CN102133244B - 一种低酸高品质银杏叶提取物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种低酸高品质银杏叶提取物的制备方法，该制备方法包括提取、精制纯化分离、浓缩干燥。通过本发明方法得到的银杏叶提取物总黄酮含量达65％以上(其中黄酮醇苷达35％以上)，总萜类内酯含量达10％以上，3，3′-二甲氧基-4，4′-二羟基二苯乙烯含量达0.05％以上，银杏酸含量可低于2ppm。与现有技术相比，本发明首次对3，3′-二甲氧基-4，4′-二羟基二苯乙烯含量进行了定量控制，有效成分富集提取率高，有害成分银杏酸含量低，具有生产过程符合工业化大生产要求，工艺路线更加合理的特点。

Description

一种低酸高品质银杏叶提取物的制备方法

技术领域

本发明涉及一种低酸高品质银杏叶提取物的制备方法，该银杏叶提取物可作为治疗血瘀型胸痹及血瘀型轻度脑动脉硬化引起的眩晕以及冠心病、心绞痛、心肌梗塞等疾病的原料药，属于中药制备技术领域。

背景技术

心脑血管疾病居各种死因首位，已成为人类死亡病因最高的头号杀手。据统计，目前中国60岁以上人口已逾3亿，人口老龄化的来临使心脑血管疾病患者也相应上升。同时现代社会来自工作、社会、生活等方面的压力促使心脑血管疾病在30岁至40岁的中青年人中的发病率也不断上升，发病的年龄跨度在不断扩大。目前，虽然西医治疗心脑血管疾病的药物较多，但是由于副作用大等原因，临床使用受到了限制。银杏叶制剂作为临床安全有效的治疗心脑血管疾病的药物，在全球临床市场已取得广泛认可。从技术先进性角度来看，银杏叶制剂至今已经历大约5个发展阶段，即第一代将银杏叶烘干，粉碎原生药压片；第二代将银杏叶用水提取后浓缩成膏，然后烘干、制粒压片，但对其中的主要有效成分银杏黄酮和银杏内酯没有进行控制；第三代在第二代的基础上对主要有效成分银杏黄酮和银杏内酯进行定性控制，但无有害成分银杏酸含量标示；***控制有效成分银杏黄酮在24％以上，银杏内酯在6％以上，有害成分银杏酸控制在10ppm以下；第五代控制有效成分总黄酮在44％以上，黄酮苷在24％以上，银杏内酯在6％以上，有害成分银杏酸控制在5ppm以下。中国药典2010版要求银杏叶提取物中含总黄酮醇苷不得少于24％，含总内酯不得少于6％，银杏酸含量小于10ppm；美国药典对此的要求是含总黄酮醇苷为22～27％，含总内酯为5.4～12％，银杏酸含量小于10ppm；德国药典对此要求是总黄酮醇苷为22～27％，含内酯为5～7％，银杏酸含量小于10ppm。由此可见，控制好总黄酮醇苷、总内酯和银杏酸的含量是银杏叶提取物质量的关键因素。

已经报道的银杏叶提取物的现有工艺技术有微波提取法，超临界萃取法等。现有技术中大多数只关注提取物的纯化，追求有效成分的高含量，忽视了有害成成分银杏酸的含量控制，在临床使用中容易引发不良反应。为了解决此问题，有少数报道提出增加有效成分含量，降低有害成分含量的银杏叶提取物，但是提取工艺繁琐，还有的需要用到葡聚糖凝胶等高贵填料，无法实现工业化大生产。其次，目前有效成分只聚焦于银杏黄酮醇苷和萜类内酯，而文献报道二苯乙烯类成分具有抗氧化、降低血脂等功效，对心血管具有良好的保护作用，有可能是银杏提取物治疗心脑血管疾病的另一大类活性成分。而目前所有报道的文献专利均未控制其中3，3′-二甲氧基-4，4′-二羟基二苯乙烯的含量。

发明内容

本发明的目的是提供一种低酸高品质银杏叶提取物的制备方法，通过该提取方法得到的银杏叶提取物，显著提高活性成分银杏总黄酮醇苷、总内酯的含量，降低有害成分银杏酸的含量，以更好的满足药物的临床需要；首次对银杏叶提取物中的二苯乙烯类成分进行了定量控制，以更好的控制产品质量。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

