个方面,本发明包括使用宿主细胞和根据本发明的方法修饰的干细胞的治疗方法,干细胞可被用于移植和/或过继细胞疗法。在该方面的一个实施方式中,从宿主分离干细胞,例如肌肉干细胞,其中干细胞能够分化成肌细胞,并且分离的干细胞被修饰从而其显示出被调节的,例如,提高的MG29或MG29受体活性,MG29或MG29受体基因表达,或被调节的MG29或MG29受体信号。在优选的实施方式中,干细胞接触作用剂,例如MG29或MG29受体多肽,MG29或MG29受体核酸或提高肌肉细胞内的MG29或MG29受体信号级联放大的作用剂。然后可体外培养被修饰的干细胞,随后给药于需要其的个体。
已知各种用于分离、培养和操作能够分化成骨骼肌的干细胞的方法。见,例如Stavropoulos M.E.,et al.Curr Protoc Stem Cell Biol.2009Jun;Chapter 1:Unit 1F.8.;Shabbir A.,et al.Transplantation.2009 May15;87(9):1275-82;Lee A.S.,et al.Stem Cells.2009 May;27(5):1098-108;Rudnicki M.A.,Cold Spring Harb Symp Quant Biol.2008;73:323-31;Scime A.,et al.Front Biosci.2009 Jan 1;14:3012-23;Tanaka K.K.,et al.,Cell Stem Cell.2009 Mar 6;4(3):217-25;Schabort E.J.,et al.,Stem Cells Dev.2009Jul-Aug;18(6):813-30;Cerletti M.,et al.Cold Spring Harb Symp Quant Biol.2008;73:317-22;Fan J.,et al.Tissue Eng Part B Rev.2009 Mar;15(1):75-86;Collins C.A.,et al.Methods Mol Biol.2009;482:319-30;Quintero A.J.,et al.Clin Spots Med.2009 Jan;28(1):1-11;Okada M.,et al.J Am Coll Cardiol.2008 Dec 2;52(23):1869-80;Lagha M.,et al.Cold Spring Harb Symp Quant Biol.2008;73:307-15;Luchessi A.D.,et al.J Cell Physiol.2009Mar;218(3):480-9。
治疗方法
在某些其它方面,本发明涉及与治疗肌肉相关的病理和状况的组合物和方法。在某些示例性实施方式中,本发明包括,例如将有效量的本发明的治疗组合物给药于个体从而治疗和/或预防肌肉相关的病理和状况;治疗和/或预防年龄相关的肌肉机能障碍;治疗和/或预防任何类型的肌肉组织的损伤,如那些在患有心血管疾病和/或运动相关损伤的主体中发生的损伤;治疗和/或预防肌肉萎缩、少肌症、肌肉疲劳,包括年龄相关的肌肉疲劳和由于锻炼或用力造成的肌肉疲劳,包括年龄相关的肌肉退化和疲劳的肌肉萎缩、心脏缺血、恶病质、心力衰竭、老年性退化、COPD或其任意组合。
也在本发明范围内的是本发明的治疗剂在制造用于治疗或预防肌肉相关病理或状况、失调或综合症的药物中的应用,包括,例如少肌症、肌肉疲劳或萎缩、COPD、心血管疾病、心肌病、糖尿病、动脉硬化、高血压、先天性心脏缺损、主动脉瓣狭窄、房间隔缺损(ASD)、房室(AV)的管缺损、动脉导管未闭、肺动脉狭窄、主动脉瓣下狭窄、室间隔缺损(VSD)、瓣膜疾病、高凝症、血友病、溃疡、创伤、损伤、割伤、擦伤、氧化损伤、与年龄相关的组织变性、手术相关的病变、烧伤、肌肉无力、肌肉萎缩、***失调、特发性血小板减少性紫癜、心力衰竭、由心力衰竭和高血压引起的继发疾病、低血压、心绞痛、心肌梗死、结节性硬化症、硬皮病、移植、自体免疫疾病、红斑狼疮、病毒/细菌/寄生虫感染、多发性硬化、自身免疫性疾病、过敏、免疫缺陷、移植物抗宿主病、哮喘、肺气肿、急性呼吸窘迫综合症、炎症及免疫反应调节、病毒病、耐老化相关的疾病、Th1炎症疾病如风湿性关节炎、多发性硬化症、发炎性肠道疾病、艾滋病、创面修复、心脏病发作、心脏衰竭、肌肉萎缩症、褥疮、糖尿病溃疡、氧化损伤、如鼻窦炎或粘膜炎的组织损伤、皱纹、湿疹或皮炎、皮肤干燥、肥胖、内分泌紊乱、厌食、贪食症、肾动脉狭窄、间质性肾炎、肾小球肾炎、多囊肾病、***性、肾小管性酸中毒、IgA肾病、肾内科疾病、高钙血症、Lesch-Nyhan综合症、Von Hippel-Lindau(VHL)综合征、创伤、再生(在体外和体内)、先天性巨结肠病、克罗恩病、阑尾炎、子宫内膜异位症、喉炎、牛皮癣、光化性角化病、痤疮、毛发的生长/损失、秃头症、色素沉着症、重症肌无力、α-甘露、β-甘露、其它存储功能紊乱、失调、如齐薇格过氧化物酶体综合征、小儿refsum疾病、点状软骨发育异常(斑点状软骨发育异常、肢根性)和高哌啶酸血症、骨质疏松、肌肉疾病、尿潴留、奥尔布赖特遗传性骨营养不良、溃疡、阿尔茨海默氏症、中风、帕金森氏病、亨廷顿氏症、脑性麻痹、癫痫、自毁-容貌综合症、多发性硬化症、共济失调毛细血管扩张症、行为障碍、成瘾、焦虑、疼痛、神经保护、中风、无晶体眼、神经退行性疾病、神经***紊乱、发育缺陷、随着GRK2的脑作用和趋化因子受体、脑脊髓炎、焦虑、精神***症、躁狂抑郁症、精神错乱、痴呆调控、严重的精神发育迟滞相关条件和运动障碍、抽动秽语综合症、白质营养不良、癌症、乳腺癌、中枢神经***癌、结肠癌、胃癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、肾癌、结肠癌、***癌、神经母细胞瘤和***、肿瘤、腺癌、淋巴癌、子宫癌、良性***增生症、生殖、生长和发展/分化相关功能的控制,例如,但不限于成熟、哺乳期和***、生殖障碍,和/或其它类似的病理和疾病。
在某些方面,肌肉功能的调节,例如MG29或MG29受体活性通过例如应用或调节MG29或MG29受体核酸或多肽,和/或MG29或MG29受体核酸或多肽结合配对物(即,结合于MG29或MG29受体核酸和/或MG29或MG29受体多肽,并且抑制、降低或中和其生物活性的调节因子,如至少一个MG29RNA结合蛋白,例如HuR、ARE和/或LOX-DICE;和/或至少一个MG29基因转录因子,例如GATA、RUNX1、SREBP1、C/EBP和/或p300;使用抑制RNA、抗体、伪肽、肽类似物或拟肽,或结合和抑制一个或多个目标核酸或多肽的小分子)来实现。
例如,本发明的组合物会具有治疗患有上文公开的疾病和失调和/或类似的其它病理和失调的患者的功效。多肽可被用做免疫原从而产生对本发明具有特异性的抗体,并作为疫苗。其还可被用于筛选可能的激动剂和拮抗剂化合物。此外,编码本发明的突触素样蛋白质(例如MG29)的cDNA当被给药于需要其的主体时,可被用于基因疗法。通过非限定性实例,本发明的组合物会具有治疗患有上文公开的疾病和失调和/或类似的其它病理和失调的患者的功效。
在其它方面,本发明包括通过将MG29或MG29受体多肽、编码MG29或MG29受体多肽的核酸或多肽特异性抗体以足够减轻或预防病理状况的量给药于主体(例如,人),来治疗或预防与哺乳动物的失调相关的病理状况的方法。在优选的实施方式中,失调包括,例如上文公开的疾病和失调和/或类似的其它病理和失调。
