CN102159092B - 含有维持了雌马酚产生能力的雌马酚产生微生物的发酵制品及其制备方法 - Google Patents

含有维持了雌马酚产生能力的雌马酚产生微生物的发酵制品及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于提供一种以活菌的状态含有维持了雌马酚产生能力的雌马酚产生微生物的发酵制品。使用雌马酚产生微生物，以大豆粉末或豆浆作为原料制备发酵物时，通过以下步骤可以制备以活菌的状态含有维持了雌马酚产生能力的微生物的发酵物：(1)使用雌马酚产生微生物，在黄豆苷原类的存在下、pH5.0以上、厌氧条件下进行发酵，由此制备母发酵剂；(2)使用上述母发酵剂，在黄豆苷原类的存在下、pH5.0以上进行发酵，由此制备生产用发酵剂；(3)使用上述生产用发酵剂，在含有大豆粉末或豆浆的培养基中发酵制备发酵物。

Description

含有维持了雌马酚产生能力的雌马酚产生微生物的发酵制品及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种以活菌的状态含有维持了雌马酚(equol)产生能力的雌马酚产生微生物的发酵制品及其制备方法。本发明还涉及一种组合物，所述组合物含有活菌状态的雌马酚产生微生物、且在保存后也能够稳定地维持该微生物的雌马酚产生能力。
背景技术
大豆中含有的异黄酮(大豆异黄酮；黄豆苷原(daidzein)、染料木黄酮(genistein)、黄豆黄素(glycitein))与***结构类似，具有随着与***受体(以下记作ER)的结合而产生的抗***作用及***样作用。迄今为止，大豆异黄酮的流行病学研究和介入研究提示了利用抗***作用得到的乳癌、***癌等激素依赖性癌的预防效果，或利用***样作用得到的更年期障碍、绝经后的骨质疏松症、高血脂症的改善效果。
近年，指出了上述大豆异黄酮的生理作用的活性本体可能是黄豆苷原的代谢物雌马酚。即，报道了与大豆异黄酮相比，雌马酚与ER的结合能力(特别是与ERβ的结合)强，向***和***组织等目标脏器的移行性非常高(参见非专利文献1-4)。另外报道了在患者-对照研究中，乳癌、***癌患者中雌马酚产生者显著少，还报道了分成雌马酚产生者和非产生者两组解析大豆异黄酮对绝经后的骨密度、脂质代谢的改善效果时，雌马酚产生者中显著被改善。
雌马酚由黄豆苷原经肠内细菌的代谢而产生，但是报道了雌马酚产生能力具有个体差异，日本人的雌马酚产生者的比例约为50％。即，日本人中有约50％不能产生雌马酚(雌马酚非产生者)，在这些人中，即使摄取大豆或大豆加工食品，也无法享受基于雌马酚的作用的有用的生理效果。因此认为：为了使雌马酚非产生者呈现基于雌马酚的作用的有用生理效果，使其摄取活菌状态下的雌马酚产生微生物是有效的。
另一方面，已经公知雌马酚产生微生物，例如，由本发明人等从人的肠内分离出了拟杆菌E-23-15(FERMBP-6435号)、链球菌E-23-17(FERMBP-6436号)、链球菌A6G225(FERMBP-6437号)及乳球菌20-92(FERMBP-10036号)(参见专利文献1及2)。
因此，认为如果能够提供以活菌的状态含有雌马酚产生微生物的发酵制品，则可以摄取雌马酚产生微生物，能够享受基于雌马酚产生微生物的有用效果。但是，存在下述问题：使用雌马酚产生微生物、按照通常的方法制备发酵制品时，该微生物的雌马酚产生能力丧失，不能得到以活菌的状态含有雌马酚产生微生物的发酵制品。进而，还存在下述问题：雌马酚产生微生物由于低pH条件或需氧保存等，雌马酚产生能力容易丧失的倾向强，所以即使能够制造维持了该微生物的雌马酚产生能力的发酵制品，也不能耐受保存，在流通阶段雌马酚产生能力被破坏。
以上述的现有技术作为背景，期望开发以活菌的状态含有维持了雌马酚产生能力的微生物的发酵制品。
专利文献1：国际公开第99/007392号说明书
专利文献2：国际公开第2005/000042号说明书
非专利文献1：MoritoK，HiroseT，KinjoJ，HirakawaT，OkawaM，NoharaT，OgawaS，InoueS，MuramatsuM，MasamuneY.Interactionofphytoestrogenswithestrogenreceptorsαandβ.BiolPharmBull24(4)：351-356，2001
非专利文献2：MaubachJ，BrackeME，HeyerickA，DepypereHT，SerreynRF，MareelMM，KeukeleireDD.Quantitationofsoy-derivedphytoestrogensinhumanbreasttissueandbiologicalfluidsbyhigh-performanceliquidchromatography.JChromatographyB784：137-144，2003
非专利文献3：MortonMS，ChanPSF，ChengC，BlacklockN，Matos-FerreiraA，Abranches-MonteiroL，CorreiaR，LloydS，GriffithsK.Lignansandisoflavonoidsinplasmaandprostaticfluidinmen：SamplesfromPortugal，HongKong，andtheUnitedKingdom.Prostate32：122-128，1997
非专利文献4：TammyEH，PaulDM，PaulGF，RobertD，StephenB，KennethJ，RayM，LorraineGO，KristiinaW，HollyMS，KarenJG.Long-termdietaryhabitsaffectsoyisoflavonemetabolismandaccumulationinprostaticfluidincaucasianmen.JNutr135：1400-1406，2005
发明内容
因此，本发明的目的在于提供一种以活菌的状态含有维持了雌马酚产生能力的雌马酚产生微生物的发酵制品。另外，本发明的另一个目的在于提供一种含有雌马酚产生微生物的组合物，所述组合物以活菌的状态含有维持了雌马酚产生能力的雌马酚产生微生物，并且在保存后也能稳定地维持雌马酚产生能力。
本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究，结果惊讶地发现通过在使用雌马酚产生微生物的发酵中，从母发酵剂(motherstarter)的制备到主发酵(mainfermentation)的各步骤中，根据使用的原料对发酵气氛及pH等进行特别的创新研究，采用可以适用于工业规模的方法，可以得到以活菌的状态含有维持了雌马酚产生能力的雌马酚产生微生物的发酵物。进而，本发明人等发现通过向以活菌的状态含有雌马酚产生微生物的组合物中添加抗坏血酸及/或其衍生物，可以得到能够稳定地保持雌马酚产生微生物的雌马酚产生能力、且保存稳定性优异的含有雌马酚产生微生物的组合物。具体而言，本发明人等发现如下发明。
(i)第1法的发酵物的制备方法
使用雌马酚产生微生物，用大豆粉末或豆浆作为原料制备发酵物时，通过以下步骤可以制备以活菌的状态含有维持了雌马酚产生能力的微生物的发酵物：(1)使用雌马酚产生微生物，在黄豆苷原类的存在下、pH5.0以上、厌氧条件下进行发酵，由此制备母发酵剂(motherstarter)；(2)使用上述母发酵剂，在黄豆苷原类的存在下、pH5.0以上进行发酵，由此制备生产用发酵剂(bulkstarter)；(3)使用上述生产用发酵剂，在含有大豆粉末或豆浆的培养基中发酵制备发酵物。
(ii)第2法的发酵物的制备方法