一种低酸高品质银杏叶提取物的制备方法，该方法包括以下步骤：

a)将干燥银杏叶粉碎至过20～30目筛，用质量百分比浓度为65～85％乙醇加热回流提取，过滤，滤液浓缩至稠膏；

b)在上述稠膏中加入银杏叶重量3～6倍的水，搅匀，冷藏静置24～48h，离心，得上清液；

c)将制得的上清液，以每克树脂加入1.5～2.5ml上清液的比例，通过混合树脂组成的离子交换柱，先用水洗涤，再用质量百分比浓度为55～70％的乙醇洗脱，收集55～70％乙醇洗脱液，将洗脱液浓缩，得浓缩液；其中，混合树脂为大孔吸附树脂与聚酰胺树脂按照4∶1～9∶1的重量比组成；优选大孔吸附树脂与聚酰胺树脂按照6∶1～9∶1的重量比组成。

d)向所得浓缩液中加入水和低极性有机溶剂作为萃取溶剂，萃取2～3次，有机层弃去，水相液浓缩，得浓缩液；干燥浓缩液，得银杏叶提取物。

所述的大孔吸附树脂优选为DM130、AB-8或D101型；所述的萃取溶剂为浓缩液体积1～3倍的水和1～3倍的低极性有机溶剂，其中，低极性有机溶剂为***、氯仿、环己烷或正己烷，优选环己烷或正己烷。采用水洗涤时用量为3～4倍柱体积，乙醇洗脱时用量12～16倍柱体积，洗脱速度为20～30ml/min。所述的干燥浓缩液方式为喷雾干燥或真空干燥。

本发明所制备的高品质银杏叶提取物中总黄酮含65％以上(银杏叶提取物中含35％以上的黄酮醇苷)，总萜类内酯含10％以上，3，3′-二甲氧基-4，4′-二羟基二苯乙烯含量达0.05％以上，银杏酸含量低于2ppm。在步骤a)中回流提取的次数可为1～3次，每次提取时间为1～2小时，每次乙醇用量为银杏叶干重的6～14倍。优选回流提取3次，每次提取时间为1～2小时，三次乙醇用量范围分别为银杏叶干重的12～14倍(第一次)，10～12倍(第二次)，6～8倍(第三次)。提取后浓缩得到的稠膏在60℃时相对密度为1.15～1.25。上述银杏叶提取物成分所指的“％”均为质量百分含量。

关键工艺参数的主要筛选过程如下：

试验1、考察了不同类型大孔吸附树脂富集纯化银杏叶提取物的效果。

取7份1kg的干燥银杏叶，分别粉碎过20～30目筛，用75％乙醇加热回流提取三次，每次时间分别均是1.5小时，三次乙醇用量范围是：分别为银杏叶干重的14倍，10倍，8倍，提取液合并，滤过，减压浓缩至60℃时相对密度为1.15～1.25的稠膏后，加干燥银杏叶3倍量水，充分搅匀，4℃冷库冷藏静置48小时后，离心，上清液分别过不同的大孔树脂柱，先用4倍柱体积的蒸馏水洗涤，再分别用6倍柱体积质量百分比浓度为55％的乙醇和8倍柱体积70％的乙醇按20ml/min速度洗脱，合并洗脱液，洗脱液浓缩，喷雾干燥，即得。

结果如表1所示：

表1

通过对比试验，发现不同的大孔吸附树脂对银杏黄酮和内酯的纯化效果存在差异，以D101、AB-8和DM130型效果最好，但是有害成分银杏酸的含量均较高，还需进一步纯化。试验2、考察在大孔吸附树脂中加入聚酰胺树脂来除去银杏酸：提取纯化步骤同试验1，仅改变纯化使用的按照不同比例装柱的混合树脂柱，按照2010版中国药典方法测定提取物中银杏酸的含量。不同比例的混合树脂柱纯化后银杏酸的含量变化结果如表2所示：

表2

结果发现：大孔吸附树脂与聚酰胺树脂组成比例必须达到一定的数值才能在富集纯化有效成分的同时，尽可能多的去除有害成分银杏酸，当两者组成重量比例在4∶1～9∶1之间(优选两者组成重量比例在6∶1～9∶1之间)时，能使银杏酸的含量降至10ppm左右，达到要求，而其他有效成分的含量没有明显变化。但是银杏酸含量仍旧偏高，需要探索进一步纯化。

试验3、树脂洗脱浓缩液采用低极性有机溶剂萃取，筛选不同的有机溶剂：提取纯化步骤同试验1，纯化使用的混合树脂为DM130大孔树脂和聚酰胺树脂按照重量比4∶1装柱，得到的洗脱液浓缩，再分别用表3所示浓缩液体积2倍低极性有机溶剂和浓缩液体积2倍的水萃取，有机层弃去，水相浓缩，喷雾干燥，即得。按照2010版中国药典测定提取物中银杏酸的含量。结果如表3所示：

