CN102140494A

CN102140494A - 赖氨酸去丙酰化酶及去丁酰化酶的筛选及活性测定方法

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Publication number: CN102140494A
Application number: CN201010103035XA
Authority: CN
Inventors: 赵英明
Original assignee: 赵英明
Current assignee: Hangzhou Jingjie Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2010-01-29
Filing date: 2010-01-29
Publication date: 2011-08-03
Anticipated expiration: 2030-01-29
Also published as: CN102140494B

Abstract

本发明涉及一种赖氨酸去丙酰化酶及去丁酰化酶的筛选及活性测定方法，该方法的基本思路是底物的赖氨酸丙酰化或丁酰化修饰程度可通过底物对去催化酶的灵敏度反应出来。该方法具体包括：a.标记有可释放信号物质的赖氨酸丙酰化底物多肽；b.赖氨酸去丙酰化酶；c.一种可将修饰性赖氨酸丙酰化多肽从对应的非修饰性多肽区别开来的检测方法。本发明方法不但能用于去修饰性酶的筛选和酶活性的测定，还可以筛查影响这些酶的活性的底物，进而可用于某些疾病的快速诊断中。

Description

赖氨酸去丙酰化酶及去丁酰化酶的筛选及活性测定方法

技术领域

本发明涉及了一种筛选赖氨酸去丙酰化酶和去丁酰化酶以及测定赖氨酸去丙酰化酶和去丁酰化酶活性的方法。尤其是通过测定Boc-Lys(Prop)-AMC(叔丁氧羟基丁酰化赖氨酸-4-氨基-7-甲基香豆素)和Boc-Lys(Buty)-AMC(叔丁氧羟基丙酰化赖氨酸-4-氨基-7-甲基香豆素)被赖氨酸去丙酰化酶及去丁酰化酶的催化后的荧光强度，以及结合质谱鉴定、生物化学分析和细胞学检测确认特异性的赖氨酸去丙酰化酶和去丁酰化酶以及酶活性的测定。

背景技术

核小体是染色质的基本重复单元，由八聚体的核心组蛋白以及环绕的约长147碱基对的DNA构成。核小体能够进一步折叠成更高级的结构⁽¹⁾。染色质结构的动态变化调节了DNA的可塑性，进而影响了基于DNA模板的生物学过程，如转录，复制和重组。

在过去几十年里，大量研究显示组蛋白的翻译后修饰(PTMs)通过调节染色质的结构和功能在细胞过程中起到了至关重要的作用^(2-5)。组蛋白，尤其是其N末端尾部，至少存在11种蛋白翻译后修饰方式，包括乙酰化，ADP-核糖基化，瓜氨酸化，甲酰化，甲基化，磷酸化，脯氨酸异构化，SUMO化，泛素化，以及在赖氨酸侧链的丁酰化和丙酰化(后两者分别记为K^Prop和K^Buty)。组蛋白翻译后修饰被认为调节了染色质的结构，进而通过两种机制行使功能^(2-3，5)。首先，通过改变组蛋白的电荷或核小体间相互作用直接调节染色质包装过程，进而调节了染色质的高级结构和DNA结合蛋白的结合能力。其次，组蛋白翻译后修饰能够招募与修饰特异性结合的蛋白及这些蛋白的相互作用蛋白，或者阻止某些蛋白结合到染色质上。

组蛋白赖氨酸乙酰化约在四十年前被鉴定。该修饰是一种高度调节的可逆的翻译后修饰方式，其修饰状态被两组互为相反活性的酶---组蛋白乙酰转移酶(HATs或KATs)和组蛋白去乙酰化酶(HDACs)所调控^(6-7)。组蛋白赖氨酸乙酰化通过中和赖氨酸侧链的正电荷调节染色质的可塑性，并且产生了一个能够招募具有bromo结构域蛋白的“停泊”位点 ^(6，8)。组蛋白赖氨酸过乙酰化被认为与活性基因表达相关。近年来，质谱分析和基因组尺度的关联研究强有力地表明了赖氨酸乙酰化与其它组蛋白翻译后修饰之间存在着长距离的关联。例如，组蛋白H3过乙酰化与组蛋白H4第四位赖氨酸的三甲基化(H3K4me3)显著相关，并调节了活性基因转录^(6，9-11)。除了组蛋白，赖氨酸乙酰化也存在于细胞的不同区域中，包括核蛋白，胞质蛋白和线粒体蛋白，并且这些修饰与衰老和多种疾病密切相关^(12-14)。

