CN102124024A - 糖蛋白质的制造方法以及筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的为提供制造除了血中半衰期等基于糖链的功能外,生理活性也为一致的糖蛋白质(glycoprotein),亦即,氨基酸序列、糖链结构以及高阶结构(higher-order structure)均为一致的糖蛋白质的方法。本发明提供制造氨基酸序列、糖链结构以及高阶结构为一致的糖蛋白质的方法,包含以下步骤(a)至(c):(a)使氨基酸序列及糖链为一致的糖蛋白质折叠(folding)的步骤;(b)使前述所折叠的糖蛋白质通过柱层析而进行区分(fractionating)的步骤;以及(c)将具有既定活性的区分(fraction)回收的步骤。
Description
技术领域
本发明为涉及制造氨基酸序列、糖链结构以及高阶结构为一致的糖蛋白质的方法。
背景技术
近年来,进行糖蛋白质作为各种医药使用的研究。糖蛋白质的糖链部分具有附加对蛋白酶的耐性而使血中的代谢延缓的功能,以及作为掌管细胞内对小器官的输送的信号的功能等。因此,通过加成适当的糖链,可控制糖蛋白质的血中半衰期以及细胞内的输送。
作为糖链影响糖蛋白质的生理活性的代表例,可列举***(erythropoietin,亦即EPO)。此糖蛋白质为通过作用于红血球系前驱细胞,并促进其增殖、分化,而具有维持末梢血中红血球数目的功能的血球分化荷尔蒙。对EPO的糖链结构与生理活性的相关关系进行研究的结果可知,虽然于活体外(in vitro)即使不结合糖链也具有生理活性,但于活体内(in vivo)若无糖链则快速地由肾脏排出,无法获得充分的生理活性。
再者,糖蛋白质在糖链为不完全时、结合不同糖链时,会被辨识为血液中的巨噬细胞等,而由血中排出。
因此,使用糖蛋白质作为医药品时,期望于各蛋白质的相同位置均加成一致结构的糖链。
以往,糖蛋白质的制造方法,虽广泛使用将糖予以酵素加成于蛋白质的方法,但是于此方法中,无法加成一致的糖链,再者,加成糖链后也難以一致地实施修饰或整饰(trimming)。
再者,一般而言,蛋白质制剂虽是使用力价来评估,但即使是具有相同力价的制剂,也有时会包含糖链结构为杂乱不均者,造成血中半衰期为杂乱不均的,于质量管理方面成为问题。
本发明人们截至目前为止已开发以经脂溶性保护基保护氨基的氨基酸与糖链天门冬酰胺(asparagine)作为材料,而可较大量地制造具有一致的氨基酸序列与糖链的糖蛋白质的方法(例如参照专利文献1)。进一步地,已开发可维持充分的血中浓度的氨基化复合型糖链衍生物及糖蛋白质(参照专利文献2)。任一种的糖蛋白质皆期待作为医药品的有用性。
因此,为了作为医药品使用,而需要制造生理活性不会为杂乱不均的糖蛋白质,关于糖蛋白质的功能,不仅与氨基酸序列及糖链结构为有关,相信与蛋白质部分的高阶结构也有密切关联。
蛋白质的高阶结构为通过氨基酸残基间的氢键、离子键、疏水性相互作用、半胱氨酸残基间的S-S键等而使其安定化,多数的蛋白质具有各别固有的高阶结构。然而,S-S键以外的键为比较弱的键,通过比较温和的加热或加压等破坏高阶结构,使其生理活性降低、消失。此称为蛋白质的变性。再者,特别是在氨基酸链为长时,由于产生多个赋予能量极小点的结构,故有产生异常的高阶结构(错误折叠(misfolding))的情况。于此情况中,也已有蛋白质的活性会变化或消失的报告。
由于這些事实,一般而言,为了使蛋白质发挥功能而必须有正确的高阶结构,并认为若使蛋白质折叠,則会分成具有生理活性的正确折叠,以及不具有生理活性的错误折叠。
关于蛋白质的高阶结构与生理活性的关系虽然已有种种研究,但在人工合成的糖蛋白质中,截至目前为止未有关于糖链对于折叠与生理活性可赋予何种影响的报告。
本发明人们使用专利文献1的方法合成糖蛋白质片段,通过自然型化学连接法(Native Chemical Ligation,亦即NCL法)与其它的肽片段连结,合成单核细胞驱化性蛋白质-3(monocyte chemotactic protein-3)。使所合成的单核细胞驱化性蛋白质-3折叠后,使用胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)处理而确认双硫键的位置时,可知虽然约90%的糖蛋白质为双硫键形成在正确位置,但约10%則是双硫键形成在与通常不同的位置(非专利文献1)。
然而,于同文献中,不同的2种以上的糖蛋白质在折叠的状态下未分离。胰凝乳蛋白酶处理时,若也考虑双硫键再形成的可能性,則也无法否定不是发生2种以上的折叠,而只是胰凝乳蛋白酶处理的结果分成2种以上的可能性。因此,当然,也未探讨双硫键形成于正确位置的糖蛋白质与形成于不同于通常位置的糖蛋白质的生理活性的差异。
再者,在较常被研究功能与结构的糖蛋白质中,有属于包含于蛋白中的一种蛋白质的卵类粘蛋白(ovomucoid)。卵类粘蛋白为分子量约28,000的蛋白质,分子内具有3个功能域(domain),各功能域分别对于不同的蛋白酶具有抑制活性。特别是第3功能域,由于单独也会显示抑制活性,所以被详细地研究。截至目前为止,已有关于100种以上的来自鸟的第3功能域的结构的报告,通过X射线结晶解析也了解立体结构。
关于化学上所合成的卵类粘蛋白第3功能域的立体结构,例如已有通过NCL法,合成其肽骨架有改变的卵类粘蛋白第3功能域,并进行X射线结晶解析的报告(参照非专利文献2)。
再者,已有卵类粘蛋白第3功能域通过逐步合成(stepwise synthesis)法与NCL法合成,使其折叠,通过热安定性的解析,得到强烈暗示会正确折叠的结果的报告(参照非专利文献3)。
背景技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2004/005330号小册子
专利文献2:国际公开第2004/011036号小册子
非专利文献
非专利文献1:Yamamoto et al.,Journal of American Chemical Society,2008,130,501-510
非专利文献2:Batemen et al.,Journal of Molecular Biology(2001)305,839-849
非专利文献3:Lu et al.,Journal of American Chemical Society,1996,118,8518-8523
发明内容
《发明欲解决的技术问题》
但是,上述背景技术中,所合成的糖蛋白质未加成糖链,于糖蛋白质中,糖链对于折叠及生理活性造成的影响并不明确。
因此,本发明是以提供制造除了血中半衰期等基于糖链的功能外,生理活性也为一致的糖蛋白质,也就是氨基酸序列、糖链结构以及高阶结构均为一致的糖蛋白质的方法为目的。
再者,本发明是以提供由生理活性强度不同的多种糖蛋白质中选择具有既定活性的糖蛋白质的筛选方法,以及提供具有所期望活性的糖蛋白质混合物为目的。
《解决技术问题的技术方案》
本发明人们发现,在合成氨基酸序列与糖链结构为一致的卵类粘蛋白的的3功能域且使其折叠時,会再现性佳地获得以一定比率包含多种高阶结构的混合物。然后,将其分离且测定生理活性时,与以往的理解不同,确认到:具有同一种类的生理活性被认为是较高活性的程度的高阶结构为存在多种;虽然为较高活性,但依高阶结构而有活性差异;高阶结构不同的糖蛋白质可通过柱层析而各别分离、精制。
再者,发现具有既定活性的糖蛋白质以外者,使其展开后,若使其再度折叠,則可变换成以上述一定比率获得的高阶结构,因此,通过重复进行展开/折叠步骤,可以最大限度回收具有具既定活性的高阶结构的糖蛋白质。
也就是说,本发明提供:
一种方法,所述的方法为制造氨基酸序列、糖链结构及高阶结构为一致的糖蛋白质的方法,包含以下步骤(a)至(c):
(a)使氨基酸序列及糖链为一致的糖蛋白质折叠的步骤;
(b)使前述所折叠的糖蛋白质通过柱层析而进行区分的步骤;以及
(c)将具有既定活性的区分回收的步骤。
上述方法中,优选为:
在前述步骤(c)后,复包含
(d)使于前述步骤(c)未回收的区分中所包含的糖蛋白质展开的步骤;
(e)使前述所展开的糖蛋白质再度折叠的步骤;
(f)使前述再度折叠的糖蛋白质通过柱层析而进行区分,将具有前述既定活性的区分回收的步骤;以及
(g)根据需要而重复进行步骤(d)至(f)的步骤。
本发明再提供:
一种方法,所述的方法为筛选具有既定的生理活性的糖蛋白质的方法,包含以下步骤(i)至(iii):
(i)使氨基酸序列及糖链为一致的糖蛋白质折叠的步骤;
(ii)使前述所折叠的糖蛋白质通过柱层析而进行区分的步骤;以及
(iii)测定各区分的活性,判定是否具有既定的活性的步骤。
本发明再提供:
一种方法,所述的方法为获得具有所期望的生理活性的糖蛋白质混合物的方法,包含以下步骤(A)至(D):
(A)使氨基酸序列及糖链为一致的糖蛋白质折叠的步骤;
(B)使前述所折叠的糖蛋白质通过柱层析而进行区分的步骤;
(C)测定各区分的活性的步骤;以及
(D)求出用以获得所期望活性的各区分的混合比率,根据所述比率使各区分混合的步骤。
本发明的糖蛋白质的制造方法、糖蛋白质的筛选方法或获得具有所期望的生理活性的糖蛋白质混合物的方法中,优选为:
氨基酸序列及糖链为一致的糖蛋白质的至少一部分是通过包含为以下步骤(1)至(6)的方法所制造,
(1)使具有羟基的树脂的羟基,与经脂溶性保护基保护氨基的氨基酸的羧基或经脂溶性保护基保护氨基的糖链加成氨基酸的羧基,进行酯化反应的步骤;
(2)使前述脂溶性保护基脱离而形成游离氨基的步骤;
(3)使前述游离氨基,与经脂溶性保护基保护氨基的氨基酸的羧基或经脂溶性保护基保护氨基的糖链加成氨基酸的羧基,进行酰胺化反应的步骤;
(4)前述步骤(3)后,使前述脂溶性保护基脱离而形成游离氨基的步骤;
(5)将前述步骤(3)及(4)的步骤重复进行1次以上的步骤;以及
(6)将前述步骤(1)所形成的酯键以酸切断的步骤。
再者,在上述氨基酸序列及糖链为一致的糖蛋白质的制造方法中,优选为:
在前述氨基酸序列及糖链为一致的糖蛋白质的一部分是通过前述步骤(1)至(6)制造时,所述糖蛋白质复包含以下步骤(7):
(7)将于前述步骤(6)所得的糖蛋白质的一部分,与其它肽或糖肽,通过连接法而连结的步骤。
《发明的效果》
根据本发明的糖蛋白质的制造方法,由于会获得除了氨基酸序列、糖链结构以外,高阶结构也为一致的糖蛋白质,故可制造不仅血中半衰期及细胞内的输送不会发生杂乱不均,且一致地具有既定的生理活性的糖蛋白质。
再者,根据本发明的糖蛋白质的筛选方法,可从因高阶结构不同而于生理活性产生杂乱不均的糖蛋白质群中,选择一致地具有既定的生理活性的糖蛋白质。所述糖蛋白质由于糖链结构为一致的,故血中半衰期及细胞内的输送等基于糖链的功能也为一致的。
再者,根据本发明,可控制使糖蛋白质的混合物具有所期望活性。
根据本发明的這些效果,特别有利于糖蛋白质作为医药品使用的情况。
附图说明
图1是表明白鹇(silver pheasant)的卵类粘蛋白第3功能域(OMSVP3)与其化学合成所使用的片段(fragment)1至3的氨基酸序列。
图2是表明OMSVP3的化学合成所使用的片段1(硫酯体)。
图3是表明具有糖链的OMSVP3的化学合成所使用的片段2(硫酯体)。
图4是表明OMSVP3的化学合成所使用的片段3。
图5是表明片段1合成时于各阶段中的波长220nm的色谱图(chromatogram)。
图6是表明片段2合成时于各阶段中的波长220nm的色谱图。
图7是表明片段3合成时于各阶段中的波长220nm的色谱图。
图8是表明片段2及片段3通过NCL法连结的各阶段中的波长220nm的色谱图。
图9是表明片段2及3,与片段1通过NCL法连结的各阶段中的波长220nm的色谱图。
图10是表明使具有糖链的OMSVP3折叠后,通过HPLC分离时的波长220nm的色谱图。
图11是表明图10的区分B的NMR谱图(NMR spectrum)。
图12是表明图10的区分B的CD谱图。
图13是表明图10的各区分对于胰凝乳蛋白酶的抑制活性的测定结果。
图14是表明不具有糖链的OMSVP3的化学合成所使用的片段2’(硫酯体)。
图15是表明片段2’合成时于各阶段中的波长220nm的色谱图。
图16是表明片段2’及片段3通过NCL法连结的各阶段中的波长220nm的色谱图。
图17是表明片段2’及3,与片段1通过NCL法连结的各阶段中的波长220nm的色谱图。
图18是表明使不具有糖链的OMSVP3折叠后,通过HPLC分离时的波长220nm的色谱图。
图19是表明图18的区分F的NMR谱图。
图20是表明图18的区分F的CD谱图。
图21是表明图18的各区分对于胰凝乳蛋白酶的抑制活性的测定结果。
图22是表明区分F的标准曲线(calibration curve)。
图23是表明区分A至D对于胰凝乳蛋白酶的抑制率。
图24是表明区分A至D的IC50值。
图25是表明区分E至H对于胰凝乳蛋白酶的抑制率。