此外,由于内源MG29基因表达的肌肉特异性的性质,本发明包括治疗和/或预防任意类型的肌肉或血管细胞/组织损伤的方法,例如作为心血管疾病的结果发生的组织损伤,例如心肌梗死;或激烈体育活动的结果,例如运动相关的损伤,该方法包括将有效量的本发明的治疗剂给药于需要其的主体。
试剂盒
在另外一个方面,本发明提供了包括合适的容器、放置于其中的本发明的组合物和其使用说明的试剂盒。本发明的另一目标是提供包括合适的容器、放置于其中的药物可接受形式的本发明的治疗剂和其使用说明的试剂盒。本发明还公开了使用本发明所述的方法、选择策略、材料或成分中的任意一个的试剂盒或***。本公开的示例性试剂盒可选地、附加地包括操作方法或检测的说明,包装材料,含有检测的一个或多个容器,装置或***组件等。
配方
在某些实施方式中,本发明的治疗组合物包括,例如编码MG29或MG29受体多肽的核酸、MG29或MG29受体核酸;结合于编码MG29或MG29受体多肽的核酸的核酸;MG29或MG29受体编码核酸;MG29或MG29受体肽类似物;基于其的伪肽或拟肽;MG29或MG29受体或者MG29或MG29受体蛋白质-蛋白质相互作用的小分子调节剂;或MG29-特异性抗体或其生物活性衍生物或片段。如本文所述,MG29在正常的肌肉功能中具有重要作用。因此,以这些核酸、多肽或其类似物的表达和/或活性为目标可以产生与肌肉功能失调和退化相关的各种急性或慢性疾病或状况的新型治疗方法。
在本发明的任意方面,本发明的治疗组合物可以是任意药物可接受的形式,并且通过任意药物可接受的途径进行给药,例如,可口服给药该治疗组合物,以每日单剂量或单一剂量形式,用于治疗由于心肌梗死、硬化损伤,或由于体育活动的肌肉撕裂从而提高损伤肌肉组织的再生和修复。这样的药物可接受载体和赋形剂和给药方法对于所属领域的一般技术人员来说是显而易见的,并且包括USP-NF 2008(美国药典/国家处方集United States Pharmacopeia/National Formulary)中描述的组合物和方法,其全部内容通过引用结合到本文中作为参考。
短语“药物或药理可接受的”表示当视情况给药于动物或人时,不产生有害的、过敏的或其它的不利反应的分子实体或组合物。如本文所用的“药用载体”包括任意的和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这样的用于药用活性物质的介质和作用剂的使用在所属领域中是熟知的。除非任意的与活性成分不相容的常规介质或作用剂,其在治疗组合物中的应用是被考虑到的。补充的活性成分也可整合到组合物中。
活性化合物通常被配制成非消化道给药,例如配制为通过静脉内、关节内、鞘内、肌肉、皮下、病灶内或甚至腹膜内途径注射。根据本公开,含有癌症标记抗体、共轭物、抑制剂或作为活性组分或成分的其它作用剂的组合物水制剂对于所属领域的一般技术人员来说会是已知的。一般,这样的组合物可被制备成溶液或悬浮液的注射剂;也可制备成适合于通过在注射前加入液体而制备成溶液或悬浮液的固体形式;还可乳化该制剂。
药物组合物或制剂(formulation)是指以适合给药(例如全身给药)于细胞或主体(优选是人)的形式的组合物或制剂。“全身给药(***给药)”表示血流中的药物的体内***吸收或积累,随后分布于整个身体。合适的形式部分地取决于应用和进入的途径,例如口部、经皮的或通过注射。这样的形式不应阻止组合物或制剂达到目标细胞(即,带负电荷的聚合物需要被传递至的细胞)。例如,注射入血流的药物组合物应该是可溶的。其它因素在所属领域中是已知的,并且包括如毒性和阻止组合物或制剂发挥其功效的形式的考虑。
用于给药本发明的治疗剂的制剂包括无菌的水溶液或非水溶液、悬浮液或乳剂。非水溶剂的实施例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯类(如油酸乙酯)。水相载体包括水、乙醇/水溶液、乳剂或悬浮剂,包括生理盐溶液和缓冲介质。介质包括氯化钠溶液、Ringer′s葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、包括液体和营养补充物的乳酸化Ringer′s静脉介质、电解质补充剂等。可增加防腐剂和其它添加剂,如,例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
本发明的药物组合物被配置成与其期望的给药途径相容。给药途径的实例包括非消化道的,例如静脉、皮内、皮下、口部(例如,吸入)、经皮的(例如,局部)、穿黏膜种植体、腹膜内和直肠给药。用于非消化道、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可包括以下成分:无菌稀释剂,如用于注射的水、盐溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂;抗细菌剂,如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯;抗氧化剂,如抗坏血酸或亚硫酸氢钠;螯合剂,如乙二胺四乙酸(EDTA);缓冲剂,如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐,调整张力的作用剂,如氯化钠或葡萄糖;可通过酸或碱来调整pH,如盐酸或氢氧化钠。非消化道给药的制剂可封闭在安培瓶、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
导致全身吸收的给药途径包括,但是不限定于:静脉、皮下、腹膜内、吸入、口服、肺内或肌肉内。已显示药物进入循环的速率是分子量或大小的函数。应用包括本发明的化合物的脂质体或其它药物载体可潜在地定位药物,例如在特定的组织类型中,如网状内皮***(RES)的组织。可有助于药物与细胞(如淋巴细胞或巨噬细胞)表面结合的脂质体配方也是有用的。
药物可接受的配方表示可以使本发明的核酸分子在最适合于其理想活性的身***置内有效分散的组合物或配方。适合于具有本发明的核酸分子的配方的作用剂的非限定性实例包括:共轭结合于核酸的PEG、共轭结合于核酸的磷脂、含有亲脂部分的核酸、磷硫酰、可提高药物进入各个组织的P-糖蛋白抑制剂(如普流尼克(Pluronic)P85),例如CNS(Jolliet-Riant and Tillement,1999,Fundam.Clin.Pharmacol.,13,16-26);生物降解聚合物,如在移植后缓释传递的聚(DL-丙交酯-共乙交酯)微球体(Emerich,DFet al,1999,Cell Transplant,8,47-58);Alkermes,Inc.Cambridge,Mass.;和负载的纳米粒子,如由聚氰基丙烯酸丁酯制成的,其可传递药物穿过血脑屏障并可改变神经元摄入机制(Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry,23,941-949,1999)。包括核酸分子的CNS传递的传递策略的其它非限定性实例包括Boado et al.,1998,J.Pharm.Sci.,87,1308-1315;Tyler et al,1999,FEBS Lett.,421,280-284;Pardridge et al.,1995,PNAS USA.,92,5592-5596;Boado,1995,Adv.Drug Delivery Rev.,15,73-107;Aldrian-Herrada et al.,1998,Nucleic Acids Res.,26,4910-4916;和Tyler et al.,1999,PNAS USA.,96,7053-7058中描述的材料。所有这些参考文献通过引用结合到本文中作为参考。