表3

混合树脂洗脱液的浓缩液，再经低极性有机溶剂萃取，可以确保银杏酸含量显著降低，特别是环己烷和正己烷将银杏酸含量纯化至2ppm以下。

与现有技术比较本发明的有益效果：相对于现有技术来说，大多采用先大孔吸附树脂再聚酰胺的工艺，操作麻烦，同时不能确保最终产品中银杏酸的含量是否最低。本发明所采用的提取工艺步骤少，并且未采用毒性大的有机试剂，所制备的提取物更容易达到临床要用的要求。首次对3，3′-二甲氧基-4，4′-二羟基二苯乙烯含量进行了定量控制；有害成分银杏酸含量可控制在2ppm以下，有效成分富集提取率高；具有提取、除杂、纯化、萃取、柱层析富集纯化等过程符合工业大生产要求，工艺路线更加合理的优点。本发明的低酸高品质银杏叶提取物可以作为不同类型银杏叶制剂的优质原料来源。

具体实施方式

下面以具体实施例对本发明作详细说明，所涉及到的方法是本领域的技术人员能够掌握和应用的技术手段，但本发明不限于所述实施例。

以下实例以银杏叶为原料。秋季银杏叶尚绿时采摘，除去杂质，阴干。选用的银杏叶中总黄酮醇苷含量0.85％以上，总萜类内酯含量0.25％以上。

实施例1：

干燥银杏叶1kg，粉碎至过20目筛，用质量百分比为70％乙醇回流提取三次，第一次加干燥银杏叶重量14倍量醇，提取1小时，第二、三次分别加干燥银杏叶重量12、8倍量醇，均提取1.5小时，合并提取液，滤过，减压回收乙醇，浓缩至稠膏(60℃时相对密度1.15)。加入干燥银杏叶重量3倍量的水，充分搅匀，于4℃冷库静置48小时，离心，得上清液。以每克树脂加入2ml上清液的比例，通过由混合树脂组成的离子交换柱(其中大孔吸附树脂DM130与聚酰胺树脂的装柱比为9∶1)，装柱径高比为1∶6。先用4倍柱体积蒸馏水洗涤，再分别用6倍柱体积质量百分比浓度为55％的乙醇和8倍柱体积70％的乙醇按20ml/min速度洗脱，合并洗脱液，减压回收乙醇，得浓缩液。加入浓缩液体积3倍的水和1倍体积的环己烷，萃取2次，有机层弃去，水相减压浓缩，浓缩液于60℃以下真空干燥，得约12g银杏叶提取物，银杏叶提取物干粉得率为1.2％。按照中国药典2010版银杏叶提取物含量测定方法，测得总黄酮含量为：66.5％(其中黄酮醇苷含量为45.1％)，总内酯的含量为11.5％，3，3′-二甲氧基-4，4′-二羟基二苯乙烯的含量为0.07％，银杏酸的含量为2ppm。

实施例2：

干燥银杏叶5kg，粉碎至过20目筛，用质量百分比为80％乙醇回流提取三次，第一次加干燥银杏叶重量12倍量醇，提取2小时，第二、三次分别10、6倍量，均提取1.5小时，合并提取液，滤过，减压回收乙醇，浓缩至稠膏(60℃时相对密度1.17)。加入5倍叶重量的水，充分搅匀，于冷库静置24小时，离心，得上清液。以每克树脂加入2.5ml上清液的比例，通过已经处理好的由混合树脂组成的离子交换柱(其中大孔吸附树脂AB-8与聚酰胺树脂的装柱比为8∶1)，装柱径高比为1∶7。先用4倍柱体积蒸馏水洗涤，再分别用6倍柱体积质量百分比浓度为55％的乙醇和8倍柱体积65％的乙醇以30ml/min速度洗脱，合并洗脱液，减压回收乙醇，得浓缩液。加入浓缩液体积2倍的水和1倍体积的***，萃取3次，有机层弃去，水相减压浓缩，浓缩液喷雾干燥，得约51g银杏叶提取物，银杏叶提取物干粉得率为1.02％。按照中国药典2010版银杏叶提取物含量测定方法，测得总黄酮含量为：66.8％(其中黄酮醇苷含量为44.6％)，总内酯的含量为11.8％，3，3′-二甲氧基-4，4′-二羟基二苯乙烯的含量为0.06％，银杏酸的含量为5ppm。