图26是表明区分E至H的IC50值。
图27是表明通过区分B的温度变化所得到的CD谱图。
图28是表明通过区分F的温度变化所得到的CD谱图。
图29是表明对于区分B在嗜热菌蛋白酶(Thermolysin)消化中的波长220nm的色谱图。
图30是表明对于区分B在嗜热菌蛋白酶消化后的肽片段的质量分析结果。
图31是表明对于区分F在嗜热菌蛋白酶消化中的波长220nm的色谱图。
图32是表明对于区分F在嗜热菌蛋白酶消化后的肽片段的质量分析结果。
图33是表明对于区分B通过嗜热菌蛋白酶消化所得到的双硫键的位置决定结果。
图34是表明对于区分F通过嗜热菌蛋白酶消化所得到的双硫键的位置决定结果。
图35是表明基质肽的标准曲线。
图36是表明基质肽的Michaelis-Menten plot图。
图37是表明基质肽的每单位时间的反应速度。
具体实施方式
以下,说明本发明的较佳实例。
本说明书中,「蛋白质」只要为多个氨基酸通过酰胺键结合者即可,并无特别限定,包含众所周知的蛋白质以及新颖的蛋白质与蛋白质改质体。优选实施方式中,根据本发明的制造方法所制得的糖蛋白质中的蛋白质部分,与天然型相同是通过酰胺键(肽键)使多个氨基酸结合。本说明书中的蛋白质是通过使其折叠而为具有可取得既定的高阶结构的长度者。
本说明书中,「蛋白质改质体」为使蛋白质进行天然或人工改质的化合物,关于這些方式的改质,例如可列举蛋白质的1个或多个氨基酸残基的烷基化、酰基化(例如乙酰基化)、酰胺化(例如蛋白质的C末端的酰胺化)、羧基化、酯形成、双硫键形成、糖基化(glycosylation)、脂质化(lipidation)、磷酸化、羟基化(hydroxylation)、标识成分的结合等。
又,本说明书中,用语「肽」在原则上虽与蛋白质以相同意义使用,但也有使用于指称蛋白质的一部分或未采取高阶结构的比较短的氨基酸链的情况。
本说明书中,「氨基酸」是以其最广泛的意义使用,不仅包含天然的氨基酸,例如丝氨酸(Ser)、天门冬酰胺(Asn)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Ler)、异亮氨酸(Ile)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)、甘氨酸(Gly)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)、苯基丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、脯氨酸(Pro),也包含如氨基酸突变体及衍生物的非天然氨基酸。此项技术领域者考虑此广泛的定义,可理解本说明书中的氨基酸可列举例如:L-氨基酸;D-氨基酸;氨基酸突变体及衍生物等经化学修式的氨基酸;正亮氨酸(norleucine)、β-丙氨酸、鸟氨酸(ornithine)等于活体内不会成为蛋白质构成材料的氨基酸;以及熟习此项技术者众所周知的具有氨基酸特性的化学合成的化合物等。非天然氨基酸的例子可列举α-甲基氨基酸(α-甲基丙氨酸等)、D-氨基酸、组氨酸类氨基酸(2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高碳组氨酸(homohistidine)、α-氟甲基-组氨酸以及α-甲基-组氨酸等)、侧链具有额外的亚甲基(methylene)的氨基酸(「高碳」氨基酸)及侧链中的羧酸官能基氨基酸经磺酸基取代的氨基酸(半胱磺酸等)。
优选实施方式中,利用本发明的制造方法所制得的糖蛋白质的蛋白质部分,是全部由在活体内作为蛋白质或糖蛋白质的槽成氨基酸而存在的氨基酸所構成。
本说明书中,「糖蛋白质」只要为在前述蛋白质加成至少1个糖链的化合物即可,并无特别限定,包含众所周知的糖蛋白质以及新颖的糖蛋白质。再者,本说明书中,用语「糖肽」在原则上虽与糖蛋白质以相同意义使用,但也有使用于指称糖蛋白质的一部分或在上述肽結合糖链者的情况。
优选实施方式中,利用本发明的制造方法所制得的糖蛋白质,为具有N结合型糖链或O结合型糖链的糖蛋白质,例如可列举***、白细胞介素(interleukin)、干扰素-β、抗体、单核细胞驱化性因子蛋白质-3(monocyte chemotactic protein-3,亦即MCP-3)、卵类粘蛋白(ovomucoid)蛋白质等肽的一部分或全部。
糖蛋白质中,糖链与蛋白值中的氨基酸残基,可为直接结合,也可为通过连结子(linker)而结合。糖链与氨基酸的结合部位并无特别限制,优选为在糖链的还原末端结合氨基酸。
糖链结合的氨基酸的种类并无特别限定,可与天然氨基酸、非天然氨基酸的任一种结合。从糖蛋白质与存在于活体内的糖蛋白质具有相同或类似结构的观点来看,糖链优选为以N结合型糖链的方式与Asn结合,或以O结合型糖链的方式与Ser或Thr结合。特别是N结合型的情况,根据本发明的制造方法所制得的糖蛋白质,优选为具有使糖链与Asn结合,在所述Asn的C末端侧以酰胺键(肽键)結合脯氨酸以外的氨基酸(X),且在所述X的C末端侧以酰胺键(肽键)結合Thr或Ser的结构(-糖Asn-X-Thr/Ser-)的糖蛋白质。在糖链与氨基酸为通过连结子结合时,从与联结子的结合容易性的观点来看,糖链结合的氨基酸优选为:天门冬氨酸或谷氨酸等分子内具有2个以上的羧基的氨基酸;赖氨酸、精氨酸、组氨酸、色氨酸等分子内具有2个以上氨基的氨基酸;丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸等分子内具有羟基的氨基酸;半胱胺酸等分子内具有硫醇基的氨基酸;或天门冬酰胺、谷氨酰胺等分子内具有酰胺基的氨基酸。特别是从反应性的观点来看,优选为天门冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱胺酸、天门冬酰胺或谷氨酰胺。
糖蛋白质中,在糖链与氨基酸为通过连结子结合时,作为连结子,可广泛使用所述技术领域中所使用者,例如可列举:
-NH-(CO)-(CH2)a-CH2-
(式中,a为整数,只要是不阻碍目的的连结子功能者,即无限定,优选为0至4的整数);
C1-10聚亚甲基;
-CH2-R3-
(此处,R3为从选自由烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、芳基、经取代的芳基、碳环基、经取代的碳环基、杂环基及经取代的杂环基所成群中的基使1个氢原子脱离所产生的基);等。
本说明书中,「糖链」除了包含单位糖(单糖及/或其衍生物)为2个以上相连的化合物以外,也包含由1个单位糖((单糖及/或其衍生物)所構成的化合物。這些糖链,可列举例如活体内所含有的单糖类及多糖类(polysaccharide)(葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、木糖、N-乙酰基葡糖胺(N-acetylglucosamine)、N-乙酰基半乳糖胺、唾液酸以及這些的复合物及衍生物),此外也可列举从经分解的多糖、糖蛋白质、蛋白聚糖(proteoglycan)、葡糖胺聚醣(glycosaminoglycan)、糖脂质等复合活体分子所分解或衍生的糖链等广范围者,但不以這些为限定。单位糖为2个以上相连时,各单位糖彼此间是通过糖苷键(glycoside bond)的脱水缩合而结合。糖链可为直链型或分支链型。
再者,本说明书中,「糖链」也包含糖链的衍生物,作为糖链的衍生物,例如可列举构成糖链的糖为具有羧基的糖(例如,C-1位被氧化而成为羧酸的醛糖酸(aldonic acid)(例如,D-葡萄糖被氧化的D-葡萄糖酸)、末端的C原子成为羧酸的糖羰酸(uronic acid)(D-葡萄糖被氧化的D-葡萄糖醛酸))、具有氨基或氨基的衍生物(例如经乙酰基化的氨基)的糖(例如,N-乙酰基-D-葡萄糖胺、N-乙酰基-D-半乳糖胺等)、具有氨基及羧基两者的糖(例如,N-乙酰基神经氨酸(唾液酸)、N-乙酰基胞壁酸等)、去氧化糖(例如,2-脱氧-D-核糖)、含硫酸基的硫酸化糖、含磷酸基的磷酸化糖等糖链,但不以這些为限定。
本发明的糖链,优选为于活体内作为复合糖质(糖蛋白质(或糖肽)、蛋白聚糖、糖脂质等)而存在的糖链,优选为于活体内作为糖蛋白质(或糖肽)而结合于蛋白质(或肽)的糖链之N-结合型糖链、O-结合型糖链等。O-结合型糖链结合的糖蛋白质中,是在肽的Ser或Thr以O-糖苷键结合N-乙烯基半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNAc)、木糖、海藻糖等,并于其再加成糖链。N结合型糖链,例如,可列举高甘露糖(high mantose)型、复合(complex)型、混成(hybrid)型,优选为复合型。
本发明中,优选的糖链,例如为下述式(4)表示的糖链。
[式中,R1及R2各自独立为氢原子或式(5)至(8)表示之基。]
本发明的糖蛋白质的制造方法,从考虑适用于医药品等的制造领域时可回避抗原性等问题的观点来看,优选的糖链,例如可列举:于人体内,与作为结合于蛋白质的糖蛋白质而存在的糖链(例如,FEBS LETTERS Vol.50,No.3,Feb.1975所揭露的糖链)具有相同结构的糖链(构成糖的种类及其结合样式为相同的糖链)或由這些的非还原端失去1个或多个个糖的糖链。
糖蛋白质中,糖链的加成数目,只要为1链以上即可,并无特别限定,从提供与存在于活体内的糖蛋白质为类似结构的糖蛋白质的观点来看,只要为与体内存在的糖蛋白质为相同程度的加成数目,即为更优选的。
本发明的糖蛋白质的制造方法中,使用氨基酸序列及糖链为一致的糖蛋白质。本发明中,所谓「糖蛋白质中糖链的结构为一致的」,是指糖蛋白质间比较时,肽中的糖链加成部位、构成糖链的各糖的种类、结合顺序以及糖间的结合样式,至少为90%以上,优选为95%以上,更优选为99%以上的糖链为相同的。
再者,本发明中,所谓「糖蛋白质中氨基酸序列为一致的」,是指糖蛋白质间比较时,蛋白质中的氨基酸种类、结合顺序及氨基酸间的结合样式为相同的。限制条件为:只要在使糖蛋白质折叠时具有既定的活性,則至少为90%以上,优选为95%以上,更优选为99%以上的糖蛋白质为相同的。
使用于本发明的氨基酸序列及糖链为一致的糖蛋白质,可于固相合成、液相合成、通过细胞而合成、将存在于天然者分离萃取的方法等此项技术领域中众所周知的肽制造方法中,组合并入糖链加成步骤而制造。关于糖链加成步骤所使用的糖链的制造方法,例如,可参照国际公开号WO03/008431、WO2004/058984、WO2004/008431、WO2004/058824、WO2004/070046、WO2007/011055等。
本发明的优选实施方式中,氨基酸及糖链为一致的糖蛋白质,至少其一部分为根据以下所示方法制造。以下所示方法,可参照WO2004/005330小册。
首先,(1)使具有羟基的树脂(resin)的羟基,与经脂溶性保护基保护氨基的氨基酸的羧基或经脂溶性保护基保护氨基的糖链加成氨基酸的羧基,进行酯化反应。此情况中,由于氨基酸的氨基是经脂溶性保护基所保护,故防止氨基酸彼此的自我缩合,使树脂的羟基与氨基酸的羧基之间发生酯化反应。
其次,(2)使步骤(1)所获得的酯的脂溶性保护基脱离而形成游离氨基,
(3)使上述游离氨基,与经脂溶性保护基保护氨基的氨基酸的羧基或经脂溶性保护基保护氨基的糖链加成氨基酸的羧基,进行酰胺化反应,
(4)在步骤(3)后,使脂溶性保护基脱离而形成游离氨基,
(5)必要时重复进行步骤(3)及(4)的步骤,由此而使所期望数目的氨基酸连接,可获得在所期望的位置加成有1个以上的糖链的糖蛋白质。又,作为糖链加成氨基酸,例如,可列举:在天门冬酰胺侧链的酰胺基的氮以N-糖苷键结合糖链而成的糖链天门冬酰胺、在丝氨酸或苏安酸侧链的羟基以O-糖苷键结合糖链而成的糖链丝氨酸或糖链苏氨酸。
步骤(5)所获得的糖蛋白质,一端与树脂结合,另一端具有游离氨基。因此,(6)通过将步骤(1)所形成的酯键以酸切断,可制造所期望的糖蛋白质。
作为固相树脂(resin),通常只要为固相合成中使用的树脂(resin)即可,例如,可使用Amino-PEGA resin(默克(Merck)公司制造)、Wang resin(默克公司制造)、HMPA-PEGA resin(默克公司制造)、Trt Chloride resin(默克公司制造)等。
再者,Amino-PEGA resin(树脂)与氨基酸之间也可存在连结子,作为這些连结子,例如,可列举4-羟基甲基苯氧基乙酸(HMPA)、4-(4-羟基甲基-3-甲氧基苯氧基)-丁基乙酸(HMPB)等。
作为脂溶性保护基,例如,可列举9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)基、叔丁基氧基羰基(Boc)基、烯丙基氧基羰基(Alloc)基等含有羰基的基,乙酰基(Ac)基等酰基、烯丙基、苄基等保护基,并不特别限定为這些。
