CN102154186A - 一株枯草芽孢杆菌及其在真菌病害防治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株枯草芽孢杆菌，该菌株命名为：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，已于2009年1月15日由中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCC No.2843。本发明的菌株枯草芽孢杆菌是从烟草叶面生境中分离筛选到的，经实验证明，其发酵液对烟草赤星病、辣椒炭疽病等真菌病害病原菌有很强的抑制作用，对烟草赤星病、烟草黑胫病、辣椒炭疽病、番茄枯萎病、黄瓜疫病、茄子黄萎病等显示出很好的防病效果，同时对烟草、辣椒、黄瓜、番茄和茄子具有良好的促生作用，因此，本发明的枯草芽孢杆菌可以用于制备生物防治烟草或蔬菜真菌病害的菌剂，也可以用于制备促进烟草或蔬菜生长的生长剂。

Description

一株枯草芽孢杆菌及其在真菌病害防治中的应用

技术领域

本发明涉及一株枯草芽孢杆菌，及其在烟草或蔬菜真菌病害防治、促进烟草或蔬菜生长中的应用，属于生物防治领域。

背景技术

长期以来，植物病害以化学防治为主，但受到高效低毒的杀菌剂农药品种少、防效易受环境条件影响、易造成环境污染和产生抗药性等问题困扰。生物防治具有对环境、生态和人类健康安全的优点，在病虫害综合治理中发挥了越来越大的作用，并被认为是实现农业可持续发展的重要手段。随着人们对环境安全和健康的关注，对烟草(吸食品)和蔬菜产品的质量要求也越来越高，无公害、绿色食品甚至有机食品逐渐成为消费市场的主流，因此，采用生物防治技术得到了广泛的认可。近年来，国内外广泛利用有益微生物及其代谢产物来抑制病原菌生存和活动，使得这一防治措施得以快速发展。

美国已有GB03、MBI600、QST713和解淀粉枯草芽孢杆菌变种等4株枯草芽孢杆菌生防菌株获得环保局商品化或有限商品化生产应用许可。在德国解淀粉枯草芽孢杆菌变种FZB24被商业化生产，用于控制粮食作物的不同真菌病害。我国已开发成功并投入生产的枯草芽孢杆菌商品制剂有亚宝、百抗、麦丰宁、纹曲宁等。上述产品主要用于粮食和果树真菌病害的防治，尚未见用于烟草、辣椒、黄瓜、茄子、番茄真菌病害的报道。

国内已报道防治烟草赤星病、黑胫病等真菌病害的拮抗细菌主要有荧光假单胞杆菌(顾金刚等，2004；李洪林等，2008)、绿针假单胞菌(王远山等，2002)、短小芽孢杆菌AR03(王静，2010)、枯草芽孢杆菌(易龙等，2007；张成省等2008)，防治辣椒疫病拮抗细菌解淀粉芽孢杆菌(柳凤，2009)，防治黄瓜枯萎病、茄子黄萎病、番茄叶霉病等蔬菜真菌病害拮抗细菌未见报道。上述研究仅是生防菌株筛选与机理研究，并未将其制成适用于工业化生产和应用的制剂，其实际应用存在难题。

本发明人已经努力开发了一种具有强抗真菌活性、促进植物生长、防治真菌病害、改善烟叶品质的多功能新微生物杀菌剂，所述植物病害包括烟草赤星病、烟草黑胫病、辣椒疫病、番茄叶霉病、茄子黄萎病和黄瓜枯萎病。经检索，在所有已申请的专利文献中均没有涉及本发明主题的文献报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一株枯草芽孢杆菌，其对烟草或蔬菜真菌病害具有防 治作用，对烟草或蔬菜的生长具有促进作用，对烟叶品质的提高也有一定的作用。本发明还提供了一种由该菌种培养制备而成的微生物制剂。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一株枯草芽孢杆菌，该菌株命名为：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，已于2008年12月29日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCCNo.2843。

本发明所涉及的枯草芽孢杆菌Tpb55，其分离鉴定、培养方法、生物特性、发酵条件等，已经公开，记载在中国文献“烟草叶围细菌Tpb55菌株的鉴定及其抑菌活性，中国生物防治，2008，24(1)：63-68”以及“烟草赤星病拮抗细菌Tpb55摇瓶发酵条件的筛选，中国烟草科学2009，30(1)：54-57”上，在此不再赘述。

一种微生物制剂，由枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Tpb55的全培养液培养物和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Tpb55的孢子组成；该制剂对烟草或蔬菜真菌病害具有防病促生作用。其可通过以下制备方法制备得到：