实施例3：

干燥银杏叶50kg，粉碎过20目筛，用质量百分比为85％乙醇回流提取三次，第一次加干燥银杏叶重量13倍量醇，提取1.5小时，第二、三次分别11、7倍量，均提取1小时，合并提取液，滤过，减压回收乙醇，浓缩至稠膏(60℃时相对密度1.20)。加入5倍叶重量的水，充分搅匀，于冷库静置48小时，离心，得上清液。以每克树脂加入2ml上清液的比例，通过已经处理好的由混合树脂组成的离子交换柱(其中大孔吸附树脂D101与聚酰胺树脂的装柱比为9∶1)，装柱径高比为1∶5。先用3倍柱体积蒸馏水洗涤，再分别用6倍柱体积质量百分比浓度为55％的乙醇和8倍柱体积65％的乙醇以25ml/min速度洗脱，合并洗脱液，减压回收乙醇，得浓缩液。加入浓缩液体积2倍的水和2倍体积的正己烷，萃取2次，有机层弃去，水相减压浓缩，浓缩液喷雾干燥，得约580g银杏叶提取物，干粉得率为1.16％。按照中国药典2010版银杏叶提取物含量测定方法，测得总黄酮含量为：67.0％(其中黄酮醇苷含量为43.5％)，总内酯的含量为11.3％，3，3′-二甲氧基-4，4′-二羟基二苯乙烯的含量为0.07％，银杏酸的含量为1ppm。

实施例4：

干燥银杏叶10kg，粉碎至过30目筛，用质量百分比65％乙醇回流提取三次，第一次加干燥银杏叶重量14倍量醇，提取2小时，第二、三次分别10、6倍量，均提取1小时，合并提取液，滤过，减压回收乙醇，浓缩至稠膏(60℃时相对密度1.25)。加入6倍叶重量的水，充分搅匀，于4℃冷库静置36小时，离心，得上清液。以每克树脂加入2.5ml上清液的比例，通过已经处理好的由混合树脂组成的离子交换柱(其中大孔吸附树脂DM130与聚酰胺树脂的装柱比为4∶1)，装柱径高比为1∶8。先用4倍柱体积蒸馏水洗涤，再分别用6倍柱体积质量百分比浓度为55％的乙醇和8倍柱体积70％的乙醇以20ml/min速度洗脱，合并洗脱液，减压回收乙醇，得浓缩液。加入浓缩液体积1倍的水和3倍体积的氯仿，萃取3次，有机层弃去，水相减压浓缩，浓缩液于60℃以下真空干燥，得约106g银杏叶提取物，干粉得率为1.06％。按照中国药典2010版银杏叶提取物含量测定方法，测得总黄酮含量为：66.2％(其中黄酮醇苷含量为44.7％)，总内酯的含量为10.9％，3，3′-二甲氧基-4，4′-二羟基二苯乙烯的含量为0.06％，银杏酸的含量为5ppm。

实施例5：

干燥银杏叶10kg，粉碎至过20目筛，用质量百分比65％乙醇回流提取三次，第一次加干燥银杏叶重量12倍量醇，提取1.5小时，第二、三次分别10、6倍量，均提取1小时，合并提取液，滤过，减压回收乙醇，浓缩至稠膏(60℃时相对密度1.25)。加入4倍叶重量的水，充分搅匀，于4℃冷库静置36小时，离心，得上清液。以每克树脂加入2.5ml上清液的比例，通过已经处理好的由混合树脂组成的离子交换柱(其中大孔吸附树脂DM130与聚酰胺树脂的装柱比为7∶1)，装柱径高比为1∶8。先用3倍柱体积蒸馏水洗涤，再分别用7倍柱体积质量百分比浓度为55％的乙醇和9倍柱体积70％的乙醇以20ml/min速度洗脱，合并洗脱液，减压回收乙醇，得浓缩液。加入浓缩液体积1倍的水和3倍体积的环己烷，萃取3次，有机层弃去，水相减压浓缩，浓缩液于60℃以下真空干燥，得约108g银杏叶提取物，干粉得率为1.08％。按照中国药典2010版银杏叶提取物含量测定方法，测得总黄酮含量为：67.0％(其中黄酮醇苷含量为44.9％)，总内酯的含量为11.5％，3，3′-二甲氧基-4，4′-二羟基二苯乙烯的含量为0.07％，银杏酸的含量为1ppm。