若要导入脂溶性保护基,例如导入Fmoc基时,可通过加入9-芴基甲基-N-琥珀酰亚氨基碳酸酯(9-Fluorenylmethyl-N-succinimidylcarbonate)与碳酸氢钠并进行反应而导入。反应于0至50℃,优选为于室温,进行约1至5小时左右。
经脂溶性保护基保护的氨基酸,可使用将已知的氨基酸以上述方法保护者。再者,也可使用市售者。例如,可列举Fmoc-Ser、Fmoc-Asn、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Ile、Fmoc-Ala、Fmoc-Tyr、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys、Fmoc-Arg、Fmoc-His、Fmoc-Asp、Fmoc-Glu、Fmoc-Gln、Fmoc-Thr、Fmoc-Cys、Fmoc-Met、Fmoc-Phe、Fmoc-Trp、Fmoc-Pro。
作为酯化触媒,例如可使用1-(均三甲基苯基)磺酰基-3-硝基-1,2,4-***(1-mesitylenesulfonyl-3-nitro-1,2,4-triazole,亦即MSNT)、二环己基碳二亚胺(DCC)、1,3-二异丙基碳二亚胺(DIPCDI)等众所周知的脱水缩合剂。氨基酸与脱水缩合剂的使用比例,相对于前者1重量份,后者通常使用1至10重量份,优选为2至5重量份。
酯化反应,例如优选为将树脂装入固相柱,使用溶剂洗净此树脂,然后加入氨基酸的溶液而进行。作为洗净用溶剂,例如可列举二甲基甲酰胺(DMF)、2-丙醇、二氯甲烷等。作为溶解氨基酸的溶剂,例如可列举二甲基亚砜(DMSO)、DMF、二氯甲烷等。酯化反应宜为于0至50℃,优选为于室温,进行约10分钟至30小时左右,优选为15分钟至24小时左右。
此时,固相上未反应的官能基,优选为使用乙酸酐等进行乙酰基化而覆盖(capping)。
脂溶性保护基的脱离,例如可通过以碱处理而进行。作为碱,例如可列举哌啶、吗啉等。此时,优选为在溶剂的存在下进行。作为溶剂,例如可列举DMSO、DMF、甲醇等。
游离氨基与经脂溶性保护基保护氨基氮的任选的氨基酸的羧基的反应,优选为在活性化剂及溶剂的存在下进行。
作为活性化剂,例如,可列举二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺·盐酸盐(WSC/HCl)、叠氮磷酸二苯酯(diphenylphosphoryl azide,亦即DPPA)、羰基二咪唑(CDI)、氰基磷酸二乙酯(DEPC)、1,3-二异丙基碳二亚胺(DICPI)、六氟磷酸苯并***-1-基-氧基-三吡咯啶基鏻(PyBOP)、3-(二乙氧基磷酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮(DEPBT)、1-羟基苯并***(HOBt)、羟基琥珀酰亚胺(HOSu)、二甲基氨基吡啶(DMAP)、1-羟基-7-氮杂苯并***(HOAt)、3-羟基-4-酮基-3,4-二氢-5-氮杂苯并-1,2,3-三嗪(HODhbt)、羟基酞酰亚胺(HOPht)、五氟苯酚(pentafluorophenol,亦即Pfp-OH)、2-(1H-苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、O-(7-氮杂苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)、O-苯并***-1-基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)等。
活性化剂的使用量,相对于经脂溶性保护基保护氨基氮的任选氨基酸,宜为1至20当量,优选为1至10当量,更优选为1至5当量。
虽然仅以上述活性化剂亦可进行反应,但优选为并用作为辅助剂的胺。作为胺,例如,可使用二异丙基乙基胺(DIPEA)、N-乙基吗啉(NEM)、N-甲基吗啉(NMM)、N-甲基咪唑(NMI)等。辅助剂的使用量,相对于经脂溶性保护基保护氨基氮的任选氨基酸,宜为1至20当量,优选为1至10当量,更优选为1至5当量。
作为溶剂,例如可列举DMSO、DMF、二氯甲烷等。反应宜于0至50℃,优选于室温,进行约10分钟至30小时左右,优选为15分钟至24小时左右。此时,固相上未反应的官能基也优选为使用乙酸酐等进行乙酰基化而覆盖。脂溶性保护基的脱离,可依与上述同样方法进行。
从树脂(resin)切断肽链,优选为以酸进行处理。作为酸,例如可列举三氟乙酸(TFA)、氟化氢(HF)等。此时,由于从氨基酸所使用的脂溶性保护基以及树脂(resin)上的连结子有生成反应性高的阳离子种的情况,故为了将這些捕获,而优选为添加亲核性试剂。作为亲核性试剂,可列举三异丙基硅烷(TIS)、苯酚(phenol)、茴香硫醚(thioanisole)、乙烷二醇(ethahedithiol,亦即EDT)等。
氨基酸序列及糖链为一致的糖蛋白质,分成数个肽段(peptide block)或糖肽段,分别根据步骤(1)至(6)合成后,也可根据连接法连结而制造。
本说明书中的「连接法」,是以国际公开第96/34878号小册揭露的自然型化学连接法(Native Chemical Ligation,NCL法)为首,也包括对于包含非天然氨基酸或胺基酸衍生物的肽应用自然型化学连接法的情况。通过连接法,可制造在连结部位具有天然酰胺键(肽键)的蛋白质。
使用连接法的连结,虽然于肽-肽间、肽-糖肽间、糖肽-糖肽间的任一者中皆可进行,但必须为:连结的2个肽或糖肽的一者在N末端具有半胱氨酸残基,且另一者在C末端具有α羧基硫酯部分。
各肽或糖肽段,若要使其在N末端具有半胱氨酸残基,則例如在设计各肽或糖肽段时,只要于最终制造的糖蛋白质所包含的半胱氨酸残基的N末端侧进行分割即可。
在C末端具有α羧基硫酯部分的酞或糖肽段,可使用国际公开号WO96/34878揭露的方法等此项技术领域人员众所周知的方法制造。
例如,如后述的实施例揭露的方式,通过固相合成法而制得氨基酸侧链与N末端的氨基经保护的保护肽(或糖肽),将此C末端侧的羧基于液相中使用缩合剂PyBOP(六氟磷酸苯并***-1-基-氧基-三吡咯啶基鏻,亦即Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate)/DIPEA,并与苄基硫醇(benzyl mercaptan)缩合,然后,使用95%TFA溶液进行脱保护,由此可制得在C末端具有α-羧基硫酯部分的酞(或糖肽)。
连接法,可使用如专利文献1所揭露的此项技术领域人员众所周知的方法,再者,可参照后述实施例的揭露而实施。例如,参照上述揭露而准备C末端具有-C(=O)-SR所表示的α-羧基硫酯部分的第1肽,与N末端具有具-SH基的氨基酸残基的第2肽。又,第1肽中,R只要为不抑制硫醇交换反应且于羰基碳的亲核置换反应中成为脱离基的基即可,并无特别限定,优选為可选自苄基硫醇等苄基型、苯硫酚(thiophenol)、4-(羧基甲基)-苯硫酚等芳基型、2-巯基乙烷磺酸盐、3-巯基丙酰胺等烷基型等。再者,第2肽的N末端的-SH基可根据期望而經保护基予以保护,此保护基是在至以下的连接反应为止的期同于所期望的时同点进行脱保护,N末端具有-SH基的第2肽是与第1肽反应。例如双硫基(disulfide group)等,只要是于发生连接的条件中会自然地脱保护的保护基,則也可将经保护基保护的第2肽直接使用于以下的连接反应。
此2个肽,根据需要,于4-巯基苯基乙酸、苄基硫醇、苯硫酚等触媒硫醇的存在下,于100mM磷酸缓冲溶液等溶液中混合。优选为相对于第1肽1当量,第2肽以0.5至2当量以及触媒硫醇以5当量左右的比例进行反应。反应期望于pH6.5至7.5左右,20至40℃左右的条件下,进行约1至30小时左右。反应的进行可使用组合HPLC、MS等的众所周知的方法确认。
于其中,加入如二硫苏糖醇(dithiothreitol,亦即DTT)、三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)类的还原剂抑制副反应,根据期望而精制,由此可连结第1肽与第2肽。
又,在C末端具有羧基硫酯部分(-C=O-SR)的肽中,存在R基不同的肽时,可操作连接反应的顺序(参照Protein Science(2007),16:2056-2064等),在进行多次连接時可加以考虑。例如,存在有芳基、苄基及烷基作为R时,一般而言,依此顺序进行连结反应。
本说明书中,蛋白质的「高阶结构」,包含α螺旋(α-helix)与β折叠(β-sheet)结构等2级结构或无规线团(random coil)等结构,2级结构通过氢键、双硫键、离子键、疏水型相互作用而于空间折叠并形成安定构造(conformation)的3级结构,以多个多肽链作为次单位(subunit)集合所形成的4级结构,而称为蛋白质的立体结构。蛋白质的高阶结构,优选为蛋白质于活体内为了发挥功能所必要的结构。蛋白质的高阶结构,可通过X射线结晶结构解析或NMR等而解析。
本说明书中,所谓「糖蛋白质的高阶结构为一致的」,是意指将糖蛋白质的蛋白质部分的高阶结构于糖蛋白质间比较时,实质上为一致的。所谓「高阶结构实质上为一致的」,是意指至少90%以上,优选为95%以上,更优选为99%以上的结构为一致的。高阶结构为一致的糖蛋白质,有一定质量,特别于医药品的制造或分析等领域为优选。某区分所含有的糖蛋白质的高阶结构是否为一致的,例如可通过NMR解析、CD测定、双硫定位(disulfide mapping)等而确认。
本说明书中「折叠(folding)」意指,糖蛋白质的蛋白质部分折成特定的高阶结构。糖蛋白质的折叠,可根据众所周知的方法或比照所述方法的方法使此项技术领域人员适宜的进行,例如可列举透析法与稀释法、失活法等。透析法为预先加入蛋白质改质剂(展开剂),通过将其透析而缓缓稀释,置换为缓冲液,使肽折叠为既定的高阶结构的方法。作为展开剂,可列举盐酸胍、尿素等。再者,稀释法为加入蛋白质改质剂后,利用缓冲液等以阶段性或一次性的方式进行稀释,使肽折叠为高阶结构的方法。失活法为加入蛋白质改质剂后,以阶段性或一次性的方式加入使此改质剂失活的第2剂,使肽折叠为高阶结构的方法。
本发明中的「既定的生理活性」,于使其折叠时,可由具有以一定比率而再现性良好地获得高阶结构的糖蛋白质的生理活性之中选择。此生理活性,是先将作为对象的糖蛋白质,利用与后述步骤(a)及步骤(b)同样的方法折叠后,通过柱层析而進行区分,回收对应主峰的洗脱液,测定此区分所含有的糖蛋白质的生理活性而可求得。此处,主峰意指在重复进行步骤(a)及步骤(b)时,再现性良好地获得的峰。生理活性的测定,可根据作为对象的糖蛋白质,利用此项技术领域人员众所周知的方法进行。
本发明的「氨基酸序列、糖链结构及高阶结构为一致的糖蛋白质的制造方法」中,首先于步骤(a)中,使氨基酸序列及糖链结构为一致的糖蛋白质折叠。于含有折叠后的糖蛋白质的溶液中,混合有高阶结构不同的糖蛋白质,包含具有既定活性者与不具有既定活性者。
其次,步骤(b)中,折叠的糖蛋白质通过柱层析而进行区分。柱层析为只要可分离高阶结构不同的糖蛋白质者即可,并无特别限定,例如可使用高速液体层析(HPLC)。柱层析的固定相、移动相的种类、流出速度等条件,可根据分离的糖蛋白质,由此项技术领域人员适宜选择,例如可使用ODS型的逆相层析、顺相系柱、亲和性柱(affinity column)、凝胶过滤柱(gel filtration column)、离子交换柱等。
步骤(c)中,测定柱层析的洗脱液的各区分中所含的糖蛋白质的活性,通过回收具有既定活性的区分,可获得氨基酸序列、糖链结构及高阶结构为一致的糖蛋白质。
本发明的糖蛋白质制造方法中,在步骤(c)后,(d)使前述步骤(c)未回收的区分中所含的糖蛋白质展开,
(e)使前述展开的糖蛋白质再度折叠,
(f)使前述再度折叠的糖蛋白质通过柱层析而进行区分,回收具有前述所期望活性的区分,
(g)根据需要,重复(d)至(f)的操作也为优选的。
步骤(d)中,含有展开的糖蛋白质的区分中,也包含不具有既定活性的高阶结构。再者,混合存在有2种以上的具有既定活性的糖蛋白质的区分,也因不显示既定的活性值,而含于展开的区分中。
糖蛋白质的展开,可使用此项技术领域人员众所周知的方法进行,例如可列举添加盐酸胍、尿素等展开剂(蛋白质改质剂)的方法,除了這些方法以外,也可列举添加二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙醇等还原剂的方法。
步骤(e)及步骤(f)可利用与上述步骤(a)至步骤(e)同样的方法进行。
如此,通过进行步骤(d)至步骤(f),使不具有既定活性的区分中所包含的糖蛋白质先展开,通过再度折叠,变换为以一定比率具有既定活性的高阶结构。如此一来,可于最大限度回收采取具有既定活性的高阶结构的糖蛋白质。
