CN102154489A

CN102154489A - 单标记寡聚核苷酸荧光探针及检测核酸酶的方法

Info

Publication number: CN102154489A
Application number: CN 201110049749
Authority: CN
Inventors: 赵美萍; 宋晨; 张晨; 苏昕
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2011-03-01
Filing date: 2011-03-01
Publication date: 2011-08-17
Anticipated expiration: 2031-03-01
Also published as: CN102154489B

Abstract

本发明公开了一类单标记寡聚核苷酸荧光探针及检测核酸酶的方法。该单标记寡聚核苷酸荧光探针具有茎环结构，环部由5-24个核苷酸残基组成，茎部根据待测核酸酶的活性分为水解模式与合成模式两种：水解模式的茎部为双链结构，且末端至少有3个连续G-C碱基对，C碱基端标记荧光基团，G碱基端产生猝灭作用，在核酸酶作用下茎部的一条链水解，释放出荧光信号；合成模式的茎部由一段双链和5’-(dC)_4-8侧链组成，5’-端标记荧光基团，3’-端与核酸酶反应，聚合延伸产生4-8个连续的鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸，猝灭5’-端的荧光基团，根据荧光信号的变化情况分析待测核酸酶活性。

Description

单标记寡聚核苷酸荧光探针及检测核酸酶的方法

技术领域

本发明涉及外切酶、聚合酶、多聚核苷酸激酶、磷酸酯酶等多种核酸酶的分析检测领域，更具体地，涉及一种单标记寡聚核苷酸荧光探针，以及利用单标记寡核苷酸荧光探针分析检测核酸酶的方法。

背景技术

DNA是生命信息传递的重要遗传物质，这种传递过程依赖各种核酸酶的特殊作用。例如，核酸的延伸、校正、连接、磷酸化、去磷酸化、酶切等重要的生命过程无不依靠核酸酶与DNA的特异性相互作用。快速简便的核酸酶动力学分析方法对研究生物多样性和深入理解生命现象有着重要意义。

核酸酶活性分析，通过研究DNA反应产物的方法有凝胶电泳、高效液相色谱、亲和力分析(filter binding)等。这些方法都是不连续性分析，操作麻烦、费时、费用高，无法快速、方便地获取分析结果，而且一般是采用放射性标记来提高灵敏度。采用增色效应紫外分析法可连续检测核酸酶反应，但是可检测底物浓度的范围较窄并且所需底物的浓度较高。酶联免疫吸附方法(ELISA)也被用于酶切反应的研究，但也是一种不连续的分析体系。近几年来，随着荧光核酸探针的发展，出现了一些新的分析技术和方法来检测核酸酶与DNA相互作用过程，主要是通过荧光共振能量转移对目标DNA与核酸酶反应前后体系荧光的变化进行实时的监测。其中分子信标(Molecular Beacon)核酸探针应用最为广泛。分子信标是呈发夹结构的短链DNA，一端标记荧光基团，一端标记猝灭基团。在进行核酸酶活性分析中，将分子信标设计成特异的序列与核酸酶相互作用导致分子信标的构象发生变化，从而由荧光信号实时指示核酸酶的动力学作用过程。但是有许多重要核酸酶的作用位点是在DNA链的末端，例如聚合酶、连接酶、核酸外切酶、激酶、去磷酸化酶等等，由于分子信标的5’-端和3’-端分别标记了荧光基团和猝灭基团，使之不能直接作为核酸酶的作用底物，这样就需要设计使用另一条与分子信标互补的序列来提供能与核酸酶反应的DNA末端。这样不仅增加了设计成本和工作量，而且额外的DNA分子增加了反应的复杂性，既要考虑分子信标与互补模板的浓度匹配，又要考虑使二者形成稳定杂交体的反应条件。诸多的因素使得分子信标方法在核酸酶的实际检测应用中受到限制。

因此，迫切需要开发出简便、快速、灵敏度高、成本低、准确可靠的核酸酶实时检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于实时检测核酸酶活性和酶催化反应动力学的简便、快速、灵敏度高、成本低、准确可靠的分析方法，以克服现有技术中的诸多局限。

