CN102149824A - 保护亲核基团的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了涉及含亲核基团的分子的保护和脱保护、如热稳定聚合酶的保护和脱保护的组合物、方法和试剂盒。还提供了用根据本发明加以保护的聚合酶进行核酸扩增的方法。

Description

保护亲核基团的组合物和方法
发明背景
自1980年代中期以来，聚合酶链反应(PCR)的到来由于极度地扩大了鉴定、操控和复制DNA的能力而彻底变革了分子生物学。如今，PCR常规应用在进行科学研究、临床诊断、法医鉴定和环境研究的过程中。聚合酶链反应(PCR)是模板导向的聚合反应，其提供了体外扩增特定核酸的方法。PCR可以在单个酶促反应中于数分钟至数小时内产生百万到十亿倍的DNA模板拷贝，从而使研究者能够确定靶DNA的大小和序列。
尽管在分子生物学和工程学领域中取得了显著进展，但PCR仍然是具有问题的应用。一个具体问题是由PCR引物组与非靶DNA序列杂交的错误引物引发引起的非特异性DNA扩增。原则上，引物与靶DNA的特异性杂交应确保靶DNA而不是其它污染序列的扩增。特异性引物引发大多在较高温度如约60℃-70℃下实现。这也是DNA聚合酶Taq最具活性的温度。因此，链延伸反应通常被设定成在这些温度下发生，以使特异性DNA扩增最大化。然而，在较低温度，如室温下，这时PCR反应的组分发生装配，将更频繁地发生错误引物引发。错误引物引发可能由正向引物与反向引物之间的部分杂交(即形成引物二聚体)、或由引物与DNA模板中的部分互补序列之间的杂交导致。这些微弱形成的杂交体在室温或室温左右十分稳定。由于Taq在室温下仍然表现出显著、尽管非最佳的活性，因此非特异性杂交体可以引起非特异性PCR产物的产生，而非特异性PCR产物在PCR反应期间充当模板，以形成更大量的非特异性产物。在一些情况下，如在低模板拷贝数的情况下，非特异性扩增产物可以是优势PCR产物。
为了克服前述问题，人们已经开发出了多种所谓的“热启动”PCR法来遏制在低于常用PCR操作温度的温度下的非特异性扩增。一般而言，大多数已知热启动法都采用了在低于常用PCR操作温度的温度下无活性或活性非常低的热启动聚合酶或聚合酶复合物。例如，已经开发的聚合酶特异性单克隆抗体通过形成聚合酶-抗体酶复合物来抑制酶活性。在室温下，该酶复合物稳定，因而无活性。当温度升高至约90℃时，酶复合物释放出抗体，因而变得被活化(美国专利No.5,338,671，Scalice E R等，Kellogg等，(1994)Biotechniques16：1134-1137)。为了充分遏制室温下的酶活性，常常需要抗体与酶的高摩尔比(通常为1-7倍)。这种高的抗体与酶比使该方法相对昂贵。另一缺点是，酶-抗体结合在某种程度上说是可逆的。因此，即使在PCR操作温度下酶活性明显较高，但与无抗体存在下的酶相比，酶也可能未完全活化。
开发热启动聚合酶的另一途径是用热敏修饰基团对酶的赖氨酸残基进行化学修饰。修饰的酶在低于PCR温度下无活性。然而，一旦修饰的酶被加热到较高温度，如高于90℃，修饰基团便从酶释放，从而使酶活化(美国专利No.5,677,152和6,183,998)。这种方法具有两个吸引人的特征。第一个是修饰的酶的修饰化学和生产工艺都简单而且廉价。第二个特征是，酶的活化原则上是不可逆的过程。因此，在活化时可能获得与基于抗体的热启动酶相比更大量的酶活性。然而，实际上，化学修饰的常规热启动DNA聚合酶遇到了许多深切的缺点。化学修饰的热启动酶启动慢。例如，AmpliTaq Gold是市场上可以买到的化学修饰Taq，它可能需要长达15-20min的活化时间，这构成了全部PCR时间的很大部分。并且，如进行性降低的活化恢复效率(recovery activation efficiency)经常显示的那样，已知化学修饰的Taq在储存期间显著降解。而且，热活化后，化学修饰的Taq一般而言不能恢复到相应的未修饰酶的全部酶能力，即使该修饰的酶是新制的。
发明概述
对修饰的酶(例如，聚合酶)改善PCR和其它化学反应的性能存在着相当的需求。具体地说，需要在PCR反应被装配的条件下基本上无活性、但一旦需要反应被激活便可以迅速且高效地活化的聚合酶。此外，适合这种及其它应用的聚合酶应该在储存期间稳定，并且制造应该相对廉价。本发明解决了这些需求中的一个或多个需求，并且也提供了相关利益。
在一个实施方案中，本发明提供了可逆地保护亲核基团的方法，其包括：a)提供亲核基团；b)使亲核基团与下式的试剂反应：
Figure BPA00001311644800031
其中R1，R2，R5和R6是取代或未取代的烃残基；
a和b独立地为0或1；
R3和R4独立地为-H或取代基，其中当a和b为0时，R3和R4中至少有一个为取代基，以及其中R3和R4是顺式的；
Z形成3，4，5，6，7或8元环。
在一些实施方案中，a和b为0。在有关实施方案中，R3或R4为取代基。例如，R3或R4为烷基，如甲基。在一些实施方案中，Z形成了6元环。或者，Z形成双环部分。在特定实施方案中，试剂具有下式：
Figure BPA00001311644800032
其中X是O或者取代或未取代的亚烷基。
在一些实施方案中，亲核基团是多肽的赖氨酸残基的ε-氨基。在其它实施方案中，多肽是聚合酶。
本发明还提供了可逆地保护亲核基团的方法，其包括：a)提供亲核基团；b)使亲核基团与下式的试剂反应：
其中R1，R2，R5和R6是取代或未取代的烃残基；
a和b独立地为0或1，并且a和b中至少有一个为1；
R3和R4独立地为-H或取代基，其中R3和R4任选形成环，此外，其中R3和R4是顺式的。
在一些实施方案中，a是1，b是0。或者，a是0，b是1。R3或R4可以是取代基。例如，R3或R4可以是烷基，如甲基。在其它实施方案中，R3和R4形成6元环和/或芳环。在具体实施方案中，R3和R4形成被最多四个其它取代基取代的苯环。
在本方法的特定实施方案中，试剂具有下式：
Figure BPA00001311644800042
其中R是单价取代基，c是0，1，2，3或4。
另一方面，本发明提供了在多肽中制备受保护赖氨酸残基的方法，其包括使六元或七元环酐与赖氨酸残基的ε-氨基反应，其中反应生成了包含酰胺和羧酸的受保护赖氨酸残基；此外，其中羧酸是相对于酰胺构象受限的，以至于所述羧酸表现出与包含相应未受限羧酸的受保护赖氨酸残基相比更强的与酰胺反应的倾向。
多肽的受保护赖氨酸残基与包含相应未受限羧酸的受保护赖氨酸残基相比更容易发生脱保护。例如，羧酸可以由于5、6或7元环的存在而成为相对于酰胺是构象受限的。羧酸也可以由于烷基取代而成为相对于酰胺是构象受限的。例如，烷基取代的位置可以邻近酰胺。或者，烷基取代的位置邻近羧酸。
本发明还提供了在多肽中制备受保护赖氨酸残基的方法，其包括使五元环酐与赖氨酸残基的ε-氨基反应，其中反应生成了包含酰胺和羧酸的受保护赖氨酸残基；此外，其中羧酸由于被取代的3、4、5、6或7元环而成为相对于酰胺是构象受限的，以至于所述羧酸表现出与包含相应未受限羧酸的受保护赖氨酸残基相比更强的与酰胺反应的倾向。
3、4、5、6或7元环可以被烷基取代，从而进一步相对于酰胺在构象上限制羧酸。例如，烷基取代的位置可以邻近酰胺。或者，烷基取代的位置可以邻近羧酸。
本发明另外提供了扩增模板核酸的方法，其包括：a)提供包含聚合酶群的扩增反应混合物，该聚合酶群被可逆地保护，以使聚合酶群在被置于合适的脱保护条件下小于约10min时，可以至少80％的收率转化为相应的未受保护聚合酶群；b)使受保护聚合酶群中的单个聚合酶脱保护成相应的未受保护聚合酶；和c)将所述混合物置于合适的扩增条件下，以扩增模板。
在一个实施方案中，转化步骤包括在所述合适的脱保护条件下将受保护聚合酶群温育10min以下，以使受保护聚合酶群的80％以上被转化为未受保护聚合酶。
另一方面，提供了扩增模板核酸的方法，其包括：a)提供包括聚合酶的扩增反应混合物，该聚合酶被可逆地保护，以使其在被置于合适的脱保护条件下小于约10min时，可以至少80％的确定性转化为相应的未受保护聚合酶；b)使受保护聚合酶脱保护成所述未受保护聚合酶；和c)将所述扩增反应混合物置于使模板扩增的条件下。或者，提供了扩增模板核酸的方法，其包括：a)提供包含聚合酶群的扩增反应混合物，该聚合酶群被可逆地保护，以使聚合酶群在被置于合适的脱保护条件下小于约15min时，可以至少50％的收率转化为相应的未受保护聚合酶群；b)使受保护聚合酶群中的单个聚合酶脱保护成相应的未受保护聚合酶；c)将所述混合物置于合适的扩增条件下，以扩增模板。所述脱保护可以发生在，例如，约6至11的pH下。在其它实施方案中，所述脱保护可以发生在大于约85℃的温度下。或者，所述脱保护可以发生在约90℃至100℃，或约55℃至65℃的温度下。未受保护聚合酶可以是Taq聚合酶。
在一些实施方案中，聚合酶通过与上文所述试剂反应而得到保护。在其它实施方案中，反应混合物包括一种或多种选自引物、核苷酸、模板和核酸检测试剂的扩增试剂。或者，扩增反应在基底上进行。
本发明进一步提供了包含受保护聚合酶群的组合物，其中a)与相应的未受保护聚合酶群相比，受保护聚合酶群基本上无活性；b)所述受保护聚合酶群内的单个聚合酶在被置于合适的脱保护条件下小于10min时，可以至少80％的收率转化为相应的未受保护聚合酶，所述收率通过聚合酶活性的增加而测得。聚合酶活性可以作为执行核酸引物的模板依赖性延伸的能力来测量。例如，聚合酶活性可以在核酸扩增反应中进行评价。所述脱保护可以发生在，例如，约6至11的pH下。在其它实施方案中，所述脱保护可以发生在大于约85℃的温度下。或者，所述脱保护可以发生在约90℃至100℃的温度下。本发明还涵盖了扩增反应混合物，其包含根据本发明的受保护聚合酶群和一种或多种选自核苷酸、模板核酸和引物的扩增试剂。扩增反应混合物可以另外包含提供指示被扩增的模板核酸存在的可检测信号的核酸检测试剂。
