CN102154158A

CN102154158A - 一种交替假单胞菌及其产右旋糖苷酶的方法与产品

Info

Publication number: CN102154158A
Application number: CN2010106093482A
Authority: CN
Inventors: 吕明生; 王淑军; 房耀维; 刘姝; 焦豫良; 李瑛�; 曹茜
Original assignee: Huaihai Institute of Techology
Current assignee: Huaihai Institute of Techology
Priority date: 2010-12-28
Filing date: 2010-12-28
Publication date: 2011-08-17
Anticipated expiration: 2030-12-28
Also published as: CN102154158B

Abstract

本发明是一种交替假单胞菌LP602（Pseudoalteromonassp.LP602）CGMCCN0.4319。该菌株具有以下特征：菌株为革兰氏阴性杆状细菌、有荚膜、无芽孢；该菌株生长温度范围为4～37℃，生长pH范围为6.0～11.0，生长的NaCl浓度范围为0.5%～10%。本发明还公开了一种利用交替假单胞菌产右旋糖苷酶的方法及按该方法得到的右旋糖苷酶产品，该右旋糖苷酶在龋齿防治和药用右旋糖苷的生产等方面发挥着重要的作用。

Description

一种交替假单胞菌及其产右旋糖苷酶的方法与产品

技术领域

本发明涉及一种微生物，特别是一种分离自中国江苏省连云港海域的交替假单胞菌LP602（Pseudoalteromonassp. LP602）CGMCC N0.4319（已于2010年11月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC N0.4319）；本发明还涉及该菌株产右旋糖苷酶的方法及其产品。

背景技术

右旋糖苷（Dextean）主要是α-1,6-糖苷键连接的葡萄糖。右旋糖苷酶（Dextranase,α-D-1,6-Glucan-6-D-Glucanohydrolase, EC3.2.1.11），又叫α-葡聚糖酶，是专一切割右旋糖苷中α-1,6糖苷键的水解酶。

目前国内外报道的产生右旋糖苷酶微生物主要为青霉（Penicilliumsp.）、斯达油脂酵母（Lipomyces starkeyi）、对角毛壳菌（Chaetomium gracile）、曲霉（Aspergillus ustus）、芽孢杆菌（Bacillus sp.）、链球菌（Streptococcus sp.）均能产生右旋糖苷酶。

右旋糖苷酶有很重要的应用价值，右旋糖苷酶在制糖工业中降解多糖聚合物，降低多糖的相对分子质量，从而降低糖的黏性。右旋糖苷酶还可以用于口腔医用制品和***右旋糖苷的酶法生产。

右旋糖苷酶在口腔医用制品中的应用。口腔中的细菌发酵食物中的蔗糖，生成右旋糖苷（α-D-glucan）。右旋糖苷在牙齿面形成牙菌斑，它是导致细菌在牙齿表面积累的决定因素。菌斑中微生物则在网状结构保护下大量繁殖，其酸性代谢物破坏牙釉质，从而导致龋齿，造成无法再生的牙齿损伤，同时也给患者带来巨大痛苦。牙菌斑是龋齿和牙周病重要的致病因素之一。因此为了预防和控制龋齿和牙周病，抑制牙菌斑的发生和发展是至关重要的。

右旋糖苷由α-1,4、α-1,3、以及α-1,6糖苷键构成，其中α-1,6糖苷键形成的侧链决定其粘附性，而这种粘附性是形成菌斑和龋齿的重要物化因素。右旋糖苷通过其粘附性相互交联，形成保护性网状结构，使得其中微生物，特别是具有龋齿形成能力的链球菌非常容易滋生。

由于右旋糖苷在牙齿表面或缝隙中形成坚固的并具有一定韧性的菌斑结构，这种保护性结构使得具有龋齿形成能力的微生物很难根除，因此传统的牙刷、牙线等物理治疗方法难以杜绝龋齿损害。普通的化学口腔护理剂中通常含有硼酸、甲硝唑、西吡氯铵、氯己定、碘酒、乙醇等化合物，通常情况下以及口腔粘膜破损的情况下，这些物质可能会引起副反应，增加病人的痛苦。