本发明的技术方案是，根据光诱导电子转移猝灭原理设计单标记寡聚核苷酸荧光探针(简称单标记探针)，该探针序列既作为DNA底物与核酸酶反应，又作为指示反应进程的探针，实时检测荧光信号的变化来分析核酸酶的活性以及与DNA反应的动力学过程。

所谓光诱导电子转移猝灭原理是指：1)构成DNA序列的四种脱氧核糖核苷酸对于特定的荧光基团在激发光诱导下通过电子转移机制使得荧光信号产生猝灭作用的现象；2)这种猝灭作用是在光引发下电子从脱氧核糖核苷酸转移到荧光基团产生的，碱基的氧化能力(给电子能力)和荧光基团的还原能力(得电子能力)大小决定了猝灭作用的强弱；3)对于给定的荧光基团，四种碱基根据氧化电势排列猝灭作用的强弱顺序为：dG＞dA＞dC≈dT；

相对于分子信标，本发明的单标记探针在设计中仅标记荧光基团而不标记淬灭基团，利用上述的光诱导电子转移猝灭原理，通过鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸(简称鸟嘌呤，dG)来产生猝灭作用，在单标记探针与核酸酶的反应过程中鸟嘌呤的变化导致荧光信号的变化，从而指示核酸酶与DNA的反应活性。

本发明的单标记寡聚核苷酸荧光探针(简称单标记探针)具有茎环结构，其中环部为单链结构，一般由5-24个核苷酸残基组成，而茎部则根据待测核酸酶的活性功能分为水解模式与合成模式两种设计(参见图1)：

1)水解模式的茎部是由一定长度的互补碱基对构成的双链结构，其中至少有3个连续G-C碱基对在茎部末端，即茎部末端的一条链是连续的C碱基，另一条链是连续的G碱基，C碱基端标记荧光基团，G碱基端既产生猝灭作用又参与待测核酸酶反应或者在进一步修饰后用作待测核酸酶的底物，在核酸酶作用下茎部的一条链水解，释放出荧光信号；

2)合成模式的茎部由6-10对互补碱基构成的双链和5’-(dC)_4-8(4-8个连续的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸)侧链组成，5’-端标记荧光基团，3’-端与核酸酶反应，聚合延伸产生4-8个连续的鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸，猝灭5’-端的荧光基团，根据荧光信号的变化情况分析待测核酸酶活性。

本发明中选用可被鸟嘌呤高效猝灭的荧光基团来标记探针，常用的荧光基团的中英文全称见表1。

表1.单标记探针的荧光基团标记的中英文全称

缩写	英文全称	中文名
			FAM	6-carboxy-fluorescein；494；518；green	6-羧基荧光素
TET	5-tetrachloro-fluorescein；521；538orange	5-四氯荧光素
			HEX	5-hexachloro-fluorescein；535；553；pink	5-六氯荧光素
ROX	6-carboxy-x-rhodamine；587；607；red	6-羧基罗丹明x
			TAMRA	tetramethyl-6-carboxyrhodamine；560；582；rose	6-羧基四甲基罗丹明

本发明的单标记探针中荧光猝灭效率与连续鸟嘌呤个数呈正相关，3个以上的鸟嘌呤能产生可用于检测的猝灭作用，一般3-8个为宜。本发明中单标记探针的两种检测模式可以分别对应检测不同功能的核酸酶，现列举检测思路如下，但不限于以下方案：

(1)水解模式单标记探针适用于直接检测对双链DNA的3’或5’末端或者末端附近序列具有切割活性的核酸酶，同时还可以与这些核酸酶联用，进一步用于检测其他更多的以双链DNA的3’或5’末端为反应底物的核酸酶的活性。根据待测酶的活性功能，此模式适用于以下核酸酶的检测：

a)作用于双链DNA的核酸外切酶。此种酶沿双链DNA的3’→5’方向或者5’→3’方向逐个切去单核苷酸，以单标记探针为底物反应，探针茎部一端逐步被核酸外切酶水解从而释放出荧光信号。此类代表性酶有脱氧核糖核酸酶I(DNase I)、核酸外切酶III(Exonuclease III)和T7核酸外切酶(T7 Exonuclease)等。