使用雌马酚产生微生物，用乳作为原料制备发酵物时，通过在黄豆苷原类的存在下、厌氧条件下使其发酵制备母发酵剂，进而在使用母发酵剂使乳原料发酵时，通过在黄豆苷原类的存在下、pH为4.6以上的条件下进行，可以制备以活菌的状态含有维持了雌马酚产生能力的微生物的发酵物。另外，该发酵物能够长期保持雌马酚产生微生物的雌马酚产生能力，且保存稳定性也优异。进而，通过在酵母提取物的存在下实施从母发酵剂的制备到乳原料的发酵所进行的全部发酵，可以进一步提高雌马酚产生微生物的雌马酚产生能力的维持和保存稳定性。
(iii)含有雌马酚产生微生物的组合物
通过向以活菌的状态含有雌马酚产生微生物的发酵制品中添加抗坏血酸及/或其衍生物，可以提供一种在保存后也不丧失雌马酚产生微生物的雌马酚产生能力的组合物。
本发明是基于上述的发现并通过进一步反复改良而完成的。
即，本发明提供下述方案的发明。
项1.一种发酵物的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)，在含有选自黄豆苷原糖苷、黄豆苷原及二氢黄豆苷原中的至少1种黄豆苷原类的培养基中，使用雌马酚产生微生物，在维持pH5.0以上的状态下进行厌氧发酵，由此制备母发酵剂；
步骤(2)，使用上述步骤(1)中所得的母发酵剂，在含有上述黄豆苷原类的培养基中，在维持pH5.0以上的状态下进行发酵，由此制备生产用发酵剂；及
步骤(3)，使用上述步骤(2)中所得的生产用发酵剂，在含有大豆粉末及/或豆浆的培养基中进行发酵，由此得到发酵物。
项2.如项1所述的制备方法，其中，雌马酚产生微生物为乳酸菌。
项3.如项1所述的制备方法，其中，雌马酚产生微生物为格氏乳球菌。
项4.一种发酵物的制备方法，包括以下步骤：
步骤(I)，在含有选自黄豆苷原糖苷、黄豆苷原及二氢黄豆苷原中的至少1种黄豆苷原类的培养基中，使用雌马酚产生微生物进行厌氧发酵，由此制备母发酵剂，及
步骤(II)，使用上述步骤(I)中得到的母发酵剂，在含有上述黄豆苷原类及乳的培养基中，在维持pH4.6以上的状态下进行发酵，由此得到发酵物。
项5.如项4所述的制造方法，其中，使用大豆胚轴提取物作为黄豆苷原类。
项6.如项4所述的制备方法，其中，上述步骤(I)及(II)中使用的培养基还含有酵母提取物。
项7.如项4所述的制备方法，其中，雌马酚产生微生物为乳酸菌。
项8.如项4所述的制备方法，其中，雌马酚产生微生物为格氏乳球菌。
项9.一种发酵制品，含有通过项1～3中任一项所述的制备方法得到的发酵物。
项10.一种发酵制品，含有通过项4～8中任一项所述的制备方法得到的发酵物。
项11.如项10所述的发酵制品，其中，pH为4.6以上。
项12.一种含有雌马酚产生微生物的组合物，含有(A)活菌状态的雌马酚产生微生物、及(B)选自抗坏血酸、其衍生物、及它们的盐中的至少1种。
项13.如项12所述的组合物，其中，以0.05～5重量％的配合比例含有上述(B)成分。
项14.如项12所述的组合物，其中，pH为5.0以下。
项15.如项12所述的组合物，含有使用雌马酚产生微生物进行发酵所得的发酵物作为活菌状态的雌马酚产生微生物。
项16.如项12所述的组合物，其中，所述组合物为发酵大豆饮料或发酵豆浆。
项17.如项12所述的组合物，其中，雌马酚产生微生物为乳酸菌。
项18.如项12所述的组合物，其中，雌马酚产生微生物为格氏乳球菌。
项19.一种雌马酚产生微生物的雌马酚产生性能的维持方法，其特征在于，向含有活菌状态的雌马酚产生微生物的组合物中添加选自抗坏血酸、其衍生物、及它们的盐中的至少1种。
根据本发明的制备方法，可以制备以活菌的状态含有维持了雌马酚产生能力的雌马酚产生微生物的发酵制品，因此在世界范围内首次实现提供以活菌的状态含有雌马酚产生微生物的饮料和食品。另外，即使在需要大量生产的工业规模中实施，本发明的制备方法也维持了雌马酚产生微生物的雌马酚产生能力并进行发酵，因此在商业上的实用性很高、极为有用。
如果能够提供以活菌的状态含有维持了雌马酚产生能力的雌马酚产生微生物的饮料和食品，则能够使不能产生雌马酚的人(雌马酚非产生者)获得雌马酚产生能力，因此根据本发明能够使雌马酚非生产者享受基于雌马酚的有效生理活性。
另外，根据本发明的含有雌马酚产生微生物的组合物，可以长期稳定地维持雌马酚产生微生物的雌马酚产生能力，具备可以充分耐受流通·销售的保存稳定性。特别是，本发明的含有雌马酚产生微生物的组合物为发酵大豆饮料或发酵豆浆的形态时，由于含有以黄豆苷原类为代表的来自大豆的有用成分，同时还含有活菌状态的雌马酚产生微生物，因此也存在雌马酚产生微生物容易在肠内生成雌马酚的优点。
附图说明
[图1]为在实施例4中测定的各饮料中所含的格氏乳球菌的活菌数的结果。
[图2]为在实施例4中测定的各饮料中所含的格氏乳球菌的雌马酚产生能力的结果。
具体实施方式
本发明中，所谓雌马酚产生微生物，是指具有同化选自黄豆苷原糖苷、黄豆苷原及二氢黄豆苷原中的至少1种黄豆苷原类产生雌马酚的能力(代谢活性)的微生物。此处，作为黄豆苷原糖苷，具体地可以举出黄豆苷、丙二酰黄豆苷、乙酰黄豆苷等。作为本发明中使用的雌马酚产生微生物，只要作为食品允许食用并具有雌马酚产生能力即可，没有特别限定。例如，已知在下述微生物中存在具有上述能力的微生物：格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)等属于乳球菌属的微生物；中间链球菌(Streptococcusintermedius)、星座链球菌(Streptococcusconstellatus)等属于链球菌属的微生物；粘膜乳杆菌(Lactobacillusmucosae)等属于乳杆菌属的微生物；卵形拟杆菌(Bacteroidesovatus)等属于拟杆菌属的微生物；屎肠球菌(Enteroccusfaecium)等属于肠球菌属的微生物；大芬戈尔德菌(Finegoldiamagna)等属于芬戈尔德菌属的微生物；属于韦荣氏球菌(Veillonella)属的微生物；Adlercreutziaequolifaciens等属于Adlercreutzia属的微生物；粘液真杆菌(Eubacteriumlimosum)等属于真杆菌属的微生物；Eggerthellahongkongenis等属于埃格特菌(Eggerthella)属的微生物；青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)等属于双歧杆菌属的微生物；属于史雷克氏菌(Slackia)属的微生物；属于不动杆菌属(Acinetobacter)属的微生物等。在雌马酚产生微生物中，优选为乳球菌属、链球菌属、乳杆菌属及双歧杆菌属等乳酸菌，更优选属于乳球菌属的乳酸菌，可以特别优选举出格氏乳球菌。雌马酚产生微生物，例如可以以有无雌马酚的产生能力作为指标，从人类肠内中分离。对于上述雌马酚产生微生物，已经保藏了由本发明人等从人类肠内分离鉴定的菌，即乳球菌20-92(FERMBP-10036号)、链球菌E-23-17(FERMBP-6436号)、链球菌A6G225(FERMBP-6437号)及拟杆菌属E-23-15(FERMBP-6435号)，本发明中可以使用上述保藏菌。另外，作为雌马酚产生微生物，也可以使用Eubacteriumlimnosus(ATCC8486)、埃格特菌属(KCC10490)、Adlercreutziaequolifaciens(JCM14793)、EggerthellahongkongenisHKU10(JCM14552)、青春双歧杆菌TM-1(FERMP-20325号)、短双歧杆菌(JCM1273)、史雷克氏菌TM30(FERMAP-20729号)、革兰氏阳性菌do03(AHU-1763)(FERMAP-20905号)等。在上述的保藏菌中，本发明中优选使用乳球菌20-92。
