CN102146424B - 一种复合酶降解秸秆制备纤维素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种复合酶降解秸秆制备纤维素的方法，包括：原料的预处理；配制水解基液，将0.05g/L-0.5g/L的硫酸镁溶液、0.05g/L-0.5g/L的硫酸锰溶液以及0.05g/L-0.5g/L的硫酸铜溶液，用pH3.5-5的0.01mol/L-0.03mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定容；复合酶的制备，将60000U/mL-120000U/mL的漆酶、800U/mL-1600U/mL的锰过氧化物酶以及2000U/mL-3600U/mL的木质素过氧化物酶，按照2∶1∶1的体积比混合；酶解和纤维素的提取。本发明利用复合酶对植物秸秆进行降解，纤维素得率高，无污染。
Description
技术领域
本发明涉及使用酶分解植物秸秆生产纤维素的方法，具体地说是一种复合酶降解秸秆制备纤维素的方法。
背景技术
农作物植物秸秆是重要的生物质能源之一，但往往没有被充分利用，而是被大量废弃或焚烧。焚烧秸秆，不仅给大气带来污染，而且浪费了大量的生物质能源。秸秆通过处理不仅可以减轻环境污染，而且可以制备纤维素等材料，解决日益严峻的能源危机。
传统处理秸秆制备纤维素的主要方法是通过物理和化学方法相结合。比如用蒸汽***和膨化机械处理，用酸、碱、氨等处理。这些方法虽然处理速度快，但成本高，处理过程中还存在废水废气的排放，造成对环境污染的问题。
现有技术中虽然也有利用酶对植物秸秆进行降解处理的方法，但采用的酶品种单一，降解的效率不高，纤维素得率低。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种复合酶降解秸秆制备纤维素的方法，该方法采用多种酶联合降解秸秆制备纤维素，不仅不会造成环境污染，而且降解效率高、纤维素得率高。
本发明的技术方案为：
一种复合酶降解秸秆制备纤维素的方法，包括以下步骤：
a.原料的预处理：
将秸秆原料风干至水分小于2％，粉碎，过20目-60目筛；
b.配制水解基液：
将浓度为0.05g/L-0.5g/L的硫酸镁溶液、浓度为0.05g/L-0.5g/L的硫酸锰溶液以及浓度为0.05g/L-0.5g/L的硫酸铜溶液，用pH3.5-5的浓度为0.01mol/L-0.03mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定容；
c.复合酶的制备：
将60000U/mL-120000U/mL的漆酶(Laccase)、800U/mL-1600U/mL的锰过氧化物酶(Manganese-dependent Peroxidase)以及2000U/mL-3600U/mL的木质素过氧化物酶(Lignin Peroxidase)，按照2∶1∶1的体积比混合，形成复合酶；
d.酶解：
称取过筛后的秸秆粉放入水解容器，在水解容器中加入水解基液，秸秆粉与水解基液的固液比为1∶50g/mL-1∶100g/mL，将水解容器用高压蒸汽灭菌30min，然后向水解容器中添加复合酶进行水解，秸秆粉与复合酶的固液比为1∶0.5g/mL-1∶2.5g/mL，水解温度为30℃-50℃，水解时间为2h-6h；
e.纤维素的提取：
将上述水解液离心后倒出上清液，沉淀中加入双氧水进行漂洗，再经离心后倒出上清液，漂洗过程重复2次-3次，剩下的沉淀经冷冻干燥离心后即得秸秆纤维素。
本发明进一步的技术方案为：
所述步骤b中硫酸镁溶液的浓度为0.1g/L-0.3g/L、硫酸锰溶液的浓度为0.1g/L-0.3g/L、硫酸铜溶液的浓度为0.1g/L-0.3g/L；
所述步骤b中还加入浓度为0.03g/L的磷酸氢二钾溶液；
所述步骤d中所述水解容器置于摇床上，所述摇床的转速为100r/min-200r/min；
所述步骤e中在漂洗过程中添加三聚磷酸钠和磷酸氢二钠作为螯合剂。
与现有技术相比，本发明利用多种木质素降解酶组成的复合酶对植物秸秆进行降解，比单一品种酶降解木质素的效率高，纤维素得率高；本发明全过程无污染，无废水废气排放，生产的纤维素可以用来制备燃料乙醇等，具有较大的经济效益和社会效益。
具体实施方式
本发明是一种复合酶降解秸秆制备纤维素的方法，
一种复合酶降解秸秆制备纤维素的方法，包括以下步骤：
a.原料的预处理：
将秸秆原料风干至水分小于2％，粉碎，过20目-60目筛；
