CN102151246A - 一种新的脂质体制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种新的脂质体制备方法，它解决了易氧化、易水解和易变性的药物制备成脂质体过程中出现的一些难题，并且对于各类药物均具有较高包封率。制备工艺过程包括如下步骤：a、将用于形成脂质体的脂类物质、亲脂性物质溶于有机溶剂形成油相溶液(O)；b、将待包封的水溶性物质溶于水中形成水相溶液(W)；c、将上述两种溶液按合适的比例混合并乳化得到W/O型乳剂(包括微乳、反胶束)；d、将得到的W/O型乳剂冷冻干燥除去溶媒，得到冻干产物；e、将得到的冻干产物水化，即得到脂质体。本工艺过程简单，容易实施。

Description

一种新的脂质体制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，确切地说它是一种新的脂质体(liposomes)(包括类脂体，niosomes)制备方法。

背景技术

脂质体是由磷脂双分子层形成的闭合囊泡状结构。脂质体根据其结构的不同可以分为单层脂质体(unilamellar yesicles)、多层脂质体(multilamellar yesicles)和多囊脂质体(multivesicular liposomes)。脂质体由英国人Alec D.Bangham在1965年首先发现。此后，人们发现脂质体作为物质载体，尤其是药物载体，有着巨大的应用价值，于是便对脂质体进行了***而广泛的研究。

经过了二十多年的探索，科研人员已经提出了许多很有价值的脂质体制备方法。目前脂质体主要通过分散技术(dispersion technique)制备，其方法可分为三大类：1)以机械分散技术为基础。如薄膜分散法(film dispersion)，即将用于形成脂质体的磷脂溶于有机溶媒中——通常是氯仿或氯仿和甲醇的混合物，之后在减压的条件下除去溶媒形成干燥的磷脂膜。将磷脂膜水化即可形成多层脂质体(multilamellar vesicles)。该方法虽是最经典、应用最广的方法，但是却存在一些缺点。例如：使用毒性很大的有机溶媒；无法实现工业化生产；当用含药水溶液水化时，形成的多层脂质体(multilamellar vesicles)层与层之间药物分布不均一，必须通过反复冻融处理等。2)以表面活性剂分散技术为基础。如去左污剂透析法，但难以工业化生产，且不适合包封水溶性药物。3)以溶剂或共溶剂(cosolvent)分散技术为基础。例如，逆相蒸发法(reverse evaporation vesicles，REV)，此种制备方法对水溶性药物的包封率及载药量相对较高；而乳剂法制备多囊脂质体(multivesicular liposome)目前可以实现大规模生产(请参见skyepharma的depofoam技术平台)，但是仅限于制备微米级具有缓释功能的多囊脂质体；乙醇注入法(ethanol injection)，已经实现大规模生产(请参见alza公司的技术和polymun的crossflow技术)，可采用被动载药法制备脂质体，但包封率较低，且需要在较高温度下制备(60℃左右)，通常会引起易氧化、易水解和易变性的药物失去活性，而采用主动载药法制备脂质体，包封率虽有所提高，但不适用于对酸碱敏感的药物，同时也容易引起磷脂分解变性。