实施例6：

干燥银杏叶5kg，粉碎至过30目筛，用质量百分比为75％乙醇回流提取二次，第一次加干燥银杏叶重量12倍量醇，提取2小时，第二次10倍量醇，提取1.5小时，合并提取液，滤过，减压回收乙醇，浓缩至稠膏(60℃时相对密度1.17)。加入3倍叶重量的水，充分搅匀，于冷库静置24小时，离心，得上清液。以每克树脂加入2ml上清液的比例，通过已经处理好的由混合树脂组成的离子交换柱(其中大孔吸附树脂AB-8与聚酰胺树脂的装柱比为4∶1)，装柱径高比为1∶6。先用蒸4倍柱体积馏水洗涤，再分别用6倍柱体积质量百分比浓度为55％的乙醇和8倍柱体积70％的乙醇以30ml/min速度洗脱，合并洗脱液，减压回收乙醇，得浓缩液。加入浓缩液体积2倍的水和1倍体积的***，萃取3次，有机层弃去，水相减压浓缩，浓缩液喷雾干燥，得约51.5g银杏叶提取物，银杏叶提取物干粉得率为1.03％。按照中国药典2010版银杏叶提取物含量测定方法，测得总黄酮含量为：66.6％(其中黄酮醇苷含量为42.5％)，总内酯的含量为10.9％，3，3′-二甲氧基-4，4′-二羟基二苯乙烯的含量为0.06％，银杏酸的含量为5ppm。

实施例7：

干燥银杏叶50kg，粉碎至过20目筛，用质量百分比为65％乙醇回流提取三次，第一次加干燥银杏叶重量14倍量醇，提取1.5小时，第二、三次分别10、8倍量，均提取1小时，合并提取液，滤过，减压回收乙醇，浓缩至稠膏(60℃时相对密度1.25)。加入3倍叶重量的水，充分搅匀，于冷库静置48小时，离心，得上清液。以每克树脂加入1.5ml上清液的比例，通过已经处理好的由混合树脂组成的离子交换柱(其中大孔吸附树脂D101与聚酰胺树脂的装柱比为4∶1)，装柱径高比为1∶7。先用4倍柱体积蒸馏水洗涤，再分别用5倍柱体积质量百分比浓度为55％的乙醇和7倍柱体积70％的乙醇以25ml/min速度洗脱，合并洗脱液，减压回收乙醇，得浓缩液。加入浓缩液体积2倍的水和2倍体积的环己烷，萃取3次，有机层弃去，水相减压浓缩，浓缩液减压真空干燥，得约600g银杏叶提取物，干粉得率为1.2％。按照中国药典2010版银杏叶提取物含量测定方法，测得总黄酮含量为：66.9％(其中黄酮醇苷含量为43.7％)，总内酯的含量为11.1％，3，3′-二甲氧基-4，4′-二羟基二苯乙烯的含量为0.06％，银杏酸的含量为1ppm。

Claims (8)

1.一种银杏叶提取物的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

a）将干燥银杏叶粉碎至过20～30目筛，用质量百分比浓度为65～85%的乙醇加热回流提取，过滤，滤液浓缩至稠膏；

b）在上述稠膏中加入银杏叶重量3～6倍的水，冷藏静置24～48h，离心，得上清液；

c）将制得的上清液，以每克树脂加入1.5～2.5ml上清液的比例，通过混合树脂组成的离子交换柱，先用水洗涤，再用质量百分比浓度为55～70%的乙醇洗脱，收集55～70%乙醇洗脱液，将洗脱液浓缩，得浓缩液；其中，混合树脂为大孔吸附树脂与聚酰胺树脂按照4：1～9：1的重量比组成；大孔吸附树脂为DM130、AB-8或D101型；

d）向所得浓缩液中加入水和低极性有机溶剂作为萃取溶剂，萃取2～3次，有机层弃去，水相液浓缩，得浓缩液；干燥浓缩液，得银杏叶提取物。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤a）中所述的稠膏在60℃时相对密度为1.15～1.25。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤c）中混合树脂为大孔吸附树脂与聚酰胺树脂按照6：1～9：1的重量比组成。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤d）中所述的萃取溶剂为浓缩液体积1～3倍的水和1～3倍的低极性有机溶剂，其中，低极性有机溶剂为***、氯仿、环己烷或正己烷。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤d）中所述的低极性有机溶剂为环己烷或正己烷。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的干燥为喷雾干燥或真空干燥。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所制备的银杏叶提取物中总黄酮含65%以上，总萜类内酯含量含10%以上，3，3′-二甲氧基-4，4′-二羟基二苯乙烯含量达0.05%以上，银杏酸含量低于2ppm。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在银杏叶提取物中含35%以上的黄酮醇苷。