CN102132772A - 聚β-羟基丁酸酯对卤虫幼体的强化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种聚β-羟基丁酸酯对卤虫幼体的强化方法,其特征在于:聚β-羟基丁酸酯强化卤虫幼体时,聚β-羟基丁酸酯浓度为100mg/L,强化时间为24h,聚β-羟基丁酸酯的颗粒大小为10~50μm。本发明使用的β-羟基丁酸酯(PHB)是具有广泛应用前景的可替代抗生素的生物控制剂,目前针对其在水产养殖中应用的研究在国内尚处于起步阶段,国内尚属首次。本发明给出了不同浓度PHB和不同强化培养时间对卤虫成活率和生长的影响,得出以100mg/L PHB浓度强化卤虫幼体24h效果最佳,本发明对PHB在水产育苗中的应用研究具有很好的指导意义。
Description
技术领域
本发明属于水产养殖领域,尤其是一种聚β-羟基丁酸酯对卤虫幼体的强化方法。
背景技术
抗生素在一定程度上可以预防和控制水产动物细菌病的流行,但不加选择地滥用抗生素不仅可使细菌产生多重抗药性,而且还会造成水产动物免疫机能下降、体内微生物菌群失调和药物残留等问题。短链脂肪酸具有抑菌、降低动物肠道pH和促进营养物质吸收利用等广泛的生理功能,是一种具有应用前景的生物活性物质和饲料添加剂。聚β-羟基丁酸酯(Poly-β-hydroxybutyrate,PHB)是短链脂肪酸β-羟基丁酸的聚合体,为一定粒度的脂溶性颗粒(直径0.2~0.5μm)。一些细菌在碳过量和氮缺乏等营养胁迫时,可大量积累PHB作为碳源和能量储备。PHB在动物肠道内可通过酶解和化学水解的方式,降解为β-羟基丁酸单体。PHB的疏水特性可减少挥发性SCFA对水质的破坏作用,适于在水产育苗和养殖中的应用。研究表明,在养殖水体中加入PHB颗粒或者积累PHB的细菌,可完全保护感染发光弧菌(Vibrio campbellii)的卤虫。最近发现饲料中添加PHB具有促进欧洲鲈鱼(Dicentrarchus labrax)生长的作用。目前还没有将PHB应用于水产经济动物育苗的报道。
发明内容
本发明提供了一种聚β-羟基丁酸酯对卤虫幼体的强化方法,发现以100mg/L PHB浓度强化卤虫幼体24h效果最佳,本发明对PHB在水产育苗中的应用研究具有很好的指导意义。
为实现上述发明目的,本发明采用以下技术方案:
一种聚β-羟基丁酸酯对卤虫幼体的强化方法,其特征在于:聚β-羟基丁酸酯强化卤虫幼体时,聚β-羟基丁酸酯浓度为100mg/L,强化时间为24h,聚β-羟基丁酸酯的颗粒大小为10~50μm。
而且,所述聚β-羟基丁酸酯采用超声波处理法将PHB颗粒分散成均匀,粒度为10~50μm的悬浮液。
本发明具有如下优点和积极效果是:
1、本发明使用的β-羟基丁酸酯(PHB)具有广泛应用前景的可替代抗生素的生物控制剂,目前针对其在水产养殖中应用的研究在国内尚处于起步阶段,国内尚属首次。本发明给出了不同浓度PHB和不同强化培养时间对卤虫成活率和生长的影响,得出以100mg/L PHB浓度强化卤虫幼体24h效果最佳,本发明对PHB在水产育苗中的应用研究具有很好的指导意义。
2、本发明的方法中采用超声波处理法将PHB颗粒分散成均匀的、平均粒度30μm(10~50μm)的悬浮液,PHB可以被有效包裹于卤虫消化道,较小的颗粒更有利于卤虫摄食,且更容易降解为水溶性β-羟基丁酸单体,从而被卤虫所利用。
附图说明:
图1为本发明PHB浓度标准曲线
图2-1-4为本发明PHB强化48h卤虫和饥饿48h卤虫的相差显微照片(图2-1和图2-2)和经过尼罗蓝A染色后的荧光显微照片(图2-3和图2-4);
图3为本发明试验1中不同浓度PHB强化培养卤虫的成活率;
图4为本发明试验1中不同浓度PHB强化培养72h的卤虫体长;
图5为本发明试验2中不同浓度PHB强化培养卤虫的成活率;
图6为本发明试验2中不同浓度PHB强化培养72h的卤虫体长;
图7为本发明经过不同时间强化培养的卤虫体内PHB含量(占卤虫干重)。
具体实施方式
下面结合实施例,对本发明进一步说明,下述实施例是说明性的,不是限定性的,不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
卤虫强化是利用其非选择性滤食的特点,将一定大小的颗粒状物质包裹于卤虫消化道内,水产幼苗通过捕食卤虫而间接地将被包裹物摄入体内,既达到输送营养物质的目的,又可避免这些物质直接加入水中所造成的浪费和水质污染。
一种聚β-羟基丁酸酯对卤虫幼体的强化方法,通过以下实验证明得到卤虫强化的最佳方法。
实验1中PHB浓度分别设定为0,50,100,200,400和800mg/L,探索PHB强化卤虫的最佳浓度范围;在此基础上,实验2中PHB浓度分别设定为50,100,150和200mg/L,试验PHB强化卤虫的最佳浓度。小球藻(5×106cell/mL)投喂作为对照组。每组设置3个平行样。
PHB悬浮母液的配制
称取一定量的PHB粉末于50mL塑料离心管中,加入45mL海水(盐度为30)。将离心管置于超声波处理器中处理5min,使其中的PHB分散均匀,颗粒直径为10~50μm。
卤虫幼体的孵化和PHB强化