另一方面，提供了组合物，其包含：a)第一受保护聚合酶群，其中该第一群相对于相应的第一未受保护聚合酶群基本上无活性；b)第二受保护聚合酶群，其中该第二群相对于相应的第二未受保护聚合酶群基本上无活性；其中所述第一受保护聚合酶群内的单个聚合酶在第一组合适的脱保护条件下可以转化为相应的未受保护聚合酶，但是在该条件下，所述第二受保护聚合酶群内的单个聚合酶不能转化为相应的未受保护聚合酶；此外，其中所述第二受保护聚合酶群内的单个聚合酶在第二组合适的脱保护条件下可以转化为相应的未受保护聚合酶。
第一受保护聚合酶群可以包含RNA聚合酶。在另一实施方案中，第二受保护聚合酶群包含热稳定DNA聚合酶。第一和第二聚合酶群可以一起进行逆转录-偶联PCR反应。例如，第一组脱保护条件下的脱保护可以发生在约40℃至约60℃的温度下。第二组合适脱保护条件下的脱保护可以发生在约80℃至约100℃的温度下。
本发明还提供了包含根据本发明的受保护聚合酶和核酸检测试剂的试剂盒。核酸检测试剂可以是荧光试剂，例如EvaGreen或SYBR Green I。试剂盒可以另外包含一种或多种选自引物、模板、磷酸核苷和缓冲剂的试剂。试剂盒可以另外包含用户指导手册。这样的用户手册可以指导用户执行反应，如核酸扩增反应。
本文还提供了用于包含多重热循环的核酸扩增反应的仪器，其包括：自动化热循环仪，其能够交替加热和冷却，并且适合容纳至少一个含有扩增反应混合物的反应器，所述扩增反应混合物包含模板核酸、核苷酸、核酸检测试剂和本发明的受保护聚合酶群；其中循环仪可以被编程，以通过控制受保护聚合酶的脱保护来控制扩增反应的起动。在一些实施方案中，该仪器另外包含能显示受保护聚合酶的脱保护程度和/或显示可以使一个或多个脱保护聚合酶群变成失活的条件组的显示器。这样的显示器可以帮助仪器用户执行本文所公开的反应。
该仪器可以进一步包含在扩增反应进行时可以用来检测荧光信号的检测器，该荧光信号与反应容器中被扩增核酸的存在和/或量有关。检测器可用于，例如，检测以下波长范围中的至少一个波长范围内的荧光信号：约510至约530nm，约540至约550nm，560至约580nm，约585至约595nm，590至约610nm，660至约680nm，约690至约710nm，或770至约790nm。该仪器也可以适合容纳多个各自含有扩增反应混合物的反应容器。
引入用作参考
本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请都引入本文作为参考，其程度如同明确且独立地指出各个独立出版物、专利或专利申请被引入作为参考。
附图简述
本发明的新特征在所附权利要求书中具体阐述。参照以下阐述利用了本发明原则的说明性实施方案的详尽描述和说明性实施方案的附图，将更好地理解本发明的特征和优点：
图1和2.使用本发明的保护试剂进行的胺的保护和脱保护。
图3和4.本发明的保护试剂的合成。
图5.在琼脂糖凝胶中使用Taq DNA聚合酶与使用根据本发明的受保护Taq DNA聚合酶之间的PCR产物比较。
图6.被9号化合物保护的Taq在94℃分别于pH 8.0、pH 8.5和pH 9.0的Tris缓冲液中活化后的相对酶活性。
图7.使用未受保护Taq聚合酶及分别被1号化合物和9号化合物保护的Taq聚合酶的DNA扩增的Ct值。
图8.使用被9号化合物保护的Taq和5′-外切核酸酶可切开的AllGlo探针的PCR的扩增曲线
图9.被不同保护试剂(分别为1号化合物，9号化合物和柠康酐)保护的Taq DNA聚合酶在不同温育时间后的相对活性。
图10.显示柠康酐的可逆和不可逆酶修饰的示意图。
发明详述
本发明提供了用于各种有机分子、包括生物学上有意义的分子如多肽中的亲核基团的保护和脱保护的组合物和方法。
定义
本文所用术语“亲核基团”指的是能在合适反应条件下与相应亲电子基团反应的任何部分。亲核基团包括但不限于有机亲核基团，如胺、硫醇和羟基部分。亲核基团可以与任何大小的有机分子或与任何其它结构或支持体如表面相连。
本文所用的“核酸扩增”指的是在其中靶核酸拷贝数增加的酶促反应。这种增加可以线性或指数方式出现。
术语“多肽”涵盖了通过共价键如酰胺键结合的两个或以上天然或非天然存在的氨基酸。本文所述的多肽包括包括全长蛋白以及较短的氨基酸序列(例如，天然存在的蛋白的片段或合成多肽片段)。
本文所用术语“聚合酶”表示可以使一组单体聚合成具有预定单体序列的聚合物的任何分子或分子集合，包括但不限于天然存在的聚合酶或逆转录酶、突变的天然存在的聚合酶或逆转录酶、非天然存在的聚合酶或逆转录酶，其中突变包括一个或多个或许多氨基酸被其它氨基酸代替、聚合酶或逆转录酶的一个或多个或许多氨基酸的***或缺失、或一种或多种聚合酶或逆转录酶的部分的结合。术语聚合酶还包含可以聚合产生具有预定单体序列的聚合物的合成分子或分子集合，或可以具有促进标签的纯化和/或固定和/或分子相互作用的其它序列、并且可以聚合产生具有预定或指定或用模板的(templated)单体序列的聚合物的任何其它分子或分子集合。
本文所用术语“热稳定酶”指的是能够在高于约40℃的温度下催化或促进化学反应的酶。
本文所用术语“构象受限”表示分子或部分中旋转或平动自由度的至少一种被降低或消除。因此，构象受限分子可以基本上被锁定为特定构象，或者可以具有相对于该分子的剩余部分基本上被限于特定构象和/或位置的一个或多个取代基。
本文所用术语“保护”和“受保护的”指的是分子在与本发明的保护试剂反应之后的状态。同样地，术语“脱保护”或“脱保护的”指的是分子在引入了合适的脱保护条件之后的状态。当要保护和/或脱保护的分子包含多个能与本发明的保护试剂反应的亲核基团时，应当了解，没有必要为了分子被视为“脱保护的”而将每一个和所有的亲核基团都脱保护，判断分子是“受保护”或“脱保护”状态的根据是其功能特性。仅仅作为例子，如果聚合酶包含几个亲核基团，如赖氨酸的ε-氨基，当该聚合酶与本发明的保护试剂反应后变得无活性时则认为其是受保护的。同样地，在引入合适的脱保护条件后，聚合酶的活性恢复，则认为聚合物是脱保护的，而不管是否聚合酶中的每一个和所有的赖氨酸基团本身都被脱保护。
术语“卤”或“卤素”指的是氟，氯，溴或碘或其根。
术语“烷基”指的是含有数目指出的碳原子的直链或支链烃链。例如，C1-C10表示该基团中含有1-10个(含)碳原子。在没有任何数字标识的情况下，“烷基”是在其中含有1-20个(含)碳原子的(直或支)链。
术语“亚烷基”指的是二价烷基(即，-R-)。
术语“烯基”指的是含有一个或多个碳碳双键的直链或支链烃链。烯基部分含有数目指出的碳原子。例如，C2-C10表示该基团中含有2-10个(含)碳原子。术语“低级烯基”指的是C2-C6烯基链。在没有任何数字标识的情况下，“烯基”是在其中含有2-20个(含)碳原子的(直或支)链。
术语“炔基”指的是含有一个或多个碳碳三键的直链或支链烃链。炔基部分含有数目指出的碳原子。例如，C2-C10表示该基团中含有2-10个(含)碳原子。术语“低级炔基”指的是C2-C6炔基链。在没有任何数字标识的情况下，“炔基”是在其中含有2-20个(含)碳原子的(直或支)链。
术语“芳基“指的是6碳单环或10碳双环的芳环***，其中各个环的0、1、2、3或4个原子被取代基取代。芳基的例子包括苯基，萘基等。术语“芳基烷基”或术语“芳烷基”指的是被芳基取代的烷基。术语“芳基烷氧基”指的是被芳基取代的烷氧基。
“芳基烷基”指的是上文所定义的芳基，其中芳基的氢原子之一被上文所定义的C1-C5烷基代替。芳基烷基的代表性例子包括但不限于2-甲基苯基，3-甲基苯基，4-甲基苯基，2-乙基苯基，3-乙基苯基，4-乙基苯基，2-丙基苯基，3-丙基苯基，4-丙基苯基，2-丁基苯基，3-丁基苯基，4-丁基苯基，2-戊基苯基，3-戊基苯基，4-戊基苯基，2-异丙基苯基，3-异丙基苯基，4-异丙基苯基，2-异丁基苯基，3-异丁基苯基，4-异丁基苯基，2-仲丁基苯基，3-仲丁基苯基，4-仲丁基苯基，2-叔丁基苯基，3-叔丁基苯基和4-叔丁基苯基。
“芳基酰氨基”指的是上文所定义的芳基，其中芳基的氢原子之一被一个或多个-C(O)NH2基团代替。芳基酰氨基的代表性例子包括2-C(O)NH2-苯基，3-C(O)NH2-苯基，4-C(O)NH2-苯基，2-C(O)NH2-吡啶基，3-C(O)NH2-吡啶基和4-C(O)NH2-吡啶基。
“烷基杂环”指的是上文所定义的C1-C5烷基，其中C1-C5烷基的氢原子之一被杂环代替。烷基杂环基团的代表性例子包括但不限于-CH2CH2-吗啉，-CH2CH2-哌啶，-CH2CH2CH2-吗啉和-CH2CH2CH2-咪唑。
“烷基酰氨基”指的是上文所定义的C1-C5烷基，其中C1-C5烷基的氢原子之一被-C(O)NH2基团代替。烷基酰氨基的代表性例子包括但不限于-CH2-C(O)NH2，-CH2CH2-C(O)NH2，-CH2CH2CH2C(O)NH2，-CH2CH2CH2CH2C(O)NH2，-CH2CH2CH2CH2CH2C(O)NH2，-CH2CH(C(O)NH2)CH3，-CH2CH(C(O)NH2)CH2CH3，-CH(C(O)NH2)CH2CH3，-C(CH3)2CH2C(O)NH2，-CH2-CH2-NH-C(O)-CH3，-CH2-CH2-NH-C(O)-CH3-CH3和-CH2-CH2-NH-C(O)-CH＝CH2。