右旋糖苷酶可以降解口腔中的右旋糖苷。右旋糖苷酶是一种生物制剂，使用和保存简便易行。无毒性，无耐药性，不影响口腔内的生物生态平衡，对不会刷牙的婴幼儿和不具备洗漱条件的情况下，是一种良好的预防牙龋齿斑的制剂。而每个人饭后，尤其是食糖后应用添加有此酶的漱口剂，是一项很好的抑制菌斑形成，预防龋齿和牙周病的有效措施。近几年各国在这一领域已作了深入研究，将具有降解菌齿斑能力的右旋糖苷酶添加到牙膏、漱口水和口香糖中，取得了良好的防治龋齿的效果。

右旋糖苷酶在***右旋糖苷的酶法生产中的应用。右旋糖苷主要用作血浆增量剂，即***。目前医药上用的右旋糖苷有中分子量和低分子量两种，中分子量限于70000左右，低分子量的为40000。目前，药用右旋糖苷的生产主要是采用酸水解法，条件激烈，得率低，要求生产设备条件苛刻，如能采用酶法生产，可提高产率，降低成本。

国外对这两个领域的研究与应用均有报道，但国内目前相关研究较少，经查新尚无海洋来源右旋糖苷酶应用于医学制品的相关专利。而且国外的右旋糖苷酶制品的生产菌株多为陆源的真菌，例如Lipomyces starkeyi等，其酶活性参数不甚理想。这是由于陆源的右旋糖苷酶最适温度较高，并且在比较温和的酸碱条件下发挥作用，不耐有机溶剂。而海洋来源的右旋糖苷酶可以在极端条件下发挥作用，例如低温、极端pH、高盐、有机溶剂，这为开发出更多新型海洋生物医用材料提供了最佳的条件。当今国内外对海洋微生物产右旋糖苷酶用于生物医学制品的开发研究尚未见报道。

虽然我国酶制剂市场增长较快，但是海洋来源酶制剂研究不足。我国酶制剂研究多集中在食品、工业、农业中，但是对于医药用酶研究不足。我国对于海洋来源的右旋糖苷酶的酶学性质研究以及工业化应用研究，尤其是在生物医学上的应用研究起步较晚。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的能产右旋糖苷酶的海洋细菌替假单胞菌LP602。

本发明所要解决的另一个技术问题是研究交替假单胞菌的生长特性，及其产右旋糖苷酶的方法与酶产品。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。

本发明的特征包括交替假单胞菌LP602（Pseudoalteromonassp. LP602）菌株本身，以及利用该菌株产右旋糖苷酶的方法，以及利用该菌株所产的右旋糖苷酶产品。

本发明所涉及的菌株是在中国江苏省连云港海域的海水中分离到的交替假单胞菌LP602（Pseudoalteromonas sp. LP602），该交替假单胞菌LP602于2010年11月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC N0.4319，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

一、本发明菌株的筛选方法。

1.1本发明中涉及的培养基：

2216E培养基：蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，琼脂2%，陈海水配制，pH8。

初筛培养基：蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，右旋糖苷0.2%，琼脂2%，陈海水配制，pH 8.0；

产酶培养基：酵母膏0.1%，蛋白胨0.1%，右旋糖苷1%，陈海水配制，pH 8.0。

微量矿物盐溶液(每升)：CuSO₄·5H₂O, 0.01g; ZnSO₄·7H₂O, 0.1g; CoCl₂·6H₂O, 0.005g; MnCl₂·4H₂O, 0.2g; Na₂MoO₄·2H₂O, 0.1g; KBr, 0.05g; KI, 0.05g; H₃B0_3,0.1g; NaF, 0.05g; LiCl, 0.05g; Al₂(SO4)_3,0.05g; NiCl₂·6H₂O, 0.01g; VoSO₄·2H₂O, 0.005g; H₂WO₄·2H₂O, 0.002g; Na₂SeO_4,0.005g; SrCl·6H₂O, 0.005g; BaCl₂, 0.005g。