b.配制水解基液：
将浓度为0.05g/L-0.5g/L的硫酸镁溶液、浓度为0.05g/L-0.5g/L的硫酸锰溶液以及浓度为0.05g/L-0.5g/L的硫酸铜溶液，用pH3.5-5的浓度为0.01mol/L-0.03mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定容；
c.复合酶的制备：
将60000U/mL-120000U/mL的漆酶(Laccase)、800U/mL-1600U/mL的锰过氧化物酶(Manganese-dependent Peroxidase，简称MnP)以及2000U/mL-3600U/mL的木质素过氧化物酶(Lignin Peroxidase，简称LiP)，按照2∶1∶1的体积比混合，形成复合酶；
d.酶解：
称取过筛后的秸秆粉放入水解容器，在水解容器中加入水解基液，秸秆粉与水解基液的固液比为1∶50g/mL-1∶100g/mL，将水解容器用高压蒸汽灭菌30min，然后向水解容器中添加复合酶进行水解，秸秆粉与复合酶的固液比为1∶0.5g/mL-1∶2.5g/mL，水解温度为30℃-50℃，水解时间为2h-6h；
e.纤维素的提取：
将上述水解液离心后倒出上清液，沉淀中加入双氧水进行漂洗，再经离心后倒出上清液，漂洗过程重复2次-3次，剩下的沉淀经冷冻干燥离心后即得秸秆纤维素。
在步骤b中硫酸镁溶液的浓度最佳为0.1g/L-0.3g/L、硫酸锰溶液的浓度最佳为0.1g/L-0.3g/L、硫酸铜溶液的浓度最佳为0.1g/L-0.3g/L。
在步骤b中还可以加入浓度为0.03g/L的磷酸氢二钾溶液。
在步骤d中水解容器置于摇床上，摇床的转速为100r/min-200r/min。
在步骤e中在漂洗过程中添加三聚磷酸钠和磷酸氢二钠作为螯合剂，以排除金属离子干扰。
以下是本发明的实施例：
实施例1
(1)原料的预处理：
采用风干的水分小于2％的秸秆原料用小型高速粉碎机进行破碎，过40目筛。
(2)配制水解基液：
取0.1g/L的硫酸镁溶液、0.3g/L的硫酸锰溶液、0.3g/L的硫酸铜溶液以及0.03g/L的磷酸氢二钾溶液，用pH4.0的浓度为0.03mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定容到100mL。
(3)复合酶的制备：
将120000U/mL的漆酶、1600U/mL的锰过氧化物酶以及3600U/mL的木质素过氧化物酶，按照2∶1∶1的体积比混合，形成复合酶。
(4)酶解：
称取秸秆粉2.0g放入250mL烧瓶中，加入100mL的水解基液，高压蒸汽灭菌30min使之溶胀软化。向水解瓶中添加复合酶5mL，进行水解。温度为45℃，水解瓶置于摇床上，摇床的转速为200r/min，时间为6h。
(5)纤维素的提取：
将上述水解液在转速为8000r/min下离心15min，倒出上清液。沉淀加入10％的双氧水50℃漂白2h，在转速为8000r/min下离心15min，倒出上清液。在漂白过程中，添加0.75％的三聚磷酸钠和0.75％的磷酸氢二钠作为螯合剂排除金属离子干扰；漂洗过程重复2-3次。沉淀经冷冻干燥后即得秸秆纤维素。
本实施例所得纤维素的得率为92％，纯度为95％。
实施例2
(1)原料的预处理：
采用风干的水分小于2％的秸秆原料用小型高速粉碎机进行破碎，过60目筛。
(2)配制水解基液：
取0.05g/L的硫酸镁溶液、0.1g/L的硫酸锰溶液、0.1g/L的硫酸铜溶液以及0.03g/L的磷酸氢二钾溶液，用pH4.5的浓度为0.02mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定容到100mL。
(3)复合酶的制备：
将100000U/mL的漆酶、1500U/mL的锰过氧化物酶以及3000U/mL的木质素过氧化物酶，按照2∶1∶1的体积比混合，形成复合酶。
(4)酶解：
称取过筛后的秸秆粉2.0g放入250mL烧瓶中，加入100mL的水解基液，高压蒸汽灭菌30min使之溶胀软化。向水解瓶中添加复合酶3mL，进行水解。温度为40℃，水解瓶置于摇床上，摇床的转速为150r/min，时间为4h。
(5)纤维素的提取：
方法同实施例1步骤(5)。
本实施例所得纤维素的提取率为81％，纯度为90％。
实施例3
(1)原料的预处理：
采用风干的水分小于2％的秸秆原料用小型高速粉碎机进行破碎，过20目筛。
(2)配制水解基液：