“烷醇”指的是上文所定义的C1-C5烷基，其中C1-C5烷基的氢原子之一被羟基代替。烷醇基团的代表性例子包括但不限于-CH2OH，-CH2CH2OH，-CH2CH2CH2OH，-CH2CH2CH2CH2OH，-CH2CH2CH2CH2CH2OH，-CH2CH(OH)CH3，-CH2CH(OH)CH2CH3，-CH(OH)CH3和-C(CH3)2CH2OH。
“烷基羧基”指的是上文所定义的C1-C5烷基，其中C1-C5烷基的氢原子之一被--COOH基团代替。烷基羧基的代表性例子包括但不限于-CH2COOH，-CH2CH2COOH，-CH2CH2CH2COOH，-CH2CH2CH2CH2COOH，-CH2CH(COOH)CH3，-CH2CH2CH2CH2CH2COOH，-CH2CH(COOH)CH2CH3，-CH(COOH)CH2CH3和-C(CH3)2CH2COOH。
本文所用术语“环烷基”包括含有3-12个碳原子、3-8个碳原子、或3-6个碳原子的饱和和部分不饱和环烃基，其中环烷基另外任选被取代。一些环烷基包括但不限于环丙基，环丁基，环戊基，环戊烯基，环己基，环己烯基，环庚基和环辛基。
术语“杂芳基”指的是芳香族5-8元单环、8-12元双环或11-14元三环的环***，其中单环含有1-3个杂原子，双环含有1-6个杂原子，或三环含有1-9个杂原子，所述杂原子选自O、N或S(例如，碳原子和单环、双环或三环分别为1-3、1-6、或1-9个O、N或S杂原子)，其中各个环的0、1、2、3或4个原子被取代基取代。杂芳基的例子包括吡啶基，呋喃基(furyl)或呋喃基(furanyl)，咪唑基，苯并咪唑基，嘧啶基，苯硫基或噻吩基，喹啉基，吲哚基，噻唑基等。
术语“杂芳基烷基”或术语“杂芳烷基”指的是被杂芳基取代的烷基。术语“杂芳基烷氧基”指的是被杂芳基取代的烷氧基。
术语“杂芳基烷基”或术语“杂芳烷基”指的是被杂芳基取代的烷基。术语“杂芳基烷氧基”指的是被杂芳基取代的烷氧基。
术语“杂环基”指的是非芳香族的5-8元单环、8-12元双环或11-14元三环的环***，其中单环含有1-3个杂原子，双环含有1-6个杂原子，或三环含有1-9个杂原子，所述杂原子选自O、N或S(例如，碳原子和单环、双环或三环分别为1-3、1-6、或1-9个O、N或S杂原子)，其中各个环的0、1、2或3个原子被取代基取代。杂环基的例子包括哌嗪基，吡咯烷基，二氧杂环己烷基，吗啉基，四氢呋喃基等。
术语“烃残基”指的是任何烷基，环烷基，烯基，环烯基和炔基。
术语“取代基“指的是代替任何分子、化合物或部分上的另一原子或基团如氢原子的基团。适宜的取代基包括但不限于卤，羟基，巯基，氧基，硝基，卤烷基，烷基，烷芳基，芳基，芳烷基，烷氧基，硫代烷氧基，芳氧基，氨基，烷氧基羰基，酰氨基，羧基，烷磺酰基，烷基羰基和氰基。
在一些实施方案中，本发明的化合物含有一个或多个不对称中心，因此以外消旋体和外消旋混合物、单一对映异构体、各个非对映异构体和非对映异构体混合物出现。除另有明文规定外，这些化合物的所有这些异构形式都包括在本发明中。在一些实施方案中，本发明的化合物也呈现为多个互变异构形式，在这些情况下，本发明包括本文所述化合物的所有互变异构形式(例如，当环***的烷基化导致多个位点的烷基化时，本发明包括所有这些反应产物)。除另有明文规定外，这些化合物的所有这些异构形式都包括在本发明中。除另有明文规定外，本文所述化合物的所有晶形都包括在本发明中。
本发明的修饰试剂
一方面，本发明提供了能与亲核基团反应的保护试剂，其中反应导致了对所述亲核基团的保护。例如，保护试剂可以与赖氨酸残基的-氨基或多肽(例如，酶)的N末端氨基反应，形成酰胺键和游离羧酸基(图1和2)。在酶的赖氨酸残基中，至少有一个可以通常有助于维持蛋白质构象和/或酶功能。当这样的赖氨酸残基变成受保护时，酶可变成失活的。
由于修饰基团与各赖氨酸胺基之间的酰胺键在低温如室温或低于室温下十分稳定，因此根据本发明的受保护酶在储存、运输、处理和针对涉及该酶的反应进行组分集合的过程中保持失活。然而，在高温下，靠近酰胺键的游离羧酸基起到了强亲核体的作用，其环化而重新形成酸酐保护试剂，同时释放氨基。由于该反应发生在缓冲液中，所生成的保护试剂迅速水解成二羧酸化合物(图1和2)，从而导致了氨基的不可逆脱修饰。
一方面，本发明提供了式I的试剂：
Figure BPA00001311644800151
其中R1，R2，R5和R6是取代或未取代的烃残基；
a和b独立地为0或1；R3和R4独立地为-H或取代基，其中当a和b为0时，R3和R4中至少有一个是取代基，并且其中R3和R4为顺式的；并且Z形成3，4，5，6，7或8元环。
在本发明的一些实施方案中，a和b都是0。或者，a和b中至少有一个是1。在其它实施方案中，R3或R4是取代基。例如，R3或R4是烷基取代基，如甲基或乙基。在具体实施方案中，a和b为0，R3和R4是取代基。Z部分在某些实施方案中形成6元环。在其它情况下，Z形成双环部分，其可以是芳香族的、非芳香族的，或者可以包含芳环和非芳环。
在一些实施方案中，试剂具有下式：
Figure BPA00001311644800152
其中X是O或取代或未取代的亚烷基。例如，X可以是-CH2-，-CH2-CH2-等。
保护试剂可以具有构象更受限的结构，以至该环酐的两个羰基甚至在该酸酐环在与亲核体反应后被打开之后也倾向于靠近。构象限制在一部分上是通过环Z的存在来实现的，当R3和R4中至少有一个是取代基时可以进一步被加强。当酸酐环是6或7元环时，CR1R2或CR5R6或CR1R2和CR5R6两者的存在是进一步确保构象限制所必需的。
另一方面，本发明提供了式II的试剂：
Figure BPA00001311644800161
其中R1，R2，R5和R6是取代或未取代的烃残基；
a和b独立地为0或1，并且a和b中至少有一个是1；
R3和R4独立地为-H或取代基，其中R3和R4任选形成环，此外，其中R3和R4为顺式的。
在一些实施方案中，a是1，b是0，或者a是0，b是1，或者a和b都是1。R3或R4可以是取代基，如烷基，例如甲基或乙基。或者，R3和R4形成6元环。这样的环可以是芳香族或非芳香族的。例如，R3和R4可以形成6元芳环，如被最多4个其它取代基取代的苯环。
在一个实施方案中，试剂具有下式：
Figure BPA00001311644800162
其中R是单价取代基，并且c是0，1，2，3或4。
下表显示了本发明的例示性保护试剂列表：
表1.根据本发明的例示性保护试剂
Figure BPA00001311644800171
制备本发明的试剂的方法
本发明的保护试剂可以按照本文所公开的方法和本领域已知的其它方法容易地合成。例如，一些根据式II的保护试剂可以通过Diels-Alder反应从马来酸酐或适用的马来酸酐衍生物和适用的二烯合成。所生成的Diels-Alder产物可以直接作为保护试剂使用，或者进一步衍生，以制备保护试剂。如本文解释的那样，通常Diels-Alder产物通过将分子中的C＝C双键氢化成饱和C-C单键而进一步衍生，从而防止在较高温度下可能发生的Diels-Alder产物回复成马来酸酐起始原料。图3显示了四个典型保护试剂：1号化合物，2号化合物，3号化合物和4号化合物的Diels-Alder反应合成。应当了解，Diels-Alder反应可以形成内型异构体和外型异构体。因此1-4号化合物每个可以表现为两种异构体的混合物。一般而言，出于本发明的目的，内型异构体和外型异构体都适合作为保护试剂。并且，某些Diels-Alder反应的发生需要高压。这些通常是形成立体受阻加合物的反应。例如，呋喃与柠康酐之间的反应只在高压下进行(图3的合成计划B)。高压Diels-Alder反应先前已有描述(Dauben，W.G.；Krabbenhoft，H.O.J.Am.Chem.Soc.98，1992(1976))。式3或4的修饰试剂也可以用易得的起始原料制备。图4说明了制备式4的保护试剂(5号化合物)的典型方法。合成从市场上可以买到的高邻苯二甲酸酐开始，首先将其转化为二甲酯，然后将亚甲基碳二甲基化。二甲酯中间体水解成游离酸，然后转化为最终的环酐保护试剂。本领域技术人员将容易了解，利用已知的化学，5号化合物的芳环可以容易地被各种取代基修饰。根据这样的芳环上的取代基是供电子还是吸电子的，预期其将影响试剂的羰基的反应性，从而可以精细调节羧酸与酰胺基之间的反应速率，因此可以精细调节受保护酶可以被活化的温度。
制备受保护亲核基团的方法
本发明的保护试剂的应用可以用于酶、其它蛋白质和任何其它亲核基团例如含胺小分子的可逆修饰或保护。例如，它们可以用于有机合成或生物化学操作过程中含胺小分子化合物的临时保护或掩蔽。
在一些实施方案中，要与本发明的保护试剂反应的亲核体是酶中所包含的赖氨酸残基的ε-氨基。所生成的受保护酶可以包含一个或多个与修饰基团共价结合的其氨基。通常，酶的一个以上氨基受到了保护，这是由于在酶的蛋白质序列中存在着多个赖氨酸残基所致。此外，任何酶或多肽的N末端胺基也可以与本发明的保护试剂反应。需要时，可以通过控制酶修饰的程度，例如，受保护氨基的数目，来调节酶失活的程度。一般而言，受保护的氨基越多，酶被失活的程度就越大。当受保护氨基数目达到阈值时，酶便被完全失活。这个阈值可以通过用渐增量的保护试剂来修饰酶和测试受保护酶的活性而凭经验获得。这样的测定在本领域技术人员的能力范围之内。