最近，我们通过质谱分析在组蛋白H4上鉴定到两种结构与赖氨酸乙酰化相似的翻译后修饰方式--赖氨酸丙酰化与赖氨酸丁酰化⁽¹⁵⁾。最初的鉴定通过对合成多肽的二级质谱分析(MS/MS或串联质谱)、体外酶促反应、HPLC共洗脱、以及修饰得的蛋白印迹分析得到确认^(15-16)。我们最近的研究证实这两种翻译后修饰并不仅仅存在于组蛋白中，在一些非组蛋白如p53，p300和CBP中也存在⁽¹⁷⁾。研究显示赖氨酸乙酰化的调节酶，Sirt1，p300和CBP也能够调节p53的丙酰化⁽¹⁷⁾。Escalante-Semerena及其同事报道了肠道沙门氏菌的丙酰辅酶A合酶PrpE的赖氨酸丙酰化，并显示该可逆性修饰起到了调节酶活性的作用⁽¹⁸⁾。

赖氨酸乙酰化，丙酰化和丁酰化之间在生化水平存在类似性。例如，这三种修饰均用三种不同的高能辅酶A分子，即乙酰辅酶A，丙酰辅酶A和丁酰辅酶A，作为修饰反应的底物。先前的结构研究显示酵母组蛋白乙酰转移酶Hat1具有一个空间上足够大的乙酰辅酶A结合域，在空间上该结合域可接受更大的乙酰辅酶A类似物⁽¹⁹⁾。因此，丁酰辅酶A也可能被某些赖氨酸乙酰转移酶(KATs)所利用以催化赖氨酸丙酰化反应。的确，研究表明乙酰化转移酶p300/CBP能够利用催化同位素标记的丁酰辅酶A转移到组蛋白赖氨酸 ⁽¹⁵⁾。此外，一些去乙酰化酶，如Sirt1，在体内和体外都能够催化去丙酰化反应⁽¹⁷⁾。利用一系列赖氨酸乙酰化类似多肽作为底物，Smith和Denu发现一些去乙酰化酶具有对体外赖氨酸丁酰化的可测量的酶活性⁽²⁰⁾。这些有限的研究暗示了在赖氨酸去乙酰化和去丙酰化及去丁酰化反应之间共享一些催化酶的可能性。然而，对具体的赖氨酸去丙酰化和去丁酰化酶的筛选以及酶活性的测定却知之甚少，从而直接影响了对这两种修饰方式的生物学功能研究。

发明内容

基于此，结合生物化学分析，本发明提出了一种筛选赖氨酸去丙酰化酶和去丁酰化酶以及酶活性测定的方法。

本发明方法包括三个主要步骤：首先，合成高纯度的Boc-Lys(Prop)-AMC和Boc-Lys(Buty)-AMC；其次，将待筛选赖氨酸去丙酰化酶或去丁酰化酶在特定的反应体系中与Boc-Lys(Prop)-AMC或Boc-Lys(Buty)-AMC反应，特异性的赖氨酸去丙酰化酶或去丁酰化酶将能够切除赖氨酸侧链的丙酰基(Prop)或丁酰基(Buty)，进而在胰酶的裂解作用下释放出AMC基团，通过测定释放的AMC基团的荧光强度初步筛选特异的赖氨酸去丙酰化酶或去丁酰化酶，并通过测定的荧光强度反映酶的活性强度；最后，经一系列的质谱分析和生化分析确定候选的赖氨酸去丙酰化酶或去丁酰化酶为目标赖氨酸去丙酰化酶或去丁酰化酶。