b)限制性内切酶。此种酶特异性识别双链特定序列并对其进行切割，单标记探针茎部双链区可设计为相应限制性内切酶的识别序列作为反应底物，该序列被切割后茎部脱离解链，荧光信号恢复。此类代表性酶有HaeIII、NciI、RsaI等。

c)作用于双链DNA的修饰酶。此种酶可与具有识别修饰产物并切割水解功能的核酸外切酶组合成为检测体系。例如具有5’-磷酸化活性的多聚核苷酸激酶(Polynucleotide Kinase)与λ核酸外切酶组合，5’-磷酸化的双链DNA是该外切酶的最适底物，合适的体系条件可以确保所产生的5’-磷酸化的双链DNA立即被切割并释放荧光信号得到检测。

d)具有脱嘌呤/脱嘧啶(AP)裂解酶活性的修复酶。该类酶识别双链DNA中的AP位点并切割此位点产生切刻或者缺口，可设计单标记探针靠近茎部末端具有AP位点，经过此类修复酶作用后，茎部产生的单链DNA脱离互补链释放荧光信号。此类代表性酶有核酸内切酶IV(Endonuclease IV)、Tth核酸内切酶IV(Tth Endonuclease IV)等。

e)对损伤的鸟嘌呤位点具有N-糖基化酶活性的修复酶。具有N-糖基化酶活性的修复酶识别受损碱基位点，催化N-糖苷键的断裂水解，释放受损碱基。针对可以识别并释放受损鸟嘌呤的修复酶，本发明的单标记探针可以实现检测。将单标记探针茎部起猝灭作用的鸟嘌呤多聚体设计为受损鸟嘌呤多聚体，修复酶的作用使这些受损碱基释放，猝灭作用消除，荧光信号得到恢复实现检测。此类代表性酶有人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG，此酶可识别多种受损嘌呤底物，7-甲基鸟嘌呤是其特定识别的底物之一)、8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)等。

(2)合成模式单标记探针适用于各种DNA聚合酶的聚合活性以及保真性的检测，同时还可以与这些聚合酶联用，进一步用于检测其他更多的酶，聚合酶与该酶联用使得DNA聚合延伸反应实现。根据待测酶的活性功能，此模式适用于以下核酸酶的检测：

a)DNA聚合酶聚合活性。以合成模式单标记探针为底物，DNA聚合酶催化3’-端延伸合成互补链，形成与5’-侧链互补的连续鸟嘌呤，对5’-端标记的荧光基团产生猝灭作用，荧光强度降低指示聚合反应的进程。

b)DNA聚合酶保真性。聚合酶保真性主要体现在聚合酶对双链DNA的3’-端可能发生的碱基错配进行校读的能力。用本发明的单标记探针作底物，对其3’-端序列进行各种人为的错配设计，可以方便地检测各种聚合酶的保真性，并分别获得聚合酶错配延伸和校读活性数据，以聚合延伸产生的荧光下降作为指示信号。

c)具有3’-端去磷酸化活性的激酶和磷酸酶。此类酶可催化除去DNA的3’-磷酸基团，产生的3’-羟基适于参与延伸聚合反应，因此用3’-磷酸化修饰的合成模式单标记探针与聚合酶组合可以检测此类酶的3’-端去磷酸化反应过程。此类代表性酶有T4多聚核苷酸激酶(T4Polynucleotide Kinase)、小牛肠碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，Calf Intestinal)等。

如本文所用，下列词语/术语具有下列含义，除非另外说明。

“DNA”：脱氧核糖核酸。

“单标记寡聚核苷酸荧光探针”(简称单标记探针)：具有自杂交结构的寡核苷酸序列，其一个末端具有连续胞嘧啶脱氧核糖核苷酸并连接荧光基团。

本发明可灵活、价廉、灵敏、准确地应用于各种核酸酶活性分析，不仅操作简便，而且设计合成成本大大降低，对于揭示核酸酶与DNA相互作用的特点、基因诊断、疗效评价、药物筛选、人群普查及遗传分析等均有很高的实用价值。本发明具有明显优于现有技术的优点，其主要优点包括：