本发明的多肽修饰通过在在缓冲水溶液中本发明的保护试剂存在下温育要保护的多肽来进行。所需要的试剂的量取决于想要的修饰程度。为了完全或几乎完全失活热稳定酶，试剂/酶的摩尔比通常需要达到阈值，该阈值一般凭经验确定。给定蛋白质和保护试剂的试剂/蛋白质摩尔比可以在给定标记条件下用本领域已知的标准方法凭经验确定。缓冲液通常为pH～7.5至约～10、更优选pH～8至～9的碱性缓冲液。适宜的缓冲液的例子包括但不限于碳酸氢盐缓冲液，硼酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液和Tris缓冲液。缓冲液浓度通常为约50mM或大于约50mM，更优选为100mM或大于100mM。修饰反应可以在约4℃至约40℃的温度进行，更优选在约4℃至约25℃的温度进行。温育时间通常为约15min至过夜。精确的反应时间根据反应温度和试剂/蛋白质摩尔比而异。例如，在较高的反应温度和较高的试剂/蛋白质比下，需要的反应时间较短。另一方面，较低的反应温度和较低的试剂/蛋白质比通常可能需要较长的反应时间。反应完成后，任选地用例如透析的方法将被水解的保护试剂从受保护蛋白质中去除。根据本发明的酶修饰的一个优点是，在修饰反应之后，通常没有必要去除被水解的保护试剂，因为本发明的未去除保护试剂通常不干扰受保护酶的储存和使用。
适宜的聚合酶的例子包括但不限于用于核酸扩增反应的酶，用于连接反应的酶和具有核酸外切和/或内切活性的酶。在某些实施方案中，聚合酶是RNA聚合酶。在其它实施方案中，聚合酶是DNA聚合酶，如DNA聚合酶I、II或III或者DNA聚合酶α、β或γ，末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)或端粒酶。在其它实施方案中，适宜的聚合酶包括但不限于DNA依赖性RNA聚合酶，引发酶，或RNA依赖性DNA聚合酶(逆转录酶)。例如，适宜的聚合酶包括T7 DNA聚合酶，Kornberg DNA聚合酶I，Klenow DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶，微球菌DNA聚合酶，DNA聚合酶α，AMV逆转录酶，M-MuLV逆转录酶，逆转录酶，DNA聚合酶，RNA聚合酶，大肠杆菌(E.coli)RNA聚合酶，SP6 RNA聚合酶，T3 RNA聚合酶，T4 DNA聚合酶，T7 RNA聚合酶，RNA聚合酶II，末端转移酶，多核苷酸磷酸化酶，掺有核糖核苷酸的DNA聚合酶等。这些掺有核苷酸的生物催化剂中的某些，其序列可以从各种来源，包括，例如，GenBank等公开获得。
在一些实施方案中，具有显著3′5′外切核酸酶活性的DNA聚合酶被用来进行本发明。这种酶包括Pfu DNA聚合酶，大肠埃希杆菌DNA聚合酶I，Klenow片段，T-4聚合酶，T-7聚合酶，大肠埃希杆菌DNA pol III，Ultima DNA聚合酶(Cetus)，Vent DNA和Deep Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)。在暴露于升高的温度下的反应混合物中使用主题组合物时，例如，在PCR技术过程中，可以使用热稳定DNA聚合酶。具有显著3′5′外切核酸酶活性的热稳定DNA聚合酶的例子包括Vent DNA聚合酶，Ultima DNA聚合酶，Deep Vent DNA聚合酶，和Pfu DNA聚合酶。例如，用于主题组合物的具有3′-5′外切核酸酶活性的DNA聚合酶是可以购自Stratagene(La Jolla，Calif.)的Pfu DNA聚合酶，其在1991年12月2日提交的美国专利申请No.07/803,627中有描述。其它热稳定酶通常得自有机体，如Thermus antranikianii，水生栖热菌(Thermus aquaticus)，Thermus caldophilus，Thermus chliarophilus，丝状栖热菌(Thermus filiformis)，黄栖热菌(Thermus flavus)，Thermus igniterrae，乳栖热菌(Thermus lacteus)，Thermus oshimai，红栖热菌(Thermus ruber)，红色栖热菌(Thermus rubens)，水管致黑栖热菌(Thermus scotoductus)，Thermus silvanus，栖热菌种Z05，栖热菌种sps 17，嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)，海栖热袍菌(Thermotoga maritima)，那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)，非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)，嗜热厌氧菌(Anaerocellum thermophilum)，热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)等。
除了其它地方外，DNA聚合酶及其性质还在DNA Replication(DNA复制)第二版，Kornberg和Baker，W.H.Freeman，New York，N.Y.(1991)中有详细描述。用于主题组合物和方法的具有较低3′5′外切核酸酶活性的DNA聚合酶可以从天然来源分离，或者通过重组DNA技术产生。3′5′外切核酸酶活性比3′5′外切核酸酶活性、即3′5′单链外切核酸酶活性显著的酶的3′5′外切核酸酶活性低的DNA聚合酶，包括Taq DNA聚合酶和SequenaseTM(修饰的噬菌体T7 DNA聚合酶，可得自U.S.Biochemical，Columbus，Ohio)。此外，本领域一般技术人员将认识到，缺乏外切核酸酶的聚合酶，如Exo-Pfu DNA聚合酶，Vent
Figure BPA00001311644800211
(exo-)DNA聚合酶，Deep Vent
Figure BPA00001311644800212
(exo-)DNA聚合酶等可以适当地用在主题组合物中。Taq DNA聚合酶，SequenaseTM，Exo-Pfu DNA聚合酶，Vent(exo-)DNA聚合酶和Deep Vent(exo-)DNA聚合酶，是基本上缺乏3′5′外切核酸酶活性的DNA聚合酶的全部例子。
关于可用的聚合酶和酶的详情还提供在，例如，1999年8月17日授权的Gelfand等人的题目为“THERMOSTABLE DNA POLYMERASES HAVING REDUCED DISCRIMINATION AGAINST RIBO-NTPS(对核糖核苷三磷酸的辨别力降低的热稳定DNA聚合酶)”的美国专利No.5,939,292，1989年12月26日授权的Gelfand等人的题名为“PURIFIED THERMOSTABLE ENZYME(纯化的热稳定酶)”的美国专利No.4,889,818，1994年12月20日授权的Gelfand等人的题名为“DNA ENCODING A THERMOSTABLE NUCLEIC ACID POLYMERASE ENZYME FROM THERMOTOGA MARITIMA(来自海栖热袍菌的编码热稳定核酸聚合酶的DNA)”的美国专利No.5,374,553，1995年5月30日授权的Gelfand等人的题目为“MUTATED THERMOSTABLE NUCLEIC ACID POLYMERASE ENZYME FROM THERMOTOGA MARITIMA(来自海栖热袍菌的突变的热稳定核酸聚合酶)”的美国专利No.5,420,029，1995年10月3日授权的Abramson等人的题目为“MUTATED THERMOSTABLE NUCLEIC ACID POLYMERASE ENZYME FROM THERMUS SPECIES Z05(来自栖热菌种Z05的突变的热稳定核酸聚合酶)”的美国专利No.5,455,170，1995年11月14日授权的Abramson等人的题目为“5′TO 3′EXONUCLEASE MUTATIONS OF THERMOSTABLE DNA POLYMERASES(热稳定DNA聚合酶的5′→3′外切核酸酶突变)”的美国专利No.5,466,591，1997年4月8日授权的Gelfand等人的题目为“RECOMBINANT EXPRESSION VECTORS AND PURIFICATION METHODS FOR THERMUS THERMOPHILUS DNA POLYMERASE(嗜热栖热菌DNA聚合酶的重组表达载体及纯化方法)”的美国专利No.5,618,711，1997年4月29日授权的Gelfand等人的题目为“PURIFIED THERMOSTABLE NUCLEIC ACID POLYMERASE ENZYME FROM THERMOTOGA MARITIMA(来自海栖热袍菌的纯化热稳定核酸聚合酶)”的美国专利No.5,624,833，1997年10月7日授权的Abramson等人的题目为“DNA ENCODING THERMOSTABLE NUCLEIC ACID POLYMERASE ENZYME FROM THERMUS SPECIES Z05(来自栖热菌种Z05的编码热稳定核酸聚合酶的DNA)”的美国专利No.5,674,738，1998年8月4日授权的Gelfand等人的题目为“RECOMBINANT EXPRESSION VECTORS AND PURIFICATION METHODS FOR THERMUS THERMOPHILUS DNA POLYMERASE(嗜热栖热菌DNA聚合酶的重组表达载体及纯化方法)”的美国专利No.5,789,224，1998年8月18日授权的Abramson等人的题目为“5′TO3′EXONUCLEASE MUTATIONS OF THERMOSTABLE DNA POLYMERASES(热稳定DNA聚合酶的5′→3′外切核酸酶突变)”的美国专利No.5,795,762，由Smith等人于2002年1月31日公布的题目为“HIGH TEMPERATURE REVERSE TRANSCRIPTION USING MUTANT DNA POLYMERASES(利用突变型DNA聚合酶进行高温逆转录)”的美国专利申请公布No.US 2002/0012970，以及2003年3月26日提交的美国专利申请No.10/401,403中，其各自引入作为参考。