本发明的特征还在于包括含有聚乙二醇脂质的表面修饰脂质体(PEG-修饰的,或长循环脂质体或隐形脂质体)的组合物。本发明的核酸分子还可包括共价结合的各种分子量的PEG分子。这些配方提供了提高药物在目标组织中积累的方法。这系列的药物载体抵抗单核吞噬细胞***(MPS或RES)的助噬作用和消灭,从而可以使血液循环时间更长并提高组织接触被包裹的药物(Lasic et al.Chem.Rev.1995,95,2601-2627;Ishiwata et al.,Chem.Pharm.Bull.1995,43,1005-1011)。与阳离子脂质体相比,长循环脂质体还可能保护药物更大程度免于核酸酶降解,这是基于其避免在代谢侵略性的MPS组织(如肝脏和脾脏)中的积累的能力。所有这些参考文献通过引用结合到本文中。
本发明的化合物、核酸分子、多肽和抗体(在本文中还被称为“活性化合物”)和其衍生物、片段、类似物和同源物可被整合到适合于给药的药用组合物中。这样的组合物通常包括核酸分子、蛋白质,或抗体和药物可接受载体。本文所用的“药用载体”是要包括任意的和所有的与药物给药相容的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。在Remington′s Pharmaceutical Sciences(本领域中的标准参考文献)的最新版中描述了合适的载体,其通过引用结合到本中作为参考。这样的载体或稀释剂的优选实例包括,但是不限定于水、盐溶液、finger’s溶液、葡萄糖溶液和5%人血清白蛋白。还可使用脂质体和非水的介质(如不挥发性油)。这样的用于药用活性物质的介质和作用剂的应用在所属领域中是熟知的。除非任意的与活性化合物不相容的介质或作用剂,其在组合物中的应用是被考虑到的。还可将补充的活性化合物整合到组合物中。
本发明还可包括制备用于储存或给药的组合物,其包括药物可接受载体或稀释剂中的药物有效量的需要的化合物。用于治疗用途的可接受载体或稀释剂在制药领域中是熟知的,例如,在Remington′s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.(A.R.Gennaroedit.1985)中描述,其通过引用结合到本文中作为参考。例如,可提供防腐剂、稳定剂、着色剂和调味剂。这些包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯。此外,可使用抗氧化剂和悬浮剂。
有效量、药用有效剂量、治疗有效量或药用有效量是预防、抑制或治疗(一定程度减轻症状,优选完全消除症状)疾病状态或病理状况的发生所需要的剂量。有效量取决于疾病的类型、使用的组合物、给药途径、被治疗的哺乳动物的类型、考虑的特殊哺乳动物的身体特征、同时的用药和药物领域中的一般技术人员会认识到的其它因素。一般,根据带负电荷的聚合物的效能,活性成分的给药量是0.1mg/kg体重/天至1000mg/kg体重/天。此外,本发明的组合物的有效量包括实施例中使用的那些量从而有助于需要的或理想的生物效果。
可通过细胞培养或实验动物中的标准制药程序来确定这样的化合物的毒性和治疗效力,例如,确定LD50(50%群体致死的剂量)和ED50(50%群体治疗有效的剂量)。毒性和治疗效力之间的剂量比是治疗指标,并且可表达为LD50/ED50比。表现出高治疗指标的化合物是优选的。虽然可使用表现出毒副作用的化合物,应该小心地设计将这样的化合物靶向于受影响的组织位点的传递***,以便将对未受影响的细胞的可能伤害最小化从而降低副作用。从细胞培养检测和动物研究获得的数据可用于设计用于人的剂量范围。这样的化合物的剂量优选在包括具有低或无毒性的ED50的循环浓度的范围内。剂量可根据使用的剂型和给药途径在该范围内变化。对于本发明的方法中使用的任意化合物,可通过细胞培养检测初步估计治疗有效剂量,可在动物模型中设计剂量从而实现如在细胞培养物中确定的包括IC50(即,实现症状的半最大抑制的测试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。
可以以含有常规的、无毒的药物可接受载体、辅剂和介质的剂量单元配方通过吸入、喷雾或直肠来进行口服、局部或非消化道给药配方。本文所用的术语“非消化道”包括经皮的、皮下的、血管内(例如,静脉的)、肌肉内或鞘内注射或灌注技术等。此外,提供了包括本发明的核酸分子和药物可接受载体的药用配方。本发明的一个或多个核酸分子可以与一个或多个无毒的药物可接受载体和/或稀释剂和/或辅剂结合,如果需要的话还有其它活性成分。本发明的药用组合物可以是适合于口服使用的形式,例如,药片、锭剂、含片、水或油悬浮液、可分散粉末或颗粒、乳剂、硬或软胶囊,或糖浆或酏剂。
可通过制造药用组合物领域中已知的任意方法制备口服使用的组合物,这样的组合物可含有一种或多种这样的甜味剂、调味剂、着色剂或防腐剂从而提供药用良好的的和可口的制剂。对于口服给药,制药组合物可采取,例如通过利用如结合剂(例如,预糊化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素);填充物(例如,乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙);润滑剂(例如,硬脂酸镁、滑石或二氧化硅);崩解剂(如,土豆淀粉或羧乙酸淀粉钠);或润湿剂(例如,十二烷基硫酸钠)的药物可接受的赋形剂的常规方法制备的片剂或胶囊的形式。可通过所述领域熟知的方法包衣片剂。用于口服给药的液体制剂可采取,例如溶液、糖浆或悬浮液的形式,或者它们可以干燥产品存在,在使用前与水或其它液体介质组成。可通过常规的方法,用药物可接受的添加剂制备这样的液体制剂,添加剂如悬浮剂(例如,山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪);乳化剂(例如,卵磷脂或***树胶);非水介质(例如,杏仁油、油酯、乙醇或分馏植物油);和防腐剂(例如,对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。这样的制剂还可视情况包含缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。用于口服给药的制剂可被适当地设计从而控释活性化合物。对于口腔给药的组合物,可采取常规方式配制的片剂或锭剂。
赋形剂可以是,例如惰性稀释剂,如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠;颗粒剂和***剂,例如玉米淀粉或褐藻酸;结合剂,例如淀粉、凝胶或***树胶,和润滑剂,例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是未包衣的或可通过已知的技术将其包衣。在一些情况下,可通过已知的技术制备这样的包衣,从而延迟胃肠道中的分解和吸收,从而产生较长期的持续作用。例如,可使用如单硬脂酸甘油酯或甘油二硬脂酸酯的时间延迟材料。口服应用的配方还可以以是硬胶胶囊,其中活性成分和惰性固体稀释剂(例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合,或者是软胶胶囊,其中活性成分和水或油介质(例如花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。