本发明的「糖蛋白质的筛选方法」为(i)使氨基酸序列及糖链为一致的糖蛋白质折叠,
(ii)使前述所折叠的糖蛋白质通过柱层析而进行区分,
(iii)测定各区分的活性,判定是否具有既定的活性。
步骤(i)及步骤(ii),可与上述步骤(a)及步骤(b)同样的进行。如上所述,使氨基酸序列及糖链为一致的糖蛋白质折叠后的糖蛋白质溶液中,混合存在有采取多个高阶结构的糖蛋白质。因此,通过柱层析而区分后,测定各区分的活性,通过判定是否具有既定的活性,可仅选择具有既定生理活性的具有一致高阶结构的糖蛋白质並加以精制。
另外,本发明提供获得具有所期望生理活性的糖蛋白质混合物的方法。此方法包含(A)使氨基酸序列及糖链为一致的糖蛋白质折叠,
(B)使前述折叠的糖蛋白质通过柱层析而进行区分,
(C)测定各区分的活性,
(D)求出可得所期望活性的各区分的混合比率,根据所述比滤混合各区分。
步骤(A)及步骤(B),可与上述步骤(a)及步骤(b)同样的进行。通过步骤(A)及步骤(B),可获得氨基酸序列、糖链结构及高阶结构为一致的且具有既定活性的糖蛋白质。因此,通过将這些以既定的比率混合,可获得具有所期望的生理活性的糖蛋白质混合物。
又,本说明书中所使用的用语,只是为了说明特定实施方式而使用者,不意图限定发明。
再者,本说明书中所使用的「包含」的用语,除了在文章脉络上清楚明白应为不同理解的情况以外,意指所记述的事项(构件、步骤、要素、数字等)为存在者,且不排除這些以外的事项(构件、步骤、要素、数字等)存在的情形。
只要沒有不同的定义,此处所使用的全部用语(包含技术用语及科学用语)具有与本发明所属技术领域人员所广泛理解者为相同意义。此处所使用的用语,只要未明白显示有不同的定义,即应解释为具有本说明书及相关技术领域的意义与整合的意义者,不应解释为理想化或过度形式化的意义。
本发明的实施方式虽有参照附图而说明的情况,但在附图中,为了明确地说明,有夸张表达的情况。
第一、第二等用语是为了表现各种要素而使用,這些要素应理解为不以這些用语为限定。這些用语仅用于将一个要素与其他要素区别,例如,将第一要素记为第二要素,同样地将第二要素记为第一要素,为不脱出本发明的范围而為可能者。
以下文中,参照实施例更详细说明本发明。但是,本发明可通过各种实施方式而具体化,不可解释为仅限定此处所揭露的实施例。
实施例
<实施例1>白鹇的卵类粘蛋白第3功能域(以下也称为「OMSVP3」)的化学合成
1.氨基酸序列及糖链皆为一致的白鹇的卵类粘蛋白第3功能域的化学合成
分別合成图1所示的3个片段后,通过NCL法而进行连接,合成氨基酸序列及糖链为一致的白鹇的卵类粘蛋白第3功能域。片段1至3是示于图2至4。
[使用的装置]
1H-NMR是以Bruker的AVANCE 600(标示为600MHz)测定。ESI质谱的测定是使用Brucker Daltonics的Esquire3000plus。
CD谱的测定是使用JASCO的J-820、J-805。
RP-HPLC分析装置是使用Waters公司製的,UV检测器是使用Waters公司製的Waters486与光二极管陈列检测器(photodiode array detector)(Waters 2996)與Waters2487,柱是使用Cadenza column(Imtakt Corp.,3μm,4.6×75mm)与VydacC-18(5μm,4.6×250mm,10×250mm)、VydacC-8(5μm,10×250mm)、VydacC-4(5μm,4.6×250mm)。
[片段1的合成]
在固相合成用柱中加入2-氯三苯甲基树脂(2-Chlorotrityl resin)(143mg,200μmol),利用二氯甲烷(DCM)充分洗净。另外,使Fmoc-Leu(212.1mg,0.6mmol)与DIPEA(272.1μL,1.6mmol)溶解于DCM(1.2mL)者,加入已加有树脂的固相合成用柱中,于室温搅拌2小时。搅拌后,将树脂利用DCM∶MeOH∶DIPEA=17∶2∶1、DCM、DMF洗净。其次,将Fmoc基以20分钟利用20%哌啶/DMF溶液(2mL)脱保护。利用DMF洗净后,通过Kaiser Test确认反应,其后的肽链的延长是利用以下所示的方法,依序使氨基酸缩合。
将经Fmoc基保护氨基的氨基酸与HOBt(135.1mg,1mmol)、DIPCI(153.9μL,1mmol)溶解于DMF(4mL)使其活性化15分钟后,加入至固相合成用柱,于室温搅拌1小时。搅拌后,树脂利用DCM、DMF洗净。将Fmoc基以20分钟利用20%哌啶/DMF溶液(2mL)脱保护。重复此操作,依序使氨基酸缩合。经保护氨基的氨基酸是使用Fmoc-Pro、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Met、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Ala、Fmoc-Pro、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Pro、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala,最后的氨基酸是使用可通过酸而去除保护基的Boc-Leu-OH·H2O(249.3mg,1mmol)。于固相树脂上,获得Boc-Leu-Ala-Ala-Val-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Pro-Lys(Boc)-Pro-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Met-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Pro-Leu的具有保护基的23残基肽(序列编号1)。在其中,加入AcOH∶DCM∶MeOH=5∶4∶1(2mL),于室温搅拌3小时。搅拌后,过滤去除树脂,再于MeOH中进行树脂的洗净。将滤液加入另外准备的己烷中,进行晶析。将过滤后的结晶于过量的苯中共沸3次后,进行冻结干燥(图5上段。惟进行脱保护并测定)。
所得肽(具有保护基的序列编号1揭示的23残基肽)(39mg,10μmol)与MS4A、苄基硫醇(35.5μL,0.3mmol)于DMF溶媒中(1.35mL),于氩气流下、-20℃搅拌1小时后,加入PyBOP(26mg,50μmol)与DIPEA(8.5μL,50μmol),搅拌2小时。搅拌后,反应溶液中加入过量***使化合物沉淀,过滤。然后使沉淀物于DMF中溶解。溶液于减压下浓缩后,加入95%TFA、2.5%TIPS、2.5%H2O溶液(1mL)于室温搅拌2小时(图5中段)。减压浓缩反应溶液后,通过HPLC(Cadenza column CD18(Imtakt Inc.),3mm,75×4.6mm,洗脱溶剂A:0.09%TFA水溶液 B:0.1%TFA乙腈∶水=90∶10,梯度A∶B=80∶20→40∶60(乙腈的梯度:18%→54%),15分钟,流速1.0mL/min)精制,获得Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Val-Asp-Cys-Ser-Glu-Tyr-Pro-Lys-Pro-Ala-Cys-Thr-Met-Glu-Tyr-Arg-Pro-Leu-SBn的C末端为苄基硫酯的23残基肽(序列编号2)(图5下段)。
ESI-MS:C118H181N27O34S4[M+2H]2+计算值1326.0,实测值1325.8
[片段2的合成]
其次,于另外的固相合成用柱中加入Amino-PEGA树脂(默克公司制造)(1g,50μmol),利用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗净后,利用DMF使其充分膨润。使4-羟基甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.125mmol)、TBTU(0.125mmol)及N-乙基吗啉(0.125mmol)溶解于DMF(1ml)并加入柱中,于室温搅拌2小时。树脂利用DMF及DCM充分洗净,通过Kaiser Test确认反应。确认Kaiser Test为阴性(-),树脂利用DCM使其膨润1小时。获得HMPB-PEGA树脂,将其使用做为固相合成用的固相载体。
使Fmoc-Phe(96.9mg,0.25mmol)、MSNT(74mg,0.25mmol)及N-甲基咪唑(14.9μL,0.188mmol)溶解于DCM(1mL),加入固相合成用柱中,于室温搅拌2小时。搅拌后,树脂利用DCM、DMF洗净。将Fmoc基利用20%哌啶/DMF溶液(1mL)进行20分钟处理而脱保护。利用DMF洗净后,通过Kaiser Test确认反应,其后的肽链的延长是利用以下所示的方法,依序使氨基酸缩合。
将经Fmoc基保护氨基的氨基酸与HOBt(33.8mg,0.25mmol)、DIPCI(38.5μL,0.25mmol)溶解于DMF(1mL)使其活性化15分钟后,加入至固相合成用柱,于室温搅拌1小时。搅拌后,树脂利用DCM、DMF洗净。将Fmoc基以20分钟利用20%哌啶/DMF溶液(2mL)脱保护。重复此操作,依序使氨基酸缩合。经保护氨基的氨基酸为使用Fmoc-Asn、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Asn、Fmoc-Gly、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Lys(Boc),于固相树脂上,获得Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-Asn-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asn-Phe的具有保护基的9残基肽(序列编号3)。将相当于此固相树脂上的9残基肽3μmol者取至另外的固相合成用柱中,以20分钟使用20%哌啶/DMF溶液(1mL)使Fmoc基脱保护。利用DMF进行充分洗净后,将树脂移至离心管(Eppendorf tube)。其次,将下述式(1)表示的糖链天门冬酰胺(12mg,6μmol)与DEPBT(3mg,10μmol)溶解于0.20mL的DMF∶DMSO=4∶1中,将其加入离心管,加入DIPEA(1.02μL,6μmol)于室温搅拌20小时。
搅拌后,树脂移入固相合成用柱,利用DCM、DMF充分洗净。将Fmoc基利用20%哌啶/DMF溶液(1mL)处理20分钟而脱保护。利用DMF洗净后,其后的糖链的延长是使用以下所示方法,依序使氨基酸缩合。将经Fmoc基保护氨基的氨基酸与HOBt(2mg,0.015mmol)、DIPCI(2.3μL,0.015mmol)溶解于DMF(0.375mL)使其活性化15分钟后,加入至固相合成用柱,于室温搅拌2小时。搅拌后,树脂利用DCM、DMF洗净。将Fmoc基以20分钟利用20%哌啶/DMF溶液(2mL)脱保护。重复此操作,依序使氨基酸缩合。经保护氨基的氨基酸为使用Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Gly、Boc-Cys(Thz),于固相树脂上,获得Boc-Cys(Thz)-Gly-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Asn(寡糖)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-Asn-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asn-Phe的具有保护基的14残基糖链加成肽(序列编号4)。在其中,加入乙酸∶三氟乙醇(=1∶1)1mL,于室温进行搅拌20小时。过滤除去树脂,在利用MeOH洗净后,减压下浓缩滤液,使用苯进行共沸3次。使此残渣溶解后,进行冻结干燥(图6上段。惟进行脱保护并测定)。
所得肽(具有保护基的序列编号4揭示的14残基糖链加成肽)(11.7mg,3μmol)与MS4A(10mg)、苄基硫醇(10.6μL,0.09mmol)于DMF溶媒中(0.41mL),于氩气流下、-20℃搅拌1小时后,加入PyBOP(7.8mg,15μmol)与DIPEA(2.6μL,15μmol),搅拌2小时。搅拌后,反应溶液中加入过量***使化合物沉淀。过滤后使沉淀物于DMF中溶解。溶液于减压下浓缩后,加入95%TFA、2.5%TIPS、2.5%H2O溶液(1mL)于室温搅拌2小时(图6中段)。减压浓缩反应溶液后,通过HPLC(Cadenza column CD18(Imtakt Inc.),3mm,75×4.6mm,洗脱溶剂A:0.09%TFA水溶液 B:0.1%TFA乙腈∶水=90∶10,梯度A∶B=80∶20→40∶60(乙腈的梯度:18%→54%),15分钟,流速1.0mL/min)精制,获得Cys(Thz)-Gly-Ser-Asp-Asn(寡糖)-Lys-Thr-Tyr-Gly-Asn-Lys-Cys-Asn-Phe-SBn的C末端为苄基硫酯的具有保护基的14残基糖链加成肽(序列编号5)(图6下段)。