以赖氨酸去丁酰化酶的筛选和活性测定为例，通过测定不同的待筛选酶对Boc-Lys(Buty)-AMC催化后释放的AMC基团的荧光强度，本发明首先确认了HDAC3和HDAC6为候选赖氨酸去丁酰化酶；随后通过HDAC3及HDAC6对合成的赖氨酸丁酰化肽段去丁酰化后的二级质谱分析以及体外生化试验证明这两种酶具有体外赖氨酸去丁酰化酶；最后，通过体内的生化实验和细胞学实验确认HDAC3及HDAC6为赖氨酸去丁酰化酶。

除了对赖氨酸去丙酰化酶和去丁酰化酶的筛选以及酶活性测定，本发明的基本原理及实验方法同样能用于常规的酶活性分析及后继的药物筛选。

此外，本发明还提出了一种用于筛选赖氨酸去丙酰化酶及酶活性测定的试剂盒，该试剂盒包括：

a.标记有可释放信号物质的赖氨酸丙酰化底物多肽；

b.能够根据底物多肽的丙酰化水平而改变其酶切活性的肽酶。

本发明的另一种用于鉴定能抑制或增强去丙酰化酶活性的化合物的试剂盒，其包括：

a.标记有可释放信号物质的赖氨酸丙酰化底物多肽；

b.赖氨酸去丙酰化酶；

c.能够根据底物多肽的丙酰化而改变其酶切活性的肽酶。

本发明的另一种用于筛选赖氨酸丙酰化酶及酶活性测定的试剂盒包括：a.标记有可释放信号物质的底物多肽；b.能够根据底物多肽的丙酰化水平而改变其酶切活性的肽酶。

其中，上述任一检测试剂盒，所述可释放信号物质是一种染料。所述的染料为一种荧光物质，释放的信号是荧光信号。

所述的肽酶来自于Lysylendopeptidase、endoproteinase Lys-C、plasmin、calpain、metalloendopeptidase及Armillaria mellea protease。

所述的丙酰化底物多肽含有一个丙酰化赖氨酸残基。

所述的肽酶为lysylendopeptidase。

所述的赖氨酸丙酰化底物多肽是经7-amino-4-methyl-coumarin(AMC)或para-nitroaniline(p-Na)荧光团标记的丙酰化/丁酰化赖氨酸，且荧光团与赖氨酸用肽键相连。

所述的底物多肽含有一个赖氨酸残基。

附图说明

图1.组蛋白赖氨酸丁酰化是真核细胞中进化保守的翻译后修饰。(A)乙酰辅酶A和丁酰辅酶A结构，以及赖氨酸乙酰化和丁酰化酶促反应图示图。(B)五种真核细胞中组蛋白的赖氨酸丁酰化。核心组蛋白赖氨酸丁酰化的免疫印迹检测(上)及等量核心组蛋白的考马斯蓝染色(下)。(C)细胞核及染色体中的赖氨酸丁酰化免疫荧光检测。(D)经质谱分析所得的五种真核细胞中核心组蛋白赖氨酸乙酰化，丙酰化和丁酰化位点示意图。Ac：乙酰基；Pr：丙酰基；Bu：丁酰基；O：未检测到。

图2.蛋白赖氨酸去丁酰化酶的初步筛选与活性测定。(A)HDAC抑制剂影响组蛋白赖氨酸丁酰化状态。HeLa细胞分别用I，II，III，IV类HDAC抑制剂处理6小时后，免疫印迹分析核心组蛋白赖氨酸丁酰化水平。HDAC抑制剂分别是2μM trichostatin A(TSA)；50mM丁酸钠；50μM suberoyl anilide hydroxamic acid(SAHA)；10ng/ml depsipeptide(FK288)；30mM nicotinamide和200μM sirtinol。(B)Boc-Lys(Buty)-AMC的合成与分子结构(合成方法见具体实施方式)。(C)赖氨酸去丁酰化酶的筛选与活性测定(筛选与活性测定方法见具体实施方式)。