以下，详细说明本发明的发酵物的制备方法(第1法和第2法)、发酵制品、及含有雌马酚产生微生物的组合物。第1法为以大豆粉末及/或豆浆作为原料制备发酵物的方法，第2法为以乳作为原料制备发酵物的方法。
在本说明书中，所谓母发酵剂是指由储用培养物制备的发酵剂(种菌)，所谓生产用发酵剂是指使用母发酵剂制备的发酵剂(种菌)，在利用主发酵大量生产发酵物时作为发酵剂使用。
1.发酵物的制备方法(第1法)
该第1法的发酵物的制备方法包括下述步骤：制备母发酵剂(以下也记作“母发酵剂-1”)的步骤(1)；使用母发酵剂-1制备生产用发酵剂(以下也记作“生产用发酵剂-1”)的步骤(2)；及使用生产用发酵剂-1，以大豆粉末或豆浆作为原料制备发酵物的步骤(3)。以下，详细说明该第1法的发酵物的制备方法的每个步骤。
步骤(1)
本发明中，首先，在含有黄豆苷原类的培养基(以下也记作“母发酵剂培养基-1”)中，在维持pH5.0以上的状态下，对雌马酚产生微生物进行厌氧发酵，由此制备母发酵剂(以下也记作“母发酵剂-1”)(步骤(1))。
母发酵剂培养基-1以雌马酚产生微生物可以生长且允许作为食品成分为限，母发酵剂没有特别限定，可以根据最终制备的发酵物的种类适当设定其组成。
母发酵剂培养基-1中使用的黄豆苷原类包括黄豆苷原糖苷、黄豆苷原及二氢黄豆苷原中的1种或2种以上的黄豆苷原类。作为黄豆苷原糖苷，具体地可以举出黄豆苷、丙二酰黄豆苷、乙酰黄豆苷等。本发明中，作为上述黄豆苷原类，可以使用黄豆苷原类的纯品、黄豆苷原类的粗精制品及含有黄豆苷原类的物质中的任一种。作为含有黄豆苷原类的物质，可以举出大豆、豆浆、大豆胚轴、葛、葛根、红地球葡萄(redglobegrape)、苜蓿及它们的提取物(水、含水酒精等极性溶剂提取物)等。从稳定地维持雌马酚产生微生物的雌马酚产生能力的观点考虑，作为本发明中使用的黄豆苷原类，优选大豆、豆浆、大豆胚轴或其提取物，特别优选大豆。
此处，使用大豆作为黄豆苷原类时，优选举出粉末化后的大豆，更优选举出蒸煮或煮沸并且粉末化后的大豆，特别优选举出在65～105℃下蒸煮或煮沸30秒～30分钟并粉末化后的大豆。另外，对于粉末化后的大豆的平均粒径没有特别限定，但一般而言，从使制备的发酵物具备良好的口感的观点考虑，优选中值粒径约为50μm左右以下。另外，优选粒径150μm以上的粒子为10％以下。需要说明的是，上述粒径使用激光衍射/散射式粒度分布测定装置进行测定。
作为母发酵剂培养基-1中的黄豆苷原类含有物的配合比例，例如，可以举出黄豆苷原类的总量为0.002～0.04重量％，优选为0.004～0.02重量％，更优选为0.008～0.012重量％的比例。更具体而言，使用大豆粉末作为黄豆苷原类时，可以举出母发酵剂培养基-1中大豆粉末换算成干燥重量时为3～28重量％，优选为5～28重量％，更优选为7～17重量％的比例。另外，使用大豆胚轴提取物作为黄豆苷原类时，可以举出母发酵剂培养基-1中大豆胚轴提取物换算为干燥重量时为0.005～0.1重量％，优选为0.01～0.05重量％，更优选为0.02～0.03重量％的比例。通过以上述的配合比例含有黄豆苷原类，可以在不破坏雌马酚产生能力的情况下使雌马酚产生微生物增殖，得到母发酵剂-1。
另外，为了促进雌马酚产生微生物的生长，母发酵剂培养基-1中可以含有精氨酸等氨基酸、抗坏血酸等维生素类、焦磷酸铁等微量金属。母发酵剂为了使雌马酚产生微生物的生长良好，优选在母发酵剂培养基-1中添加精氨酸，作为母发酵剂培养基-1中的精氨酸的配合比例，例如可以举出为0.01～1重量％，优选为0.05～0.3重量％。
进而，根据需要，除上述成分之外，还可以在母发酵剂培养基-1中添加氮源、碳源等营养素。
母发酵剂培养基-1有时影响发酵物的味道，因此可以优选举出对发酵物味道没有不良影响的培养基。
母发酵剂培养基-1通过混合规定量的添加成分、根据需要使其乳化、然后进行杀菌处理而制备。
本步骤(1)中，雌马酚产生微生物的厌氧发酵可以通过使用气体容器(gaspacks)和厌氧罐的现有的公知方法实施。
另外，本步骤(1)中，维持pH为5.0以上、优选为5.5～8.0、更优选为6.0～8.0进行厌氧发酵。通过如上所述维持pH，可以在不破坏雌马酚产生能力的情况下使雌马酚产生微生物增殖，制备母发酵剂-1，通过该第1法的制备方法最终得到的发酵物中，可以稳定地维持该微生物的雌马酚产生能力。上述厌氧发酵中的pH的控制可以利用公知的方法实施。例如，在使用的培养基中，设定被雌马酚产生微生物同化的糖类(例如葡萄糖等)的配合比例为0.5重量％以下、优选为0.4重量％以下、更优选为0.3重量％以下时，即使发酵进行，pH也不降低，因此可以维持厌氧发酵中的pH在上述范围内。另外，厌氧发酵中的pH的控制也可以通过适当添加pH调节剂进行。
本步骤(1)中的厌氧发酵如下实施：将雌马酚产生微生物的种菌接种在母发酵剂培养基-1上，在该微生物可生长的温度区域、优选在该微生物的最佳温度区域下，使其厌氧发酵20～96小时，优选72～96小时。更具体而言，使用乳酸菌作为雌马酚产生微生物时，例如可以在35～39℃下进行厌氧发酵72～96小时。
如上所述得到的母发酵剂-1含有雌马酚产生微生物，所述雌马酚产生微生物增殖且为维持了雌马酚产生能力的状态。
如上所述得到的母发酵剂可以直接供给至接下来的步骤(2)，同时也可以根据需要，使用该母发酵剂作为种菌，在与上述条件相同的条件下进一步制备母发酵剂，在接下来的生产中使用。使用制备的母发酵剂、在与上述条件相同的条件下再次制备母发酵剂的步骤可以重复1次或数次，例如1～10次左右。即使如上所述重复实施发酵，只要满足上述条件，则在母发酵剂-1中就可以以维持了雌马酚产生能力的状态含有雌马酚产生微生物。
步骤(2)
接着，使用上述步骤(1)中得到的母发酵剂-1，在含有上述黄豆苷原类的培养基中(以下也记作“生产用发酵剂培养基-1”)，在维持pH5.0以上的状态下进行发酵，由此制备生产用发酵剂-1(以下也记作“生产用发酵剂-1”)(步骤(2))。
生产用发酵剂培养基-1为含有上述黄豆苷原类的培养基，以雌马酚产生微生物可以生长且允许作为食品成分为限，没有特别限定，可以根据发酵物的种类适当设定。
生产用发酵剂培养基-1通过含有黄豆苷原类，可以在维持雌马酚产生微生物的雌马酚产生能力的状态下使其增殖。关于生产用发酵剂培养基-1中配合的上述黄豆苷原类的种类及配合比例，与下述的主发酵用培养基-1相同。
另外，生产用发酵剂培养基-1中，除上述黄豆苷原类之外，可配合的添加成分的种类及配合比例与上述母发酵剂培养基-1相同。另外，生产用发酵剂培养基-1有时影响发酵物的味道，因此可以优选举出对发酵物的味道没有不良影响的培养基，进而优选举出与上述母发酵剂培养基-1的组成相同的培养基。
生产用发酵剂培养基-1可以通过混合规定量的配合成分、根据需要使其乳化、然后进行杀菌处理而制备。
该步骤(2)中，厌氧发酵通过维持pH为5.0以上，优选为5.5～8.0，更优选为6.0～8.0而进行。通过如上所述维持pH，可以在不破坏雌马酚产生能力的情况下使雌马酚产生微生物增殖，制备生产用发酵剂-1，通过该第1法的制备方法最终获得的发酵物中，可以稳定地维持该微生物的雌马酚产生能力。上述发酵中的pH的控制可以通过与上述步骤(1)同样的方法进行。
另外，该步骤(2)中，发酵可以在需氧或厌氧中的任一气氛下进行，但从制备成本的降低、操作简便性等观点考虑，优选在需氧气氛下进行。雌马酚产生微生物在需氧气氛下容易丧失雌马酚产生能力，但通过控制培养中的pH条件在特定范围内，即使在需氧气氛下，也可以维持雌马酚产生能力。
本步骤(2)中的发酵如下实施：向生产用发酵剂培养基-1中添加例如0.5～10容量％左右、优选1～5容量％左右的上述步骤(1)中得到的母发酵剂-1，在该微生物可以生长的温度区域、优选在该微生物的最佳温度区域内使其发酵10～28小时，优选为14～24小时。更具体而言，使用乳酸菌作为雌马酚产生微生物时，例如，可以在35～39℃下发酵14～24小时。