ESI-MS:C133H203N23O67S3[M+2H]2+计算值1647.1,实测值1646.6
[片段3的合成]
其次,固相合成用柱中加入2-氯三苯甲基树脂(200μmol),利用二氯甲烷(DCM)充分洗净。另外,使Fmoc-Cys(Trt)(351.4mg,0.6mmol)与DIPEA(272.1μL,1.6mmol)溶解于DCM(1.2mL)者,加入已加有树脂的固相合成用柱中,于室温搅拌2小时。搅拌后,将树脂利用DCM∶MeOH∶DIPEA=17∶2∶1、DCM、DMF洗净。其次,将Fmoc基以20分钟利用20%哌啶/DMF溶液(2mL)脱保护。利用DMF洗净后,通过Kaiser Test确认反应,其后的肽链的延长是利用以下所示的方法,依序使氨基酸缩合。
将经Fmoc基保护氨基的氨基酸与HOBt(135.1mg,1mmol)、DIPCI(153.9μL,1mmol)溶解于DMF(4mL)使其活性化15分钟后,加入至固相合成用柱,于室温搅拌1小时。搅拌后,树脂利用DCM、DMF洗净。将Fmoc基以20分钟利用20%哌啶/DMF溶液(2mL)脱保护。重复此操作,依序使氨基酸缩合。经保护氨基的氨基酸为使用Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Gly、Fmoc-Phe、Fmoc-His(Trt)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Asn、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Val、Fmoc-Ala、Fmoc-Asn、Fmoc-Cys(Trt),于固相树脂上,获得Cys(Trt)-Asn-Ala-Val-Val-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Asn-Gly-Thr(tBu)-Leu-Thr(tBu)-Leu-Ser(tBu)-His(Trt)-Phe-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)的具有保护基的19残基肽(序列编号6)。在其中,加入95%TFA、2.5%TIPS、2.5%H2O溶液(3mL)于室温搅拌2小时后,过滤去除树脂,减压下浓缩滤液(图7上段)。将其通过HPLC(Cadenza column CD18(Imtakt Inc.),3mm,75×4.6mm,洗脱溶剂A:0.09%TFA水溶液 B:0.1%TFA乙腈∶水=90∶10,梯度A∶B=80∶20→40∶60(乙腈的梯度:18%→54%),15分钟,流速1.0mL/min)精制,获得Cys-Asn-Ala-Val-Val-Glu-Ser-Asn-Gly-Thr-Leu-Thr-Leu-Ser-His-Phe-Gly-Lys-Cys的19残基肽(序列编号7)(图7下段)。
ESI-MS:C83H134N24O28S2[M+2H]2+计算值991.1,实测值991.0
[片段2与片段3的通过NCL法的连接]
将片段3(序列编号7揭露的19残基肽)1.9mg(1μmol)与片段2(序列编号5揭露的C末端为苄基硫酯的具有保护基的14残基糖链加成肽)3.2mg(1μmol)的二种类,放入相同的离心管中,使其溶解于0.1%磷酸缓冲溶液(pH7.5,含有6M胍盐酸盐)485μL后,于25℃加入苯硫酚(15μL),于室温进行反应(图8的0小时)。24小时后,利用HPLC确认反应结束后(图8的24小时),反应溶液通过HPLC(Cadenza column CD18(Imtakt Inc.),3mm,75×4.6mm,洗脱溶剂A:0.09%TFA水溶液 B:0.1%TFA乙腈∶水=90∶10,梯度A∶B=80∶20→40∶60(乙腈的梯度:18%→54%),15分钟,流速1.0mL/min)精制(图8的精制后)。然后进行冻结干燥,获得Cys(Thz)-Gly-Ser-Asp-Asn(寡糖)-Lys-Thr-Tyr-Gly-Asn-Lys-Cys-Asn-Phe-Cys-Asn-Ala-Val-Val-Glu-Ser-Asn-Gly-Thr-Leu-Thr-Leu-Ser-His-Phe-Gly-Lys-Cys的具有保护基的33残基糖链加成肽(序列编号8)。
ESI-MS:C209H329N47O95S4[M+4H]4+计算值1287.28,实测值1287.6
将所得肽(序列编号8揭露的具有保护基的33残基糖链加成肽)溶解于0.2M甲氧基胺水溶液(pH=4.0)。4小时后,利用HPLC确认反应结束后,反应溶液通过HPLC(Cadenza column CD18(Imtakt Inc.),3mm,75×4.6mm,洗脱溶剂A:0.09%TFA水溶液 B:0.1%TFA乙腈∶水=90∶10,梯度A∶B=80∶20→40∶60(乙腈的梯度:18%→54%),15分钟,流速1.0mL/min)精制(图8的噻唑啉(thiazoline)脱保护)。然后进行冻结干燥,获得Cys-Gly-Ser-Asp-Asn(寡糖)-Lys-Thr-Tyr-Gly-Asn-Lys-Cys-Asn-Phe-Cys-Asn-Ala-Val-Val-Glu-Ser-Asn-Gly-Thr-Leu-Thr-Leu-Ser-His-Phe-Gly-Lys-Cys的33残基糖链加成肽(序列编号9)。
ESI-MS:C208H329N47O95S4[M+4H]4+计算值1284.28,实测值1284.5
又,以下的条件也同样获得序列编号9揭露的33残基糖链加成肽。
片段3(序列编号7揭露的19残基肽)1.9mg(1μmol)与片段2(序列编号5揭露的C末端为苄基硫酯的具有保护基的14残基糖链加成肽)3.2mg(1μmol)的二种类,分别放入离心管中,使其溶解于0.1%磷酸缓冲溶液(pH 7.5,含有6M胍盐酸盐)247.5μL后,合并于一个离心管中。于25℃加入苯硫酚(5μL),于室温进行反应。利用HPLC与质量分析追踪反应,7小时后,利用HPLC确认片段3的消失。然后添加0.2M的甲氧基胺水溶液直到系中成为接近pH4为止,使N末端的Cys脱保护。6小时后,利用质量分析确认反应的结束,反应溶液通过HPLC(Cadenza column CD18(Imtakt Inc.),3mm,75×4.6mm,洗脱溶剂A:0.09%TFA水溶液 B:0.1%TFA乙腈∶水=90∶10,梯度A∶B=80∶20→40∶60(乙腈的梯度:18%→54%),15分钟,流速1.0mL/min)精制。然后进行冻结干燥,获得序列编号9的33残基糖链加成肽(序列编号8)。
ESI-MS:C208H329N47O95S4[M+4H]4+计算值1284.28,实测值1284.5
[片段1与片段2及3的通过NCL法的连接]
通过将片段2与片段3连接所调制的33残基糖链加成肽(序列编号9)1.3mg(0.25μmol)与片段1(序列编号2揭露的C末端为苄基硫酯的23残基肽)1.3mg(0.50μmol)的二种类,放入相同的离心管中,使其溶解于0.1%磷酸缓冲溶液(pH 7.5,含有8M胍盐酸盐)485μL后,于25℃加入苯硫酚(15μL),于室温进行反应(图9的0小时)。54小时后,利用HPLC确认反应结束后(图9的54小时)。反应溶液通过HPLC(Cadenza column CD18(Imtakt Inc.),3mm,75×4.6mm,洗脱溶剂A:0.09%TFA水溶液 B:0.1%TFA乙腈∶水=90∶10,梯度A∶B=80∶20→40∶60(乙腈的梯度:18%→54%),15分钟,流速1.0mL/min)精制(图9下段)。然后进行冻结干燥,获得Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Val-Asp-Cys-Ser-Glu-Tyr-Pro-Lys-Pro-Ala-Cys-Thr-Met-Glu-Tyr-Arg-Pro-Leu-Cys-Gly-Ser-Asp-Asn(寡糖)-Lys-Thr-Tyr-Gly-Asn-Lys-Cys-Asn-Phe-Cys-Asn-Ala-Val-Val-Glu-Ser-Asn-Gly-Thr-Leu-Thr-Leu-Ser-His-Phe-Gly-Lys-Cys的56残基糖链加成肽(序列编号10)。
ESI-MS:C319H502N74O129S7[M+5H]5+计算值1532.46,实测值1532.7
又,以下的条件也同样可获得56残基糖链加成肽(序列编号10)。
将序列编号9揭露的33残基糖链加成肽1.3mg(0.25μmol)与片段1(序列编号2揭露的C末端为苄基硫酯的23残基肽)1.3mg(0.25μmol)的二种类,分别放入离心管中,使其溶解于0.1%磷酸缓冲溶液(pH 7.5,含有6M胍盐酸盐)247.5μL后,合并于一个离心管中。利用HPLC与质量分析追踪反应,30小时后,反应溶液通过HPLC(Cadenza column CD18(Imtakt Inc.),3mm,75×4.6mm,洗脱溶剂A:0.09%TFA水溶液 B:0.1%TFA乙腈∶水=90∶10,梯度A∶B=80∶20→40∶60(乙腈的梯度:18%→54%),15分钟,流速1.0mL/min)精制。
[糖蛋白质的折叠]
将由此所调制的56残基糖链加成肽(序列编号10)0.5mg(65.2nmol)取至离心管中,使其溶解于0.6M Tris缓冲液(pH=8.7,含有0.6M胍盐酸盐、6mM EDTA)100μL。加入蒸馏水500μL稀释,使具有糖链的卵类粘蛋白第3功能域折叠。
[通过HPLC而进行的区分]
36小时后,利用HPLC与质量分析确认反应的进行后,通过HPLC(Cadenza column CD18(Imtakt Inc.),3mm,75×4.6mm,洗脱溶剂A:0.09%TFA水溶液 B:0.1%TFA乙腈∶水=90∶10,梯度A∶B=80∶20→40∶60(乙腈的梯度:18%→54%),15分钟,流速1.0mL/min)精制。获得包含具有高阶结构的Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Val-Asp-Cys-Ser-Glu-Tyr-Pro-Lys-Pro-Ala-Cys-Thr-Met-Glu-Tyr-Arg-Pro-Leu-Cys-Gly-Ser-Asp-Asn(寡糖)-Lys-Thr-Tyr-Gly-Asn-Lys-Cys-Asn-Phe-Cys-Asn-Ala-Val-Val-Glu-Ser-Asn-Gly-Thr-Leu-Thr-Leu-Ser-His-Phe-Gly-Lys-Cys的56残基糖链加成肽(序列编号10)的4个区分A至D(图10)。
ESI-MS:C319H502N74O129S7[M+5H]5+1532.2,[M+4H]4+1915.0,[M+3H]3+2553.0
A;实测值 1532.5,1915.2,2553.2
B;实测值 1532.5,1915.2,2553.2
C;实测值 1532.6,1915.3,2553.2
D;实测值 1532.7,1915.4,2553.3
图9下段至图10的峰变化以及质量的减少,是显示通过上述折叠步骤而使双硫键形成。
又,利用HPLC与质量分析追踪反应,通过以质量分析确认分子量变化与以HPLC确认峰的滞留时同(retention time)变化,可适宜变更反应时间(例如24小时)。
区分B的NMR测定:使冻结干燥后的区分B溶于5%D2O/H2O(300μl),于25℃、60ms、600MHz测定2D TOCSY。NMR谱图示于图11。
区分B的CD测定:使冻结干燥后的区分B溶于蒸馏水并进行CD测定。装置是使用JASCO的J-820。测定区域是于180nm至260nm的范围进行。CD谱图示于图12。
根据图11而确认,仅利用HPLC的分离,而使具有相同高阶结构的糖蛋白质受到高度的精制。
2.不具有糖链的白鹇的卵类粘蛋白第3功能域的化学合成
与实施例同样地,分别合成3个片段后,通过NCL法进行连接,合成不具有糖链的白鹇的卵类粘蛋白第3功能域。片段1及片段3与实施例同样的方法合成。比较例中,对应于实施例片段2的片段2’(以下称为「片段2’」),是图14所示不具有糖链。
[片段2’的合成]