(1)反应与检测集成性，有利于反应过程的即时监测。本发明通过结合光诱导电子转移猝灭机制与自杂交寡核苷酸结构，设计出一端参与反应另一端产生检测信号的集成模式探针，实现了底物反应与信号指示在分子内发生的即时快速监测模式。

(2)高准确性，该探针体系自身作为反应底物，形成准确计量且稳定的自杂交体，易于消除现有荧光探针法由互补序列模板与探针分子浓度匹配产生的高背景以及附加前杂交温育过程产生的不稳定杂交体缺点，降低检测误差、减少假阳性现象。

(3)强适应性，对于各种功能不同的核酸酶，本发明探针都可以灵活改变序列组成实现检测；并且可以方便地应用于研究识别位点附近的背景序列对核酸酶与DNA反应造成的影响，全面地分析核酸酶与DNA的作用模式。

(4)简化操作，相比于其它用放射性标记或者高效液相色谱来进行不连续检测的方法，本发明没有反应之后繁琐的分离检测步骤而可得到连续实时的分析数据；相比于其它荧光探针法，本发明省去了温育杂交步骤而只需要将反应组分均混合置于反应管即可开始收集数据。本发明是非常快速便捷的方法。

(5)降低成本，本发明的探针只需要有一端标记荧光基团，将合成成本至少降低一半。

附图说明

图1是本发明的单标记寡聚核苷酸荧光探针的水解与合成两种检测模式示意图。

图2是本发明实施例1进行T4多聚核苷酸激酶与DNA反应分析方法的原理示意图

图3是本发明实施例2进行聚合酶与DNA反应分析方法的原理示意图

具体实施方式

下面结合附图，通过具体实施例进一步阐述本发明。本领域的技术人员应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1<脱氧核糖核酸外切酶Exonuclease III活性分析>

在该例子中，使用水解模式单标记探针进行核酸外切酶Exonuclease III(ExoIII)活性的检测。单标记探针的5’-端为连续的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸并标记荧光基团，3’-端为连续的鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸，检测原理参见图1中水解模式，具体步骤如下：

1.水解模式单标记探针起始时的荧光信号为猝灭状态，与Exo III混合置于合适的溶液条件中形成反应体系。

2.探针双链部分的3’-自由末端(羟基末端)被Exo III逐个碱基水解为单核苷酸，荧光信号被释放，通过实时荧光PCR仪进行检测。随着反应的进行，被水解的探针增多，荧光信号快速增强，直到反应平衡，荧光强度达到平台值。

在该实施例中，设计的单标记探针序列如下：

5’-FAM-CCCCCCCCCGCACCTAAAGGGTGCGGGGGGGGG-3’

不同Exo III的50μL反应体系：单标记探针浓度为30nM，Exo III浓度分别为：0.2，0.4，1，2，4，10U/ml。

空白对照体系：单标记探针浓度为30nM。

PCR方案是：37℃1250秒，每5s检测一次荧光强度。

检测时使用的检测仪器为实时荧光PCR仪Strategene 3000p，激发光源为石英卤钨灯，波长为492nm。

检测结果：在反应前200s，荧光上升速率随着Exo III浓度由低到高逐渐增加，酶浓度高于4U/ml的体系在5min即达到反应平台，荧光信号趋于稳定；反应20min后，荧光强度增强归一化数据如下表所示：

Exo III浓度(U/ml)	0.2	0.4	1	2	4	10
							荧光增强效率(归一化)	16％	22％	35％	73％	100％	100％

实施例2<T4多聚核苷酸激酶磷酸化活性分析>

在该例子中，使用水解模式单标记探针与λ外切酶联用，进行T4多聚核苷酸激酶磷酸化活性的检测。单标记探针的5’-端为连续的鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸且5’-羟基末端，3’-端为连续的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸并标记荧光基团，检测原理参见图2，具体步骤如下：