如上所述得到的生产用发酵剂-1含有雌马酚产生微生物，所述雌马酚产生微生物增殖且为维持雌马酚产生能力的状态。
生产用发酵剂-1可以被直接供给到接下来的步骤(3)中，但根据需要，也可以使用生产用发酵剂-1作为发酵剂(1次生产用发酵剂)，再次实施本步骤(2)，制备2次生产用发酵剂，将所述的2次生产用发酵剂供给到接下来的步骤(3)中。
步骤(3)
接着，使用上述步骤(2)中获得的生产用发酵剂-1，在含有大豆粉末及/或豆浆的培养基(以下也记作“主发酵用培养基-1”)中进行发酵，由此制备发酵物(步骤(3))。
主发酵用培养基-1为含有大豆粉末及豆浆中至少一种的培养基，以雌马酚产生微生物可以生长且允许作为食品成分为限，没有特别限定。
含有被用作主发酵用培养基-1的大豆粉末的培养基，具体而言可以举出含有大豆粉末的水溶液。主发酵用培养基-1中使用的大豆粉末，从使味道和口感良好、进而抑制大豆气味的观点考虑，优选使用实施了利用蒸煮或煮沸的加热处理的大豆粉末。作为如上所述实施了加热处理的大豆粉末，具体而言，可以举出将在65～105℃下蒸煮或煮沸30秒～30分钟后的大豆进行粉末化所得的大豆粉末。对于大豆粉末的平均粒径，没有特别限定，但一般来说，从使制备的发酵物具备良好的口感的观点考虑，优选中值粒径约为50μm左右以下。另外，优选粒径150μm以上的粒子为10％以下。需要说明的是，上述粒径使用激光衍射/散射式粒度分布测定装置进行测定。使用含有大豆粉末的水溶液作为主发酵用培养基-1时，优选向水中添加大豆粉末，使用均化器等进行均质化处理。通过如上所述进行均质化处理，可以赋予制备的发酵物优异的口感，特别是赋予润滑的口感。另外，使用含有大豆粉末的水溶液作为主发酵培养基-1时，对于该水溶液中的大豆粉末的配合比例没有特别限定，例如，可以举出大豆粉末换算成干燥重量时为3～28重量％，优选为5～28重量％，更优选为7～17重量％。
使用含有豆浆的培养基作为主发酵用培养基-1时，可以直接使用豆浆作为主发酵用培养基-1。豆浆的制备方法在该技术领域是公知的。具体而言，豆浆可以如下制备：将脱皮的原料大豆磨碎，将其加入水中进行湿式粉碎，由此制备悬浮液(生豆；豆汁)，根据需要对该悬浮液进行加热处理后，通过固液分离处理除去固体成分(豆渣)。
另外，主发酵用培养基-1也可以在上述的组成中进一步含有其他添加成分。由于主发酵用培养基-1的组成对制备的发酵物的味道和口感有影响，所以配合的其他添加成分可以根据制备目标发酵物的种类适当确定。作为主发酵用培养基-1中配合的添加成分，例如可以举出蔗糖、三氯蔗糖、甜菊等甜味剂；咖啡提取物、红茶提取物等调味剂；香料；果汁、水果片、蔬菜汁、蔬菜片等植物来源成分；葡糖酸等酸化剂；钠、钾、钙、锌、铁等金属；抗坏血酸等维生素类等。由于在本步骤(3)的发酵中没有必要抑制pH的降低，所以主发酵用培养基-1中可以含有包括被雌马酚产生微生物同化的糖类(蔗糖、葡萄糖等)等在内的甜味剂和植物来源成分。
主发酵用培养基-1通过混合规定量的成分、根据需要使其乳化、然后进行杀菌处理而制备。
本步骤(3)中的发酵，可以向主发酵用培养基-1中添加例如0.5～10容量％左右、优选1～5容量％左右的上述步骤(2)中得到的生产用发酵剂-1，在该微生物可以生长的温度区域、优选在该微生物的最佳温度区域内搅拌或静置10～28小时，优选14～24小时。更具体而言，使用乳酸菌作为雌马酚产生微生物时，可以在35～39℃下发酵14～24小时。
本步骤(3)中的主发酵可以在需氧或厌氧中的任一气氛下进行，但从制备成本的降低、操作简便性等观点考虑，优选在需氧气氛下进行。
另外，在本步骤(3)的发酵中，没有必要特别控制发酵中的pH。通常认为随着本步骤(3)中发酵的进行，发酵物中的pH有降低到约5.0以下的倾向。
雌马酚产生微生物通常在需氧气氛及pH约5.0以下丧失雌马酚产生能力的倾向增强，但根据本第1法的制备方法，使用通过上述步骤(1)及(2)制备的生产用发酵剂-1进行最后阶段的发酵，由此可以制备以活菌的状态含有维持了雌马酚产生能力的雌马酚产生微生物的发酵物。
使用含有大豆粉末的培养基作为主发酵用培养基-1时，作为发酵物最终得到了用作饮料和食品的发酵大豆。另外，使用含有豆浆的培养基作为主发酵用培养基-1时，作为发酵物最终得到了用作饮料和食品的发酵豆浆。本第1法的制备方法适用于制备发酵大豆饮料和食品，即，制造使含有大豆粉末的培养基发酵所得的发酵物。
如上所述得到的发酵物以活菌的形式含有维持了雌马酚产生能力的雌马酚产生微生物。
2.发酵物的制备方法(第2法)
本第2法的发酵物的制备方法包括：制备母发酵剂(以下也记作“母发酵剂-2”)的步骤(I)和使用母发酵剂-2、以乳作为原料进行发酵的步骤(II)。以下，详细说明本发明的制备方法的每个步骤。
步骤(I)
本发明中，首先，通过在含有黄豆苷原类的培养基(以下记作“母发酵剂培养基-2”)中对雌马酚产生微生物进行厌氧发酵，制备母发酵剂(步骤(I))。
母发酵剂培养基-2以含有黄豆苷原类、且雌马酚产生微生物可以生长、并且允许作为食品成分为限，对其组成没有特别限定，可以根据发酵物的种类适当设定。
关于母发酵剂培养基-2中使用的黄豆苷原类，与上述第1法的母发酵剂培养基-1中使用的黄豆苷原类相同，但在本第2法的制备方法中，从稳定地维持雌马酚产生微生物的雌马酚产生能力的观点考虑，优选大豆胚轴或其提取物，特别优选大豆胚轴的提取物。
母发酵剂培养基-2中配合的上述黄豆苷原类的配合比例，与上述第1法中使用的母发酵剂培养基-1相同。
另外，母发酵剂培养基-2除上述成分之外，还可以含有其他添加成分。母发酵剂培养基-2中可以配合的其他添加成分的种类及配合比例，与上述第1法中使用的母发酵剂培养基-1相同。
特别是，优选在母发酵剂培养基-2中含有酵母提取物、酵母水解物等来自酵母的成分、乳清水解物、酪蛋白水解物等发酵促进剂。该第2法的制备方法中，来自酵母的成分、特别是酵母提取物能够有效地发挥稳定地维持雌马酚产生微生物的雌马酚产生能力的作用。向母发酵剂培养基-2中添加酵母提取物时，作为其配合比例，可以举出通常为0.0125重量％以上，优选为0.05～1重量％，更优选为0.1～0.2重量％。酵母提取物的浓度满足上述范围时，在最终制备的发酵物中，也可以长期稳定地维持雌马酚产生微生物的雌马酚产生能力。
母发酵剂培养基-2有时影响最终制备的发酵物的味道，因此优选可以举出对发酵物的味道没有不良影响的培养基，例如除上述成分之外，可以举出含有乳及根据需要含有乳脂肪含有成分的培养基。母发酵剂培养基-2中配合的乳及含有乳脂肪成分的种类及配合比例，与下述的发酵用培养基-2相同。作为母发酵剂培养基-2的一个优选例，可以举出与步骤(II)中使用的主发酵用培养基-2的组成相同的培养基。
母发酵剂培养基-2通过混合规定量的添加成分、根据需要使其乳化、然后进行杀菌处理来制备。
在本步骤(I)中，雌马酚产生微生物的厌氧发酵可以通过使用气体容器和厌氧罐的现有的公知方法实施。
另外，本步骤(I)中，优选维持厌氧发酵中的pH为4.6以上、优选为5.0～7.0、更优选为5.5～6.5。通过如上所述维持pH，可以增强本发明的效果，即，在不破坏雌马酚产生能力的情况下使雌马酚产生微生物增殖、并且在制备后也稳定地维持该微生物的雌马酚产生能力。上述厌氧发酵中的pH的控制可以通过与上述第1法的步骤(1)同样的方法进行。
本步骤(I)中的厌氧发酵如下实施：将雌马酚产生微生物的种菌接种在母发酵剂培养基-2上，在该微生物可以生长的温度区域、优选在该微生物的最佳温度区域下使其厌氧发酵20～28小时，优选22～26小时。更具体而言，使用乳酸菌作为雌马酚产生微生物时，例如可以在35～39℃下厌氧发酵22～26小时。
如上所述得到的母发酵剂-2包含雌马酚产生微生物，所述雌马酚产生微生物增殖且为维持雌马酚产生能力的状态。