取0.3g/L的硫酸镁溶液、0.5g/L的硫酸锰溶液、0.05g/L的硫酸铜溶液以及0.03g/L的磷酸氢二钾溶液，用pH5的浓度为0.02mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定容到100mL。
(3)复合酶的制备
将80000U/mL的漆酶、1000U/mL的锰过氧化物酶以及2800U/mL的木质素过氧化物酶，按照2∶1∶1的体积比混合，形成复合酶。
(4)酶解：
称取过筛后的秸秆粉2.0g放入250mL烧瓶中，加入100mL的水解基液，高压蒸汽灭菌30min。向水解瓶中添加复合酶1mL，进行水解。温度为30℃，水解瓶置于摇床上，摇床的转速为150r/min，时间为2h。
(5)纤维素的提取：
方法同实施例1步骤(5)。
本实施例所得纤维素的得率为70％，纯度为92％。
实施例4
(1)原料的预处理：
采用风干的水分小于2％的秸秆原料用小型高速粉碎机进行破碎，过40目筛。
(2)配制水解基液：
取0.5g/L的硫酸镁溶液、0.05g/L的硫酸锰溶液、0.5g/L的硫酸铜溶液以及0.03g/L的磷酸氢二钾溶液，用pH3.5的浓度为0.01mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定容到100mL。
(3)复合酶的制备
将60000U/mL的漆酶、800U/mL的锰过氧化物酶以及2000U/mL的木质素过氧化物酶，按照2∶1∶1的体积比混合，形成复合酶。
(4)酶解：
称取过筛后的秸秆粉2.0g放入250mL烧瓶中，加入100mL的水解基液，高压蒸汽灭菌30min。向水解瓶中添加复合酶2mL，进行水解。温度为50℃，水解瓶置于摇床上，摇床的转速为100r/min，时间为3h。
(5)纤维素的提取：
方法同实施例1步骤(5)。
本实施例所得纤维素的得率为59％，纯度为93％。
Claims (5)
1.一种复合酶降解秸秆制备纤维素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.原料的预处理：
将秸秆原料风干至水分小于2%，粉碎，过20目－60目筛；
b. 配制水解基液：
将浓度为0.05 g/L－0.5 g/L的硫酸镁溶液、浓度为0.05 g/L－0.5 g/L的硫酸锰溶液以及浓度为0.05 g/L－0.5 g/L的硫酸铜溶液，用pH3.5－5的浓度为0.01 mol/L－0.03 mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定容；
c.复合酶的制备：
将60000U/mL－120000 U/mL的漆酶Laccase、800 U/mL－1600 U/mL的锰过氧化物酶Manganese-dependent Peroxidase以及2000 U/mL－3600 U/mL的木质素过氧化物酶Lignin Peroxidase，按照2：1：1的体积比混合，形成复合酶；
d.酶解：
称取过筛后的秸秆粉放入水解容器，在水解容器中加入水解基液，秸秆粉与水解基液的固液比为1：50 g/mL－1：100g/mL，将水解容器用高压蒸汽灭菌30 min，然后向水解容器中添加复合酶进行水解，秸秆粉与复合酶的固液比为1：0.5 g/mL－1：2.5g/mL，水解温度为30 ℃－50 ℃，水解时间为2 h－6 h；
e.纤维素的提取：
将上述水解液离心后倒出上清液，沉淀中加入双氧水进行漂洗，再经离心后倒出上清液，漂洗过程重复2次－3次，剩下的沉淀经冷冻干燥后即得秸秆纤维素。
2.根据权利要求1所述的一种复合酶降解秸秆制备纤维素的方法，其特征在于：所述步骤b中硫酸镁溶液的浓度为0.1 g/L－0.3 g/L、硫酸锰溶液的浓度为0.1 g/L－0.3 g/L、硫酸铜溶液的浓度为0.1 g/L－0.3 g/L。
3.根据权利要求1或2所述的一种复合酶降解秸秆制备纤维素的方法，其特征在于：所述步骤b中还加入浓度为0.03 g/L的磷酸氢二钾溶液。
4.根据权利要求1或2所述的一种复合酶降解秸秆制备纤维素的方法，其特征在于：所述步骤d中所述水解容器置于摇床上，所述摇床的转速为100 r/min－200 r/min。
5.根据权利要求1或2所述的一种复合酶降解秸秆制备纤维素的方法，其特征在于：所述步骤e中在漂洗过程中添加三聚磷酸钠和磷酸氢二钠作为螯合剂。
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