(1)将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Tpb55试管种接种于肉汤培养基(为常规培养基，其配方为公知，在此不再赘述)摇瓶中，振荡培养至对数期；

(2)将上述培养好的菌种按种子罐培养基的体积比10％接种量接入30L种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖10g/L、蛋白胨3g/L、MgSO₄ 0.5g/L、酵母膏1.5g/L，牛肉膏1.5g/L；培养条件：溶氧量为15-18％，搅拌速度200rpm，发酵温度31℃；

(3)将种子液生产罐培养基的10％的接种量接入生产罐培养，生产罐培养基配方为：玉米粉20g/L、豆饼粉50g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，MnSO₄·H₂O 10g/L；培养条件：溶氧量为15-18％，搅拌速度200rpm，发酵温度31℃；培养至最终生物量为109cfu/g，芽孢形成率达97％以上，发酵完成；

(4)发酵完成后，培养液出罐，用白炭黑吸附用包装袋装成固体剂型。

本发明的菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是从烟草叶面生境中分离筛选到的，经实验证明，本发明的枯草芽孢杆菌的发酵液对烟草赤星病、辣椒炭疽病等真菌病害病原菌有很强的抑制作用，对烟草赤星病、烟草黑胫病、辣椒炭疽病、番茄枯萎病、黄瓜疫病、茄子黄萎病、大葱紫斑病、芦笋茎枯病等显示出很好的防病效果，同时对烟草、辣椒、黄瓜、番茄和茄子具有良好的促生作用，因此，本发明的枯草芽孢杆菌可以用于制备生物防治烟草或蔬菜真菌病害的菌剂，也可以用于制备促进烟草或蔬菜生长的生长剂。另外，实验还表明，本 发明的菌株对烟叶品质的提高也有作用。可以预见，本发明的菌株在烟草或蔬菜真菌病害的生物防治领域将有广阔的应用前景。

上述描述中，所述烟草赤星病是由链格孢菌烟草专化型(Altternaria altternata f.sp.nicotianae)引起的。所述烟草黑胫病是由寄生疫霉烟草变种(Phytophthora parasitica var.nicotianae)引起的。所述辣椒疫病是由辣椒疫霉(Phytophthora capsici)引起的。所述辣椒炭疽病是由辣椒刺盘孢(Colletotrichum capsici)引起的。所述番茄枯萎病是由番茄尖镰孢菌番茄专化型(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici)引起的。所述黄瓜枯萎病是由尖镰孢菌黄瓜专化型病菌(Fusarium oxysporum f..sp.cucumerinum)引起的。所述黄瓜疫病是由瓜疫霉(Phytophthora melonis)引起的。所述茄子黄萎病是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的。所述大葱紫斑病是由香葱链格孢(Alternaria porri)引起的。所述芦笋茎枯病是由天门冬拟茎点霉(Phomopsis asparagi)引起的。

附图说明

本发明的枯草芽孢杆菌Tpb55命名为Bacillus subtilis，已于2008年12月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNO.2843，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，邮编：100101。

图1：本发明的枯草芽孢杆菌Tpb55(Bacillus subtilis Tpb55)菌株对辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici)菌丝的生长平板抑制作用示意图。

图2：本发明的枯草芽孢杆菌Tpb55(Bacillus subtilis Tpb55)菌株抑制烟草赤星病菌(Alternaria alternata)示意图，图中可见，烟草赤星病菌发生畸形，菌丝膨大呈结节状。

图3：本发明的枯草芽孢杆菌Tpb55(Bacillus subtilis Tpb55)菌株处理烟草赤星病菌(Alternaria alternata)示意图，图中可见，菌丝末端膨大，破裂，原生质泄漏。

图4：本发明的枯草芽孢杆菌Tpb55(Bacillus subtilis Tpb55)菌株发酵液处理烟草赤星病菌(Alternaria alternata)示意图，图中可见，赤星病菌分生孢子不萌发，且产生囊泡。

图5：本发明的枯草芽孢杆菌Tpb55(Bacillus subtilis Tpb55)菌株发酵液处理烟草赤星病菌(Alternaria alternata)示意图，图中可见，分生孢子囊泡破裂，分生孢子彻底消解。

图6：烟草赤星病菌(Alternaria alternata)分生孢子正常萌发、菌丝正常生长示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1菌株对烟草和蔬菜真菌病害病原菌生长的抑制作用