在本发明的实施方面(例如，产生受保护酶，执行反应等)，任选利用分子生物学和重组DNA的许多常规技术。这些技术是公知的，并且在例如下列文献中说明：Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验技术)，I、II和III卷，1997(F.M.Ausubel编著)；Sambrook等，2001，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.；Berger和Kimmel，Guide to Molecular Cloning Techniques.Methods in Enzymology(分子克隆技术指导.酶学方法)，152卷，Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.(Berger)；DNA Cloning：A Practical Approach(DNA克隆：实用方法)，I和II卷，1985(D.N.Glover编著)；Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)，1984(M.L.Gait编著)；Nucleic Acid Hybridization(核酸杂交)，1985(Hames和Higgins)；Transcription and Translation(转录与翻译)，1984(Hames和Higgins编著)；Animal Cell Culture(动物细胞培养)，1986(R.I.Freshney编著)；Immobilized Cells and Enzymes(固定化细胞和酶)，1986(IRL Press)；Perbal，1984，A Practical Guide to Molecular Cloning(分子克隆实践指导)；丛书，Methods in Enzymology(酶学方法)(Academic Press，Inc.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(哺乳动物细胞的基因转移载体)，1987(J.H.Miller和M.P.Calos编著，Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods in Enzymology(酶学方法)154卷和155卷(分别由Wu和Grossman，以及Wu编著)。
在受保护聚合酶是Taq聚合酶的实施方案中，本发明的受保护Taq聚合酶比作为AmpliTaq Gold(美国专利No.5,677,152)上市的用柠康酐保护的Taq聚合酶有利。一个主要优点是，本发明的受保护Taq的活化比柠康酐保护的Taq明显更快(图9)。另一主要优点是，根据本发明的受保护Taq在储存和处理期间失去其脱保护的能力的可能性较小。这是由于本发明的保护试剂显得在标记反应中通常比柠康酐(马来酸酐衍生物)或其它类似的马来酸酐保护试剂例如美国专利No.5,677,152中公开的马来酸酐保护试剂特异性更强的事实。马来酸酐或其任何衍生物因此被称为马来酸酐试剂，其通常包含两个反应位点：酸酐位点和C＝C双键位点，这两者都能与胺反应。此外，C＝C位点还可以与硫醇反应。酸酐位点可以与胺反应，形成热可逆的酰胺键，而C＝C位点可以与胺或硫醇通过迈克尔(Michael)加成进行反应，形成不可逆的C-N或C-S键。尽管预期酸酐位点与胺之间的反应比C＝C位点与胺或硫醇之间的反应快得多，但是发生酶的少数可用氨基与C＝C位点反应的副反应的可能性还是存在的。任何不可逆C-N和/或C-S键的形成都可以导致酶活性的不可逆损害，尤其是当被不可逆保护的胺和/或硫醇在功能上重要时。更重要的是，和酸酐位点与胺反应或水解成非反应性二羧酸不同，C＝C双键在标记和储存条件下不水解，这暗示了马来酸酐或马来酸酐衍生物保护的Taq可以在所连保护基团的C＝C位点上进一步发生副反应。可能的副反应可包括所连修饰基团与来自同一酶分子或来自另一酶分子的另一胺或硫醇的交联，以及与Tris缓冲液的反应。在第一种副反应中，不仅如上文所述C-N或C-S键是不可逆的，而且交联键另一端的酰胺键也变得不可逆或者非常难以裂解。这部分归咎于酰胺键的裂解依赖于保护基团的构象限制，而胺或硫醇向C＝C键的加成减小了修饰基团的那种限制。在第二种可能的副反应中，用于Taq储存和用于DNA扩增的常用缓冲剂Tris的氨基可以加成到C＝C位点，从而使刚性的C＝C双键转化为柔性的C-C单键，因而使修饰基团不可逆地连接在胺上，或者至少难以去除得多。图10概略地说明了用柠康酐进行的蛋白质修饰及相关副反应。本发明的保护试剂通常没有见于马来酸酐或其它马来酸酐衍生物保护试剂的易于发生非特异性胺修饰和副反应的第二反应性位点。对本领域技术人员而言显而易见的是，对于受保护Taq的上述优点也可以容易地延伸至其它用本发明的保护试剂保护的酶上。
另一方面，本发明使得有可能用不同修饰基团修饰不同热稳定酶、以便单个受保护酶具有不同活化温度。相应地提供了组合物，其包含第一群受保护聚合酶，其中所述第一群相对于相应的第一群未受保护聚合酶而言是基本上无活性的；第二群受保护聚合酶，其中所述第二群相对于相应的第二群未受保护聚合酶而言是基本上无活性的；其中所述第一群受保护聚合酶内的单个聚合酶在第一组合适的脱保护条件下可以转化为相应的未受保护聚合酶，但是在该条件下，所述第二群受保护聚合酶内的单个聚合酶不能转化为相应的未受保护聚合酶；此外，其中所述第二群受保护聚合酶内的单个聚合酶在第二组合适的脱保护条件下可以转化为相应的未受保护聚合酶。如实施例5中所述，9号化合物保护的热稳定酶可以在低至60℃的温度下活化。通过首先在第一组脱保护条件下于约60℃温育以释放第一酶，然后在第二组脱保护条件下于约95℃温育以释放第二酶，9号化合物保护的热稳定酶和用柠康酐(或任何其它保护试剂，包括在美国专利No.5677152和US6183998中所公开的那些)保护的另一热稳定酶可以在相同反应混合物中独立地活化。这样的反应混合物可以是如本文所述的逆转录PCR反应。例如，9号化合物或本发明的另一相似保护试剂保护的逆转录酶(RTase)可以与柠康酐保护的Taq DNA聚合酶组合，在单一管中进行逆转录和随后的DNA扩增。受保护RTase首先在约40至约60℃活化进行逆转录阶段，同时受保护Taq仍然保持无活性。一旦逆转录完成，受保护Taq便在约80至约100℃活化，然后进行PCR。由于两种酶都需要热活化，因此可以显著减少由反应建立过程中的错误引物引发导致的非特异性产物的形成。
使用方法
本发明的一个实施方案涉及被化学保护的酶，例如，在核酸扩增***中使用的热稳定酶。扩增可以通过DNA聚合酶，如Taq聚合酶，Pfu聚合酶，T7 DNA聚合酶，大肠埃希杆菌DNA聚合酶的Klenow片段，和/或RNA聚合酶如逆转录酶，或任何本文所提及的聚合酶进行。
一个可能的扩增方法是聚合酶链反应(PCR)。PCR的一般程序在美国专利No.4,683,195(Mullis)和美国专利No.4,683,202(Mullis等)中教示。简单地说，核酸的PCR扩增包括DNA热变性、两条引物跟要扩增的靶核酸区段的两侧序列退火、以及用聚合酶延伸已退火的引物的重复循环。引物与靶核酸的相对链杂交并定向，以使聚合酶引发的合成在两个引物之间的区段上进行，从而有效地使靶区段的量翻倍。而且，由于延伸产物也与引物互补，并能与引物结合，因此每一次连续循环都使前一次循环中合成的靶核酸量基本翻倍。这导致特异性靶核酸以约2n的速率呈指数形式的累积，其中n是循环次数。
典型的常规PCR热循环方案包括30次循环：(a)在90℃-95℃的范围内变性0.5-1min，(b)在55℃-65℃的温度范围内退火1-2min，和(c)在68℃-75℃延伸至少1min，最后一次循环延长至10min。
任何使用热稳定酶的扩增***都可以与本发明的受保护聚合酶一起使用。仅仅作为举例，本发明可以应用于以下任何***，包含但不限于常规PCR、等温扩增、连接酶链反应，聚合酶连接酶链反应和修复链反应(repair chain reaction)中包括的热稳定酶。受保护酶的脱保护或者作为扩增反应的预处理、或者作为扩增反应的整体部分进行。根据一个实施方案，受保护酶是受保护Taq DNA聚合酶。优选地，Taq中有足够量的氨基受到保护，以使受保护酶在低温如室温下完全或几乎完全无活性，并且可以在引物杂交温度下或高于引物杂交温度的温度下脱保护。例如，Taq可以被1号化合物保护，或在另一实施方案中，Taq被9号化合物保护。