而概括起来，目前脂质体制备方法主要存在如下缺陷：

1.制剂的稳定性问题。通过已有方法得到的脂质体制剂通常为液体制剂，往往不够稳定，主要表现在如下三个方面：

(1)脂质体属于热力学不稳定分散系。脂质体混悬于水相时，常常会出现聚集、融合等现象，导致粒径变大，严重的还有可能出现分层。

(2)磷脂存在于水相时，通常容易出现水解、氧化等现象。由于磷脂水解后会形成溶血磷脂，一方面增加制剂的毒性，另一方面也容易使脂质体解体，造成被包封药物的渗漏。

(3)脂质体混悬在水相中，在储存过程中，药物可能会渗漏，导致药物包封率改变，从而影响制剂疗效。如果药物本身容易水解，制剂的稳定性问题更显突出。

2.包封率问题。通过已有方法得到的脂质体制剂，水溶性药物包封率往往较低。包封率低不但会造成原料浪费，还可能达不到有效剂量，不能够体现脂质体制剂的优势。目前常用主动载药法(remote loading)来提高水溶性药物包封率。但无论是pH梯度还是硫酸铵梯度主动载药法，均需要在脂质体膜内外提供较大差别的pH环境，不仅不适用于对酸碱敏感的药物，也容易引起磷脂分解变性。此外，主动载药法仅适用于可解离的药物，应用范围相对有限。

3.脂质体制剂灭菌问题。由于磷脂本身的性质，一般不能够对最终的制剂加热灭菌，这样就要求整个生产过程必须采用无菌操作。这对某些脂质体制备工艺来说可能无法实现。

4.脂质体的粒径控制问题。获得小粒径脂质体(小于200nm)通常有利于静脉给药。这是因为：

(1)大粒径的脂质体很容易被体内的单核巨噬***所吞噬，从而被迅速清除。

(2)小粒径的脂质体可以被动靶向肿瘤组织和缺血心肌。为了获得小粒径脂质体，通常需要对已得到的脂质体进行超声、研磨或挤出。这往往又会导致药物进一步渗漏，影响制剂质量。

5.药物释放问题

一些药物(如拓扑替康等喜树碱类药物)包封入脂质体后释放过快，无法达到药物的病灶浓集作用；而一些药物(如铂类制剂)包封入脂质体后释放过慢，脂质体达到病灶部位后却由于释药过慢而无法达到有效治疗浓度。

为了能够解决上述问题，我们发明了新的脂质体制备方法。

发明内容

为了克服上述脂质体制备技术的不足，我们发明了一种新的脂质体制备方法。通过此方法，可以解决目前脂质体制剂所面临的一些难题。我们将该方法称为乳化-冻干法(emulsification-lyophilization)。

该制备方法包括以下步骤：

a、将用于形成脂质体的脂类物质、冻干品支撑剂和待包封的亲脂性物质溶于有机溶剂形成油相(O)，将待包封的亲水性物质和冻干保护剂溶于水形成内水相(W)，将油相(O)、内水相(W)按合适的比例混合并乳化得到W/O型乳剂；

b、将得到的W/O型乳剂冷冻干燥除去溶媒；

c、将得到的冻干产物水化得到脂质体。

下面我们将就该技术的具体操作和优势进行详细描述。

步骤a优选的有机溶媒为环己烷或环己烷—氯仿混合溶液，用于形成脂质体的脂类物质主要包括磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)和调节磷脂膜性质的胆固醇(cholesterol)；具有类似磷脂性质的两性物质司盘(Span)可用于形成类脂体(niosomes)。此外，为了提高特包封物质的包封率、减小脂质体粒径、增加脂质体稳定性，可加入适量的荷电脂类物质：在包封荷负电物质时，可加入荷正电的脂类物质，如1，2-二酰基-sn-甘油-3-乙基磷脂酰胆碱等。在包封荷正电的水溶性药物时，可加入荷负电的脂类物质，如磷脂酰甘油和磷脂酰丝氨酸等。为了提高磷脂的抗氧化能力，可加入脂溶性抗氧化剂如vitamin E等。

本发明的成功实施，要求步骤a中必须得到稳定的W/O型乳剂。W/O型乳剂指的是澄明、半透明或乳白色均一稳定乳剂。如果环己烷溶液和水溶液的比例不合适，则乳剂不稳定，分层沉淀，可能会出现相反O/W型乳剂，无法使待包封物质包封于内水相，从而导致形成的脂质体包封率大大下降。