采用滤纸片法测定菌株Tpb55对烟草和蔬菜真菌病害病菌的拮抗作用：取发酵液20μl于灭菌滤纸片上，晾干后移至燕麦培养基平板中央，在滤纸片四周等距离接入病原菌菌饼(Φp0.5cm)，于28℃培养3～4d，测定抑菌圈大小。每种靶标菌重复3次，结果取平均值。

燕麦琼脂培养基：燕麦片30g，琼脂20g，水1000mL。燕麦片加水1000mL，在沸水浴上加热1h，纱布过滤后加水补足1000mL，加琼胶熔化后分装灭菌(121℃，20min)。

结果如表1所示，可见，菌株Tpb55对烟草赤星病菌、烟草黑胫病、辣椒疫病菌、辣椒炭疽病菌、番茄枯萎病菌、黄瓜枯萎病菌、黄瓜疫霉菌、茄子黄萎病菌、大葱紫斑病菌、芦笋茎枯病菌等病原真菌具有明显的抑制作用。图1所示为Tpb55菌株对辣椒炭疽病菌菌丝生长抑制作用。挑取抑菌圈边缘菌丝显微镜下观察，发现Tpb55菌株可以导致病原菌菌丝畸形、甚至消解。如图2所示，Tpb55菌株导致烟草赤星病菌膨大呈结节状，顶端形成泡囊，泡囊破裂后发生原生质泄漏(图3)。

表1菌株Tpb55对植物病原真菌抑制作用

实施例2菌株对烟草赤星病病原菌孢子萌发的抑制作用

用Tpb55粗提液处理的A.alternata孢子，6h后对照孢子萌发率达60％，而处理孢子未见萌发，12h后对照孢子超过90％已经萌发(图6所示)，而处理孢子80％不萌发且变畸型。粗提液处理24h后，芽管附近开始膨大，形成泡状突起(图4所示)，并有内含物开始泄露，至全部消解(图5所示)。

实施例3菌株对烟草和蔬菜的促生作用

制备Tpb55菌株发酵液(31℃、180r/m72h)。将健康饱满的烟草、辣椒、黄瓜、茄子、番茄种子用Tpb55菌株发酵液(含菌量约为10⁸cfu/mL)50倍稀释液浸泡12h后，播种于装有灭 菌土方盆(160×220mm)中，以培养基和无菌水浸种为对照，每种植物处理3盆，每盆播15粒种子。待上述植物第4片真叶完全展开后，每盆用30mLTpb55菌株发酵液(含菌量约为10⁸cfu/mL)50倍稀释液灌根，对照分别浇灌相应量的培养基和无菌水。10d后，对植株从顶叶开始倒数第2-3真叶使用便携式光合测定仪(Li-6400、Li-Cor In美国)测定其净光合速率(Pn)。菌液处理后20d将苗拔出，自来水洗净晾干，测其鲜重及株高，Tpb55菌株发酵液80℃下烘干，称干重。

室内盆栽测定结果表明(表2所示)，菌株发酵液处理后，烟草、辣椒、黄瓜、茄子、番茄植株净光合速率、株高、鲜重和干重较无菌水和培养基均有不同程度的增加，对上述植物生长具有明显的促进作用。

表2菌株对烟草和蔬菜生长的促进作用

实施例4菌株对烟草和蔬菜真菌病害的温室盆栽防治试验

为了检验枯草芽孢杆菌Tpb55防治烟草黑胫病、辣椒炭疽病、番茄枯萎病、黄瓜疫病、茄子黄萎病的效果，用Tpb55处理靶植物并在24h后接种植物病原体。

具体地，制备Tpb55菌株发酵液(31℃、180r/m72h)。烟草、辣椒、黄瓜、茄子、番茄被栽种在灭菌营养土的花盆中，至第4片真叶期。

接下来，每种病原体按照以下各项对靶植物进行接种侵染。用寄生疫霉烟草变种(Phytophthora parasitica var.nicotianae)游动孢子悬液(4×10³孢子囊/mL)接种烟苗诱发烟草黑胫病，，用辣椒刺盘孢(Colletotrichum capsici)孢子悬液(1×10⁶孢子/mL)接种辣椒苗 诱导辣椒炭疽病发生，瓜疫霉(Phytophthora melonis)的游动孢子悬浮液(1×10³孢子/mL)接种黄瓜幼苗诱发黄瓜疫病，用番茄尖镰孢菌番茄专化型(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici)孢子悬浮液(1×10⁶孢子/mL)接种番茄幼苗诱导番茄枯萎病，大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)孢子悬浮液(1×10⁶孢子/mL)接种茄子幼苗诱导茄子黄萎病，28～30℃保温保湿，诱导病害发生。