步骤(II)
接着，使用上述步骤(I)中得到的母发酵剂-2，在维持pH4.6以上的状态下使含有上述黄豆苷原类的培养基(以下记作“主发酵用培养基-2”)发酵(以下也记作“主发酵”)(步骤(II))。
本步骤(II)中，可以向主发酵用培养基-2中添加上述步骤(I)中得到的母发酵剂-2进行主发酵，但大量生产发酵乳制品时，可以使用该母发酵剂-2进一步制备生产用发酵剂(以下也记作“生产用发酵剂-2”)，将生产用发酵剂-2添加到主发酵用培养基中进行主发酵。
生产用发酵剂-2的制备中使用的培养基(以下记作“生产用发酵剂培养基-2”)，可以使用含有上述黄豆苷原类的培养基。如上所述，通过配合黄豆苷原类，可以在维持雌马酚产生微生物的雌马酚产生能力的状态下使其增殖。生产用发酵剂培养基-2中配合的上述黄豆苷原类的种类及配合比例，与上述母发酵剂培养基-2相同。
另外，生产用发酵剂培养基-2以含有上述黄豆苷原类、雌马酚产生微生物可以生长、且允许作为食品成分为限，没有特别限定，可以根据发酵物的种类适当设定。生产用发酵剂培养基-2中，对于除上述黄豆苷原类之外可以配合的添加成分的种类及配合比例，与上述母发酵剂培养基-2相同。需要说明的是，为了稳定地维持雌马酚产生微生物的雌马酚产生能力，生产用发酵剂培养基-2中也优选含有来自酵母的成分、特别是酵母提取物。另外，生产用发酵剂培养基-2有时对发酵物的味道有影响，因此优选含有乳、及根据需要含有的乳脂肪含有成分。
作为生产用发酵剂培养基-2，优选举出对发酵物的味道没有不良影响的培养基，更优选举出与主发酵用培养基-2的组成相同的培养基。
生产用发酵剂培养基-2通过混合规定量的配合成分、根据需要使其乳化、然后进行杀菌处理而制备。
为了制备生产用发酵剂-2，可以向生产用发酵剂培养基-2中添加例如约为1～10容量％、优选约为1～5容量％的上述步骤(I)中得到的母发酵剂-2，在该微生物的可生长的温度区域、优选在该微生物的最佳温度区域内使其发酵20～28小时，优选22～26小时。更具体而言，使用乳酸菌作为雌马酚产生微生物时，例如在35～39℃下发酵22～26小时。
生产用发酵剂-2的制备中，发酵可以在需氧或厌氧中的任一气氛下进行，但从制备成本的减少、操作简便性等观点考虑，优选在需氧气氛下进行。
另外，在生产用发酵剂-2的制备中，对于发酵中的pH没有特别限定，但例如优选维持为pH4.6以上，优选为5.0～7.0，更优选为5.5～6.5。通过如上所述维持pH，可以在不破坏雌马酚产生能力的情况下使雌马酚产生微生物增殖。上述发酵中的pH控制，可以利用与上述步骤(I)同样的方法进行。
生产用发酵剂-2可以直接供给到接下来的主发酵中，根据需要，也可以使用生产用发酵剂-2作为发酵剂(1次生产用发酵剂)，在与制备生产用发酵剂-2时的条件相同的条件下再次实施发酵，制备2次生产用发酵剂，将该2次生产用发酵剂供给到接下来的主发酵中。
本步骤(II)中使用的主发酵用培养基-2以含有上述黄豆苷原类及乳、雌马酚产生微生物可以生长、且允许作为食品成分为限，没有特别的限定。
主发酵用培养基-2使用的黄豆苷原类与上述第1法的母发酵剂用培养基-1中使用的黄豆苷原类相同，但该第2法的制备方法中，从稳定地维持雌马酚产生微生物的雌马酚产生能力的观点考虑，优选为大豆胚轴或其提取物，特别优选为大豆胚轴的提取物。
主发酵用培养基-2中配合的上述黄豆苷原类的配合比例与上述母发酵剂培养基-2相同。
另外，作为主发酵用培养基-2中使用的乳，只要是允许作为食品的乳即可，例如可以举出牛奶、山羊奶、羊奶等动物奶；脱脂奶；将脱脂奶粉或全奶粉溶解所得的复原乳等。
另外，主发酵用培养基-2中，为了改善制备的发酵物的味道，主发酵用培养基-2中可以含有新鲜奶油、黄油等乳脂肪含有成分。作为上述乳脂肪含有成分的配合比例，换算成乳脂肪的量，可以举出通常为0.1～4.5重量％，优选为0.5～4.2重量％，更优选为1.0～3.5重量％。
另外，主发酵用培养基-2中，除上述成分之外可以配合的添加成分的种类及配合比例与上述母发酵剂培养基-2相同。需要说明的是，为了稳定地维持雌马酚产生微生物的雌马酚产生能力，主发酵用培养基-2中也优选含有来自酵母的成分，特别是酵母提取物。
主发酵用培养基-2通过混合规定量的乳、上述黄豆苷原类、及根据需要的其他添加成分，根据需要使其乳化，然后进行杀菌处理而制备。
本步骤(II)中的主发酵可以如下进行：向主发酵用培养基-2中添加例如约1～10容量％、优选约1～5容量％上述步骤(I)中得到的母发酵剂-2或上述生产用发酵剂-2，在该微生物可以生长的温度区域、优选在该微生物的最佳温度区域内搅拌或静置20～28小时、优选为22～26小时。更具体而言，使用乳酸菌作为雌马酚产生微生物时，可以在35～39℃下发酵22～26小时。
本步骤(II)中的主发酵可以在需氧或厌氧中的任一气氛下进行，但从制备成本的减少、操作简便性等观点考虑，优选在需氧气氛下进行。
另外，在本步骤(II)中的主发酵中，维持发酵中的pH为4.6以上，优选为5.0～7.0，更优选为5.5～6.5。通过如上所述维持pH，可以在不破坏雌马酚产生能力的情况下使雌马酚产生微生物增殖，且制备后也能够稳定地维持该微生物的雌马酚产生能力。上述发酵中的pH的控制可以通过与上述步骤(I)相同的方法进行。
本第2法的制备方法中，制备发酵乳作为发酵物。在该发酵物中以不丧失雌马酚产生能力的活菌状态含有雌马酚产生微生物。
3.发酵制品
进而，本发明提供一种含有使用上述第1法及第2法得到的发酵物的发酵制品。即，使用上述第1法及第2法得到的发酵物，可以直接或根据需要配合下述的添加成分并作为发酵制品被提供，所述添加成分例如为蔗糖、三氯蔗糖、甜菊等甜味剂；咖啡提取物、红茶提取物等调味剂；香料；大豆粉末、大豆片、果汁、水果片、蔬菜汁、蔬菜片等来自植物的成分；钠、钾、钙、锌、铁等金属；抗坏血酸等维生素；胶凝剂；葡糖酸等稳定剂；水等稀释剂等。特别优选提供上述第1法中得到的发酵物作为与含有大豆粉末的水溶液混合所得的发酵制品。
在主发酵制品中，对于利用上述第1法及第2法得到的发酵物的配合比例没有特别限定，可以举出例如为5～100重量％，优选为10～100重量％。
对于主发酵制品的pH没有特别限定。例如，重视长期稳定地维持发酵制品中的雌马酚产生微生物的雌马酚产生能力时，优选将pH调节为4.6以上，优选为5.0～7.0，更优选为5.5～6.5。另一方面，由于担心在中性区域中杂菌繁殖而重视抑制杂菌繁殖时，优选将pH调节为5.0以下，优选为4.0～4.8，更优选为4.2～4.6。
主发酵制品的形态根据制备时使用的主发酵培养基的种类、采用上述第1法或第2法得到的发酵物的种类、发酵物中配合的添加成分的种类等确定，可以为液态、半固态、固态、凝胶状中的任一种。作为主发酵制品形态的优选例，可以举出发酵大豆饮料和食品、发酵豆浆饮料和食品、发酵乳等。此处，发酵乳中包括酸奶(硬型、软型、饮料型)、乳酸菌饮料等。
由于主发酵制品中以活菌的状态含有雌马酚产生微生物，因此优选在低温下流通、销售。
由于主发酵制品以活菌的状态含有维持了雌马酚产生能力的雌马酚产生微生物，所以能够实现基于该微生物的各种生理活性和药理活性。因此，除一般的饮料和食品之外，主发酵制品还能够用作特定保健用饮料和食品、营养补充饮料和食品、功能性饮料和食品、病人用饮料和食品等。
例如，主发酵制品被摄取，在肠内可以通过雌马酚产生微生物的作用生成雌马酚，可以有效地享有基于雌马酚的生理活性，因此在以下的用途中有用：例如更年期障碍、骨质疏松症、***增生、代谢症候群等疾病和症状的预防或改善、血中胆固醇值的降低、美白、痤疮的改善、调整肠道、改善肥胖及利尿等。其中，主发酵制品对中老年女性中的症状不定的自诉或绝经伴有的症状(例如骨质疏松症、更年期障碍等)的预防或改善特别有用。