通过防止由PCR反应建立过程中的错误引物引发导致的非特异性DNA扩增或使其减至最少，根据本发明的受保护Taq可用于PCR。受保护Taq通常在高于PCR退火温度的温度下例如约60℃至约70℃、或约70℃至约80℃、或80℃至约90℃、或约90℃至约100℃下活化达足以在PCR循环之前达到所需的酶活化程度的时间。受保护Taq能在pH为约6至约11、或约7至约10、或约8至约9的缓冲液中脱保护。在一些实施方案中，受保护酶与可显示相似pH范围的PCR缓冲液相容。
变形的和其它的扩增方法也被视为适合执行本发明。可以进行的常规PCR的变体是使用嵌套引物的“嵌套式PCR”。当样品中的靶核酸量极其有限，例如，使用存档的法医样品时，此方法是优选的。进行嵌套式PCR时，核酸首先用能与靶核酸的较大区段的两侧序列杂交的外引物组进行扩增。该扩增反应后，用与所述较大区段内的靶序列杂交的内引物组进行第二轮扩增循环。
核酸“定量”扩增的方法是本领域技术人员公知的。例如，定量PCR(qPCR)可以包括用相同引物同时共扩增已知量的对照序列。这提供了可以用来校准PCR反应的内标。
主题受保护聚合酶可以用在逆转录PCR反应(RT-PCR)中。RT-PCR是常规PCR的另一变形，在其中，逆转录酶首先将RNA分子转化为双链cDNA分子，然后用其作为随后的聚合酶链反应扩增的模板。反应在适宜温度(例如，30-45℃)下维持足够量的时间(例如，5-60min)，以在预定的扩增循环发生之前产生cDNA模板。这样的反应尤其可用于检测其遗传信息储存在RNA分子内的生物学实体。这类生物学实体的非限制性例子包括RNA病毒，如HIV和导致肝炎的病毒。本发明所体现的RT-PCR的另一重要应用是根据在供试样品中检出的mRNA水平同时定量生物学实体。本领域技术人员将了解，当想要定量结果时，必须注意使用维持或控制被扩增核酸的相对拷贝数的方法。
扩增反应混合物中扩增产物的检测可以用任何已知方法进行，其包括但不限于在扩增反应之后的DNA凝胶电泳分析，采用DNA结合染料或荧光寡核苷酸探针的实时产物检测，以及DNA熔解曲线分析，包括高分辨率DNA熔解曲线分析。根据本发明的一个实施方案，反应混合物包含额外的DNA结合染料，以实时检测产物。适宜的DNA结合染料的例子包括但不限于EvaGreen
Figure BPA00001311644800281
染料和SYBR Green
Figure BPA00001311644800282
I染料。实时产物检测的另一方法是通过在反应混合物中包含荧光标记的寡核苷酸探针。在DNA扩增过程中，探针通过聚合酶的5′-外切核酸酶活性裂解，释放出与产物形成量成比例的荧光信号。荧光寡核苷酸探针在扩增产物实时检测中的应用先前在很多专利和学术出版物中已有描述。所有这些探针都适用于本发明。仅仅作为举例，适宜的探针包括TaqMan探针，AllGlo探针，分子信标和MGB探针。DNA熔解曲线分析是产物检测的另一可用方法。在此方法中，DNA结合染料在扩增反应之前加入到反应混合物中，或者在反应后加入到扩增产物中，并且监测产物溶液随温度的荧光变化。与凝胶电泳法一样，熔解曲线分析可用于测定产物的量和特异性，但具有更大的便利性和更好的灵敏度。常规熔解曲线分析的变体是所谓的高分辨率熔解曲线分析，其可以检测单突变。其它核酸检测方法有，例如，核酸结合剂，如6,814,934中所公开的那些，用于分析法中的探针，如美国专利No.5,210,015、5,487,972和6,214,979中所描述的那些。在一些实施方案中，核酸检测试剂是与双链核酸相互作用的分子。在某些实施方案中，荧光指示剂可以是“嵌入荧光染料”，它们是在嵌入双链核酸时表现出增强的荧光的分子。在某些实施方案中，“小沟结合荧光染料”可以与双链DNA的小沟结合。在某些实施方案中，荧光染料和其它荧光分子可以用特定波长的光来激发荧光，然后发出另一波长的荧光。根据某些实施方案，染料可以包括但不限于吖啶橙；溴化乙锭；噻唑橙；pico green；色霉素A3；SYBRGreen I(见美国专利No.5,436,134)；4-[(3-甲基-2(3H)-苯并噁唑亚基)甲基]-1-[3-(三甲基铵基)丙基]喹啉鎓二碘化物(YOPRO
Figure BPA00001311644800284
)；和4-[(3-甲基-2(3H)-苯并噻唑亚基)甲基]-1-[3-(三甲基铵基)丙基]喹啉鎓二碘化物(TOPRO
Figure BPA00001311644800291
)。SYBR
Figure BPA00001311644800292
Green I，YOPRO和TOPRO
Figure BPA00001311644800294
可购自Molecular Probes，Inc.，Eugene，Ore。以上提及的所有产物检测方法及其变体都适合用于本发明的核酸扩增方法。
在这个以及其它实施方案中，本发明的聚合酶被用来通过并入磷酸核苷而延伸核酸链。这样的延伸可以发生在，例如，核酸扩增反应混合物中。适合于此目的的磷酸核苷包括连接了一个或多个磷酸基的核苷。这样的磷酸核苷包括但不限于核苷单磷酸，核苷二磷酸，核苷三磷酸，核苷五磷酸等。例如，适宜的磷酸核苷在美国专利No.7,052,839，7,041,812，4,994,373，5,175,269和5,241,060中公开。磷酸核苷可以是天然存在的，或者可以包括另外的修饰，如标记物(例如，荧光，化学发光，色度，荧光，质量标签(mass tag)等)或其它2’或3’修饰。
试剂盒
本发明还提供了包括根据本发明的受保护聚合酶和核酸检测试剂的试剂盒。核酸检测试剂可以是荧光试剂，例如，EvaGreen或SYBR Green I。试剂盒可以另外包括一种或多种选自引物、模板、磷酸核苷和缓冲液的试剂。试剂盒可以另外包括用户指导手册。这样的用户手册可以指导用户执行反应，如核酸扩增反应。
仪器和其它使用方法
本文还提供了用于包含多重热循环的核酸扩增反应的仪器，所述仪器包含：自动化热循环仪，其能够交替加热和冷却，并且适合容纳至少一个含有扩增反应混合物的反应容器，所述扩增反应混合物包含模板核酸、核苷酸、核酸检测试剂和本发明的受保护聚合酶群；其中循环仪可以被编程，通过控制受保护聚合酶的脱保护来控制扩增反应的起始。在一些实施方案中，该仪器另外包含能显示受保护聚合酶的脱保护程度和/或显示其中一个或多个脱保护聚合酶群可以变得失活的条件组的显示器。这样的显示器可以帮助仪器用户执行本文所公开的反应。
该仪器可以进一步包含可以用来在扩增反应进行时检测荧光信号的检测器，该荧光信号与反应容器中被扩增核酸的存在和/或量有关。检测器可以用来例如检测在以下波长范围中的至少一个波长范围内的荧光信号：约510至约530nm，约540至约550nm，560至约580nm，约585至约595nm，590至约610nm，660至约680nm，约690至约710nm，或770至约790nm。该仪器也可以适合容纳多个各自含有扩增反应混合物的反应容器。
其它本领域已知的仪器也适合于施行本发明的方法。这样的仪器在，例如，美国专利No.6,814,934，5,475,610，5,928,907，5,972,716和6,015,674中有描述，其全部因此引入作为参考。
在一些实施方案中，本发明的受保护酶被用来进行单分子反应。这样的反应包括但不限于单分子序列测定和滚环反应。进行这些反应的方法记载于在美国专利No.7,315,019；美国专利申请No.2003/0044781；M.J.Levene，J.Korlach，S.W.Turner，M.Foquet，H.G.Craighead，W.W.Webb，SCIENCE 299：682-686，2003年1月“Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at High Concentration(高浓度下单分子分析的零模波导)”中。其它方法在例如，美国专利No.7,056,676，7,056,661，7,052,847和7,033,764中公开。
本发明的聚合酶也可以用来在固体支持体、如阵列(arrays)上进行核酸扩增反应。这些技术在，例如，美国专利No.5,922,591，6,582,938，6,485,944，6,511,803，6,387,621和6,248,521中描述。
实施例
实施例1.聚合酶活性分析的测量
聚合酶活性分析根据已发表程序(Nucleic Acids Research，2004，Vol.32，No.3 1197-1207)进行少许修改来执行。具体地说，将要分析的DNA聚合酶在指定温度下加入到预先温育的1X AmpliTaq DNA聚合酶缓冲液II(Applied Biosystems，Inc)中，所述缓冲液含有2.5mM MgCl2、0.25mM各dNTP和100nM引物(序列测定：5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCC-3′)退火的ssM13mp18 DNA。在继续温育时，分别于0，1，2，3，5，7，10，15，20，25，30，35，40，50和60min的时间点取等份试样(5L)，加入到195L含有0.1M EDTA和1X EvaGreen(Biotium，Inc.，Hayward，CA)的溶液中。用荧光读板仪(BioRad)在室温定量所合成DNA的量。DNA聚合酶的单位活性通过将其初始速率与Applied Biosystems公司的AmpliTaq的初始速率进行比较来确定。
实施例2.Taq DNA聚合酶的修饰