试验用卤虫卵来源于我国新疆艾比湖。卤虫卵的孵化条件如下:海水(盐度为30),pH范围8~9,温度28℃,水表面光强为2000lux,连续充气。孵化24h后,分离并收集无节幼体。将100个初孵卤虫无节幼体转入装有200mL海水的锥形玻璃管中,向其中加入不同剂量PHB悬浮母液,使锥形管中PHB达到试验设计浓度,连续培养72h。强化培养条件同卤虫卵孵化条件。试验期间每天换水100%,pH维持在8.30~8.45,溶解氧DO>6mg/L。
卤虫成活率和体长的测定
每天换水的同时,分别记录24h,48h和72h各组卤虫的成活率。试验结束时(72h),每组取10~20只卤虫,在立体解剖镜(Nikon SMZ645)下测定卤虫体长,并计算平均值。数据处理采用CCD图像采集***和Imganaly计算机图像处理软件(济南维纳仪器有限公司提供)。
强化卤虫体内PHB积累的荧光显微观察
尼罗蓝A是一种碱性嗪类颜料,溶于水和乙醇。经过尼罗蓝A染色的PHB颗粒在荧光显微镜下呈现亮橘黄色光斑,而细胞膜和其它脂类物质由于不能与染料有效结合,仅呈现较暗的红色。本实验参照细菌中PHB颗粒的荧光染色法,经PHB强化培养48h的卤虫经过1%尼罗蓝A染色1h,将卤虫取出固定,在543nm波长的荧光激发下,在显微镜下(Nikon Eclipse Ti)观察强化卤虫体内的PHB积累情况。
强化卤虫体内PHB含量的测定
卤虫体内PHB含量参照细菌中PHB的紫外光谱测定,方法参考陈玲,李礼尧,王武.聚β-羟丁酸酯紫外检测方法的改进[J].无锡轻工大学学报,1997,16(2):27-31,或KAYNAR P,BEYATLI Y.Determination of poly-β-hydroxybutyrate production by Bacillus spp.isolated from the intestines of various fishes[J].Fish Sci,2009,75(2):439-443。PHB在浓硫酸溶液中加热可以定量转化为巴豆酸,后者在235nm处有一吸收峰值。该测定方法排除了其它脂类的干扰,与细胞内的总脂含量无关。
绘制PHB标准曲线:精确称取0.0100g PHB溶于适量的氯仿中(Mettler,AL204),60℃水浴1h后,100℃蒸去氯仿,加入10mL浓硫酸配成PHB母液。分别精确移取10,20,30,40和50μL PHB母液于比色管中,加入10mL浓硫酸,使浓硫酸溶液中PHB含量分别为1,2,3,4和5μg/mL。将比色管置于100℃水浴10min,冷却后,用紫外分光光度计(Pgeneral T6)于235nm下测定吸光值,浓硫酸为空白对照。所得标准曲线如图1所示,回归方程为y=0.128x+0.019(R2=0.984)。
卤虫卵孵化24h后,收集卤虫无节幼体。将一定量的卤虫无节幼体迅速转入装有1000mL海水的锥形玻璃管中。卤虫无节幼体密度为300个/mL,以100mg/L PHB浓度进行强化,强化条件同前。分别于6h,12h,21h和24h时取出200mL强化培养液,终止强化。用100目筛绢收集卤虫,并用自来水反复冲洗,以去除卤虫体外附着的PHB颗粒,于-18℃冰箱中冷冻保存。未经PHB强化的卤虫(0h)作为对照。待全部样品收集完成后,将样品于60℃烘箱中干燥3h,得到卤虫干品。
精确称取0.0100g卤虫干品于比色管中,向比色管中加入5mL氯仿,60℃下水浴抽提1h,在100℃下蒸去氯仿。再向比色管中加入5mL氯仿,取30μL PHB氯仿溶液于干净比色管中,蒸干氯仿后,加入5mL浓硫酸,100℃水浴10min,冷却,于235nm下测定吸光值,浓硫酸为空白对照。根据标准曲线,计算出卤虫中PHB的含量:
式中:a为标准曲线中查到的PHB浓度(μg/mL)
数据统计分析
采用SPSS 17.0软件对实验数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)。所有数据在进行显著性差异检验之前,用Levene’s法检验均匀性,如果均匀性不好,则将数据转化成对数或平方根后再进行分析。Tukey’s multiple range test用来检验显著性差异(P<0.05)。
结果
图2-1和图2-2表示,在可见光下,未经尼罗蓝A染色,饥饿48h的卤虫幼体肠道透明,而PHB强化48h的卤虫肠道饱满。由图2-3和2-4可以看出,543nm波长绿色荧光激发下,经尼罗蓝A染色,48h饥饿卤虫的肠道呈暗黑色,而PHB强化48h的卤虫肠道显示出亮橘黄色条带,说明卤虫能够对PHB进行有效的生物包裹。
本发明得出强化卤虫的最适PHB浓度和时间分别为100mg/L和24h,10~50μm颗粒的更有利于卤虫摄食,且更容易降解为水溶性β-羟基丁酸单体,从而被卤虫所利用。使其中的PHB分散均匀,颗粒直径为10~50μm。
Claims (2)
1.一种聚β-羟基丁酸酯对卤虫幼体的强化方法,其特征在于:聚β-羟基丁酸酯强化卤虫幼体时,聚β-羟基丁酸酯浓度为100mg/L,强化时间为24h,聚β-羟基丁酸酯的颗粒大小为10~50μm。
2.根据权利要求1所述的聚β-羟基丁酸酯对卤虫幼体的强化方法,其特征在于:所述聚β-羟基丁酸酯采用超声波处理法将PHB颗粒分散成均匀,粒度为10~50μm的悬浮液。
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