药剂对照分别为防治烟草黑胫病主用药剂58％甲霜灵锰锌400倍液，防治辣椒炭疽病主用药剂75％百菌清可湿性粉剂600倍液，防治番茄枯萎病主用药剂50％多菌灵可湿性粉剂1000倍液，防治黄瓜疫病主用药剂75％百菌清可湿性粉剂600倍液，防治茄子黄萎病主用药剂70％甲基托布津可湿性粉剂600倍液

盆栽防治试验结果如表3所示，Tpb55对烟草黑胫病、辣椒炭疽病、番茄枯萎病、黄瓜疫病和茄子黄萎病等有较好的防效，防治效果与上述病害主用药剂相当或略优。

表3菌株对烟草和蔬菜真菌病害的温室防治效果试验

实施例5菌株对烟草和蔬菜真菌病害的田间防治试验

烟草黑胫病防治试验于2009年安排在中国农科院烟草所即墨实验基地黑胫病病圃进行，试验用地为平原田块，土壤为淋溶褐土。6月22日移栽，行距100cm，株距30cm，所有实验小区的栽培条件一致。移栽前，Tpb55发酵液稀释200倍蘸根，黑胫病发病初期开始灌根，每株灌Tpb55发酵液200倍稀释液50mL，分别于7月23日和7月31日灌根两次。试验各处理随机区组排列，每小区面积60m²，四次重复。以58％甲霜灵锰锌400倍液为药剂对照，以清水为空白对照。7月23日、8月11日各调查一次病情指数，调查结果如表4。

辣椒炭疽病防治试验选在青岛即墨龙泉镇石门村辣椒田，土壤为淋溶褐土，辣椒于2010 年5月17日移栽。试验各处理随机区组排列，每小区种有辣椒60株，4次重复。辣椒开始发病时对叶片喷施Tpb55发酵液200倍稀释液，7月13日开始试验，试验时辣椒正处于盛果期，试验田块发病较重，7月21日再喷施1次，以75％百菌清可湿性粉剂600倍液为药剂对照，以清水为空白对照。7月13日、8月31日各调查一次病情指数，调查结果如表4。

番茄枯萎病、黄瓜疫病、茄子黄萎病防治试验均设在青岛胶南市六汪镇温室大棚，选择发病严重且连作3年以上的大棚开展试验。

番茄2010年9月27日移栽，7d后，Tpb55发酵液200倍稀释液灌根，每株50mL。番茄枯萎病开始发病后，于11月6日，11月15日连续灌根两次，以50％多菌灵可湿性粉剂1000倍液为药剂对照，以清水为空白对照。每处理重复4次，每小区面积64m²，种植番茄100株。11月6日，11月25日调查两次病情指数，调查结果如表4。

2010年3月10日移栽黄瓜，开始试验时，黄瓜藤蔓有2左右，疫病发生较重。试验小区面积36m²，每小区种植黄瓜80株，重复四次。4月17日、24日连续喷施Tpb55发酵液200倍稀释液2次，以75％百菌清可湿性粉剂600倍液为药剂对照，以清水为空白对照。4月17日、5月5日调查2次病情指数，调查结果如表4。

茄子黄萎病防治试验时间为2010年3月-6月。定植期为3月12日，4月20日在茄子发病初期开始灌根，Tpb55发酵液200倍稀释液每株50mL，4月27日灌第2次。以70％甲基托布津可湿性粉剂600倍液为药剂对照，以清水为空白对照。小区面积10m²，每小区种植茄子20株，重复4次。4月20、5月10日各调查一次病情指数，结果如表4。

如表4所示，Tpb55对烟草黑胫病、辣椒炭疽病、番茄枯萎病、黄瓜疫病和茄子黄萎病等有较好的防效，防治效果与上述病害主用药剂相当或略优。

表4菌株对烟草和蔬菜真菌病害的防治效果试验

实施例6菌株对烟草赤星病防治效果以及对烤烟产质量的影响

烟草赤星病防治试验安排在云南省陆良小百户烟田，烤烟品种为K326，移栽期为2008年4月23日，在发病初期开始施药。于7月23日、8月30日连续喷施Tpb55发酵液200倍稀释液2次，以40％菌核净可湿性粉剂500倍液为药剂对照，以清水为空白对照。小区面积66.7m²，每小区植烟100株。于7月23日、8月9日各调查一次病情指数。如表5所示，Tpb55对烟草赤星病有良好的防治效果，发酵液200倍液防治效果可达70％以上，优于生产主用药剂菌核净。