主发酵乳制品的每日的摄取量根据主发酵乳制品中的雌马酚产生微生物的菌数、摄取者的年龄和体重、摄取次数等而不同，例如，作为成人每1日的摄取量，可以举出相当于主发酵制品10～500g的量。
4.含有雌马酚产生微生物的组合物
通过向以活菌的状态含有雌马酚产生微生物的组合物中添加选自抗坏血酸、其衍生物、及它们的盐中的至少1种，在低pH条件或需氧保存条件下也可以稳定地保持雌马酚产生微生物的雌马酚产生能力，即使长期保存，也可以抑制该组合物中雌马酚产生微生物的雌马酚产生能力的丧失。因此，本发明进而提供了一种含有雌马酚产生微生物的组合物(以下有时也简单记作“本组合物”)，所述组合物含有活菌状态的雌马酚产生微生物(以下有时也简单记作“(A)成分”)以及选自抗坏血酸、其衍生物及它们的盐中的至少1种(以下有时也简单记作“(B)成分”)。
本组合物中，作为雌马酚产生微生物，可以使用分离或粗精制的雌马酚产生微生物的活菌，或者也可以使用利用雌马酚产生微生物使其发酵所得的发酵物。
本组合物中含有的雌马酚产生微生物的浓度没有特别限定，作为一个例子可以举出为1×105～1010CFU/g，优选为1×106～1010CFU/g，更优选为1×107～1010CFU/g。
为了稳定地保持雌马酚产生微生物的雌马酚产生能力，在本组合物中配合(B)成分。(B)成分中，关于抗坏血酸的衍生物没有特别的限定，只要为通过酯键或醚键键合有取代基、且允许作为食品成分的衍生物即可，作为具体例，可以举出抗坏血酸-2，6-二棕榈酸酯、抗坏血酸-6-硬脂酸酯、抗坏血酸-2-磷酸酯、抗坏血酸-2-硫酸酯、抗坏血酸-2-葡糖苷、抗坏血酸葡糖胺、抗坏血酸-6-棕榈酸酯、L-抗坏血酸四异棕榈酸酯、抗坏血酸四2-己基癸酸酯等。另外，作为抗坏血酸及它的衍生物的盐没有特别限定，只要允许作为食品成分即可，例如可以举出钠等碱金属盐。(B)成分中，作为优选例可以举出抗坏血酸及其盐。本组合物中，(B)成分可以单独使用1种，也可以组合2种以上进行使用。
作为本组合物中的上述(B)成分的配合比例，可以举出通常为0.05～5重量％，优选为0.05～2重量％，更优选为0.1～2.0重量％。通过满足上述的配合比例，可以稳定地保持雌马酚产生微生物的雌马酚产生能力。
关于本组合物的pH没有特别限定，可以根据本组合物的种类等适当设定。从抑制本组合物中杂菌繁殖的观点考虑，优选将pH调节为5.0以下，优选为4.0～4.8，更优选为4.2～4.6是理想的。通常，雌马酚产生微生物在pH5.0以下的环境下，丧失雌马酚产生能力的倾向变强，不能稳定地维持雌马酚产生能力，但根据本组合物，通过抗坏血酸及/或其衍生物的作用，即使在pH5.0以下的条件下，也可以稳定地维持雌马酚产生微生物的雌马酚产生能力。
本组合物中，根据需要可以含有下述添加成分：蔗糖、三氯蔗糖、甜菊等甜味剂；咖啡提取物、红茶提取物等调味剂；香料；果汁、水果片、蔬菜汁、蔬菜片等来自植物的成分；钠、钾、钙、锌、铁等金属；β-胡萝卜素等维生素；胶凝剂；葡糖酸等稳定剂；水等稀释剂等。此处，为了不损害保存稳定性，本组合物中配合的添加成分优选为不被雌马酚产生微生物同化的物质。
关于本组合物的形态也没有特别限制，可以为液态、半固态、固态、凝胶状等中的任一种。
作为本组合物的优选形态，可以举出在利用雌马酚产生微生物进行发酵所得的发酵物中配合抗坏血酸及/或其衍生物、并且根据需要配合了其他添加成分所得的发酵制品。此处，作为利用雌马酚产生微生物进行发酵所得的发酵物，可以优选举出通过上述第1法及第2法制备的发酵物。另外，作为该发酵制品，具体而言，可以举出发酵大豆饮料和食品、发酵豆浆饮料和食品、发酵乳等。此处，发酵乳中包括酸奶(硬型、软型、饮料型)、乳酸菌饮料等。上述的发酵制品中，可以优选举出发酵大豆饮料和食品及发酵豆浆饮料和食品，更优选举出发酵大豆饮料和食品。
另外，作为本组合物的其他优选形态，可以举出含有分离或粗精制的雌马酚产生微生物的活菌、抗坏血酸及/或其衍生物、可食用载体及根据需要添加的其他添加成分的组合物。此处，作为可食用的载体，例如可以举出含有大豆粉末的水溶液、豆浆、水、可食用凝胶、乳、各种盐溶液等。
由于本组合物中以活菌的状态含有雌马酚产生微生物，所以优选在低温下流通、销售。
由于本组合物以作为活菌且维持了雌马酚产生能力的状态含有雌马酚产生微生物，所以可以实现基于该微生物的各种生理活性和药理活性。因此，本组合物可以在药物或饮料和食品的领域中使用。
在饮料和食品领域中使用本组合物时，除一般的饮料和食品之外，本组合物还可以作为特定保健用饮料和食品、营养补充饮料和食品、功能性饮料和食品、病人用饮料和食品等被提供。
例如，本组合物被摄取，可以在肠内通过雌马酚产生微生物的作用生成雌马酚，可以使人们有效地享受基于雌马酚的生理活性和药理活性，因此在药物或饮料和食品的领域中，优选用于寻求享受雌马酚作用的人。具体而言，本组合物在下述用途中有用：例如更年期障碍、骨质疏松症、***增生、代谢症候群等疾病和症状的预防或改善；血中胆固醇值的降低；美白；痤疮的改善；调整肠道；改善肥胖及利尿等。其中，本组合物对中老年女性中的症状不定的自诉或绝经伴有的症状(例如骨质疏松症、更年期障碍等)的预防或改善特别有用。
关于本组合物的每1日的摄取量，根据本组合物中的雌马酚产生微生物的菌数、摄取者的年龄或体重、摄取次数等而不同，例如作为成人每1日的摄取量，可以举出相当于本组合物10～500g的量。
另外，如上所述，通过向以活菌的状态含有雌马酚产生微生物的组合物中添加上述(B)，可以稳定地保持雌马酚产生微生物的雌马酚产生能力，即使长期保存，也能够抑制雌马酚产生微生物的雌马酚产生能力的丧失。因此，本发明进而也提供了维持雌马酚产生微生物的雌马酚产生能力的方法，其特征在于，向含有活菌状态的雌马酚产生微生物的组合物中添加选自抗坏血酸、其衍生物及它们的盐中的至少1种。雌马酚产生能力可以按照下述的实施例中记载的方法测定。对于该保存稳定化方法的具体实施方式，可以引用上述关于含有雌马酚产生微生物的组合物所记载的内容。实施例
以下，基于实施例等详细地说明本发明，但本发明并不限定于所述的实施例。
以下的实施例及比较例中使用的大豆粉末通过以下方法制备。
大豆粉末溶液的制备
剥皮，平均分成两份，然后对脱皮大豆进行蒸煮处理。蒸煮处理是向脱皮大豆连续供给蒸汽直到达到100℃的温度，从达到100℃的时刻开始在100℃下保持140秒钟。接下来，将蒸煮处理后的大豆通过辊碾机的辊之间，成为薄片状。之后，在80℃下对薄片状的大豆进行热风干燥，将其干燥至水分含量为3～6％左右，用风动磨头将其粉碎，由此得到大豆粉末。进行采用风动磨头的粉碎，使直径150μm以上的粉碎粒子为10％以下。
接着，向溶解了适量的碳酸氢钠及柠檬酸三钠的水中添加规定量的上述得到的大豆粉末，使其分散溶解，膨润15分钟以上。接着，在95℃下加热所得溶液10分钟，提取大豆粉末中的水溶性成分，进而使大豆粉末中含有的LOX、胰蛋白酶抑制剂等酶失活。加热后，保持80℃以上的温度并添加适量的柠檬酸，使pH回到中性。之后，使用均质机(GAULIN公司制LAB40)，在200-1000kgf/cm2范围的条件下进行均质化处理，由此制备大豆粉末溶液(换算成干燥重量则含有14重量％的大豆粉末)。
实施例1：利用第1法的发酵大豆食品的制备及发酵大豆食品 的评价
1.发酵大豆食品的制备
使用具有雌马酚产生能力的格氏乳球菌(乳球菌20-92株，FERMBP-10036号)，在以下的条件下，进行母发酵剂的制备、生产用发酵剂的制备、主发酵、及向容器中的填充。
<母发酵剂的制备>
对100ml含有80重量％大豆粉末溶液(以干燥重量计含有14％大豆粉末)、0.1重量％葡萄糖、0.1重量％L-精氨酸、余量为精制水的溶液(pH7.48)进行高压釜杀菌(121℃，15分钟)，制备母发酵剂培养基。在该发酵剂培养基中接种乳球菌20-92株的种菌，使用GasPack在37℃下进行厌氧培养96小时，由此制备母发酵剂(pH6.64)。