1.将水解模式单标记探针(起始时为荧光猝灭状态)与T4多聚核苷酸激酶、λ外切酶混合置于合适的溶液条件中形成反应体系。

2.T4多聚核苷酸激酶作用于探针茎部，使5’-端碱基磷酸化。

3.5’-端碱基磷酸化的双链DNA被λ外切酶从5’-端水解为单核苷酸，荧光信号被释放，通过实时荧光PCR仪进行检测。

随着反应的进行，被水解的探针增多，荧光信号快速增强，直到反应平衡，荧光强度达到平台值。

在该实施例中，设计的单标记探针序列如下：

5’-GGGCC(AG)₁₀ GGCCC-FAM-3’

不同T4多聚核苷酸激酶浓度的50μL反应体系：λ外切酶10U，单标记探针浓度为40nM，ATP为1.0mM，T4多聚核苷酸激酶(PNK)浓度分别为：0.022，0.11，0.22，1.1，2.2，4.5，5.6，8.4nM s^-1。

空白对照体系：λ外切酶10U，单标记探针浓度为40nM。

PCR方案是：37℃1250秒，每5s检测一次荧光强度。

检测结果：在反应前200s，荧光上升速率随着T4PNK酶浓度由低到高逐渐增加，T4PNK酶浓度高于5nMs^-1的体系在10min即达到反应平台，荧光信号趋于稳定；反应20min后，荧光强度增强归一化数据如下表所示：

T4PNK浓度/nM s^-1	0.022	0.11	0.22	1.1	2.2	4.5	5.6	8.4
									荧光增强效率(归一化)	2％	7％	18％	29％	70％	84％	100％	96％

不加T4PNK酶的空白对照样品未出现荧光信号上升变化。

用上述单标记探针与λ外切酶组合在Strategene 3000p进行检测，结果加入多聚核苷酸激酶T4PNK，产生荧光增强现象，而且随着T4PNK浓度依次增加，荧光增强速率增大，而空白对照样品均未出现荧光增强信号。

实施例3<聚合酶活性分析>

在该例子中，使用合成模式单标记探针进行Klenow聚合酶的活性检测。单标记探针的5’-端为连续的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸侧链并标记荧光基团，检测原理参见图3，具体步骤如下：

1.将合成模式单标记探针(起始时的荧光信号很强)与聚合酶混合置于相应溶液条件的反应体系。

2.以聚合延伸产生鸟嘌呤猝灭荧光基团为指示信号，荧光信号下降变化通过实时荧光PCR仪进行检测。

随着反应的进行，被延伸合成的探针增多，荧光信号快速下降，直到反应平衡，荧光强度达到平台值。

在该实施例中，设计的单标记探针序列如下：

SP8探针：5’-FAM-

CGCACCTAAAGGGTGCG-3’

探针结构中下划线部分为互补茎部序列；斜体部分为连续的8个C碱基，用于延伸产生G碱基猝灭荧光基团的检测序列。

不同聚合酶浓度的50μL聚合反应体系：SP8探针20nM，dGTP浓度为8μM，DNA聚合酶(Klenow片段)浓度从3.7pM梯度增加至5.8nM；空白对照体系：SP8探针20nM，dGTP浓度为8μM。

PCR方案是：25℃下每5s检测一次荧光强度，直到反应达到稳定状态。

检测结果：

不同聚合酶浓度的聚合反应：反应的前200s，荧光下降速率随着聚合酶浓度由低到高逐渐增加，聚合酶浓度高于2nM的体系在200s即达到反应平台，荧光信号趋于稳定；反应20min后，荧光猝灭效率归一化数据如下表所示：

不加聚合酶的空白对照样品未出现荧光信号下降变化。

实施例4<聚合酶的保真性分析>

在该例子中，使用合成模式单标记探针进行Klenow聚合酶和T4聚合酶的保真性检测。单标记探针的5’-端为连续的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸并标记荧光基团，检测具体步骤如下：