图3.HDCA3体外催化赖氨酸去丁酰化。(A-C)HDAC3催化组蛋白H3多肽的赖氨酸去丁酰化(多肽序列：CSTGGK14^ButyAPRK18^ButyQLATK23^ButyAARK)。A-C显示合成的丁酰化组蛋白H3多肽(A)，或与HDAC3孵育(B)，或与HDAC3加入2μM TSA孵育(C)后的MALDI-TOF谱图。每个主峰的分子量均标出，对应于去除一个、两个或三个丁酰基团产物的肽谱峰用箭头标出。(D-F)HDAC3催化组蛋白H4多肽的赖氨酸去丁酰化。实验过程与(A-C)相同，除了使用合成的丁酰化组蛋白H4多肽为反应底物(多肽序列：CSGRGK5^ButyGGK8^ButyGLGK12^ButyGGAK)。(I)HDAC3体外催化核心组蛋白去丁酰化。来自HeLa细胞的核心组蛋白与加入或不加入TSA(10μM)的重组HDAC3在37℃孵育3小时后，免疫印迹分析核心组蛋白赖氨酸丁酰化水平。100ng重组HDAC3和50pmol H3多肽用于上述分析。

图4.HDAC3体内催化组蛋白赖氨酸去丁酰化。(A)HeLa细胞转染表达Flag-HDAC3，转染后36小时，免疫印迹分析核心组蛋白赖氨酸丁酰化水平。(B)与(A)相同，除了转染表达酶失活突变体Flag-HDAC3S424A。(C)核内HDAC3促进组蛋白赖氨酸去丁酰化水平。HeLa细胞转染表达Flag-HDAC3和Flag-HDAC3S424A突变体，转染36小时后，核心组蛋白H4K5丁酰化水平的免疫荧光检测。

图5.HDAC6体内体外催化组蛋白赖氨酸丁酰化。(A)体外HDAC6催化核心组蛋白去乙酰化。提取的HeLa细胞核心组蛋白与HDAC6(野生型或酶失活突变体)，加入或不加入TSA(2μM)，在37℃孵育2小时，免疫印迹分析核心组蛋白赖氨酸丁酰化水平。(B)HDAC6体内催化核心组蛋白赖氨酸去丁酰化。HeLa细胞转染表达Flag-HDAC6，转染后36小时，免疫印迹分析核心组蛋白赖氨酸丁酰化水平。(C)HDAC6酶失活突变体不能在体内催化组蛋白赖氨酸去丁酰化。所有实验过程与(B)相同，除了使用了Flag-HDAC6H216/611A酶活缺失突变体。(D)Leptomycin B(LMB)促进了HDAC6对核心组蛋白赖氨酸去丁酰化。HeLa细胞转染表达Flag-HDAC6或Flag-HDAC6H216/611A突变体。转染36小时后，leptomycin B(200nm)处理细胞3小时，免疫印迹分析核心组蛋白赖氨酸丁酰化水平。(E-F)Leptomycin B促进了HDAC6对组蛋白H4K5和K12的去丁酰化。所有实验过程与(D)相同，除了使用序列特异的赖氨酸丁酰化抗体免疫印迹(E)或免疫荧光(F)检测组蛋白H4特定位点的赖氨酸丁酰化水平。

具体实施方式

质粒，抗体和其他试剂：编码HDAC3，HDAC6cDNA的质粒及其对应酶失活突变体质粒HDAC3S424A和HDAC6H216/611A由H.Lee Moffitt癌症中心的Edward Seto惠赠。质粒信息见之前报道^(21-22)。抗丁酰赖氨酸抗体和抗组蛋白位点特异性丁酰赖氨酸的抗体有本发明人自己制备。其它用到的抗体有：抗乙酰化赖氨酸抗体(ImmunoChemPharmaceuticals，Burnaby，British Columbia，Canada)；抗组蛋白H3抗体，抗组蛋白H4抗体(Abcam，Cambridge，UK)；抗HA抗体(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)；抗Flag抗体(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。重组HDAC1，HDAC2，HDAC3，HDAC4，HDAC5，HDAC6，HDAC7，HDAC8，HDAC9，HDAC10和HDAC11购至BPSBioscience Inc.(BPS Bioscience Inc.，San Diego，CA)。丁酰辅酶A，乙酰辅酶A，Leptomycin B和乙酸购自Sigma-Aldrich Co.(St.Louis，MO)。HPLC级乙腈，水和乙醇购自EMD Chemicals Inc.(Gibbstown，NJ)。带有一个或几个丁酰化赖氨酸的多肽由吉尔生化合成(GL Biochem Ltd.，Shanghai，P.R.China)。