水悬浮液含有与适合制造水悬浮液的赋形剂混合的活性物质。这样的赋形剂是悬浮剂,例如,羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基-甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和***树胶;分散剂或润湿剂可以是自然产生的磷脂,例如卵磷脂,或烯基氧化物和脂肪酸的缩合产物,例如聚氧乙烯硬脂酸,或环氧乙烯和长链脂肪族醇的缩合产物,例如十七碳烷基环氧乙烯基鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol),或环氧乙烯与源于脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯),或环氧乙烯和源于脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物,例如聚乙烯山梨聚糖单油酸酯。水悬浮液还可包含一种或多种防腐剂,例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯,一种或多种着色剂,一种或多种调味剂和一种或多种甜味剂,如蔗糖或糖精。
可通过将活性成分悬浮在植物油(例如,花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(如液体石蜡)中来配置油悬浮液。油悬浮液可含有增稠剂,例如蜂蜡、固体石蜡或鲸蜡醇。可加入甜味剂和调味剂从而提供可口的口服制剂。通过加入抗氧化剂(如抗坏血酸)来保存这些组合物。
适合于通过加入水来制备水分散液的可分散粉末和颗粒提供与分散剂或润湿剂,悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。通过上文所述已经例示了合适的分散剂或润湿剂或悬浮剂。还可存在其它的赋形剂,例如甜味剂、调味剂和着色剂。本发明的药用组合物还可以是水包油乳液的形式。油相可以是植物油或矿物油或其混合物。合适的乳化剂可以是自然产生的树胶,例如***树胶或黄蓍胶,自然产生的磷脂,例如大豆,卵磷脂和来源于脂肪酸和己糖醇、酐的酯或偏酯,例如山梨聚糖单油酸酯,所述偏酯与环氧乙烷的缩聚产物,例如聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯。乳液还可包含甜味剂和调味剂。
可通过甜味剂来配制糖浆和酏剂,例如甘油、丙二醇、山梨醇、葡萄糖或蔗糖。这样的配方还可包含镇痛剂、防腐剂和调味剂和着色剂。药用组合物可以是无菌的可注射水或油悬浮液。可根据已知的技术使用上述合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制该悬浮液。无菌的注射剂还可以是无毒的非消化道给药可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射液或悬浮液,例如1,3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受介质和溶剂是水,Ringer’s溶液和等渗氯化钠溶液。此外,可常规使用无菌的不挥发性油来作为溶剂或悬浮介质。基于此目的,可使用任意的温和的不挥发性油,包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外,如油酸的脂肪酸在注射剂的制备中具有用处。
对于吸入给药,用于本发明的应用的化合物通常通过使用合适的推进剂(例如,二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体)以加压填充或喷雾器以喷雾形式传递。在加压气雾剂的情况下,可通过提供阀来提供计定量从而确定剂量单位。可将用于吸入器或吹药器的胶囊和例如凝胶的药筒设计成含有化合物和合适的基础粉末(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。该化合物可被配制为用于通过注射的非消化道给药,例如通过弹丸注射或连续灌注。
化合物还可被配制成直肠组合物,如栓剂或保留灌肠剂,例如含有常规的栓剂基质,如可可油或其它甘油酯。除了前述配方,化合物还可被配制成长效制剂。这样长期作用的配方可通过移植(例如皮下或肌肉内)或通过肌肉内注射来被给药。因此,例如,化合物可与合适的聚合物或疏水材料(例如,可接受油中的乳液)或离子交换树脂配制,或作为略溶的衍生物,例如作为略溶的盐。
适合于注射的药用组合物包括无菌的水溶液(其中是水可溶的)或分散液和用于即时制备无菌注射液或分散液的无菌粉末。可以提供单位剂量形式的注射配方,例如在安瓿瓶或多剂量容器中,附加防腐剂。组合物可采取如悬浮液、溶液,或油性或水性介质中的乳液,并且可包含配方剂,如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者,活性成分可以是粉末形式,在使用之前与合适的介质(例如,无菌的、无热原的水)组成。对于静脉给药,合适的载体包括生理盐溶液、抑菌水、CremophorTM.(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸缓冲盐溶液(PBS)。在所有情况下,组合物必须是无菌的,并且应是达到具有易于注射程度的液体。在制造和储存的条件下,它必须是稳定的,并且必须是防腐抗微生物(如细菌和真菌)的污染的。载体可以是含有,例如水、乙醇、多羟基化合物(例如,丙三醇、丙二醇和液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质,和其合适的混合物的。可通过使用,例如如卵磷脂的包衣,在分散物的情况下通过保持需要的粒子尺寸和通过使用表面活性剂来保持合适的流动性。可通过各种抗菌剂和抗真菌剂(例如,对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来防止微生物的作用。在许多情况下,优选在组合物中包括等渗剂,例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇、氯化钠)。通过在组合物中包括延迟吸收的作用剂(例如,单硬脂酸铝和凝胶)来实现注射组合物的延长吸收。
在一个实施方式中,制备与载体在一起的活性化合物,载体会保护该化合物免于被从身体快速消除,如控释配方,包括移植和微胶囊传递***。可使用生物降解、生物相容聚合物,如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚羟基乙酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。制备这样的配方的方法对于所属领域的一般技术人员来说会是显而易见的。还可从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals,Inc购买材料。还可将脂质体悬浮液(包括具有针对于病毒抗原的单克隆抗体靶向于被感染细胞的脂质体)用作药物可接受载体。其可根据所属领域的一般技术人员已知的方法制备,例如,如美国专利第4,522,811号描述的方法。