1.2菌株的筛选方法：

海泥直接取1g放入50ml 2216E培养基中，20℃、180r/min培养2-5d。选取合适的培养液的稀释液涂布初筛培养基，20℃培养3-4d，菌落长出后加入95%乙醇，-20℃冷冻3~4h，观察菌落周围是否出现透明圈。挑取有透明圈的单菌落菌株接入产酶培养基，20℃、180r/min培养2d，10000r/min离心15min取上清液测定酶活力大小。选出透明圈较大和酶活力较高的LP602菌株。

二、本发明菌株的形态特征与生理生化特征。

1.1形态特征：

菌株为革兰氏阴性杆状细菌、有荚膜、无芽孢，大小约为1.7-2μm×0.8-1.2μm，参见图1。在含有右旋糖苷固体培养基上的菌落特征：菌落直径4 mm-7 mm，圆形、乳白色、湿润、边缘光滑、中间突起，菌落长出后加入95%乙醇，-20℃冷冻3~4h，菌落周围出现透明圈，参见图2。

1.2生理生化特征:

交替假单胞菌LP602的生理生化特征以及与其他交替假单胞菌的比较见图3、4。菌株LP602氧化酶为阳性，能发酵葡萄糖、甲基红，V-P试验阴性，无氯化钠不可生长，能液化明胶，不能产生吲哚；能利用甘油、丙氨酸、谷氨酸、丙酮酸，而不能利用乳糖、半乳糖、果糖、纤维二糖、麦芽糖。通过Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology(second edition)分析比较，初步判定该菌株LP602为交替假单胞菌属（Pseudoalteromonassp.）。

1.3菌株LP602的分子生物学鉴定：

用Takara试剂盒提取 DNA 模板，并于-40℃保存。

正向引物P1：5′-GAGAGTTTGATCCTGGCT-3′，反向引物P2：5′-CGGCTACCTTGTTACGAC-3′。反应体系25μl，Taq酶2U，反应条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火45s，72℃延伸70s，35个循环，72℃延伸6min。PCR产物的纯化、克隆、测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。扩增菌株LP602的16S rDNA，其长度为1500bp。将菌株LP602的16S rRNA基因序列提交GenBank数据库，通过16S rDNA序列同源性比较，可以初步确认该菌株为交替假单胞菌属（Pseudoalteromonas sp.）。将亲缘关系较近的菌株16S rDNA应用MEGA软件进行多重比较，用中邻接法（Neibor-joining method）建***进化树，从进化树表明菌株LP602与交替假单胞菌属（NR028992 Pseudoalteromonas mariniglutinosa）位于同一簇群，亲缘关系最近，参见图5。

三、本发明菌株LP602的生长特性

本发明提供的菌株LP602，对其生长特性进行了细致的研究，了解不同条件下该菌的生长情况。

3.1种子液的制备：将保藏在2216E培养基的交替假单胞菌LP602接种到2216E培养基中，转速180r/min，装液量20%，培养12h。

3.2温度对菌株LP602生长的影响：

将种子液以2%接种量于2216E培养基，转速180r/min，装液量20%，分别在不同温度下培养，每隔一段时间测定细胞浓度，选择在600nm波长下测定OD值，该菌株能够在4℃下生长，其生长温度范围为4～37℃，最适生长温度为25℃，见图6。

3.3pH对菌株LP602生长的影响：

在2216E培养基中加入终浓度为10mM的磷酸：醋酸：硼酸（1：1：1）作为缓冲液，使培养基的pH分别为4.0～11.0之间，在25℃培养24小时，测定细胞浓度，生长pH范围为6～11，最适生长pH为9.0，见图7。

3.4 NaCl对菌株LP602生长的影响：

按照3.1方法制备种子液，在2216E培养基（将陈海水改用微量矿物盐溶液代替，每升培养基加入10ml）中加入NaCl，使之为0%到12%的NaCl，在25℃培养24小时，测定细胞浓度，生长的NaCl浓度为0.5%～10%，最适生长的NaCl浓度为7%，见图8。

四、菌株产右旋糖苷酶的方法。

将种子液以2%的接种量接种于产酶培养基，180r/min，25℃培养24h，10000r/min离心10min，取上清液，加入65％硫酸铵，静置3h后，12000r/min离心20min，用适量50mM，pH为7.0的Tris-HCL缓冲液溶解沉淀，然后4℃透析24h，再经过DEAE-sepharose Flat Flow和Sephacryl S-200等方法得到右旋糖苷酶。