在无水DMF中制备浓度为100mg/mL的9号化合物的储备溶液。将半毫升(0.5mL)该保护试剂溶液加入到4.5mL含1.1mg/mL Taq的0.1M pH 9.0Tris缓冲液中。所得溶液在4℃温育过夜。
实施例3.用9号化合物保护的Taq进行的PCR
为了评价本发明的受保护DNA聚合酶在减少PCR的非特异性DNA扩增方面的有效性，将9号化合物保护的Taq在扩增人DNA片段中与未受保护Taq进行比较。PCR实验在20L量的含有1X AmpliTaq缓冲液、0.25mM dNTP、2.5mM MgCl2、500ng各正向和反向引物(正向引物：TGGGAACTGCAACTCATCTGG；反向引物：GCGCTCCTCTCTCCAGCAG)、20或0.0ng人DNA(Applied Biosystems)、2单位9号化合物保护的Taq或未受保护Taq的反应溶液中进行。没有靶DNA的PCR作无模板对照(NTC)用。PCR方案包括95℃加热2min，然后40个于95℃温育5秒和于60℃温育60秒的循环。每个反应结束时，在4％琼脂凝糖胶上分析PCR产物(图5)。如广泛扩散的小分子量污斑所示，用普通Taq进行的靶DNA(泳道4)和NTC(泳道5)的PCR都产生了非特异性产物，而用本发明的受保护Taq进行的PCR则形成了人DNA(泳道1)的特异性扩增产物所对应的单一条带，NTC(泳道2)无明显产物。泳道3是作为参照的1kb DNA梯(Invitrogen)。
实施例4.在94℃和各种pH下进行的9号化合物保护的Taq的脱保护
为了考察pH对酶活化的影响，实施例2的受保护Taq DNA聚合酶首先在pH分别为8.0、8.5和9.0的0.1M Tris中复原成50nM的浓度，然后在94℃活化2min。活化后，按照实施例1中所述程序执行酶活性检测。同时检测未活化酶(“活化前”)，作为对照。数据概括于下表：
结果证明，受保护酶可以在pH 8-9的范围内很好地活化，pH 8-9是通用DNA聚合酶活性的典型最佳pH范围。例如，Taq和Pfu的最佳pH分别为8.3和9.0。这意味着酶活化和扩增可以在同样的缓冲液中方便地进行。
实施例5.受保护Taq在60℃的脱保护
为了检查酶活化是否可以在较低温度下进行，将化合物编号保护的Taq DNA聚合酶在pH 8.3的Tris中于60℃温育，在此温度下，许多得自中温生物的酶可以存活。用实施例1的方法测得的不同温育时间后的相对酶活性概括在下表中：
Figure BPA00001311644800331
结果表明，受保护Taq可以在60℃达到显著活化。
实施例6.分别被1号化合物、9号化合物和柠康酐保护的Taq DNA聚合酶的活化动力学比较
三种标题受保护酶(50nM)各自在pH 8.0的Tris中于94℃分别温育0，1，2，5，10和20min。温育后按照实施例1在60℃检测酶活性。柠康酐修饰的Taq花费了10min以上的时间来完全恢复，而1号化合物或9号化合物保护的Taq仅用了不到2min来活化(图9)。
实施例7.受保护Taq DNA聚合酶在基于嵌入染料的实时PCR中的应用以及受保护酶对Ct值的影响
为了测试受保护Taq DNA聚合酶在实时PCR中的应用和受保护酶对Ct值的影响，分别被1号化合物和9号化合物保护的Taq DNA聚合酶以及未受保护Taq各自分别以2.5，5，10和25nM的浓度应用于质粒***片段(序列：CATCCATGACAACTTTGGTATCGTGGAAGGACTCATGACCACAGTCCATGCCATCACTGCCACCCAGAAGACTG)的扩增中。所有扩增都以20L量的反应在含有1X EvaGreen染料(Biotium，Hayward，CA)、250M各dNTP、2.5mM MgCl2、500nM各正向(CATCCATGACAACTTTGGTATCGT)和反向(CAGTCTTCTGGGTGGCAGTGA)引物、105个质粒拷贝以及指定浓度的一种酶的1X AmpliTaq缓冲液(ABI，Foster City，CA)中进行。热解链情况(thermo-profile)为95℃活化2min，之后40个95℃，15s和60℃，60s的循环。在BioRad的iCycler iQ上监测反应。反应的Ct值列于图7的表中。由于酶浓度变化时，用所有三种酶进行的扩增的Ct值所受到的影响几乎相同，因此可以推断，两种活化酶和未受保护酶具有相似的活性。
实施例8.受保护Taq DNA聚合酶的5′-外切核酸酶活性
为了评估受保护酶的5′-外切核酸酶活性是否受到修饰的影响，对分别被1号化合物和9号化合物保护的Taq DNA聚合酶以及未受保护Taq(对照)各自在采用5′-外切核酸酶可裂解的寡核苷酸探针的实时PCR中的应用进行测试。所有PCR实验都在20L含有25nM任一种酶、250M各dNTP、2.5mM MgCl2、500nM正向引物(CCCAAGATAGTTAAGTGGGATCGA)、反向引物(AATCCAAATGCGGCATCTTC)和合适摩尔浓度的MAR-标记的AllGlo探针(序列：MAR-ATGTAAGCAGCATCATGGAGGTT-MAR；AlleLogic Biosciences Co.，Hayward，CA)、107个含有***片段序列(CCCAAGATAGTTAAGTGGGATCGAGACATGTAAGCAGCATCATGGAGGTTTGAAGATGCCGCATTTGGATT)的质粒拷贝的1X AmpliTaq缓冲液中进行。热解链情况为92℃2min，然后是40个95℃(15s)和50℃(1min)之间的循环。在BioRad的iCycler iQ上监测反应。用所有三种酶进行扩增的扩增曲线几乎可重叠(图8，仅显示了用9号化合物保护的Taq进行的反应曲线)。结果表明，本发明的受保护Taq DNA聚合酶既保留了聚合酶活性，也保留了5′-外切核酸酶活性。
实施例9.1号化合物的制备
1，3-环己二烯(840mg，10.5mmol)和柠康酐(1.18g，10.5mmol)的混合物在压力管中于50℃加热24h。冷却至室温后，加入Et2O(50mL)，所生成的悬液在室温下搅拌过夜。将悬液抽滤，滤液在真空中浓缩，得到的无色油状物经硅胶柱层析纯化，得到化合物2(310mg)的无色固体。
实施例10.2号化合物的制备
1号化合物(200mg)在无水THF中用5％Pd/C作催化剂氢化。反应混合物抽滤，并旋转蒸发，得到为白色固体的2号化合物。
实施例11.5号化合物的制备
高邻苯二甲酸酐(15g)在10mL浓硫酸存在下于150mL甲醇中回流24h。溶液冷却至室温，然后通过旋转蒸发浓缩至～60mL。溶液在200mL***与100mL冰冷的水之间分配。分离***层，连续用150mL水、150mL 10％NaHCO3、100mL水和150mL饱和NaCl洗涤。***溶液用无水硫酸钠干燥，然后旋转蒸发，得到高邻苯二甲酸二甲酯。将二甲酯(10g)溶解在100mL无水THF中，所得溶液在氮气下冷却至-15℃。导入2当量的双(三甲基甲硅烷基)氨基锂，然后逐滴加入2.1当量的甲基碘。所得溶液在0℃搅拌1h，然后室温搅拌过夜。反应混合物用水淬灭，然后用***萃取。***萃取物蒸发，然后纯化，得到的纯产物用NaOH/MeOH/H2O水解成游离酸，接着在酸性水中通过沉淀分离。分离出来的游离酸中间体通过在乙酸酐中回流，转化为最终产物5号化合物。5号化合物通过硅胶柱用EtOAc/己烷洗脱进行纯化。
实施例12.9号和10号化合物的制备
呋喃(6g，88.8mmol)和2，5-二氢噻吩-3，4-二羧酸酐(11.5g，74mmol)(Baker，B.R.；Querry，M.V.；Kadish，A.F.J.Org.Chem.13，128(1948))在50mL CH2Cl2中的溶液在14kbar的压力下室温放置过夜。主要产物通过硅胶柱用EtOAc/己烷洗脱分离。然后产物在THF中用10％Pd/Pd作催化剂进行氢化，得到10号化合物(80％)。化合物10用H2/雷尼镍(Raney nickel)脱硫成最终产物9号化合物，为白色固体。
实施例13.使用9号化合物的胺修饰和脱修饰
为了证明本发明的保护试剂可以用于可逆地修饰任何含胺化合物，将9号化合物(1mg)加入到含有Et3N(5μL)的5-TAMRA-PEO3-三氟乙酸铵(1mg)(Biotium Inc，目录号：90107)在DMF的溶液(100μL)中。混合物室温搅拌1h。TLC(洗脱剂：CHCl3∶MeOH∶AcOH＝7∶3∶0.5)显示氨基-TAMRA消失，并形成了加成产物对应的Rf较高的斑点。加入Tris缓冲液(500μL，10mM Tris HCl，pH＝8.2)，混合物在95℃加热10min。TLC(洗脱剂：CHCl3∶MeOH∶AcOH＝7∶3∶0.5)显示了氨基-TAMRA化合物的重新生成，因此证实9号化合物可以用来可逆地修饰胺类化合物。
尽管本文显示和描述了本发明的优选实施方案，但对本领域技术人员显而易见的是，提供这些实施方案只是为了举例说明。本领域技术人员可以在不背离本发明的条件下进行多种变形，改造和替代。应该了解的是，本文所述本发明的实施方案的各种替代方案都可以用于实施本发明。我们希望，所附权利要求定义本发明的范围，并且在这些权利要求的范围内的方法和结构及其等同体都被其覆盖。

Claims (65)

1.可逆地保护亲核基团的方法，其包括：
a.提供亲核基团；
b.使亲核基团与下式的试剂反应：
Figure FPA00001311644700011
其中R1，R2，R5和R6是取代或未取代的烃残基；