1.将合成模式单标记探针(起始时荧光强度最大)与聚合酶混合置于相应溶液条件的反应体系。

2.根据所用探针序列，聚合酶与其发生聚合延伸、单碱基错配、错配延伸或者3’→5’校正反应。

3.每种反应都以聚合延伸产生鸟嘌呤淬灭荧光基团为指示信号，荧光信号下降变化通过实时荧光PCR仪进行检测。

在该实施例中，设计的单标记探针序列如下(5’→3’)：

用于单碱基错配反应监测：

SP7G探针：FAM- CGCACCTAAAGGGTGCG

SP7A探针：FAM- CGCACCTAAAGGGTGCG

SP7T探针：FAM-

CGCACCTAAAGGGTGCG

用于3’→5’外切校正反应监测：

SP7T-G探针：FAM-

CGCACCTAAAGGGTGCG

探针结构中下划线部分为互补茎部序列，加粗部分为区分探针功能的特定序列，斜体部分为连续7个C碱基，用于延伸产生G碱基淬灭荧光基团的检测序列。

不同dGTP浓度的50μL单碱基错配反应体系：SP7T探针(或者SP7A探针、SP7G探针)20nM，DNA聚合酶(Klenow大片段)浓度为74nM，dGTP浓度从0.15μM梯度增加至462μM；空白对照体系：SP7G探针(或者SP7A探针、SP7T探针)20nM，DNA聚合酶(Klenow大片段)浓度为74nM。

不同dATP浓度的50μL外切校正反应体系：SP7T-G探针20nM，dGTP浓度为8μM，DNA聚合酶(T4)浓度为138pM，dATP浓度从0.2μM梯度增加至8.0μM；空白对照体系：SP7G-T探针20nM，dGTP浓度为8μM，DNA聚合酶(T4)浓度为138pM。

检测结果：

1.不同dGTP浓度的单碱基错配反应(以SP7T探针中形成G：T错配为例)：反应的前20min，荧光下降速率随着dGTP浓度由低到高逐渐增加，dGTP浓度高于15μM的体系在30min达到反应平台，荧光信号趋于稳定；反应70min后，荧光猝灭效率归一化数据如下表所示：

dGTP浓度/μM	1.5	3.1	7.7	15.4	30.8	77	123
								荧光猝灭效率(归一化)	34％	50％	68％	75％	89％	95％	100％

不加dGTP的空白对照样品未出现荧光信号下降变化

2.不同dATP浓度的外切校正反应：反应的前5min，荧光下降速率随着dATP浓度由低到高逐渐增加，dATP浓度高于2μM的体系在7min达到反应平台，荧光信号趋于稳定；反应20min后，荧光猝灭效率归一化数据如下表所示：

dATP浓度/μM	0.2	0.4	1.0	2.0	4.0	8.0
							荧光猝灭效率(归一化)	32％	68％	95％	100％	97％	94％

不加dATP的空白对照样品未出现荧光信号下降变化

用上述单标记探针通过PCR荧光仪Stategene 3000p进行检测，特定探针对相应待测物的响应随待测物浓度增加而加强，即荧光下降越明显。而空白对照样品均未出现荧光下降信号。

实施例5<小牛肠碱性磷酸酶去磷酸化活性分析>

在该例子中，使用3’-端标记磷酸基团的合成模式单标记探针进行小牛肠碱性磷酸酶去磷酸化活性检测。具体步骤如下：

1.将3’-标记磷酸基团的合成模式单标记探针(起始时荧光强度最大)与小牛肠碱性磷酸酶，Klenow(缺失3’-5’外切活性)聚合酶以及dGTP混合置于合适的溶液条件中形成反应体系。

2.小牛肠碱性磷酸酶作用于探针3’-端，将磷酸基团水解形成自由羟基。

3.3’-端含有自由羟基的部分互补单链DNA以自身为模版，在dGTP存在下在Klenow(缺失3’-5’外切活性)聚合酶作用下从5’-端向3’-端聚合延伸至完全互补，荧光信号被猝灭。通过实时荧光PCR仪进行检测。

随着反应的进行，聚合形成互补形式的探针增多，荧光信号快速猝灭，直到反应平衡，荧光强度达到平台值。

在该实施例中，设计的单标记探针序列如下：

5’-FAM-

CGCACCTAAAGGGTGCG-(PO₄)-3’