五、右旋糖苷酶的性质。

5.1 酶作用温度对酶活性的影响：

将右旋糖苷酶置于不同温度下与底物发生反应，测定酶活力，结果见图9，酶的最适作用温度为20℃，5℃仍有45%的酶活力，在5℃～40℃温度范围时有较高的催化活力。

5.2酶的热稳定性：

取适量酶液分别在不同温度（30℃、40℃、50℃和80℃）下保温2.5h，每隔0.5 h取出一组样品，迅速置于4℃冰箱内，待保温结束后统一在标准条件下测定残余酶活，以未处理酶液的酶活设为100%，结果见图10，产生的右旋糖苷酶的热稳定性较好，在50℃下保温2.5 h后酶活仍能保持74%以上，在80℃下保温2.5 h 后酶活仍能保持50%。

5.3酶的作用pH对酶活性的影响：

将酶液与在不同pH的1%的右旋糖苷溶液中在20℃下进行酶活力测定，不同pH值的缓冲液为：50mM柠檬酸钠缓冲液（pH3.0到6.0）；50mM磷酸钠缓冲液（pH 6.0到8.0）；50mM Tris-盐酸缓冲液 (pH 8.0 to 9.0)；50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（pH9.0到10.0）。结果见图11，pH8.0该酶的活性最高。

5.4 酶的pH稳定性：

将50 ul酶液与150 ul不同pH的缓冲液混合，缓冲液为伯瑞坦-罗宾森（Britton-Robinson）缓冲溶液，pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，在20℃水浴锅中保温1h 取出测定残余酶活，将未处理酶液的酶活设为100%。结果见图12，结果表明在20°C保温下1h后，右旋糖苷酶在pH7.0～9.0范围内稳定，残余酶活力保持在55%以上，在pH4.0和pH10.0分别有8.28%和21.6%的残余酶活力。

5.5 右旋糖苷酶活测定

①右旋糖苷酶活测定方法：取1%右旋糖苷溶液100μL加入100μL酶液，空白以100μL灭活的酶液代之，20℃反应15min，立即放入冰浴中终止反应，加入200μL DNS 100℃煮沸5min，终止反应并显色，加入3mL去离子水振荡混匀，取200μL于96孔酶标板上于520nm下进行吸光值测定。

②酶活力单位定义：上述反应条件下每分钟水解右旋糖苷产生1μg麦芽糖所需的酶量，定义为一个酶活力单位（U）。

附图说明

图1 为菌株LP602形态染色特征（10×100）图。

图2 为菌株LP602在含右旋糖苷的平板上的透明圈图。

图3 为菌株LP602的生理生化特征图表。

图4 为菌株LP602理化特征与其他交替假单胞菌的比较图。

图5 为菌株LP602的16S rRNA进化树分析图。

图6 为温度对菌株LP602生长的影响图。图中：15℃(◆), 20℃(□)，25℃（▲）， 30℃（■）。

图7 为pH对菌株LP602生长的影响图。

图8 为NaCl浓度对菌株生长的影响图。

图9 为温度对酶活性的影响图。

图10 为温度对酶热稳定性的影响图。图中：30℃（◇），40℃（×），50（◆），80℃（■）。

图11 为pH对酶活力的影响图。

图12 为pH对酶稳定性的影响图。

本发明所涉及的菌株交替假单胞菌LP602（Pseudoalteromonassp. LP602）已于2010年11月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC N0.4319；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