尤其优选将口服或非消化道给药的组合物配制成单位剂量形式从而易于给药和剂量均一化。本文所用的单位剂量形式表示适合作为用于被治疗主体的单一剂量的物理分离单位;每一单位含有与必需的药物载体相联合的、计算为产生理想的治疗效果的预定量的活性化合物。本发明的单位剂量形式的详细说明由活性化合物的独特性和要实现的独特治疗效果,配制这样的活性化合物以治疗个体的的领域中固有的限制来确定,并且直接取决于它们。
对于对非人动物的给药,本发明的治疗组合物还可被添加到动物饲料或引用水中。配制动物饲料和饮用水组合物是方便的,从而动物可随其饮食摄取治疗合适量的组合物。提供作为添加到饲料和或饮用水中的预混合物的该组合物也是方便的。组合物还可组合其它的治疗化合物来给药于主体从而提高整体治疗效果。使用多个化合物来治疗症状可提高有益效果而降低副作用的存在。
说明性实施例(参考附图)
Mitsugumin29(MG29):肌肉特异性突触素相关蛋白的分离
骨骼肌的三联体由伸入与肌质网(SR)的终池的两个部分并列的细胞质中(横向管和T-管)的单一的质膜内陷组成。考虑到三联体在肌肉收缩感应中的重要性,通过免疫染色从该抗体库筛选新型的定位于三联体的蛋白质已识别了调控骨骼肌的兴奋-收缩(E-C)偶联和Ca2+运作的其它方面的其它蛋白质,是不令人惊奇的。在筛选该库过程中发现的最重要的蛋白质之一是Mitsugumin29(MG29),跨膜蛋白的突触素家族中的新成员。
MG29基本上是专门在骨骼肌纤维中表达的,尽管在肾脏中可解析某些低水平的表达,其含有四个跨膜结构域,其可以使蛋白质同时定位于横(T-)管膜和三联体的SR膜。这种亚细胞分布提示MG29可能调节T-管和联接SR膜之间的通信。MG29的蛋白质结构与神经传递素释放必需的蛋白家族、突触素家族的成员在氨基酸序列上是同源的并且具有共同的特征性结构特征。
突触素:突触形成、释放和生物发生
突触素最初被识别为小突触囊泡的丰富的和高度免疫原的膜蛋白,其也在致密核心的嗜铬和神经分泌颗粒中被发现。突触素和其同源物,突触孔蛋白(或突触素II)和泛有小泡蛋白共享共同的跨膜结构,具有四个跨膜区和细胞质氨基和羧基端。
突触素的独特特点在于其具有低聚物结构,导致认为突触素可能是在神经传递素释放过程中形成的融合孔的组件。此外,Alder等人已表明互补于突触素mRNA的反义寡核苷酸降低通过注射总脑mRNA引起的爪蟾***的Ca2+-依赖性谷氨酸盐分泌。将突触素抗体显微注射入运动神经元阻断神经肌肉传递。这些数据与神经传递素分泌必需的突触素是一致的。但是,用于识别突触素功能的遗传学方法还未成功;缺乏突触素的突变小鼠显示出正常的表型。这可能反映了突触孔蛋白或其它突触素家族成员的补偿。确实,在突触素和突触孔蛋白两方面都有缺陷的小鼠显示出突触塑性缺陷。
突触素已被认为在小泡形成中具有结构性作用。基于其高度结合胆固醇的能力,突触素涉及突触小泡生物发生过程中的膜曲率的产生。还已知突触素与突触小泡膜的其它蛋白紧密相互作用,即小突触泡蛋白和小泡H+-ATP酶。认为这些相互作用调节SNARE复合物水平的胞吐膜融合或融合孔形成。通过对酵母液泡融合的研究支持了后一观点,其认为液泡ATP酶直接参与膜融合。
MG29和突触素之间的相似性提示了MG29可能在调节骨骼肌的膜结构中具有重要作用。骨骼肌是最具有塑性的自然组织之一,正常的肌肉生理必需复合膜结构的形成和保持。在发育的整个过程中,老化和包括疲劳的其它过程必需骨骼肌***的持续适应,因此涉及骨骼肌膜结构的塑性的基因和蛋白的识别和鉴定对于理解肌肉生理是必要的。因此,结构上MG29可能被看成是骨骼肌生物发生中的突触素的对应物。
MG29作为防止骨骼肌中钙动态平衡的年龄相关的功能失调的标记。
年龄老化在肌肉功能上的作用与肌肉纤维去神经、运动单元的丧失和运动单元变形相关。因为在显著的肌肉萎缩变得明显之前发生功能(或机能)改变,E-C偶联机制和细胞内钙动态平衡的变化可以作为肌肉老化的成因因子或肌肉老化的适应反应。已显示几种三联体蛋白质(包括DHPR、隐钙素和SERCA)的功能改变有助于扰乱老化骨骼肌中的钙动态平衡。已暗示VICR过程的累积解偶联可能是肌肉老化过程中部分的起因性和/或适应性变化。近年来肌肉老化的分子标记的识别,和其对年龄相关的肌肉功能失调的作用已成为E-C偶联研究和一般老年医学药物研究中的主要关注点。
将我们在健康的幼龄肌肉中的钙火花的初始发现进行延伸,我们已发现了老化骨骼肌中的钙火花的表型变化。其显示出在老化骨骼肌中达不到在幼龄肌肉中的钙火花的塑性特性,其中钙火花反应的持续时间降低并且不能被额外回合的渗透应力重新激发。老化肌肉中的不良的钙火花信号可能与t-管/SR膜结构和/或SR钙释放机制的改变相关,可能是由于蛋白质表达中的年龄相关改变引起的。
使用生物检测,我们发现MG29表达在老化骨骼肌中显著降低。MG29对于保持骨骼肌的膜结构和钙信号是必需的。在幼龄mg29(-/-)和老化wt小鼠的骨骼肌中都检测到三联体周围的膜超微结构的异常:t管膨胀,并且有时从A-I联接点消失,SR网络形成不良,具有空泡和碎片结构,导致三联体未对准。
除了幼龄mg29(-/-)和老化wt肌肉的膜结构中的平行变化,几个其它的研究还提示了MG29可被用作肌肉老化的分子标记。首先,mg29(-/-)小鼠在6周龄或更小的时候显示出肌无力,其类似于老化wt小鼠的萎缩表型。第二,老化肌肉中的钙池操纵Ca++通道(SOCE)被显著下调,其类似于mg29(-/-)新生和成年肌肉中识别的SOCE功能失调特性。第三,分离的钙释放池对mg29(-/-)和老化的肌肉中的EC偶联都表现出差异的敏感度似乎是普遍现象。我们的研究说明不能被生理VICR机制启动的分离的钙池可能在幼龄mg29(-/-)和老化的wt肌肉纤维中都存在。第四,我们识别了幼龄mg29(-/-)以非常类似于老化骨骼肌中见到的方式丧失了可塑钙火花信号。不良的钙火花信号和分离的胞内钙释放的识别可提供未来的抵抗老化对肌肉性能的作用的干预治疗的独特目标。
发现MG29在肌肉疲劳中的作用
考虑到mg29(-/-)动物中的三联体膜超微机构的***程度,令人惊奇的是缺乏非应激动物的可识别的功能表型。然后我们思考到因为生理反应在应激条件下被改变,我们需要研究mg29(-/-)动物和其肌肉在这样的条件下的反应。起初,我们测试了整个动物对跑台跑步训练引起的应激的体内反应。我们发现敲除的动物不能长时间保持身体活动,跑得显著少于野生型的同窝对照。这些研究提供给我们MG29是在肌肉性能中,尤其是身体活动提高的过程中,具有直接作用的生理相关分子的初步线索。因为身体不活动可能导致一些慢性退变性疾病,肌肉功能降低和肌肉萎缩,接下来我们研究了MG29在肌肉疲劳中的作用。
肌肉疲劳被广泛定义为由于反复或持续的活动导致肌肉产生力量的能力降低。疲劳是所有动物都会经历的现象,并且被认为是部分的限制扩大的肌肉收缩从而将由于用力过度造成的伤害降低到最小的生物控制过程。目前的一些关于肌肉疲劳的基础细胞学机理的理论包括:a)干扰T管和SR的Ca2+释放之间的有效通信;b)导致动作电位传播失败的肌肉细胞中的钠或其它离子的浓度变化。c)活性氧(ROS)/代谢物理论认为提高的肌肉活性导致可直接改变蛋白质功能的过氧化物、过氧化氢和自由基净增高。有时候,这个理论被扩展成更宽泛的概念,假定在疲劳过程中形成代谢物(如ROS、无机磷酸盐、ADP、AMP等)的整体积累,这同时造成SR的Ca2+释放量的降低和肌动蛋白-肌球蛋白相互作用的功能抑制。d)疲劳刺激导致胞内Ca2+升高,诱导Ca2+-活化的蛋白酶和随后的必要的E-C偶联相关蛋白的裂解。