Boc-Lys(Buty)-AMC的合成：在23℃下，向含有Boc-Lys-AMC(50mg，0.124mmol，1.0当量)和三乙胺(35μL，0.248mmol，2.0当量)的二氯甲烷(1mL)溶液中加入丁酰氯(16μL，0.149mmol，1.2当量)。搅拌过夜。反应液用二氯甲烷(1mL)稀释，然后用饱和碳酸氢钠溶液(2mL×2)和水(2mL)洗涤。有机相用硫酸钠干燥，过滤，浓缩后获得Boc-Lys(Buty)-AMC。

组蛋白去丁酰化酶的筛选及酶活性检测及酶的确认：组蛋白去丁酰化酶的筛选与酶活性检测采用修饰基团催化切除后测定激发荧光的方法。首先，发明人发展了一种基于荧光强度测定的赖氨酸去丁酰化酶的筛选及酶活性测定的方法。该方法与用于测定赖氨酸去乙酰化酶的方法类似^(23-24)。将本发明人合成的Boc-Lys(Buty)-AMC和Boc-Lys(Prop)-AMC用于荧光测定的底物。为筛选和测定赖氨酸去丁酰化酶及酶活性，随后将待筛选的重组去乙酰化酶(2ng或200ng)与85μl ddH₂O，10μl 10X HDAC反应缓冲液(25mM Tris-Cl(pH 8.0)，137mM NaCl，2.7mM KCl，1mM MgCl₂)和5μl 4mM Boc-Lys(Buty)-AMC混合。混合物在37℃反应30分钟。向反应体系中加入10μl发明人自制的Lysine Developer终止反应，并在37℃孵育30分钟。胰酶裂解后产生的荧光强度通过SPECTRAFluor Plus 荧光微孔板阅读仪(MTX Lab Systems Inc.，Vienna，VA)在Ex＝350-380nm和Em＝440-460nm处测定。只有能催化去除丁酰基或丙酰基的酶才能产生荧光信号，而荧光强度代表该酶去赖氨酸丁酰化或丙酰化的酶活性。

组蛋白赖氨酸去丁酰化酶的质谱分析：将初步筛选出的赖氨酸去丁酰化酶和合成的赖氨酸丁酰化多肽在10μl HDAC反应缓冲液中37℃反应2小时。在一个典型的实验中，需用100ng候选赖氨酸去丁酰化酶和50pmol多肽底物。为进一步确认候选赖氨酸去丁酰化酶的体外催化能力，加入2μM TSA以抑制赖氨酸去丁酰化酶活性。反应后的底物多肽最后经过μC18Zip Tips纯化，进行MALDI-TOF质谱分析。

组蛋白赖氨酸去丁酰化酶的生物化学及细胞学确认：为分析候选组蛋白赖氨酸去丁酰化酶的体外活性，将初步筛选出的重组赖氨酸去丁酰化酶与从真核细胞中分离的6μg核心组蛋白在15μl HDAC反应缓冲液中37℃反应2小时，反应产物经SDS-PAGE后用抗赖氨酸丁酰化的抗体的免疫印迹检测核心组蛋白赖氨酸丁酰化的变化。为确认候选组蛋白赖氨酸去丁酰化酶的体内活性，将含编码候选组蛋白赖氨酸去丁酰化酶cDNA的质粒(野生型及酶失活突变体)转染至真核细胞中。转染36小时后，细胞经裂解并SDS-PAGE后后用抗赖氨酸丁酰化的抗体的免疫印迹检测核心组蛋白赖氨酸丁酰化的变化，或将细胞固定后用组蛋白位点特异性赖氨酸丁酰化的抗体进行免疫荧光分析。

结果

HDAC3和HDAC6是候选组蛋白赖氨酸去丙酰化酶与去丁酰化酶

组蛋白赖氨酸乙酰化是一种可逆的翻译后修饰，其修饰状态与乙酰转移酶(HATs)和去乙酰化酶(HDACs)的动态调节作用的紧密联系。考虑到赖氨酸乙酰化和赖氨酸丙酰化及丁酰化的相似性，我们假设一些HDACs可能同样行使去赖氨酸丙酰化和去赖氨酸丁酰酶的作用。