表5菌株对烟草赤星病的田间防治效果

所有处理的成熟烟叶按小区分别采收和烘烤，并统计烤后烟叶产量，按国家标准分级，确定上、中、下等烟叶比例。各处理烟叶烘烤后选用B2F烟叶样品磨碎后进行化学成分分析，植株样经H2SO4-H2O2湿灰化法消煮后，用凯氏定氮法测定氮含量，用火焰光度法]测定钾含量；用铜还原-直接滴定法测定总糖和还原糖含量；用紫外分光光度计法测定烟碱含量；用莫尔法测定氯含量。试验结果表明，施用Tpb55菌株发酵液后，烟叶产量、上中等烟比例、上等烟比例以及产值均有不同程度的提高(表6)。

表6施用菌株发酵液对烟叶经济性状的影响

如表7所示，施用Tpb55菌株发酵液对上部烟叶内在化学成分影响不大，主要表现在还原糖、钾有少许提高，Cl离子含量降低，氮碱比、糖碱比、糖氮比、钾氯比等含量均在合理范围内。

表7施用菌株发酵液对上部烟叶B2F内在化学成分的影响

施用Tpb55菌株发酵液后，上部烟叶感官评吸质量有一定程度提高，主要体现在香气质、香气量提高，杂气和刺激性降低(表8)

表8施用菌株发酵液对上部烟叶B2F感官评吸指标的影响

实施例7制备微生物制剂

由枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Tpb55的全培养液培养物和枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis Tpb55的孢子组成，制备方法如下：

(1)将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Tpb55试管种接种于肉汤培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；

(2)将上述培养好的菌种按种子罐培养基的体积比10％接种量接入30L种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖10g/L、蛋白胨3g/L、MgSO₄ 0.5g/L、酵母膏1.5g/L，牛肉膏1.5g/L；培养条件：溶氧量为15-18％，搅拌速度200rpm，发酵温 度31℃，培养时间72h；

(3)将种子液生产罐培养基的10％的接种量接入生产罐培养，生产罐培养基配方为：玉米粉20g/L、豆饼粉50g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，MnSO₄·H₂O 10g/L；培养条件：溶氧量为15-18％，搅拌速度200rpm，发酵温度31℃，培养时间72h；培养后，最终生物量为10⁹cfu/g，芽孢形成率达97％以上，发酵完成；

(4)发酵完成后，培养液出罐，用白炭黑吸附用包装袋装成固体剂型。

Claims (10)

1.一株枯草芽孢杆菌，其特征在于：该菌株命名为：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，已于2009年1月15日由中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCC No.2843。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在烟草真菌病害防治中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述烟草真菌病害包括：烟草赤星病，黑胫病。

4.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在蔬菜真菌病害防治中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述蔬菜真菌病害包括：辣椒疫病，辣椒炭疽病，番茄叶霉病，黄瓜枯萎病，茄子黄萎病、大葱紫斑病、芦笋茎枯病。

6.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在促进烟草或蔬菜生长中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述蔬菜包括：黄瓜，辣椒，茄子，番茄。

8.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在改善烟叶品质中的应用。

9.一种微生物制剂，其特征在于：由枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Tpb55的全培养液培养物和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Tpb55的孢子组成。

10.根据权利要求9所述的微生物制剂，其特征在于：其是通过以下制备方法制备得到的：

(1)将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Tpb55试管种接种于肉汤培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；

(2)将上述培养好的菌种按种子罐培养基的体积比10％接种量接入30L种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖10g/L、蛋白胨3g/L、MgSO₄ 0.5g/L、酵母膏1.5g/L，牛肉膏1.5g/L；培养条件：溶氧量为15-18％，搅拌速度200rpm，发酵温度31℃；

(3)将种子液生产罐培养基的10％的接种量接入生产罐培养，生产罐培养基配方为：玉米粉20g/L、豆饼粉50g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，MnSO₄·H₂O 10g/L；培养条件：溶氧量为15-18％，搅拌速度200rpm，发酵温度31℃；培养至最终生物量为10⁹cfu/g，芽孢形成率达97％以上，发酵完成；

(4)发酵完成后，培养液出罐，用白炭黑吸附用包装袋装成固体剂型。

Images