虽然作用机制还不清楚,但肌肉生理研究中的共识是最佳的肌肉性能围绕着保持胞内Ca2+动态平衡,因为SR的不充分Ca2+释放导致力量输出降低。在疲劳过程中,这种不足的Ca2+释放是由于T管和SR膜上的兰尼碱受体(RyR)的不恰当的结合,SR Ca2+量的降低,RyR功能的直接改变和不良的钙池操纵Ca2+通道(SOCE)。
我们使用活体外肌肉收缩性检测研究了mg29(-/-)小鼠的骨骼肌的易疲劳特性,发现它们比野生型的对照小鼠疲劳程度更高,疲劳后恢复程度更低并且产生的力更小,即使有咖啡因。这些发现清楚地提示了mg29(-/-)骨骼肌中的E-C偶联被干扰/中断。当Ca2+被从胞外介质去除时和/或胞外Ca2+的进入被药理阻断时,mg29(-/-)小鼠和野生型小鼠的肌肉之间的疲劳特性的差异被显著降低,表明胞外Ca2+的进入是mg29(-/-)肌肉中的抗疲劳性降低的主要因素。
延伸我们在健康的幼龄肌肉中的钙火花的初始发现,我们识别了老化骨骼肌中的钙火花信号的表型变化。似乎幼龄肌肉中的钙火花的可塑性在老化骨骼肌中是不良的,其中钙火花反应的持续时间降低,并且不能被额外回合的渗透应力重新激发。可认为老化肌肉中的不良的钙火花信号可能与t管/SR膜结构的改变和/或SR钙释放机制的改变相关,可能是由于蛋白质表达中的年龄相关改变引起的。使用生物检测,我们发现老化骨骼肌中的MG29表达显著降低(见图6A)。MG29对于骨骼肌中保持膜结构和钙信号是必需的。
在幼龄mg29(-/-)和老化的wt小鼠都检测到三联体周围的膜超微结构的异常:t管肿胀,并且有时从A-I联接点消失,SR网络形成不良,具有空泡和碎片结构,导致三联体不能对准。我们的结果显示能够调节MG29的表达和/或活性的作用剂能够用于治疗肌肉疲劳,包括年龄相关的肌肉疲劳和由于运动或用力造成的肌肉疲劳,或导致慢性肌无力的病理状况(在本文中统称为“肌无力”)。
MG29表达转基因小鼠的可诱导控制
为了确定我们是否能够在整个生物体的水平控制MG29表达,我们制造了转基因小鼠,其在诱导启动子***控制下尤其是在骨骼肌中过量表达MG29。我们设计了新型的转基因方法,其中双四环素(tet)诱导***被用于控制MG29表达(图1A)。该转基因构建体包含处于tet负责最低CMV启动子控制之下的小鼠mg29 cDNA。该调控启动子含有tet阻遏子应答元件(TRE),其可被在CMV启动子控制下的双亚基mRNA结构性表达的tet-阻遏子(tTS)92和tet-反式激活因子(rtTA)93蛋白结合。没有tet时,tTS会结合于TRE并抑制转录。一旦在小鼠供水中提供tet,tTS从TRE解离,此时rtTA可结合于TRE,使mg29 cDNA稳健转录。通过在TRE启动子和mg29cDNA之间加入以loxP位点为侧翼的GFP盒来赋予这种构建体的小鼠特异性。这种GFP表达盒相对于其余的转基因构建体是反向的从而提高GFP的表达水平(图1B)。这种表达盒的存在和其将表达盒启动子反向于tet-调控的最低CMV启动子的定位保证了MG29表达在首建动物产生过程中不会发生。通过饲养αSK-肌动蛋白(ASKA)-Cre小鼠94的首建系(从Jackson Laboratories获得),通过在供水中添加多西环素(tet的稳定类似物)可实现肌肉的特异性表达。多西环素会减轻tTS抑制并诱导MG29表达的rtTA活化。
这种转基因***具有的优势是可以专门的、剂量依赖性调控骨骼肌中的MG29表达,使我们更有效地分析MG29的年龄相关降低促进老化的复杂表型的程度。测试在被转染的HEK293细胞中该重组***,我们发现通过添加多西环素可以以剂量依赖的形式控制MG29的表达(图2A)。通过这种方法还可严密调控基因表达诱导的时机(定时,timing)(图2B)。其它优势是该转基因的活化是可逆的,因此我们可以诱导转基因表达,使三联体复合物改型,然后可以抑制转基因表达。此外,该***中的mg29 cDNA可以被其它基因的cDNA取代从而进一步扩展该诱导表达***的各种用途的应用。
我们已通过使用siRNA介导的基因表达沉默来引入降低基因表达的能力,从而扩展我们的***来控制基因表达。这种方法传统的是在RNApol-III启动子(例如,U6启动子)的控制下使用小发夹RNA(shRNA)。我们的初始研究表明该***不能有效被可诱导的表达***控制。因此,我们改进了由Silva等人(Nature Genetics 37,1281)开发的***,其利用通过外源RNAses Drosha和Dicer的RNA加工从而产生microRNA,microRNA利用RNA pol-III启动子靶向特异性mRNA(例如,CMV或SV40)来降解。根据这个理论,我们设计了新型的转基因***,其利用tet-ON可诱导***来控制microRNA盒的表达(图3)。这种方法的应用便于产生其中通过应用Cre重组技术将microRNA表达特异性地限制于肌肉组织的首建小鼠。通过tet-ON***的rtTA和tTS蛋白控制microRNA的活化,便于可诱导地和可逆地抑制感兴趣的基因的表达(图4)。作为一个概念证实的方法,我们确定了该转基因***可被用于以剂量依赖性的方式抑制组织培养物中的两个基因的表达,junctophillin-1(mJP1)和junctophillin-2(mJP2)(图5)。这些结果显示出该方法的有效性,并且还确立了该***可被用于沉默除了(beside)MG29以外的其它基因的表达。
随着锻炼(运动)MG29表达升高
过去已显示长期锻炼调控骨骼肌中一些基因的表达,尤其是涉及生理性肥厚过程的收缩器组装的那些基因。但是,几乎没有在疲劳性锻炼之后立即显示出蛋白质表达水平显著升高的基因的实例。在我们检测MG29在肌肉疲劳和少肌症中的作用的过程中,我们检验了锻炼之后小鼠骨骼肌中的MG29表达是否改变。我们发现,在单轮跑台运动之后MG29表达水平迅速升高(图6B)。这种升高的表达在跑台运动后24小时左右达到峰值。考虑到mg29-/-小鼠或老化骨骼肌中的MG29水平降低与肌肉性能的降低和易疲劳性升高相关,这种瞬时的MG29表达升高可能是骨骼肌对于急性锻炼的适应反应。在这些条件下升高的MG29可作用于支撑肌肉性能并使疲劳最小化。如果MG29上调是部分的这样的反应,则可诱导MG29表达进一步升高可能足以产生骨骼肌性能的进一步提高。
MG29表达进行转录后调控
考虑到一次短回合的跑台锻炼之后MG29表达的显著上调,我们试图更好地理解控制MG29表达的细胞机制。在该过程中,我们观察到C2C12肌原细胞在成肌细胞阶段或在分化的肌管阶段都不表达MG29蛋白(图7)。当C2C12成肌细胞分化成肌管并且在不同的时间收获时,通过Western印迹法未检测到蛋白质表达,但是通过实时PCR可检测到大量的MG29 mRNA表达。这些发现高度提示具有在mRNA水平发生的一定水平的MG29翻译控制。如果它可能解释这种调控的分子机制,则可提供操纵MG29表达的方法作为抗肌肉疲劳和少肌症的治疗方法。
mg29 cDNA的3’UTR区是基因调控的目标