在固相合成用柱中加入2-氯三苯甲基树脂(143mg,200μmol),利用二氯甲烷(DCM)充分洗净。另外,使Fmoc-Phe(232.4mg,0.6mmol)与DIPEA(272.1μL,1.6mmol)溶解于DCM(1.2mL)者,加入已加有树脂的固相合成用柱中,于室温搅拌2小时。搅拌后,将树脂利用DCM∶MeOH∶DIPEA=17∶2∶1、DCM、DMF洗净。其次,将Fmoc基以20分钟利用20%哌啶/DMF溶液(2mL)脱保护。利用DMF洗净后,通过Kaiser Test确认反应,其后的肽链的延长是利用以下所示的方法,依序使氨基酸缩合。
将经Fmoc基保护氨基的氨基酸与HOBt(135.1mg,1mmol)、DIPCI(153.9μL,1mmol)溶解于DMF(0.4mL)使其活性化15分钟后,加入至固相合成用柱,于室温搅拌1小时。搅拌后,树脂利用DCM、DMF洗净。将Fmoc基以20分钟利用20%哌啶/DMF溶液(1mL)脱保护。重复此操作,依序使氨基酸缩合。经保护氨基的氨基酸为使用Fmoc-Asn、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Asn、Fmoc-Gly、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Asn、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Gly,最后的氨基酸是使用可通过酸而去除保护基的Boc-Cys(Thz)-OH(233.3mg,1mmol)。于固相树脂上,获得Boc-Cys(Thz)-Gly-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Asn-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-Asn-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asn-Phe的具有保护基的14残基肽(序列编号11)。在其中,加入AcOH∶DCM∶MeOH=5∶4∶1(2mL),于室温搅拌3小时。搅拌后,过滤去除树脂,再于MeOH中进行树脂的洗净。减压下浓缩滤液后,于过量的苯中共沸3次,进行冻结干燥(图15上段。惟进行脱保护并测定)。
将所得肽(序列编号11揭示的具有保护基的14残基肽)110mg(50μmol)与MS4A(10mg)、苄基硫醇(177.4μL,1.5mmol)于DMF溶媒中(6.8mL),于氩气流下、-20℃搅拌1小时后,加入PyBOP(130mg,250μmol)与DIPEA(42.5μL,250μmol),搅拌2小时。搅拌后,反应溶液中加入过量***使化合物沉淀,过滤后使沉淀物于DMF中溶解。溶液于减压下浓缩后,加入95%TFA、2.5%TIPS、2.5%H2O溶液(5mL)于室温搅拌2小时(图15中段)。减压下浓缩反应溶液后,通过HPLC(Cadenza column CD18(Imtakt Inc.),3mm,75×4.6mm,洗脱溶剂A:0.09%TFA水溶液 B:0.1%TFA乙腈∶水=90∶10,梯度A∶B=80∶20→40∶60(乙腈的梯度:9%→27%),15分钟,流速1.0mL/min)精制,获得Cys(Thz)-Gly-Ser-Asp-Asn-Lys-Thr-Tyr-Gly-Asn-Lys-Cys-Asn-Phe-SBn的C末端为苄基硫酯的具有保护基的14残基肽(序列编号12)(图15下段)269.6mg。
ESI-MS:C71H101N19O22S3[M+2H]2+计算值834.8,实测值834.7
[片段2’与片段3的通过NCL法的连接]
由此所调制的片段2’(序列编号12揭露的C末端为苄基硫酯的具有保护基的14残基肽)1.6mg(0.96μmol)与实施例所合成的片段31.9mg(0.96μmol)的二种类,放入相同的离心管中,使其溶解于0.1%磷酸缓冲溶液(pH 7.5,含有6M胍盐酸盐)495μL后,加入苯硫酚(5μL),于室温进行反应(图16的0小时)。18小时后,利用HPLC确认反应结束后(图16的18小时),反应溶液通过HPLC(Cadenza column CD18(Imtakt Inc.),3mm,75×4.6mm,洗脱溶剂A:0.09%TFA水溶液 B:0.1%TFA乙腈∶水=90∶10,梯度A∶B=80∶20→40∶60(乙腈的梯度:18%→54%),15分钟,流速1.0mL/min)精制(图16的精制后)。然后进行冻结干燥,获得Cys(Thz)-Gly-Ser-Asp-Asn-Lys-Thr-Tyr-Gly-Asn-Lys-Cys-Asn-Phe-Cys-Asn-Ala-Val-Val-Glu-Ser-Asn-Gly-Thr-Leu-Thr-Leu-Ser-His-Phe-Gly-Lys-Cys的具有保护基的33残基肽(序列编号13)。
ESI-MS:C147H227N43O50S4[M+3H]3+计算值1175.9,实测值1175.4
将所得的具有保护基的33残基肽(序列编号13)溶解于0.2M甲氧基胺水溶液(pH=4.0)。4小时后,利用HPLC确认反应结束后,通过HPLC(Cadenza column CD18(Imtakt Inc.),3mm,75×4.6mm,洗脱溶剂A:0.09%TFA水溶液 B:0.1%TFA乙腈∶水=90∶10,梯度A∶B=80∶20→40∶60(乙腈的梯度:18%→54%),15分钟,流速1.0mL/min)精制(图8的噻唑啉脱保护)。然后进行冻结干燥,获得Cys-Gly-Ser-Asp-Asn-Lys-Thr-Tyr-Gly-Asn-Lys-Cys-Asn-Phe-Cys-Asn-Ala-Val-Val-Glu-Ser-Asn-Gly-Thr-Leu-Thr-Leu-Ser-His-Phe-Gly-Lys-Cys的33残基肽(序列编号14)。
ESI-MS:C146H227N43O50S4[M+3H]3+计算值1171.9,实测值1171.5
又,以下的条件也同样获得序列编号14揭露的33残基糖链加成肽。
将片段2’(序列编号12揭露的C末端为苄基硫酯的具有保护基的14残基肽)1.6mg(0.96μmol)与实施例所合成的片段31.9mg(0.96μmol)的二种类,分别放入离心管中,使其溶解于0.1%磷酸缓冲溶液(pH 7.5,含有6M胍盐酸盐)247.5μL后,合并于一个离心管中。加入1%苯硫酚(5μL),于室温进行反应。利用HPLC与质量分析追踪反应,6小时后,利用HPLC确认片段3的消失。然后添加0.2M的甲氧基胺水溶液直到系中成为接近pH4为止,使N末端的Cys脱保护。6小时后,利用质量分析确认反应的结束,反应溶液通过HPLC(Cadenza column CD18(Imtakt Inc.),3mm,75×4.6mm,洗脱溶剂A:0.09%TFA水溶液 B:0.1%TFA乙腈∶水=90∶10,梯度A∶B=80∶20→40∶60(乙腈的梯度:18%→54%),15分钟,流速1.0mL/min)精制。
ESI-MS:C146H227N43O50S4[M+3H]3+计算值1171.9,实测值1171.5
[片段1与片段2’及3的通过NCL法的连接]
由此所调制的33残基糖链加成肽(序列编号14)0.6mg(0.17μmol)与实施例所合成的片段1(序列编号2揭露的C末端为苄基硫酯的23残基肽)1.mg(0.41μmol)的二种类,放入相同的离心管中,使其溶解于0.1%磷酸缓冲溶液(pH 7.5,含有8M胍盐酸盐)485μL后,加入苯硫酚(15μL),于室温进行反应(图17的0小时)。45小时后,利用HPLC确认反应结束后(图17的45小时),反应溶液通过HPLC(Cadenza column CD18(Imtakt Inc.),3mm,75×4.6mm,洗脱溶剂A:0.09%TFA水溶液 B:0.1%TFA乙腈∶水=90∶10,梯度A∶B=80∶20→40∶60(乙腈的梯度:18%→54%),15分钟,流速1.0mL/min)精制。然后进行冻结干燥,获得Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Val-Asp-Cys-Ser-Glu-Tyr-Pro-Lys-Pro-Ala-Cys-Thr-Met-Glu-Tyr-Arg-Pro-Leu-Cys-Gly-Ser-Asp-Asn-Lys-Thr-Tyr-Gly-Asn-Lys-Cys-Asn-Phe-Cys-Asn-Ala-Val-Val-Glu-Ser-Asn-Gly-Thr-Leu-Thr-Leu-Ser-His-Phe-Gly-Lys-Cys的56残基肽(序列编号15)(图17下段)。
ESI-MS:C257H400N70O84S7[M+4H]4+计算值1510.7,实测值1510.6
又,以下的条件也同样获得序列编号15揭露的56残基糖链加成肽。
将序列编号14揭露的33残基肽0.6mg(0.17μmol)与片段1(序列编号2揭露的C末端为苄基硫酯的23残基肽)1.1mg(0.41μmol)的二种类,分别放入离心管中,使其溶解于0.1%磷酸缓冲溶液(pH 7.5,含有8M胍盐酸盐)247.5μL后,合并于一个离心管中。加入1%苯硫酚(5μL),于室温进行反应。利用HPLC与质量分析追踪反应,30小时后,反应溶液通过HPLC(Cadenza column CD18(Imtakt Inc.),3mm,75×4.6mm,洗脱溶剂A:0.09%TFA水溶液 B:0.1%TFA乙腈∶水=90∶10,梯度A∶B=80∶20→40∶60(乙腈的梯度:18%→54%),15分钟,流速1.0mL/min)精制。然后进行冻结干燥,获得序列编号15揭露的56残基糖链加成肽。
ESI-MS:C257H400N70O84S7[M+4H]4+计算值1510.7,实测值1510.6
[蛋白质的折叠]
将由此所调制的56残基肽(序列编号15)0.4mg(66.2nmol)取至离心管中,使其溶解于0.6M Tris缓冲液(pH=8.7,含有0.6M胍盐酸盐、6mMEDTA)100μL。加入蒸馏水500μL稀释,使无糖链的卵类粘蛋白第3功能域折叠。
[通过HPLC而进行的区分]
36小时后,利用HPLC与质量分析确认反应的进行后,通过HPLC(Cadenza column CD18(Imtakt Inc.),3mm,75×4.6mm,洗脱溶剂A:0.09%TFA水溶液 B:0.1%TFA乙腈∶水=90∶10,梯度A∶B=80∶20→40∶60(乙腈的梯度:18%→54%),15分钟,流速1.0mL/min)精制。获得包含具有高阶结构的Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Val-Asp-Cys-Ser-Glu-Tyr-Pro-Lys-Pro-Ala-Cys-Thr-Met-Glu-Tyr-Arg-Pro-Leu-Cys-Gly-Ser-Asp-Asn-Lys-Thr-Tyr-Gly-Asn-Lys-Cys-Asn-Phe-Cys-Asn-Ala-Val-Val-Glu-Ser-Asn-Gly-Thr-Leu-Thr-Leu-Ser-His-Phe-Gly-Lys-Cys的56残基肽(序列编号15)的4个区分E至H(图18)。
ESI-MS:C257H394N70O84S7[M+5H]5+1207.5,[M+4H]4+1509.1,[M+3H]3+2011.9
E;实测值 1207.7,1509.3,2012.0
F;实测值 1207.6,1509.3,2012.0
G;实测值 1207.7,1509.3,2012.0
H;实测值 1207.8,1509.3,2012.0
图17下段至图18的峰变化以及质量的减少,是显示通过上述折叠步骤而使双硫键形成。
又,利用HPLC与质量分析追踪反应,通过以质量分析确认分子量变化与以HPLC确认峰的滞留时同变化,可适宜变更反应时间(例如24小时)。
区分F的NMR测定:使冻结干燥后的区分F溶于5%D2O/H2O(300μl),于25℃、80ms、600MHz测定2D TOCSY。NMR谱图示于图19。
区分F的CD测定:使冻结干燥后的区分F溶于蒸馏水并进行CD测定。装置是使用JASCO的J-820。测定区域是于180nm至260nm的范围进行。CD谱图示于图20。
根据图19而确认,仅利用HPLC的分离,而使具有相同高阶结构的糖蛋白质受到高度的精制。
[区分F的标准曲线的作成]
使区分F(1mg)溶于含有BSA(0.1mg/ml)的pH8.0的0.1M磷酸缓冲液(1ml),稀释此溶液而调制为165μM、82.5μM、41.3μM、20.6μM的浓度的区分F。分别测定3次各浓度的OD280,将其平均值化者示于表1及图22。