<生产用发酵剂的制备>
对5L含有80重量％大豆粉末溶液(以干燥重量计含有14％的大豆粉末)、0.1重量％葡萄糖、0.1重量％L-精氨酸、余量为精制水的溶液(pH7.48)进行高压釜杀菌(121℃，15分钟)，制备生产用发酵剂培养基。在该发酵剂培养基中接种上述得到的母发酵剂并使其为1容量％，在37℃、需氧条件下进行静置培养15小时，由此得到生产用发酵剂(pH6.72)。
<主发酵>
在95℃下，使用双管式杀菌机，对200L含有50重量％大豆粉末溶液(以干燥重量计含有14％的大豆粉末)、6重量％胡萝卜汁(宫崎县农协果汁)、6重量％南瓜糊(长野三洋食品)、余量为精制水的溶液(pH6.78)杀菌30秒钟，制备主发酵用培养基。在杀菌后回收的主发酵用培养基中接种4L上述得到的生产用发酵剂，在37℃、需氧条件下进行静置培养15小时，由此得到发酵大豆液(pH4.56)。
<副原料混合、向容器中的填充>
在95℃下，使用双管式杀菌机，对800L含有65重量％大豆粉末溶液(以干燥重量计含有14％的大豆粉末)、7.4重量％砂糖、1.0重量％胶凝剂制剂FG2524(新田明胶制)、0.8重量％葡糖酸、0.4重量％香料、0.1重量％L-抗坏血酸、余量为精制水的溶液进行杀菌30秒钟，得到副原料溶液。在37～40℃下，将80重量份上述副原料溶液和20重量份上述得到的发酵大豆液混合。维持混合液的温度，向聚乙烯杯(总容量130ml、口径71mm)中无菌地填充100g溶液，用铝盖密封。将填充物放入5℃的冰箱中，使其冷却固化，得到含有格氏乳球菌活菌的发酵大豆食品。
2.各种评价
将上述得到的放入容器的发酵大豆食品在10℃下保存3周。在刚制备后、1周后、2周后及3周后测定发酵大豆食品的pH，进而采用以下的方法评价发酵大豆食品中含有的格氏乳球菌的菌数及发酵大豆食品中含有的格氏乳球菌有无雌马酚产生能力。另外，对于上述制备的母发酵剂、生产用发酵剂及主发酵后的发酵物，也同样地测定格氏乳球菌的菌数及各自中含有的格氏乳球菌的雌马酚产生能力。
<格氏乳球菌的菌数的测定>
格氏乳球菌的活菌数的测定如下进行：使用加入了BCP的平板计数琼脂培养基(日水制药株式会社制)在37℃下进行倾注培养72小时，测量生长的菌落数。
<格氏乳球菌的雌马酚产生能力有无的测定>
向5ml以10μg/ml的浓度含有黄豆苷原的改良GAM肉汤(日水制药株式会社制)中添加200μl发酵大豆食品，用气体容器在37℃下进行厌氧培养96小时。接着，将得到的培养液进行HPLC分析，对培养液中的雌马酚量进行定量。利用HPLC的分析如下实施。首先，向5.0ml乙酸乙酯中加入0.5ml培养液进行浸透提取，将得到的提取液在3000rpm下离心10分钟，利用离心蒸发器来蒸发上清液，从而对溶剂进行减压干燥。接下来，将得到的固体用1.0ml溶剂(流动相A/流动相B＝50/50)再溶解，用作HPLC的样品。HPLC的分析使用D7000系列(日立制作所制)，色谱柱使用CapcellPackUGL205μm4.6Φ×250mm(资生堂制)。对于流动相，使用以8∶2的比例混合有0.05％磷酸缓冲液(含有EDTA)和乙酸乙酯-甲醇(1∶10)所得的溶液作为流动相A，以含有2％乙酸乙酯的甲醇作为流动相B。使用梯度法，设定流速为1.0ml/分钟。使用SPD-10AVPUV-VIS检测器检测，检测波长为254nm和280nm。
<格氏乳球菌的菌数及雌马酚产生能力的测定结果>
结果示于表1。该结果表明如果母发酵剂、生产用发酵剂的pH为5以上，则即使主发酵后的发酵物、发酵大豆食品的pH为4.6以下，也能够制备含有保持了雌马酚产生能力的格氏乳球菌的发酵大豆食品。需要说明的是，也确认了发酵大豆食品中的格氏乳球菌的菌数本身很少受到pH或雌马酚产生能力的影响，可以长期保持恒定。
[表1]
*1雌马酚产生能力按照n＝2实施，仅确认一个具有雌马酚产生能力时判定为△，两个均确认了雌马酚产生能力时判定为○。
<呈味的评价>
刚制备后的发酵大豆食品及保存3周后的发酵大豆食品的大豆味道均良好、无异样口味无异样气味，作为食品是理想的。
比较例1：发酵大豆食品的制备及发酵大豆食品的评价
在母发酵剂的制备中，除了将葡萄糖添加量由0.1重量％变为1.0重量％之外，在与实施例1相同的条件下，进行母发酵剂的制备、生产用发酵剂的制备及主发酵，制备发酵大豆食品(比较例1-1)。
进而，在生产用发酵剂的制备中，除了将葡萄糖添加量由0.1重量％变为1.0重量％之外，在与实施例1相同的条件下，进行母发酵剂的制备、生产用发酵剂的制备及主发酵，制备发酵大豆食品(比较例1-2)。
用与实施例1同样的方法评价比较例1-1及1-2的发酵大豆食品的pH、格氏乳球菌的菌数及雌马酚产生能力的有无。另外，对于母发酵剂、生产用发酵剂及主发酵液，也同样地测定格氏乳球菌的菌数、雌马酚产生能力的有无。
结果示于表2。在母发酵剂制备中使用pH降低的培养基的比较例1-1中，虽然没有观察到格氏乳球菌的菌数的差异，但雌马酚产生能力丧失。在随后的生产用发酵剂、主发酵液制备、发酵大豆食品制备中，虽然也没有观察到在菌数、pH及感官方面与实施例1有显著差异，但雌马酚产生能力没有恢复。另外，在生产用发酵剂制备中使用pH降低的培养基的比较例1-1中，虽然也没有观察到格氏乳球菌的菌数有差异，但雌马酚产生能力丧失。在随后的主发酵、发酵大豆食品制备中，虽然也没有观察到在菌数、pH及感官方面有很大差异，但雌马酚产生能力没有恢复。
[表2]
*1雌马酚产生能力按照n＝2实施，仅确认一个具有雌马酚产生能力时判定为△，两个均确认了雌马酚产生能力时判定为○，两个均未确认到雌马酚产生能力时判定为×。
实施例2：利用第2法的发酵乳的制备及发酵乳的评价
1.发酵乳的制备
使用具有雌马酚产生能力的格氏乳球菌(乳球菌20-92株，FERMBP-10036号)，在以下的条件下，进行母发酵剂的制备、生产用发酵剂的制备、主发酵及向容器中的填充。
<母发酵剂的制备>
将500mL含有10重量％脱脂奶粉、6.67重量％新鲜奶油、0.1重量％酵母提取物(“SK酵母提取物Hi-K”，日本制纸化学株式会社)、0.025重量％大豆胚轴提取物(“SoyaFlavoneHG”，不二制油株式会社；大豆胚轴提取物中的黄豆苷原类的含量约37重量％)、余量为精制水的溶液(pH6.14)进行高压釜杀菌(115℃，15分钟)，制备母发酵剂培养基。在该发酵剂培养基中接种乳球菌20-92株的种菌，使用GasPack在37℃下进行厌氧培养24小时，由此制备母发酵剂。
<生产用发酵剂的制备>
将10L含有10重量％脱脂奶粉、6.67重量％新鲜奶油、0.1重量％酵母提取物(“SK酵母提取物Hi-K”、日本制纸化学株式会社)、0.025重量％大豆胚轴提取物(“SoyaFlavoneHG”，不二制油株式会社)、余量为精制水的溶液进行UHT(超高温(UltraHighTemperature))杀菌(140℃，4秒钟)，制备生产用发酵剂培养基。在UHT杀菌后回收的生产用发酵剂培养基中接种上述得到的母发酵剂并使其为1v/v％，在37℃下进行需氧培养24小时，由此得到生产用发酵剂。
<主发酵>
将10L含有10重量％脱脂奶粉、6.67重量％新鲜奶油、0.1重量％酵母提取物(“SK酵母提取物Hi-K”，日本制纸化学株式会社)、0.025重量％大豆胚轴提取物(“SoyaFlavoneHG”，不二制油株式会社)、余量为精制水的溶液进行UHT(UltraHighTemperature)杀菌(140℃，4秒钟)，制备主发酵用培养基。在UHT杀菌后回收的主发酵用培养基中接种上述得到的生产用发酵剂并使其为1v/v％，在37℃下进行需氧培养24小时，由此得到发酵乳。
<向容器中的填充>