为了理解控制MG20转录后调控的分子机制,我们检查了MG20mRNA的结构。我们发现小鼠和人的MG29mRNA的3’UTR都显著长于这些种类中的mRNA的平均3’UTR(图8)。这可能提供了额外的序列,该序列可包含能够包含调控因子结合位点的初级结构(见下文)或要产生的更高级结构(如发夹或其它的双链区域)的契机。通过使用生物信息学方法来解析鼠MG29 5’UTR和3’UTR序列的二级结构,我们发现主要的二级结构存在于MG29的UTR区域(图9和图10)。虽然预测了一些发夹结构在5’UTR中,但3’UTR的结构是高度复杂的并且提供了多个结合可影响MG29基因表达的转录后调控的辅助因素的位点。因此,3’UTR是其中可发生MG29表达的转录后调控的位点的出色候选物。
为了有助于对该现象的进一步研究,我们从MG29表达实验制造了两个质粒构建体(图11)。pFLAG-MG29是只含有与FLAG标签(DYKDDDDK)合并的鼠MG29基因的编码序列的表达载体。pcDNA-MG29是包含鼠MG29mRNA的全长cDNA和5’和3’非翻译区(UTR)的表达载体。这两种构建体可以使我们直接检测MG29 mRNA的UTR在MG29转录后调控中是否是重要的。
虽然C2C12细胞不表达内源MG29蛋白,但当它们转染了包含仅由编码序列构成的mg29 cDNA的质粒时,这些细胞会表达MG29蛋白(图12)。当含有完整MG29 mRNA(包括UTR)的质粒被转染进相同细胞中时,没有MG29蛋白表达,但是有由该质粒产生的大量mRNA(图12B)。因此,UTR序列对于MG29基因表达的转录后调控是必需的,显示出UTR是肌肉中控制MG29表达的调控途径的目标。
为了检验该基因调控途径是否是肌肉细胞特异性的,我们用pFLAG-MG29或pcDNA-MG29转染人胚肾细胞(HEK293)。在这些非肌肉细胞中,两个构建体都产生MG29 mRNA和蛋白(图13)。但是,MG29UTR序列的存在降低了MG29蛋白表达量。这些发现显示控制MG29表达的转录后调控途径被限定于非肌肉细胞。虽然非肌肉HEK293细胞中的蛋白质表达抑制提示必须参与在该途径中的一些独特的因素,任意MG29蛋白质的出现根本显示出至少一些控制MG29调控途径的成分一定是肌肉特异性的。
在没有通常存在于HEK293细胞培养基中的胎牛血清(FBS)情况下进行先前研究中的实验(图13)。这样做是为了模拟缺少分化的C2C12成肌细胞培养基中存在的FBS(图12中)。当FBS被加入到HEK293细胞中时,转染了pFLAG-MG29或pcDNA-MG29的细胞之间的蛋白质表达的差异小于其在没有FBS下的情况(图14)。这些发现是非常有意义的,因为它们提示可通过胞外信号改变控制转录后MG29表达的途径,可能是通过FBS混合物中发现的蛋白质因素。这表示,这样的因素,或以这些为目标的小分子或相关蛋白质,可被用作治疗方法来改变MG29表达。
因此,似乎存在原始mg29mRNA的一些特性,其不存在于编码序列cDNA中,这阻止了MG29蛋白翻译。这样的调控区的一个候选物是原始mg29 mRNA的大的3’未翻译区(UTR)。使用生物信息学方法来预测这个3’UTR序列是如何影响二级结构的。在MG29的编码序列上加入3’UTR序列产生了复杂得多的二级结构并且显著改变了分子的自由能(图9/10)。
虽然这些实验显示了MG29 mRNA中的UTR序列是MG29转录后调控的基础,但MG29的3’UTR的初级结构的进一步分析显示出可以参与基因调控的特异性目标位点。有多个其中各种mRNA的UTR可影响mRNA的翻译的例子。通常铺助因素结合于UTR,并且提高或抑制mRNA的翻译,而在其它情况下,UTR的二级结构可直接影响mRNA稳定性。通过mg29 mRNA的3’UTR序列的缺失分析,我们确定了3’UTR中的负责肌肉细胞中的MG29表达转录后调控的特异性区域(图15)。通过手中的该信息,我们使用计算机数据库分析从而找到MG29 3’UTR中的这样的共有序列,其可有助于该MG29表达的转录后调控(图16)。我们发现三类特别有意义的序列:HuR、ARE和15-LOX-DICE位点。HuR位点响应于应激(如氧化应激)来调控mRNA的稳定和翻译。ARE(富AU元件)与mRNA的去稳定化相关。15-LOX-DICE(15-脂肪氧合酶分化控制元件)结合于hnRNP E1和K从而抑制翻译的起始。ARE(富AU元件)涉及mRNA的去稳定化。
显然,MG29表达在转录后水平以依赖于原始MG29 mRNA的UTR的存在的方式受到调控。这种调控途径的调整可提高骨骼肌中MG29表达。这具有了用作治疗肌肉结构和功能的年龄相关性衰退的治疗方法的可能性;包括少肌症、萎缩和收缩异常。因为先前的研究已将MG29蛋白水平与抵抗肌肉疲劳联系起来,调节MG29表达从而产生更多的蛋白质还可用作表现出疲劳和/或萎缩提高的疾病状况的疗法,包括但不限于恶病质、心力衰竭、肌肉萎缩症、慢性阻塞性肺病(COPD)、离子通道疾病等。
已有几种可用于在转录后水平以MG29表达为目标的方法作为治疗方法。以涉及mg29 mRNA的3’末端加工/加帽、外显子剪接、加入聚腺苷酸尾、mRNA定位、mRNA翻译、mRNA稳定/降解和沉默或microRNA(si/miRNA)调控的过程为目标的方法可被用作各种肌肉疾病和少肌症的治疗方法。互补的或反义的RNA序列、肽和化学小分子的应用代表了调整这些细胞过程和影响肌肉细胞中的MG29表达水平或MG29途径的其它基因的潜在的作用剂。
我们的结果在这里说明了可通过靶向mg29 mRNA中的UTR序列的机制在转录后水平控制mg29基因表达。虽然这种方法提供了令人关注的调节MG29蛋白质水平的新型方法,但是有其它的更确证的调节基因表达的方法,其能够用于容忍MG29蛋白水平的升高。这样的一一种方法提高mg29 mRNA的转录。
通过生物信息学方法,我们发现人MG29基因的上游序列包含高度保守区(图17)。这样的区域被认为包括mg29基因的启动子区。该保守区跨度为从转录起始位点的-702至-422核苷酸。在一些灵长类动物中发现高度保守序列,包括黑猩猩、绒和大猩猩。这表示该区域在mg29转录的调控中是重要的。
为了进一步研究该保守区对于控制mg29表达的作用,我们扩展了生物信息学方法来研究该区域的共有转录因子结合位点。我们发现了几个与肌肉萎缩相关的共有结合位点是该保守区(图18)。尤其令人感兴趣的是与控制肌肉特异性基因表达相关的几个位点,包括GATA、RUNX1、SREBP1、C/EBP和p300。RUNX1尤其令人关注,因为它直接与老化骨骼肌中观察到的与少肌症类似的肌肉萎缩的发展相关。靶向这些或mg29基因中的其它DNA调控元件的治疗方法会提供另外一种在治疗少肌症、肌肉疲劳和涉及骨骼肌病理的其它疾病中的操纵mg29表达的方法。
有几种用于在转录后水平靶向MG29表达的方法作为治疗方法。改变mg29基因或在MG29途径中具有调控作用的其它基因的DNA的染色质结构(甲基化、乙酰化等),基因启动子区域的特异性DNA序列或涉及转录起始/延长的蛋白质因子(聚合酶或其它通用转录因子,特异性转录因子、阻遏子和增强子)的方法可被用作各种肌肉疾病和少肌症的治疗方法。互补的或反义RNA或DNA序列、肽和化学小分子的应用代表了潜在的调节这些细胞过程和影响肌肉细胞的MG29表达水平的作用剂。
方法