a和b独立地为0或1；
R3和R4独立地为-H或取代基，其中当a和b为0时，R3和R4中的至少一个是取代基，以及其中R3和R4是顺式的；
Z形成3，4，5，6，7或8元环。
2.权利要求1的方法，其中a和b为0。
3.权利要求2的方法，其中R3或R4是取代基。
4.权利要求2的方法，其中R3或R4是烷基。
5.权利要求2的方法，其中R3或R4是甲基。
6.权利要求1的方法，其中Z形成6元环。
7.权利要求1的方法，其中Z形成双环部分。
8.权利要求1的方法，其中试剂具有下式：
Figure FPA00001311644700021
其中X是O或取代或未取代的亚烷基。
9.权利要求1的方法，其中亲核基团是多肽的赖氨酸残基的ε-氨基。
10.权利要求9的方法，其中多肽是聚合酶。
11.可逆地保护亲核基团的方法，其包括：
a.提供亲核基团；
b.使亲核基团与下式的试剂反应：
Figure FPA00001311644700022
其中R1，R2，R5和R6是取代或未取代的烃残基；
a和b独立地为0或1，并且a和b中至少有一个为1；
R3和R4独立地为-H或取代基，其中R3和R4任选形成环，此外，其中R3和R4是顺式的。
12.权利要求11的方法，其中a是1和b是0。
13.权利要求11的方法，其中a是0和b是1。
14.权利要求11的方法，其中R3或R4是取代基。
15.权利要求11的方法，其中R3或R4是烷基。
16.权利要求11的方法，其中R3或R4是甲基。
17.权利要求11的方法，其中R3和R4形成6元环。
18.权利要求11的方法，其中R3和R4形成芳环。
19.权利要求11的方法，其中R3和R4形成被多达4个其它取代基取代的苯环。
20.权利要求19的方法，其中试剂具有下式：
Figure FPA00001311644700031
其中R是单价取代基，和c是0，1，2，3或4。
21.在多肽中制备受保护赖氨酸残基的方法，其包括使六元或七元环酐与赖氨酸残基的ε-氨基反应，其中所述反应产生包含酰胺和羧酸的受保护赖氨酸残基；和此外，其中羧酸是相对于酰胺构象受限的，以至于所述羧酸表现出与包含未受限羧酸的相应受保护赖氨酸残基相比更强的与酰胺反应的倾向。
22.权利要求21的方法，其中所述多肽的受保护赖氨酸残基与包含未受限羧酸的相应受保护赖氨酸残基相比更容易发生脱保护。
23.权利要求21的方法，其中所述羧酸由于5、6或7元环的存在而相对于酰胺是构象受限的。
24.权利要求21的方法，其中所述羧酸由于烷基取代而相对于酰胺是构象受限的。
25.权利要求24的方法，其中烷基取代的位置邻近酰胺。
26.权利要求24的方法，其中烷基取代的位置邻近羧酸。
27.制备多肽中受保护赖氨酸残基的方法，其包括使五元环酐与赖氨酸残基的ε-氨基反应，其中反应产生包含酰胺和羧酸的受保护赖氨酸残基；并且此外，其中羧酸由于取代的3、4、5、6或7元环而相对于酰胺是构象受限的，以至于所述羧酸表现出与包含未受限羧酸的相应受保护赖氨酸残基相比更强的与酰胺反应的倾向。
28.权利要求27的方法，其中所述3、4、5、6或7元环被烷基取代。
29.权利要求28的方法，其中烷基取代的位置邻近酰胺部分。
30.权利要求28的方法，其中烷基取代的位置邻近羧酸。
31.扩增模板核酸的方法，其包括：
a.提供包含聚合酶群的扩增反应混合物，该聚合酶群被可逆地保护，以便使所述聚合酶群在被置于合适的脱保护条件下小于约10min时，能以至少80％的收率转化为相应的未受保护聚合酶群；
b.使受保护聚合酶群中的单个聚合酶脱保护，成为相应的未受保护聚合酶；
c.将所述混合物置于合适的扩增条件下，以便扩增模板。
32.权利要求31的方法，其中转化步骤包括在所述合适的脱保护条件下将受保护聚合酶群温育小于10min，以便使受保护聚合酶群的80％以上被转化为未受保护聚合酶。
33.扩增模板核酸的方法，其包括：
a.提供包含聚合酶的扩增反应混合物，该聚合酶被可逆地保护，以便使其在被置于合适的脱保护条件下小于约10min时，能以至少80％的确定性转化为相应的未受保护聚合酶；
b.使受保护聚合酶脱保护，成为所述未受保护聚合酶；和
c.将所述扩增反应混合物置于使得模板扩增的条件下。
34.权利要求31或33的方法，其中所述脱保护发生在约6至11的pH下。
35.权利要求31或33的方法，其中所述脱保护发生在高于约85℃的温度下。
36.权利要求31或33的方法，其中所述脱保护发生在约90℃至100℃的温度下。
37.权利要求31或33的方法，其中未受保护聚合酶是Taq聚合酶。
38.权利要求31或33的方法，其中聚合酶通过与下式的试剂反应而被保护：
其中R1，R2，R5和R6是取代或未取代的烃残基；
a和b独立地为0或1；
R3和R4独立地为-H或取代基，其中当a和b为0时，R3和R4中至少有一个是取代基，以及其中R3和R4是顺式的；
Z形成3，4，5，6，7或8元环。
39.利要求31或33的方法，其中聚合酶通过与下式的试剂反应而被保护：
Figure FPA00001311644700062
其中R1，R2，R5和R6是取代或未取代的烃残基；
a和b独立地为0或1，并且a和b中至少有一个是1；
R3和R4独立地为-H或取代基，其中R3和R4任选形成环，并且此外，其中R3和R4是顺式的。
40.权利要求31或33的方法，其中反应混合物包含选自引物、核苷酸、模板和核酸检测试剂的一种或多种扩增试剂。
41.权利要求31或33的方法，其中扩增反应在基底上进行。
42.包含受保护聚合酶群的组合物，其中a)与相应的未受保护聚合酶群相比，受保护聚合酶群基本上无活性；b)所述受保护聚合酶群内的单个聚合酶在被置于合适的脱保护条件下小于10min时，能以至少80％的收率转化为相应的未受保护聚合酶，所述收率通过聚合酶活性的增加而测量。
43.权利要求42的组合物，其中聚合酶活性作为执行核酸引物的模板依赖性延伸的能力进行测量。
44.权利要求42的组合物，其中聚合酶活性在核酸扩增反应中进行评价。
45.权利要求42的组合物，其中所述脱保护发生在约6至11的pH下。
46.权利要求42的组合物，其中所述脱保护发生在高于约85℃的温度下。
47.权利要求42的组合物，其中所述脱保护发生在约90℃至100℃的温度下。
48.扩增反应混合物，其包含根据权利要求42的受保护聚合酶群和选自核苷酸、模板核酸和引物的一种或多种扩增试剂。
49.权利要求48的扩增反应混合物，其中所述扩增反应混合物另外包含核酸检测试剂，所述核酸检测试剂提供指示被扩增模板核酸的存在的能检测信号。
50.组合物，其包含：
a.第一受保护聚合酶群，其中该第一群相对于相应的第一未受保护聚合酶群基本上无活性；
b.第二受保护聚合酶群，其中该第二群相对于相应的第二未受保护聚合酶群基本上无活性；
其中所述第一受保护聚合酶群内的单个聚合酶在第一组合适的脱保护条件下能转化为相应的未受保护聚合酶，但是在该条件下，所述第二受保护聚合酶群的单个聚合酶不能转化为相应的未受保护聚合酶；
并且此外，其中所述第二受保护聚合酶群内的单个聚合酶在第二组合适的脱保护条件下能转化为相应的未受保护聚合酶。
51.权利要求50的组合物，其中第一受保护聚合酶群包含RNA聚合酶。
52.权利要求50的组合物，其中第二受保护聚合酶群包含热稳定DNA聚合酶。
53.权利要求50的组合物，其中第一和第二聚合酶群一起进行逆转录偶联的PCR反应。
54.权利要求50的组合物，其中在第一组脱保护条件下的脱保护发生在约40℃至约60℃的温度下。
55.权利要求50的组合物，其中在第二组合适脱保护条件下的脱保护发生在约80℃至约100℃的温度下。
56.试剂盒，其包含：
a.根据权利要求42的受保护聚合酶群；
b.核酸检测试剂。
57.权利要求56的试剂盒，其中核酸检测试剂是荧光试剂。
58.权利要求56的试剂盒，其中所述试剂盒另外包含选自引物、模板、核苷酸和缓冲剂的一种或多种试剂。
59.权利要求56的试剂盒，其中所述试剂盒另外包含用户指导手册。
60.用于包括多重热循环的核酸扩增反应的仪器，包括：自动化热循环仪，其能够交替加热和冷却，并且适合容纳至少一个含有扩增反应混合物的反应容器，所述扩增反应混合物包含模板核酸、核苷酸、核酸检测试剂和权利要求42的受保护聚合酶群；其中所述循环仪能编程，通过控制受保护聚合酶的脱保护来控制扩增反应的起始。
61.权利要求60的仪器，其进一步包括在扩增反应进行时能操作检测荧光信号的检测器，该荧光信号与反应容器中被扩增核酸的存在和/或量有关。
62.权利要求61的仪器，其中热循环仪适合容纳多个各自含有扩增反应混合物的反应容器。
63.权利要求61的仪器，其中检测器能操作检测以下波长范围中至少一个波长范围内的荧光信号：约510nm至约530nm，约540nm至约550nm，560nm至约580nm，约585nm至约595nm，590nm至约610nm，660nm至约680nm，约690nm至约710nm，或770至约790nm。
64.扩增模板核酸的方法，其包括：
a.提供包含聚合酶群的扩增反应混合物，该聚合酶群被可逆地保护，以便使所述聚合酶群在被置于合适的脱保护条件下小于约15min时，能以至少50％的收率转化为相应的未受保护聚合酶群；
b.使受保护聚合酶群中的单个聚合酶脱保护，成为相应的未受保护聚合酶；
c.将所述混合物置于合适的扩增条件下，以便扩增模板。
65.权利要求64的方法，其中所述脱保护发生在约55℃至65℃的温度下。
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