为检验这个假设，我们首先分析了组蛋白赖氨酸丙酰化和丁酰化是否会在加入HDAC抑制剂的细胞中选择性增强。以组蛋白丁酰化的变化为例，组蛋白丁酰化水平在加入I、II及VI类HDACs抑制剂后大幅增加(TSA、NaBu、SAHA和FK288)；但III类HDAC抑制剂的处理却几乎不对组蛋白丁酰化水平产生影响(Nicotinamide和sirtinol)(图 2A)。这个结果暗示了I、II和VI类HDACs可能是主要的组蛋白赖氨酸去丁酰化酶。

为了筛选具体哪种I、II和VI类HDACs优先催化了组蛋白赖氨酸去丁酰化反应，发明人开发了一种赖氨酸去乙酰化酶的筛选及酶活性测定的荧光强度检测法(见具体实施方式)。在本检测中，将所有可能的I、II和VI类HDACs与合成的HDAC荧光底物Boc-Lys(Buty)-AMC进行孵育(图2B)，只有具备赖氨酸去丁酰化酶活性的HDACs能够将赖氨酸侧链的丁酰基去除，随后经胰酶裂解产生的AMC基团在荧光试剂作用下激发出可检测的荧光信号，同时荧光信号的强弱反应了酶活性的高低。该测试类似于用Boc-Lys(Ac)-AMC检测赖氨酸乙酰化的方法^(23-24)。该检测方法显示所有低剂量的HDCAs(2ng)对Boc-Lys(Buty)-AMC赖氨酸侧链的丁酰基的去除几乎没有影响，然后当提高HDACs的剂量至200ng时，HDAC3和HDAC6显示出有比其它HDACs高得多的活性将丁酰基团Boc-Lys(Bu)-AMC中移除(图2C)。上述结果暗示了HDAC3和HDAC6是潜在的去丁酰化酶，并体现出高的酶活性。

HDAC3体外催化组蛋白赖氨酸去丁酰化

为确认HDAC3体外赖氨酸去丁酰化酶活性，对合成的组蛋白H3和H4赖氨酸丁酰化多肽进行了体外赖氨酸去丁酰化反应(H3多肽序列：CSTGGK14^ButyAPRK18^ButyQLATK23^ButyAARK；H4多肽序列：CSGRGK5^ButyGGK8^ButyGLGK12^ButyGGAK)，反应产物经质谱分析确定质量位移。结果表明，在没有HDAC3的催化作用下，合成多肽H3K_14，18，23 ^Buty和H4K_5，8，12 ^Buty的分子量分别是2182Da和1728Da(图3A和3D)；当在添加HDAC3后，合成多肽的肽谱峰有渐次丢失的～70Da质量差，这个质量差与多肽分别丢失1个、2个或3个丁酰基团相一致(图3B和3E)。然而，当HDAC3活性被TSA抑制后，合成多肽丢失的质量位移又被恢复(图3C和3F)。

随后，发明人进一步检测了重组HDAC3在体外对真核细胞中核心组蛋白的赖氨酸去丁酰化能力。正如预期，HDAC3在体外显著降低了组蛋白H3和H4的赖氨酸丁酰化水平，而当HDAC3活性被TSA抑制后，组蛋白H3和H4的赖氨酸丁酰化水平恢复到正常水平(图3G)。这些体外实验确认了HDAC3是组蛋白赖氨酸去丁酰化酶。

HDAC3是体内的组蛋白赖氨酸去丁酰化酶

为检测HDAC3是否为体内的组蛋白赖氨酸去丁酰化酶，我们在HeLa细胞中引入了HDAC3剂量依赖的异位表达，然后通过免疫印迹检测组蛋白赖氨酸丁酰化水平。结果表明，组蛋白赖氨酸丁酰化随着野生型HDAC3的过表达而降低(图3A)，但HDAC3酶失活突变体HDAC3 S424A的过表达却不能引起组蛋白赖氨酸丁酰化水平的下降(图3B)。在细胞层次上，和未转染的细胞相比，体内过表达的HDAC3显著降低了组蛋白H4K5的赖氨酸丁酰化，而其酶失活突变体HDAC3 S424A的表达却不能使H4K5去丁酰化(图3C，箭头所示)。由此确认了HDAC3是体内的组蛋白赖氨酸去丁酰化酶。