[表1]
MM | 1次 | 2次 | 3次 | 平均值 |
165 | 0.58 | 0.57 | 0.58 | 0.57 |
82.5 | 0.27 | 0.29 | 0.3 | 0.28 |
41.2 | 0.14 | 0.13 | 0.14 | 0.14 |
20.6 | 0.06 | 0.06 | 0.06 | 0.06 |
<实施例2>生理活性的测定
[糖链加成OMSVP3(区分A至D)的生理活性的测定]
调制0.1M磷酸缓冲液(pH=8.0,含有0.01%α-胰凝乳蛋白酶、0.01%牛血清白蛋白)的酵素溶液,以及0.1M磷酸缓冲液(pH=8.0,含有517μM的参考例1(述于后文)所合成的具有保护基的14残基肽(序列编号16)、0.01%牛血清白蛋白)的基质溶液,各取20μL加入离心管中。于此溶液中,添加使实施例1所获得的区分A至D各别冻结干燥后溶解于0.1M磷酸缓冲液(pH=8.0,含有0.01%牛血清白蛋白)并测定各溶液的OD280而使溶液中所含有的蛋白质浓度成为一定的样品液20μL,测定抑制活性。此时,最终的反应浓度为样品浓度2.5μM、酵素浓度0.33μg/mL、基质浓度172μM。此反应液于37℃培养10分钟后,加入4N盐酸5μL停止反应。重复同样的操作3次,计算各别的分解率的平均值及标准偏差。结果示于图13。
[无糖链的OMSVP3(区分E至H)的生理活性的测定]
调制0.1M磷酸缓冲液(pH=8.0,含有0.01%α-胰凝乳蛋白酶、0.01%牛血清白蛋白)的酵素溶液,以及0.1M磷酸缓冲液(pH=8.0,含有517μM的参考例1(述于后文)所合成的具有保护基的14残基肽(序列编号16)、0.01%牛血清白蛋白)的基质溶液,各取20μL加入离心管中。于此溶液中,添加使实施例1所获得的区分E至H各别冻结干燥后溶解于0.1M磷酸缓冲液(pH=8.0,含有0.01%牛血清白蛋白)并测定各溶液的OD280而使溶液中所含有的蛋白质浓度成为一定的样品液20μL,测定抑制活性。此时,最终的反应浓度为样品浓度2.5μM、酵素浓度0.33μg/mL、基质浓度172μM。此反应液于37℃培养10分钟后,加入4N盐酸5μL停止反应。重复同样的操作3次,计算各别的分解率的平均值及标准偏差。结果示于图21。
<实施例3>生理活性的测定(IC50的导出)
[糖链加成OMSVP3(区分A至D)的IC50的导出]
使参考例1(述于后文)所合成的具有保护基的14残基肽(序列编号16)(1.5mg)溶解于0.1M磷酸缓冲液(pH=8.0,含有0.1mg/mL BSA)1mL,调制1mM的溶液。使用吸光度计以成为0.34mM的方式稀释(溶液1)。使胰凝乳蛋白酶(1mg)溶解于0.1M磷酸缓冲液(pH=8.0,含有0.1mg/mL BSA)1mL,重复进行将此溶液稀释10倍再将此溶液稀释10倍的操作,以成为0.2μg/mL的方式调制(溶液2)。使区分B溶解于0.1M磷酸缓冲液(pH=8.0,含有0.1mg/mLBSA)100μL,使用吸光度计以成为65nM的方式稀释。将其稀释作成58.5nM、52nM、45.5nM、39nM、32.5nM、26nM、19.5nM、13nM、6.5nM的溶液(溶液3)。将80μL的已于冰上充分冰冷的溶液1、各40μL的溶液2、3,移至相同的离心管,于37℃培养1小时。1小时后,加入1N盐酸16μL使反应停止。使反应液20μL与缓冲液80μL混合而成为合计100μL,使用于通过HPLC而进行的测定。由反应生成物的HPLC上的峰面积计算每单位时间的分解率(每单位时间的反应速度)。图23显示相对于各抑制剂浓度的抑制率的图。同样地,对于区分A、C及D也以使抑制剂浓度夾住抑制50%酵素活性的浓度而作图。其结果如图所示(图23)。以此图為基础而算出的糖链加成OMSVP3(区分A至D)的IC50值如图所示(图24)。
[无糖链的OMSVP3(区分E至H)的IC50的导出]
使参考例1(述于后文)所合成的具有保护基的14残基肽(序列编号16)(1.5mg)溶解于0.1M磷酸缓冲液(pH=8.0,含有0.1mg/mL BSA)1mL,调制1mM的溶液。使用吸光度计以成为0.34mM的方式稀释(溶液1)。使胰凝乳蛋白酶(1mg)溶解于0.1M磷酸缓冲液(pH=8.0,含有0.1mg/mL BSA)1mL,重复进行将此溶液稀释10倍再将此溶液稀释10倍的操作,以成为0.2μg/mL的方式调制(溶液2)。使区分F溶解于0.1M磷酸缓冲液(pH=8.0,含有0.1mg/mLBSA)100μL,使用吸光度计以成为65nM的方式稀释。将其稀释作成58.5nM、52nM、45.5nM、39nM、32.5nM、26nM、19.5nM、13nM、6.5nM的溶液(溶液3)。将80μL的已于冰上充分冰冷的溶液1、各40μL的溶液2、3,移至相同的离心管,于37℃培养1小时。1小时后,加入1N盐酸16μL使反应停止。使反应液20μL与缓冲液80μL混合而成为合计100μL,使用于通过HPLC而进行的测定。由反应生成物的HPLC的峰面积计算每单位时间的分解率(每单位时间的反应速度)。图25显示相对于各抑制剂浓度的抑制率的图。同样地,对于区分E、G及H也以使抑制剂浓度夾住抑制50%酵素活性的浓度而作图。其结果如图所示(图25)。以此图為基础而算出的无糖链的OMSVP3(区分E至F)的IC50值如图所示(图26)。
<实施例4>热安定性的测定
将CD测定用容器(cell)以蒸馏水装满,于室温直接测定。以此测定值作为对照(blank),其后的测定值全部是减去此对照值而计算者。
[糖链加成OMSVP3(区分B)的热安定性]
使区分B溶解于蒸馏水300μL中,于室温测定。测定结束后,将样品装满容器,使整个容器直接浸于恒温槽中并进行温度可变实验。首先将已于50℃恒温槽浸10分钟的容器于室温静置10分钟后,进行测定。然后,进行同样的操作至90℃,测定CD谱图。结果示于图27。
[无糖链的OMSVP3(区分F)的热安定性]
使区分F溶解于蒸馏水300μL中,于室温测定。测定结束后,将样品装满容器,使整个容器直接浸于恒温槽中并进行温度可变实验。首先将已于50℃恒温槽浸10分钟的容器于室温静置10分钟后,进行测定。然后,进行同样的操作至90℃,测定CD谱图。结果示于图28。
<实施例5>卵类粘蛋白第3功能域的双硫定位
合成的OMSVP3具有3个双硫键。双硫键为在蛋白质的折叠时所形成者,其形成过程为平衡反应。因此,认为也可能在与天然型蛋白质不同的位置发生双硫键形成。
此次所合成的OMSVP3(区分B)由NMR与抑制活性评估的结果为单一化合物,预测在与天然型蛋白质相同的位置形成双硫键。此处,为了确认区分B是否确实在与天然者相同的位置形成双硫键,而进行以下的研究。
[氨基酸序列及糖链为一致的OMSVP3(区分B)的双硫定位]
对于实施例1所得区分B(0.4mg),将溴化氰(1mg/Ml)于40%乙腈、2%TFA水溶液中,于37℃、遮光条件下使其反应一夜。使其冻结干燥,通过HPLC(VyDAC column C4(Imtakt Inc.),3μm,4.5×250mm,洗脱溶剂A:0.09%TFA水溶液 B:0.1%TFA乙腈∶水=90∶10,梯度A∶B=80∶20→40∶60(乙腈的梯度:18%→54%),30分钟,流速1.0ml/min)精制而获得区分I。
ESI-MS:C318H494N74O130S6:[M+4H]4+计算值1907.5,实测值1907.4
其次,在溶解有嗜热菌蛋白酶(Thermolysin)(50μg/mL)的50M Tris缓冲液(pH 7.6,含有10mM CaCl2)中,使区分I(0.1mg)溶解于其中,于37℃培养。3小时后,通过HPLC(VyDAC column C4(Imtakt Inc.),3μm,4.5×250mm,洗脱溶剂A:0.09%TFA水溶液 B:0.1%TFA乙腈∶水=90∶10,梯度A∶B=95∶5→50∶50(乙腈的梯度:4.5%→45%),15分钟,流速1.0ml/min)精制而获得区分II至区分VI(图29、30)。
ESI-MS:
区分II:C35H54N10O13S2:[M+2H]2+计算值444.8,实测值444.7
区分III:C25H37N7O8:[M+H]+计算值564.4,实测值564.4
区分IV:C114H187N19O64S2:[M+3H]3+计算值971.6,实测值971.5
区分V:C123H196N20O66S2:[M+3H]3+计算值1026.0,实测值1025.9
区分VI:C64H93N15O22S2:[M+2H]2+计算值744.8,实测值745.0
[不具有糖链的OMSVP3(区分F)的双硫定位]
对于实施例1所得区分F(0.4mg),将溴化氰(1mg/Ml)、于40%乙腈、2%TFA水溶液中,于37℃、遮光条件下使其反应一夜。使其冻结干燥,通过HPLC(VyDAC column C4(Imtakt Inc.),3μm,4.5×250mm,洗脱溶剂A:0.09%TFA水溶液 B:0.1%TFA乙腈∶水=90∶10,梯度A∶B=80∶20→40∶60(乙腈的梯度:18%→54%),30分钟,流速1.0ml/min)精制而获得区分VII。
ESI-MS:C256H392N70O85S6:[M+4H]4+计算值1501.6,实测值1501.5
其次,在溶解有嗜热菌蛋白酶(Thermolysin)(50μg/mL)的50M Tris缓冲液(pH 7.6,含有10mM CaCl2)中,使区分VII(0.1mg)溶解于其中,于37℃培养。4小时后,通过HPLC(VyDAC column C4(Imtakt Inc.),3μm,4.5×250mm,洗脱溶剂A:0.09%TFA水溶液 B:0.1%TFA乙腈∶水=90∶10,梯度A∶B=95∶5→50∶50(乙腈的梯度:4.5%→45%),15分钟,流速1.0ml/min)精制而获得区分VIII至区分XI(图31、32)。
ESI-MS:
区分VIII:C35H54N10O13S2:[M+2H]2+计算值444.8,实测值444.7
区分IX:C25H37N7O8:[M+H]+计算值564.4,实测值564.4
区分X:C52H85O19S2:[M+2H]2+计算值644.8,实测值644.9
区分XII:C64H93N15O22S2:[M+2H]2+计算值744.8,实测值744.9
使用CNBr处理,在具有糖链的OMSVP3(区分B)序列中的甲硫氨酸部位予以特异性地切断肽(区分I),接着进行嗜热菌蛋白酶消化的结果,获得以双硫键连接的肽片段(图29)。各别的肽片段在精制后,利用ESI-mass测定其质量。然后,解析所得的质量是与OMSVP3的何种片段相当。结果所得的推定结构示于图33的下方图。关于使用同样方法的不具有糖链的OMSVP3(区分F),也使用同样的方法解析(参照图31、34),结果所得的推定结构示于图34的下方图。确认在与天然的OMSVP3相同位置形成双硫键(图31、34)。由這些双硫定位所推定的区分B及区分F的双硫键位置,是与已解析的天然OMSVP3的双硫键位置为一致者。
由這些事实显示,通过本发明的折叠步骤、区分步骤及回收步骤,可制造氨基酸序列、糖链结构及高阶结构均为一致的糖蛋白质。再者,在为OMSVP3的情形中,本发明的区分步骤中作为最大峰所得的区分,具有与天然为相同的双硫键,而且为高活性区分,可有效率地制造具有所期望结构及所期望活性的糖蛋白质。又,此事实在制造其它糖蛋白质的情况中,即使最大峰的区分不是所期望的活性或所期望的结构,通过适宜回收具有所期望活性的其它区分,仍然可制造具有既定活性且氨基酸序列、糖链结构及高阶结构均为一致的糖蛋白质,本发明为可实施而无妨碍者。
本发明的实施例中,使具有糖蛋白质的卵类粘蛋白第3功能域折叠并利用HPLC進行区分的图形(图10),与使不具有糖链的第3功能域折叠并利用HPLC進行区分的图形(图18),为具有4个峰而为比较类似者。再者,活性的强度也分别于实施例2中为区分A>区分B>区分D>区分C,区分F>区分E>区分H>区分G(图13及21),于实施例3中为区分A>区分B>区分C>区分D,区分E>区分F>区分G>区分H(图23至26)而为类似的,故看來具有相同的高阶结构者是以相同的顺序溶出。其中作为最大峰而获得的具有高活性的区分B与区分F的双硫键的位置为一致,也为其整合结果。
然而,区分B与区分F的C谱图不一致,显示两者的高阶结构不同(图12与图20)。此事实显示加成糖链会对不具有糖链的蛋白质的折叠赋予应变等,由此而在蛋白质的高阶结构造成变化。
蛋白质的如此的高阶结构的变化,因为在对于与基质的结合容易性等也有影响的点上,推测对于生理活性可能有影响,再者,在对于肾小球过滤体的穿透容易性等也有影响的点上,推测对于血中半衰期也可能有影响。由此可知,糖蛋白质使用作为医药品时,通过仅将于蛋白质加成有糖链的状态且高阶结构为一定者予以精制分离,而制造生理活性及血中半衰期为一定的医药为重要的,本发明的方法是使此构想成为可能者。