步骤b优选的去除溶媒的方法为冷冻干燥法，W/O乳剂可以先置于液氮或低温度装置中迅速冻结，然后在冻干机中冻干。

步骤c为水化冻干产物以形成脂质体，可采用内水相相同溶液或合适的缓冲液在适宜的温度下完成，为加速水化，也可在机械力的作用下完成，如可以进行搅拌或振荡等。

为了得到无菌制剂，可将步骤a中得到的W/O乳剂(包括微乳、反胶束)可以滤过除菌(但并非所有W/O乳剂都可以滤过除菌，如果粒径大于200纳米则难以滤过除菌)，其它步骤在无菌条件下完成。

实施本发明的时候，通过步骤a得到的W/O型乳剂，内水相(W)中可加入水溶性冻干保护剂，如海藻糖、蔗糖、乳糖、甘露醇等物质，外油相中可加入油、水两溶性支撑剂(如PEG1000，PEG1500，PEG2000，PEG3000，PVP等)。这些物质，有如下几个作用：1、可以作为冻干保护剂，确保形成的脂质体具有合适的粒径及较高的包封率；2、使得到的冻干产物稳定，可以长期储存，临用前再进行水化形成脂质体；3、显著加快冻干产物的水化速度，使冻干产物可以立即水化形成脂质体；4、使冻干产物具有良好的形态。

本发明中提到的待包封物质，可以是各种药物药物也可以是其它物质。若为水溶性药物，则将药物、冻干保护剂溶于内水相(W)，脂类物质、支撑剂溶于有机相，通过乳化法得到W/O型乳剂后冻干。得到的冻干产物可长期贮存，临用前水化形成脂质体制剂。为了改变药物释放速率可以加入能够与药物形成不同晶型沉淀或络合物的不同物质(如拓扑替康(topotecan)与硫酸根(SO₄ ^2-)形成沉淀，与铜离子(Cu²⁺)、镍离子(Ni²⁺)形成络合物等)以制备控释脂质体。

待包封物质若为脂溶性药物，则与脂类物质、支撑剂溶于有机相，冻干保护剂溶于内水相，通过乳化法得到W/O型乳剂后冻干。得到的冻干产物可长期贮存，临用前水化形成脂质体制剂。

本发明也可以采用主动载药法，待包封物质可以为硫酸铵、醋酸钠等物质。例如，采用硫酸铵梯度法进行主动载药时，可以将硫酸铵溶于内水相，冻干保护剂溶于内水相，脂类物质(及支撑剂)溶于有机相，通过乳化法得到W/O型乳剂后冻干。得到的冻干产物可长期贮存，待到使用时，加水水化形成包封硫酸铵的脂质体，之后加入药物，即实现主动载药过程。采用pH梯度法进行主动载药时，可以将柠檬酸溶于内水相，冻干保护剂溶于内水相，脂类物质溶于有机相，通过乳化法得到W/O型乳剂后冻干。得到的冻干产物可长期贮存，临用前先加入水水化形成包封柠檬酸的脂质体，之后加入生物碱类药物，孵育得到含药脂质体，实现主动载药过程。

从上述步骤中我们可以看出，我们发明的制备工艺具有如下优点：

1.该制备工艺适用于大规模生产。脂质体工业化生产必须解决几个问题，例如：灭菌、除热源、生产工艺简单便于放大，保证脂质体在储藏期内稳定等。我们发明的制备工艺可以解决上述问题：1)可以将a步骤得到的W/O型乳剂过滤灭菌(粒径小于200纳米的乳剂)，其他步骤采用无菌操作，得到无菌制剂；2)工艺相对简单，只需乳化设备及冻干设备，均为常用设备，比较容易放大；3)为了保证脂质体在储藏期内稳定，可以将冻干物在使用前水化形成脂质体，实验表明得到的冻干物可以长期储存，使用时水化立即形成脂质体。