HDAC6在体内和体外催化了组蛋白赖氨酸去丁酰化

以Boc-Lys(Buty)-AMC为底物的荧光强度检测显示了具有显著的赖氨酸去丁酰化酶活性(图2B)。为进一步确认HDAC6的作用，发明人随后检测了HDAC6体外催化组蛋白赖氨酸去丁酰化的能力。结果表明，重组的HDAC6显著降低了组蛋白H3和H4的赖氨酸丁酰化水平。然而，被TSA抑制了活性的HDAC6则组蛋白赖氨酸丁酰化水平无影响。此外，酶失活突变的HDAC6 H216/611A无法催化组蛋白赖氨酸去丁酰化反应(图4A)，暗示了组蛋白赖氨酸去丁酰化需要HDAC6的酶活性。

为检测HDAC6的体内催化作用，发明人在细胞中引入了过表达的野生型及酶失活突变体的HDAC6 H216/611A。结果表明野生型HDAC6的过表达促进了组蛋白赖氨酸的去丁酰化(图4B)，而HDAC6 H216/611A则无此作用(图4C)。

HDAC6通常被认为是胞质的去乙酰化酶⁽²⁵⁾，但是该蛋白能够动态穿梭于胞质和细胞核中⁽²⁶⁾。最近的研究表明HDAC6能与染色质相结合，标记不同的DNA片段⁽²⁷⁾，暗示了了HDAC6在细胞核中的功能。当利用核输出抑制剂leptomycine B处理细胞时，发明人观察到了HDAC6被滞留在核中。所有这些结果增强了HDAC6动态定位于细胞核，行使组蛋白赖氨酸去丁酰化的可能。

为确认核内HDAC6对组蛋白赖氨酸去丁酰化作用，在leptomycin B处理或不处理下检测了过表达的HDAC6及HDAC6H216/611A对组蛋白赖氨酸丁酰化的影响。单独加入leptomycin B，或单独过表达HDAC6都产生明显的组蛋白H3和H4赖氨酸去丁酰化。然而，leptomycin B处理和HDAC6过表达的协同作用能显著降低组蛋白的赖氨酸丁酰化水平。反之，HDAC6H216/611A与leptomycin B基本没有协同效应(图4D)。通过检测组蛋白 H4特异性位点的赖氨酸丁酰化水平，观察到在leptomycine B作用下，过表达HDAC6能显著降低H4K5和H4K12丁酰化水平(图4E)。这个结果与用leptomycin B作用于过表达HDAC6与HDAC6 H216/611A细胞后，用抗组蛋白H4K5和H4K12丁酰化的序列特异性抗体标记的免疫荧光染色结果相一致(图4F)。综上所述，发明人确认了在细胞核中的HDAC6能够在体内催化组蛋白赖氨酸去丁酰化。

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Claims

1.一种用来检测含有去丙酰化酶的样品中去丙酰化酶活性的方法，其特征在于，所述方法包括：

a.标记有可释放信号物质的赖氨酸丙酰化底物多肽；

b.赖氨酸去丙酰化酶；

c.一种可将修饰性赖氨酸丙酰化多肽从对应的非修饰性多肽区别开来的检测方法。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，可释放信号物质是一种染料。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，染料为一种荧光物质，释放的信号是荧光信号。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，可释放信号物质可吸收紫外光，并能被高效液相色谱的紫外检测仪所检测。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测方法为质谱检测。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测方法为将修饰性赖氨酸丙酰化多肽从对应的非修饰性多肽区别开来的色谱法检测。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，色谱法检测为高效液相色谱法检测。

8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，色谱仪为微流设备，包括但不限于微流芯片。

9.根据权利要求1-8所述的任一检测方法，其特征在于，当赖氨酸修饰为丁酰化而不是丙酰化时，所述的检测方法可用来筛选赖氨酸丁酰化酶/去丁酰化酶及酶活性的检测。