<参考例1抑制活性试验用基质的合成>
[基质肽的合成]
在固相合成用柱中加入2-氯三苯甲基树脂(143mg,200μmol),利用二氯甲烷(DCM)充分洗净。另外,使Fmoc-Phe(232.4mg,0.6mmol)与DIPEA(272.1μL,1.6mmol)溶解于DCM(1.2mL)者,加入已加有树脂的固相合成用柱中,于室温搅拌2小时。搅拌后,将树脂利用DCM∶MeOH∶DIPEA=17∶2∶1、DCM、DMF洗净。其次,将Fmoc基以20分钟利用20%哌啶/DMF溶液(2mL)脱保护。利用DMF洗净后,通过Kaiser Test确认反应,其后的肽链的延长是利用以下所示的方法,依序使氨基酸缩合。
将经Fmoc基保护氨基的氨基酸与HOBt(135.1mg,1mmol)、DIPCI(153.9μL,1mmol)溶解于DMF(4mL)使其活性化15分钟后,加入至固相合成用柱,于室温搅拌1小时。搅拌后,树脂利用DCM、DMF洗净。将Fmoc基以20分钟利用20%哌啶/DMF溶液(2mL)脱保护。重复此操作,依序使氨基酸缩合。经保护氨基的氨基酸为使用Fmoc-Asn、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Asn、Fmoc-Gly、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Asn、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Gly,最后的氨基酸是使用Boc-Cys(Thz)-OH(233.3mg,1mmol)。于固相树脂上,获得Boc-Cys(Thz)-Gly-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Asn-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-Asn-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asn-Phe的具有保护基的14残基肽(序列编号11)。在其中,加入95%TFA、2.5%TIPS、2.5%H2O溶液(3mL)于室温搅拌2小时。过滤去除树脂,减压下浓缩滤液。使其通过HPLC(VyDAC column C4(Imtakt Inc.),3μm,4.5×250mm,洗脱溶剂A:0.09%TFA水溶液 B:0.1%TFA乙腈∶水=90∶10,梯度A∶B=95∶5→50∶50(乙腈的梯度:4.5%→45%),15分钟,流速1.0ml/min)精制后,进行冻结干燥,获得Cys(Thz)-Gly-Ser-Asp-Asn-Lys-Thr-Tyr-Gly-Asn-Lys-Cys-Asn-Phe的具有保护基的14残基肽(序列编号16)。
ESI-MS:C64H95N19O23S2[M+2H]2+计算值782.34,实测值782.2
[基质肽的标准曲线的作成]
使合成的14残基肽(序列编号16)1.5mg溶解于0.1M磷酸缓冲液(pH 8.0,含有BSA(0.1mg/ml))1ml,稀释此溶液而调制为0.6mM、0.4mM、0.2mM、0.1mM的基质浓度的溶液。分别测定3次各浓度的溶液的OD280,将平均值化者示于表2及图35。
[表2]
mM | 1次 | 2次 | 3次 | 平均值 |
0.6 | 0.85 | 0.85 | 0.83 | 0.84 |
0.4 | 0.6 | 0.58 | 0.56 | 0.58 |
0.2 | 0.3 | 0.28 | 0.28 | 0.28 |
0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
[基质肽的Michaelis-Menten plot的导出]
使合成的14残基肽(序列编号16)3.1mg溶解于0.1M磷酸缓冲液(pH 8.0,含有BSA(0.1mg/ml))1ml,调制2mM的溶液。稀释此溶液而调制为1.6mM、1.2mM、0.8mM、0.4mM、0.2mM、0.1mM、0.05mM的浓度的基质溶液。再者,使胰凝乳蛋白酶(1mg)溶解于0.1M磷酸缓冲液(pH=8.0,含有BSA(0.1mg/Ml))1mL,重复进行将此溶液稀释10倍再将此溶液稀释10倍的操作,以成为0.1μg/mL的方式调制。将50μL的已于冰上充分冰冷的各浓度的基质溶液、50μL的酵素溶液,分别移至相同的离心管,于37℃培养30分钟。30分钟后,加入1N盐酸10μL使反应停止。使反应液20μL与缓冲液80μL混合而成为合计100μL,使用于通过HPLC而进行的测定。由反应生成物的HPLC上的峰面积计算每单位时间的分解率(每单位时间的反应速度)(图36)。表3显示对于各基质浓度的反应速度。
[表3]
基质(mM) | V(mol/min) |
1 | 0.087 |
0.8 | 0.083 |
0.6 | 0.075 |
0.4 | 0.068 |
0.2 | 0.046 |
0.1 | 0.027 |
0.05 | 0.013 |
[基质肽的Lineweaver-Burk plot的导出]
使合成的14残基肽(序列编号16)1.5mg溶解于0.1M磷酸缓冲液(pH 8.0,含有BSA(0.1mg/ml))1ml,调制1mM的溶液。稀释此溶液而调制为1mM、500μM、333μM、250μM、200μM的浓度的基质溶液。再者,使胰凝乳蛋白酶(1mg)溶解于0.1M磷酸缓冲液(pH=8.0,含有BSA(0.1mg/mL))1mL,重复将所述溶液稀释10倍再将此溶液稀释10倍的操作,以成为0.1μg/mL的方式调制。将50μL的已于冰上充分冰冷的各浓度的基质溶液、50μL的酵素溶液,分别移至相同的离心管,于37℃培养30分钟。30分钟后,加入1N盐酸10μL使反应停止。使反应液20μL与缓冲液80μL混合而成为合计100μL,使用于通过HPLC而进行的测定。由反应生成物的HPLC上的峰面积计算每单位时间的分解率(每单位时间的反应速度)(图37)。表4显示对于各基质浓度的倒数的反应速度的倒数。
[表4]
1/基质(1/mM) | 1/V(mol/min) |
2 | 7.02 |
4 | 8.51 |
6 | 11.9 |
8 | 10.9 |
10 | 14.7 |
产业上可利用性
根据本发明的制造方法,可制得除了氨基酸序列、糖链结构以外,高阶结构也为一致的糖蛋白质。根据本发明的制造方法所制得的糖蛋白质,由于高阶结构一致,故不仅血中半衰期及细胞内的输送不会有杂乱不均的情形,且具有一致的既定的生理活性。再者,根据本发明,可控制使糖蛋白质的混合物具有所期望的活性。因此,本发明的制造方法,特别可使用于利用糖蛋白质的医药品的开发。
<序列表的文字>
序列编号1为片段1的具有保护基的氨基酸序列。
序列编号2为片段1的具有苄基硫酯基的氨基酸序列。
序列编号3为片段2的具有保护基的氨基酸序列。
序列编号4为片段2的经糖链加成的具有保护基的氨基酸序列。
序列编号5为片段2的经糖链加成的具有苄基硫酯基及保护基的氨基酸序列。
序列编号6为片段3的具有保护基的氨基酸序列。
序列编号7为片段3的氨基酸序列。
序列编号8为经糖链加成的具有保护基的氨基酸序列。
序列编号9为经糖链加成的氨基酸序列。
序列编号10为糖链加成OMSVP3的经糖链加成的氨基酸序列。
序列编号11为片段2’的具有保护基的氨基酸序列。
序列编号12为片段2’的具有苄基硫酯基及保护基的氨基酸序列。
序列编号13为具有保护基的氨基酸序列。
序列编号14为氨基酸序列。
序列编号15为未经糖链加成的OMSVP3的的氨基酸序列。
序列编号16为胰凝乳蛋白酶基质,为具有保护基的氨基酸序列。
Claims (6)
1.一种糖蛋白质的制造方法,所述的方法为制造氨基酸序列、糖链结构及高阶结构为一致的糖蛋白质的方法,其特征在于,包含以下步骤(a)至(c):
(a)使氨基酸序列及糖链为一致的糖蛋白质折叠(folding)的步骤;
(b)使前述所折叠的糖蛋白质通过柱层析而进行区分(fractionating)的步骤;以及
(c)将具有既定活性的区分(fraction)回收的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在所述步骤(c)后,复包含:(d)使于前述步骤(c)未回收的区分中所包含的糖蛋白质展开(unfolding)的步骤;
(e)使前述所展开的糖蛋白质再度折叠的步骤;
(f)使前述再度折叠的糖蛋白质通过柱层析而进行区分,将具有前述既定活性的区分回收的步骤;以及
(g)根据需要而重复进行步骤(d)至(f)的步骤。
3.一种糖蛋白质的筛选方法,所述的方法为筛选具有既定生理活性的糖蛋白质的方法,其特征在于,包含以下步骤(i)至(iii):
(i)使氨基酸序列及糖链为一致的糖蛋白质折叠的步骤;
(ii)使前述所折叠的糖蛋白质通过柱层析而进行区分的步骤;以及
(iii)测定各区分的活性,判定是否具有既定的活性的步骤。
4.一种获得糖蛋白质混合物的方法,所述的方法为获得具有所期望的生理活性的糖蛋白质混合物的方法,其特征在于,包含以下步骤(A)至(D):
(A)使氨基酸序列及糖链为一致的糖蛋白质折叠的步骤;
(B)使前述所折叠的糖蛋白质通过柱层析而进行区分的步骤;
(C)测定各区分的活性的步骤;以及
(D)求出用以获得所期望活性的各区分的混合比率,根据所述比率使各区分混合的步骤。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其特征在于,所述氨基酸序列及糖链为一致的糖蛋白质的至少一部分是通过包含以下步骤(1)至(6)的方法所制造,
(1)使具有羟基的树脂的羟基,与经脂溶性保护基保护氨基的氨基酸的羧基或经脂溶性保护基保护氨基的糖链加成氨基酸的羧基,进行酯化反应的步骤;
(2)使前述脂溶性保护基脱离而形成游离氨基的步骤;
(3)使前述游离氨基,与经脂溶性保护基保护氨基的氨基酸的羧基或经脂溶性保护基保护氨基的糖链加成氨基酸的羧基,进行酰胺化反应的步骤;
(4)在前述步骤(3)后,使前述脂溶性保护基脱离而形成游离氨基的步骤;
(5)将前述步骤(3)及(4)的步骤重复进行1次以上的步骤;以及
(6)将前述步骤(1)所形成的酯键以酸切断的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,在前述氨基酸序列及糖链为一致的糖蛋白质的一部分是通过前述步骤(1)至(6)制造时,所述糖蛋白质是通过复包含以下步骤(7)的方法所制造:
(7)将于前述步骤(6)所得的糖蛋白质的一部分,与其它肽或糖肽,通过连接法(ligation)而连结的步骤。
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Cited By (1)
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---|---|---|---|---|
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RU2400490C2 (ru) * | 2003-12-03 | 2010-09-27 | Биодженерикс Аг | Гликопэгилированный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор |
NZ547554A (en) * | 2003-12-03 | 2009-09-25 | Biogenerix Ag | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor |
NZ554520A (en) * | 2004-10-22 | 2010-03-26 | Amgen Inc | Methods for refolding of recombinant antibodies |
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102415478A (zh) * | 2011-12-12 | 2012-04-18 | 北京和利美生物科技有限公司 | 一种可促进微量元素吸收的离子配位体、复合微量元素饲料添加剂及其制备方法 |
CN102415478B (zh) * | 2011-12-12 | 2014-07-02 | 北京和利美生物科技有限公司 | 一种可促进微量元素吸收的离子配位体、复合微量元素饲料添加剂及其制备方法 |
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