2.本制备方法的显著特点是可以明显提高水溶性药物包封率。由于水溶性药物始终包含于乳剂内水相、有序磷脂内部、形成的脂质体内部，因此有较高包封率。

3.易于制备控释脂质体。将能够与药物形成稳定晶型沉淀或络合物等的物质与药物共同包封于脂质体，可以有效控制药物释放速度。

4.本发明可以有效地控制脂质体粒径。如前所述，通过调整冻干保护剂、支撑剂、脂类物质的比例及乳化过程等条件，可以有效地控制脂质体的粒径。由于可以得到粒度均一的小粒径脂质体，增加了本发明的应用价值。

5.该制备工艺可以充分保证某些敏感药物的活性。由于制备工艺在低温下完成，这样就避免了药物的水解和氧化。水溶性药物在W/O型乳剂中仅存在于内水相，且存在的时间很短，可以避免有机溶媒使药物的变性失活。脂溶性药物在W/O型乳剂中虽存在于油相，但有机溶媒对于脂溶性药物一般无变性失活作用。

6.可以彻底除去残留溶媒也是本发明的一个优点。由于冻干机的真空度很低(可小于10pa)，所以得到的冻干产物中检查不出溶媒残留。

简而言之，本发明不同于传统的脂质体制备工艺(如REV)，其实质是通过冻干的手段去除W/O型乳剂中的溶媒并得到冻干产物，再水化形成脂质体，从而具备了上述显著优势。

通过下列实施实例举例说明本发明的具体制备方法，但本发明的保护范围，不局限于此。

具体实施方式

实施例1：

支撑剂及冻干保护剂蔗糖对冻干特性的影响：将以5％蔗糖水溶液为内水相，支撑剂1％PEG1500、1％大豆卵磷脂溶于***—氯仿—环己烷(1∶1∶4，v/v/v)溶液为油相，内水相与油相按1∶3体积比混合，通过探头超声(80w，30s)乳化，得到W/O型乳剂，分装1ml/瓶，置入-80低温冰箱冷冻后，转入冷冻干燥机冻干，发现支撑剂PEG2000、冻干保护剂蔗糖加入明显改善冻干产物的形态，加快水化速率，并且得到的水化产物为粒径小于200纳米的脂质体。冻干品储存1年以上仍可以形成脂质体。

实施例2：

脂质成分对脂质体粒径的影响：将以5％乳糖水溶液为内水相，2％PEG2000溶于氯仿—***(1∶1，v/v)油相，通过涡旋振荡(2000rpm，3min)乳化，得到W/O型乳剂后，分装1ml/瓶，置入充满液氮的液氮灌冷冻后，转入冻干机冻干，冻干产物中脂质成分为PC，PC/CHOL(4∶1，质量比)，PC/PS(9∶1，质量比)，加入5％蔗糖水溶液后形成磷脂浓度均为1％的脂质体，用LS230(Beckmann公司)测定粒径，脂质体的平均粒径分别为176nm，158nm，123nm(number mean diameter)。这说脂质成分对于脂质体粒径有一定的影响。

实施例3：

用透射电子显微镜观察实施例1和2中得到的脂质体。采用负染法进行观察。即将脂质体用1％的磷钨酸(pH＝7)染色。在电子显微镜下发现脂质体为单层或寡层、近球形囊泡，大小与用粒度仪测定的结果相吻合。

实施例4：

钙黄绿素脂质体的制备：将3ml含0.5％大豆卵磷脂、0.5％PEG3000的***—环己烷(1∶4，v/v)溶液与1ml含10％海藻糖的0.1mM钙黄绿素水溶液混合，以高速混匀器乳化(26000rpm，1min)，得到W/O型乳剂，分装1ml/瓶，置入-80低温冰箱冷冻后，转入冷冻干燥机冻干。用1ml 10％蔗糖溶液水化冻干品，用LS32(Beckmann公司)测定粒径，脂质体的平均粒径为102nm(number mean diameter)。用荧光猝灭法测包封率，为75.1％。