将通过上述主发酵得到的发酵乳无菌地装入已灭菌的容量为600mL的容器中，进而向容器内无菌地添加规定量的乳酸，混合后密封容器。
2.发酵乳中含有的格氏乳球菌的雌马酚产生能力的评价
将上述得到的放入容器的发酵乳分别在10℃下保存74周。测定刚制备后、2周后、6周后及74周后发酵乳的pH，进而用与实施例1同样的方法评价发酵乳中含有的格氏乳球菌的菌数、及发酵乳中含有的格氏乳球菌的雌马酚产生能力的有无。另外，对于上述制备的母发酵剂及生产用发酵剂，也同样地测定格氏乳球菌的菌数、及发酵乳中含有的格氏乳球菌的雌马酚产生能力。
结果示于表3。该结果表明，发酵乳的pH为4.6以上时，能够制备含有保持了雌马酚产生能力的格氏乳球菌的发酵乳。进而，也确认了格氏乳球菌的雌马酚产生能力在发酵乳的pH为5.28以上时能够稳定保持2周，在发酵乳的pH为5.79以上时能够稳定保持6周，在发酵乳的pH为5.92以上时能够稳定保持74周。另一方面，发现发酵乳的pH为4.09及3.53时，即使是刚制备后，格氏乳球菌的雌马酚产生能力也丧失。需要说明的是，也确认了发酵乳中的格氏乳球菌的菌数本身很少受到发酵乳的pH或雌马酚产生能力的有无的影响，可以长期保持恒定。
[表3]
#1雌马酚产生能力根据n＝3测定，三个中均未确认到雌马酚产生能力时判定为×，在三个中均确认到雌马酚产生能力时判定为○。
<呈味的评价>
刚制备后的发酵乳(没有添加乳酸)及保存74周后的发酵乳(没有添加乳酸)均酸味少且容易饮用，作为食品是理想的。
实施例3：利用第2法的发酵乳的制备及发酵乳的评价
使用向以下述组成为基础的培养基中添加表4所示的规定量的发酵促进剂所制备的培养基作为母发酵剂培养基、生产用发酵剂培养基及主发酵用培养基，除此之外，在与上述实施例2相同的条件下进行母发酵剂的制备、生产用发酵剂的制备及主发酵。
<培养基组成>
[表4]
酵母提取物使用商品名“SK酵母提取物Hi-K”(日本制纸化学株式会社制)。
乳清水解物使用“FE135”(DMV日本公司制)。
酪蛋白·酵母水解物使用“FE150”“FE135”(DMV日本公司制)。
将500g如上得到的发酵乳无菌地装入已灭菌的容量为600mL的容器中密封，在10℃下保存10周。
测定刚制备后、2周后、4周后及10周后发酵乳的pH，进而用与实施例1同样的方法评价发酵乳中含有的格氏乳球菌的菌数、及发酵乳中含有的格氏乳球菌的雌马酚产生能力的有无。另外，对于母发酵剂及生产用发酵剂，也同样地测定格氏乳球菌的菌数、及发酵乳中含有的格氏乳球菌的雌马酚产生能力。
得到的结果示于表5。由该结果可以确认：通过向培养基中添加酵母提取物、乳清水解物或酪蛋白·酵母水解物，能够保持格氏乳球菌的雌马酚产生能力。特别是表明当含有0.1重量％以上酵母提取物、或0.1重量％以上酪蛋白·酵母水解物时，可以长期稳定地保持发酵乳中的格氏乳球菌的雌马酚产生能力达10周以上。
[表5]
#1雌马酚产生能力根据n＝3测定，三个中均未确认到雌马酚产生能力时判定为×，在三个中均确认到雌马酚产生能力时判定为○。
比较例2：发酵乳的制备及发酵乳的评价
除了在母发酵剂的制备中进行需氧培养之外，在与实施例2相同的条件下进行母发酵剂的制备、生产用发酵剂的制备及主发酵。
测定如上得到的发酵乳的pH，进而用与实施例2同样的方法评价发酵乳中含有的格氏乳球菌的菌数、及发酵乳中含有的格氏乳球菌的雌马酚产生能力的有无。另外，对于母发酵剂及生产用发酵剂，也同样地测定格氏乳球菌的菌数、及发酵乳中含有的格氏乳球菌的雌马酚产生能力。
其结果，在需氧的条件下需氧发酵制备母发酵剂时，虽然维持了母发酵剂中的格氏乳球菌的雌马酚产生能力，但最终得到的发酵乳制品中格氏乳球菌的雌马酚产生能力丧失。需要说明的是，即使通过需氧发酵制备母发酵剂，关于发酵乳中的pH和格氏乳球菌的菌数，也与通过厌氧发酵制备母发酵剂时为相同程度。
实施例4：雌马酚产生微生物的雌马酚产生能力的保持效果的 评价
1.含有雌马酚产生微生物的组合物的制备
在5mL改良GAM培养基(日水制药株式会社)中接种格氏乳球菌(乳球菌20-92株，FERMBP-10036号)的种菌，使用GasPack在37℃下进行厌氧培养24小时。接下来，将2mL得到的培养物接种到50mL改良GAM培养基(日水制药株式会社)中，使用GasPack在37℃下进行厌氧培养24小时。进一步将8mL得到的培养物接种到200mL改良GAM培养基(日水制药株式会社)中，使用GasPack在37℃下进行厌氧发酵24小时。
将得到的培养物离心分离(4500rpm×15分钟)，回收菌体，将得到的菌添加到表6所示组成的各饮料中，使菌浓度大概为1×108cfu/mL，制备含有雌马酚产生微生物的组合物，将其按照每管10mL分别注入容量为15mL的聚丙烯管(IWAKI制)中。
[表6]
1.保存后的雌马酚产生能力的评价
将上述得到的各含有雌马酚产生微生物的组合物在10℃下保存21天。在保存期间对各含有雌马酚产生微生物的组合物进行pH、菌数及雌马酚产生能力的评价。菌数的测定方法与上述实施例1相同。另外，雌马酚产生能力使用与上述实施例1同样的方法利用HPLC进行分析，按照下述式算出雌马酚转化率。
雌马酚转化率(％)＝{(雌马酚的峰面积)/(黄豆苷原、二氢黄豆苷原及雌马酚的峰面积的合计)}×100
pH的测定结果示于表7。另外，菌数的测定结果示于图1，雌马酚的产生能力的测定结果示于图2。如表7所表明，在所有饮料中，即使保存也能维持刚制备后的pH，在饮料中保持杂菌不能繁殖的环境。另外，如图1所表明，在各含有雌马酚产生微生物的组合物中，保存期间的活菌数基本观察不到差别。另一方面，如图2所示，在没有添加抗坏血酸的含有雌马酚产生微生物的组合物中，在保存14天后，雌马酚产生能力丧失，但在添加了抗坏血酸的含有雌马酚产生微生物的组合物中，即使保存21天后也维持了雌马酚产生能力。确认了特别是在添加了1重量％或2重量％抗坏血酸的含有雌马酚产生微生物的组合物中，极其稳定地保持了雌马酚产生能力。
[表7]
各饮料保存后的pH
实施例5：雌马酚产生微生物的雌马酚产生能力的保持效果的 评价
1.含有雌马酚产生微生物的组合物的制备
在5ml与实施例1使用的母发酵剂培养基的组成相同的培养基中接种乳球菌20-92株的种菌，使用GasPack在37℃下进行厌氧培养96小时，由此得到母发酵剂。
接着，在10ml与实施例1中使用的生产用发酵剂培养基的组成相同的培养基中接种0.2ml上述得到的母发酵剂，使用气体容器在37℃下进行厌氧培养15小时，得到1次生产用发酵剂。进而，在300ml与实施例1中使用的生产用发酵剂培养基的组成相同的培养基中接种6ml上述得到的母发酵剂，使用气体容器在37℃下进行厌氧培养15小时，得到2次生产用发酵剂。
接下来，在2000ml与实施例1中使用的主发酵用培养基的组成相同的培养基中接种40mL上述得到的2次生产用发酵剂，在37℃、需氧条件下进行静置培养15小时，由此得到发酵大豆液。
如表8所示，向得到的发酵大豆液中添加6种抗氧化剂制备发酵制品后，分别按照每个纸杯130g填充到纸杯中，用铝盖密封。将其在10℃下保存，在0天及7天后开封，采用与实施例4同样的方法测定雌马酚产生微生物的菌数和其雌马酚产生能力。
[表8]
2.评价结果
测定雌马酚产生微生物的菌数的结果示于表9，测定雌马酚产生能力的结果示于表10。在保存开始时，配合任一种抗氧剂的情况下均观察到雌马酚产生能力。然而，在保存7天后，除添加有抗坏血酸的发酵制品之外，所有雌马酚产生能力均消失。
[表9]
[表10]

Claims (1)

1.一种维持雌马酚产生微生物的雌马酚产生能力的方法，其特征在于，向含有活菌状态的雌马酚产生微生物的发酵制品中添加0.05～2重量％选自抗坏血酸、其衍生物、及它们的盐中的至少1种。
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