细胞转染:从美国模式培养物研究所(American type Culture Collection,美国典型培养物保藏中心)(Manassas,VA)购买C2C12鼠成肌细胞系。在37℃和5%CO2的加湿环境中在DMEM培养基中培养C2C12细胞,对于HEK293细胞补充了10%的胎牛血清、100单位/ml青霉素和100ug/ml链霉素。为了诱导肌管分化,C2C12成肌细胞生长至汇合,培养基转变为含有2%马血清、青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)的DMEM。为了瞬时转染,将C2C12成肌细胞或HEK293细胞置于玻璃底培养皿或塑料多孔组织培养皿中的70%汇合处。24小时后,根据使用说明使用GeneJammer试剂(Stratagene)以质粒进行细胞转染。在转染后24-48小时或在单独实验指定的时间通过活细胞共聚焦成像可视化细胞。其它细胞被用于分离mRNA或蛋白质以进行Western印迹法和其它生化实验。在一些实验中,可以使C2C12成肌细胞在观察前在指定时间分化成肌管。
Western印迹法:使用标准技术进行免疫印迹。简单来说,收获C2C12或HEK293细胞,并通过具有蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)的冰冷的改进的RIPA缓冲液(150mM NaCl、5mM EDTA、1%NP40、20mM Tris-HCl、pH 7.5)进行裂解。在4-12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离20μg的总蛋白。
生物信息学:人MG29基因的转录起始位点上游的2kb序列被用于GenBank中的非重复基因组数据库的比对(BLAST)研究(www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/)。为了共有转录因子结合位点,将人MG29基因的转录起始位点的-702至-422区域进行数据库分析(www.cbrc.jp/research/db/TF SEARCH)。
跑台运动:将6只小鼠的组置于背部装配了电栅的水平的Exer-6M啮齿动物跑台上(Columbus Instruments),并连续适应4天。在第一天,它们以3.8m/分钟的速度跑5分钟;在第二天,4.8m/分钟达5分钟;第三天,5.8m/分钟达5分钟;第四天,6.8m/分钟达5分钟。在第五天,对照和实验小鼠同时以8.8m/分钟跑直至由两次跌落在电栅上表征的筋疲力尽(exhaustion),纪录直到筋疲力尽的运动时间。对于每一实验条件以三个对照和实验小鼠进行三次测试。
应理解只是以说明的目的通过实施例的方式提供本文所述的详细实施例和实施方式,决不能被理解为限定了本发明。所属领域的一般技术人员会被提示根据其的各种改进和变化,其包括在本申请的精神和范围内和被认为在所附权利要求的范围内。例如,可变化成分的相对量从而优化所需要的效果,可增加其它成分,和/或相似的成分可取代所述的一个或多个成分。通过所附权利要求,与本发明的***、方法和过程相关的其它优势特征和功能性会是显而易见的。
表1 UniProtKB/Swiss-Prot MG29基因/蛋白质结构同源性数据
表2 MG29同源物的CLUSTAL W(1.82)多序列比对
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其中,MOUSE指小鼠,RABIT指兔,HUMAN指人,BOVIN指牛,XENLA指非洲爪蟾,XENTR指热带爪蟾,RAT指大鼠,CHICK指鸡。
Claims (18)
1.一种调节肌肉功能的方法,包括给予有效量的调节肌肉细胞内的MG29基因表达、蛋白质水平、活性;MG29受体基因表达、蛋白质水平、活性或其组合中的至少一个的作用剂,其中所述作用剂有效调节肌肉功能。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述作用剂是MG29多肽、MG29受体多肽、编码MG29多肽的核酸、编码MG29受体多肽的核酸、能够杂交于MG29基因的核酸、能够杂交于MG29 mRNA转录物的核酸,或能够改变MG29基因表达、MG29 mRNA周转、MG29蛋白质活性或MG29蛋白-蛋白相互作用中的至少一个的化合物中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的方法,其中,所述有效量是0.1mg/kg体重/天至1000mg/kg体重/天。
4.根据权利要求1所述的方法,其中,所述组合物还包括药用载体或赋形剂。
5.根据权利要求2所述的方法,其中,所述作用剂能够通过抑制MG29mRNA结合蛋白的表达或活性来上调MG29蛋白质水平。
6.根据权利要求5所述的方法,其中,所述MG29结合蛋白与MG29mRNA转录物的3’UTR相互作用。
7.根据权利要求2所述的方法,其中,所述MG29多肽选自由SEQ IDNO.1至SEQ ID NO.20或其生物活性部分构成的组。
8.根据权利要求2所述的方法,其中,所述编码MG29多肽的核酸显示出与选自由SEQ ID NO.21至SEQ ID NO.26构成的组中的核酸具有至少30%的序列同源性。
9.根据权利要求2所述的方法,其中,所述能够杂交于MG29 mRNA转录物的核酸是抑制RNA或反义RNA中的至少一个。
10.根据权利要求9所述的方法,其中,所述抑制RNA是microRNA。
11.根据权利要求1所述的方法,其中,所述作用剂是能够分化成肌细胞的干细胞,其中所述干细胞被修饰使得其显示出MG29的增强的活性或表达。
12.一种治疗或预防肌肉病理的方法,包括给予有效量的调节肌肉细胞或组织中的MG29基因表达、蛋白质水平、活性;MG29受体基因表达、蛋白质水平、活性或其组合中的至少一个的作用剂,其中所述作用剂有效治疗或预防所述肌肉病理。
13.根据权利要求12所述的方法,其中,所述肌肉病理是选自由肌肉疲劳、肌肉萎缩、恶病质、少肌症、肌营养不良、心肌缺血、心力衰竭和离子通道疾病构成的组中的至少一种。
14.根据权利要求13所述的方法,其中,所述肌肉疲劳是年龄相关的肌肉疲劳。
15.根据权利要求13所述的方法,其中,所述肌肉疲劳是由于运动或用力。
16.一种筛选用于调节肌肉细胞或组织中的MG29基因表达、蛋白质水平、活性;MG29受体基因表达、蛋白质水平、活性或其组合中的至少一个的作用剂的方法,包括提供肌肉细胞或组织,测量MG29基因表达、蛋白质水平、活性;MG29受体基因表达、蛋白质水平、活性或其组合中的至少一个从而建立对照值;使测试作用剂接触所述肌肉细胞或组织;测量MG29基因表达、蛋白质水平、活性;MG29受体基因表达、蛋白质水平、活性或其组合中的至少一个,以及将所述对照值和所述测试值进行比较,其中在所述测试值和对照值之间观察到的变化表示作用剂能够调节肌肉细胞或组织中的MG29基因表达、蛋白质水平、活性;MG29受体基因表达、蛋白质水平、活性或其组合中的至少一个。
17.一种具有10至100个核苷酸的抑制寡核苷酸,其中,所述寡核苷酸与编码MG29多肽的核酸的至少一部分或编码MG29多肽的核酸的3’UTR或5’UTR内的区域杂交。
18.一种具有MG29的修饰等位基因、重组MG29转基因、包括MG29转基因或能够与MG29核酸杂交的核酸的载体中的至少一个的转基因生物。
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