实施例5：

本实施例是将非甾体抗炎药物Flurbiprofen制成脂质体。将3ml含Flurbiprofen(1mM)、1％SPC、1％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)的环己烷溶液与1ml含2.5％葡萄糖、2.5％甘露醇水溶液混合，水浴超声乳化(21kHz，120w，2min)得到W/O型乳剂，分装1ml/瓶，置入-80低温冰箱冷冻后，转入冷冻干燥机冻干。每瓶冻干品用1ml 5％蔗糖水溶液水化，用LS230(LS32version 3.19 software，Beckmann公司)测定粒径。脂质体的平均粒径为122nm(number meandiameter)。用微柱离心分离法分离脂质体和游离药物，测得包封率为91.2％。

实施例6：

本实施例是制备具有控释特性的拓扑替康脂质体。将3ml含2％SPC、2％PEG1500的环己烷—氯仿(3∶1，v/v)溶液与1ml 5％蔗糖水溶液(不同处方分别含有300mM枸橼酸钠、300mM Na₂SO₄、300mM CuSO₄)混合后高压乳匀机乳化(200psi，3 cycles)，得到W/O型乳剂，分装1ml/瓶，置入-80低温冰箱冷冻后，转入冷冻干燥机冻干。冻干品用5％蔗糖水溶液水化，得到小粒径脂质体，测得包封率为60％-70％，含有300mM枸橼酸钠脂质体释药速率约为含300mM CuSO₄脂质体的3倍，为300mM Na₂SO₄脂质体的2倍。

实施例7：

本实施例是将乳化—冻干法与主动载药法结合制备拓扑替康脂质体。将3ml含2％SPC、4％PEG2000***—环己烷(1∶4，v/v)溶液与1ml 5％蔗糖水溶液(含硫酸铵)混合，混匀器乳化(6000rpm，3min)，得到W/O型乳剂，分装1ml/瓶，置入充满液氮的液氮灌冷冻后，转入冻干机冻干，冻干品用5％蔗糖水溶液水化，得到小粒径脂质体，用G-50 SEPHADEX葡聚糖凝胶柱分离去除游离硫酸铵，加入拓扑替康(药物/磷脂＝1∶4)，在40-50℃保温10分钟，得到包封拓扑替康的脂质体，测得包封率为99.7％。

实施例8：

本实施例是将乳化—冻干法制备5-FU类脂体(niosomes)。将3ml含2％SPAN60、4％PEG2000的***—环己烷(1∶1，v/v)溶液与1ml 5％葡萄糖水溶液(含5mg/ml 5-FU)混合，混匀器乳化(6000rpm，3min)，得到W/O型乳剂，分装1ml/瓶，置入-80℃低温冰箱冷冻后，转入冻干机冻干。冻干品用5％蔗糖水溶液水化，得到粒径为230纳米的类脂体，测得包封率为25.7％。

Claims (10)

1.一种新的脂质体制备方法，其特征在于：

a、将用于形成脂质体的脂类物质和待包封的亲脂性物质溶于有机溶剂形成油相(O)，将待包封的亲水性物质溶于水形成内水相(W)，将油相(O)、内水相(W)按合适的比例混合并乳化得到W/O型乳剂(包括微乳、反胶束)；

b、将得到的W/O型乳剂冷冻干燥除去溶媒得到冻干产物；

c、将得到的冻干产物水化得到脂质体。

2.根据权利要求1所述的一种新的脂质体制备方法，其特征在于：步骤a中的有机溶剂指环己烷、氯仿、***等与水不混溶易挥发除去的有机溶剂，或其混合物，优选与水凝固点接近的有机溶剂。

3.根据权利要求1所述的一种新的脂质体制备方法，其特征在于：步骤a中的乳化(emulsification)指的是搅拌，或振荡，或涡旋振荡，或匀乳，或高压匀乳，或超声等机械做功操作，或为搅拌、涡旋振荡、匀乳、高压匀乳、超声等组合操作，或为处方成分自动乳化，等等。