具体实施方式

以下参照附图，进一步描述本实用新型的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。

实施例1。一种交替假单胞菌LP602（Pseudoalteromonassp. LP602）CGMCC N0.4319。该菌株具有以下特征：菌株为革兰氏阴性杆状细菌、有荚膜、无芽孢，大小约为1.7-2μm×0.8-1.2μm；在含有右旋糖苷固体培养基上的菌落特征：菌落直径4 mm-7 mm，圆形、乳白色、湿润、边缘光滑、中间突起，菌落长出后加入95%乙醇，-20℃冷冻3~4h，菌落周围出现透明圈；氧化酶为阳性，能发酵葡萄糖、甲基红，V-P试验阴性，无氯化钠不可生长，能液化明胶，不能产生吲哚；能利用甘油、丙氨酸、谷氨酸、丙酮酸，而不能利用乳糖、半乳糖、果糖、纤维二糖、麦芽糖。交替假单胞菌LP602的生长特性为：该菌株生长温度范围为4～37℃，生长pH范围为6.0～11.0，生长的NaCl浓度范围为0.5%～10%，最适生长温度为25℃，最适生长pH为9.0，最适生长的NaCl浓度为7%。

实施例2。一种实施例1所述的交替假单胞菌LP602 （Pseudoalteromonassp. LP602）CGMCC N0.4319产右旋糖苷酶的方法，其步骤如下：将交替假单胞菌LP602菌株接种到2216E培养基中，转速180r/min，装液量20%，培养12h，得种子液；将种子液以2%的接种量接种于发酵培养基，180r/min，25℃培养24h，10000r/min离心5min，取上清液即为右旋糖苷酶粗酶液。

实施例3。一种实施例2所述的方法所产右旋糖苷酶，该右旋糖苷酶具有以下特征：所述的右旋糖苷酶的性质为：右旋糖苷酶的适合作用温度为20℃，5℃仍有45%的酶活力，在5℃～40℃温度范围时有较高的催化活力, 产生的右旋糖苷酶的热稳定性较好，在50℃下保温2.5 h后酶活仍能保持74%以上，在80℃下保温2.5 h 后酶活仍能保持50%。右旋糖苷酶在pH7.0～9.0范围内稳定。

Claims

1.一种交替假单胞菌LP602（Pseudoalteromonassp. LP602）CGMCC N0.4319。

2.根据权利要求1所述交替假单胞菌LP602 CGMCC N0.4319，其特征在于，该菌株具有以下特征：菌株为革兰氏阴性杆状细菌、有荚膜、无芽孢，大小为1.7-2μm×0.8-1.2μm；在含有右旋糖苷固体培养基上的菌落特征为：菌落直径4 mm-7 mm，圆形、乳白色、湿润、边缘光滑、中间突起，菌落长出后加入95%乙醇，-20℃冷冻3~4h，菌落周围出现透明圈；氧化酶为阳性，能发酵葡萄糖、甲基红，V-P试验阴性，无氯化钠不可生长，能液化明胶，不能产生吲哚；能利用甘油、丙氨酸、谷氨酸和丙酮酸，而不能利用乳糖、半乳糖、果糖、纤维二糖和麦芽糖。

3.根据权利要求1所述交替假单胞菌LP602 （Pseudoalteromonassp. LP602）CGMCC N0.4319，其特征在于，其生长特性为：该菌株生长温度范围为4～37℃，生长pH范围为6.0～11.0，生长的NaCl浓度范围为0.5%～10%。

4.根据权利要求3所述交替假单胞菌LP602 （Pseudoalteromonassp. LP602）CGMCC N0.4319，其特征在于：该菌株最适生长温度为25℃，最适生长pH为9.0，最适生长的NaCl浓度为7%。

5.一种如权利要求1-4中任何一项所述的所述交替假单胞菌LP602（Pseudoalteromonassp. LP602）CGMCC N0.4319产右旋糖苷酶的方法，其特征在于，其步骤如下：将交替假单胞菌LP602菌株接种到2216E培养基中，转速180r/min，装液量20%，培养16h，得种子液；将种子液以2%的接种量接种于产酶培养基，180r/min，25℃培养24h，10000r/min离心5min，取上清液即为右旋糖苷酶粗酶液。

6.一种如权利要求5所述的方法所产右旋糖苷酶，其特征在于，所述的右旋糖苷酶的理化性质为：右旋糖苷酶的适合作用温度为20℃，5℃仍有45%的酶活力，在5℃~40℃温度范围时有催化活力, 产生的右旋糖苷酶的热稳定性好，在50℃下保温2.5 h后酶活仍能保持74%以上，在80℃下保温2.5 h 后酶活仍能保持50%；该酶在pH 7.0～9.0的范围内稳定。