探针结构中下划线部分为互补茎部序列，3’-末端标记磷酸基团作为小牛肠碱性磷酸酶的催化反应底物，斜体部分为连续8个C碱基，用于与聚合酶结合延伸产生G碱基猝灭荧光基团的检测序列。

不同小牛肠碱性磷酸酶浓度的50μL反应体系：Klenow(缺失3’-5’外切活性)聚合酶0.5U，dGTP为10μM，单标记探针浓度为40nM，小牛肠碱性磷酸酶(CIP)浓度分别为：2，4，10，20，40，100，200，400U L^-1。

空白对照体系：Klenow(缺失3’-5’外切活性)聚合酶0.5U，dGTP为10μM，单标记探针浓度为40nM。

PCR方案是：37℃1250秒，每5s检测一次荧光强度。

检测结果：在反应前200s，荧光下降速率随着CIP酶浓度由低到高逐渐增加。CIP酶浓度高于400U L^-1的体系初始荧光下降速率趋于稳定，但由于过量酶干扰无法达到荧光猝灭平台；反应20min后，荧光强度增强归一化数据如下表所示：

CIP浓度/UL^-1	2	4	10	20	40	100	200	400
									荧光猝灭效率(归一化)	7％	12％	20％	29％	37％	74％	90％	99％

不加CIP酶的空白对照样品未出现荧光信号上升变化。

用上述单标记探针与Klenow(缺失3’-5’外切活性)聚合酶以及dGTP为组合在Strategene3000p进行检测。结果随着CIP酶的加入，产生荧光猝灭现象。并且随着CIP浓度依次增加，荧光猝灭速率增大。而空白对照样品均未出现荧光猝灭信号。

Claims

1.一种单标记寡聚核苷酸荧光探针，具有茎环结构，其环部为单链结构，茎部为双链结构，茎部末端是3个以上的连续C碱基和连续G碱基组成的G-C碱基对，C碱基端标记荧光基团，G碱基端具有荧光淬灭作用。

2.一种单标记寡聚核苷酸荧光探针，具有茎环结构，其环部为单链结构，茎部由6-10对互补碱基构成的双链和5’-(dC)_4-8侧链组成，且5’-端标记荧光基团。

3.如权利要求1或2所述的单标记寡聚核苷酸荧光探针，其特征在于，所述环部由5-24个核苷酸残基组成。

4.如权利要求1或2所述的单标记寡聚核苷酸荧光探针，其特征在于，所述荧光基团是6-羧基荧光素、5-四氯荧光素、5-六氯荧光素、6-羧基罗丹明x或6-羧基四甲基罗丹明。

5.权利要求1所述的单标记寡聚核苷酸荧光探针在核酸酶检测中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所检测的核酸酶是下列所述酶i)或酶ii)：

i)对双链DNA的3’或5’末端或者末端附近序列具有切割活性的核酸酶；

ii)以双链DNA的3’或5’末端为反应底物，且与i)所述的核酸酶联用能够切割双链DNA的3’或5’末端或者末端附近序列的核酸酶；

以所述单标记寡聚核苷酸荧光探针作为DNA底物与所述核酸酶反应，实时检测荧光信号的变化，从而分析核酸酶的活性以及酶与DNA反应的动力学过程。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所检测的核酸酶是下列酶中的一种：作用于双链DNA的核酸外切酶、限制性内切酶、作用于双链DNA的修饰酶、具有脱嘌呤/脱嘧啶裂解酶活性的修复酶和对损伤的鸟嘌呤位点具有N-糖基化酶活性的修复酶。

8.权利要求2所述的单标记寡聚核苷酸荧光探针在核酸酶检测中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所检测的核酸酶是下列所述酶1)或酶2)：

1)具有聚合活性或者聚合和保真活性的DNA聚合酶；

2)与1)所述DNA聚合酶联用，使得DNA的聚合延伸反应得以实现的酶。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述酶2)是具有3’-端去磷酸化活性的激酶和磷酸酶。