4.根据权利要求1所述的一种新的脂质体制备方法，其特征在于：步骤a中用于形成脂质体的脂类物质主要为磷脂(phospholipid)，如磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)或聚乙二醇修饰磷脂酰乙醇胺(PEGylatedPE)、磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)、磷脂酰甘油(Phosphatidylglycerol，PG)等，以及调节磷脂膜性质的胆固醇(cholesterol)；也可以为具有磷脂类似性质的其它两性物质(如司盘类等，以形成类脂质体，niosomes)；以及不同脂类适当配比的混合物；为了提高待包封物质的包封率、减小脂质体粒径及增加稳定性，可加入适量的荷电脂类物质：在包封负电荷物质时，可加入荷正电的脂类物质，在包封正电荷物质时，可加入荷负电的脂类物质；为了提高脂质体在体内外稳定性可以加入亲水性高分子修饰磷脂，如聚乙二醇磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)；为了提高磷脂的抗氧化能力，可加入脂溶性抗氧化剂。

5.根据权利要求1所述的一种新的脂质体制备方法，其特征在于：步骤a中待包封的物质可以为药物，也可以为其它物质，如核酸，DNA等。

6.根据权利要求1所述的一种新的脂质体制备方法，其特征在于：为了使冻干产品易于水化及改善冻干品外形，可以在油相中加入能够同时溶于有机溶剂及水的支撑剂(supportagents)，如聚乙二醇类(polyethylene glycol，PEG，如PEG1000，PEG1500，PEG2000，PEG3000，等溶于卤代烃，水)、聚乙烯吡咯烷酮(PolyVinylPyrrolidone，PVP易溶解于水，醇，胺以及卤代烃中)。

7.根据权利要求1所述的一种脂质体制备新方法，其特征在于：在步骤a内水相(W)中可加入适当的冻干保护剂(cryoprotectant)，包括二糖(disaccharide)，如海藻糖(trehalose)、蔗糖(sucrose)、乳糖(lactose)、麦芽糖(maltose)等，或单糖(monosaccharide)，如葡萄糖(glucose)、半乳糖(galactose)、甘露糖(mannose)，或其它寡聚糖(oligosaccharide)，如三糖(trisaccharide)、四糖(tetrose)、五糖等，或甘露醇(mannitol)等具有冻干保护等作用的物质；或者为几种冻干保护剂的混合物；为了改变药物释放速率可以加入能够与药物形成不同晶型沉淀或络合物的不同物质(如拓扑替康(topotecan)与硫酸根(SO₄ ^2-)形成沉淀，与铜离子(Cu²⁺)、镍离子(Ni²⁺)形成络合物等)以制备控释脂质体。

8.根据权利要求1所述的一种脂质体制备新方法，其特征在于：为了得到无菌制剂，可将步骤a中得到的W/O型乳剂(粒径小于200纳米，包括微乳、反胶束)过滤灭菌，其它步骤在无菌条件下完成。

9.根据权利要求1所述的一种新的脂质体制备方法，其特征在于：步骤b中W/O型乳剂可以在液氮或低温装置冻结，然后在冻干机中冻干；也可以直接在冻干机中冻干。

10.根据权利要求1所述的一种新的脂质体制备方法，其待征在于：步骤c为水化冻干产物以形成脂质体，可采用水或合适的缓冲液在适当的温度下完成，为加速水化，也可在机械力的作用下完成，如可以进行搅拌或振荡等；如采用被动载药法时，水化时可以采用水或合适的缓冲液；如采用硫酸铵或醋酸钠或醋酸钙梯度法主动载药时，可以用水水化形成脂质体后，加入待包封的药物孵育形成含药脂质体；如采用PH梯度法主动载药时，用水水化形成脂质体后，再加入药物孵育得到含药脂质体。