CN102121051B - 水产品中主要病原菌的多重荧光定量pcr检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种水产品中主要病原菌的多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于包括①取待测样品在增菌液中进行增菌培养4～8小时；②培养后的样品采用煮沸法抽提基因组DNA；③利用特异性的引物与TaqMan探针进行多重荧光定量PCR检测；④根据检测后的特异性S扩增曲线和阈值(Ct value)进行结果判断。与现有技术相比，本发明的优点在于：可以实现一管多检的实际需要，为副溶血弧菌、霍乱弧菌和单增李斯特菌的快速、灵敏、特异检出提供重大技术保障。
Description
技术领域
本发明涉及一种水产品中副溶血弧菌、霍乱弧菌和单增李斯特菌的多重荧光定量PCR检测方法。
背景技术
近年来，食源性疾病呈现上升趋势，这类疾病主要由食源性致病菌引起，包括在水产动物或养殖环境中长期存在的副溶血弧菌、单增李斯特菌及可通过食物传播的霍乱弧菌等。然而，由于含菌量少、菌株变异大和检测方法的局限性等原因，往往使得传统检测方法无法检出或者容易漏检。因此，寻求快速、灵敏、特异的方法来检测水产品中的副溶血弧菌、霍乱弧菌和单增李斯特菌具有重要意义。
食源性病原菌的检测技术经历了从传统的分离鉴定法、免疫检测技术，到分子生物学方法的转变。目前，国内外对副溶血弧菌、霍乱弧菌和单增李斯特菌的快速检测技术已有不少研究，如专利号为ZL03146896.9的中国发明专利《一种快速检测副溶血弧菌的方法》(授权公告号：CN1280425C)，又如申请号为200710046637.4的中国发明专利申请公开《一种用于检测副溶血弧菌的方法》(公开号：CN101140243A)；针对霍乱弧菌的有申请号为200710030446.9的中国发明申请公开《霍乱弧菌检测用引物、检测方法、检测试剂盒》(公开号：CN101153332A)，又如申请号为200810198809.4的中国发明专利申请公开《霍乱弧菌基因快速诊断试剂盒及其检测方法》(公开号：CN101403005A)；针对单增李斯特菌的有申请号为200610029348.9的中国发明专利申请公开《一种快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒》(公开号：CN101113465A)，又见申请号为200810201408.X的中国发明专利申请公开《单增李斯特菌检测试剂盒及其检测方法》(公开号：CN101381777A)；公开文献里也有多重荧光定量PCR方面的文献，如申请号为200610068561.0的中国发明专利申请公开《食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的PCR检测方法》(公开号：CN1967234A)。
虽然现有技术已经作了很多研究，但是在同一个反应管内，利用具有多个激光通道的荧光PCR检测仪，建立一种同时检测副溶血弧菌、霍乱弧菌和单增李斯特菌的多重荧光定量PCR反应体系未见报道和相关文献公开。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状而提供一种在水产品中同时能检测副溶血弧菌、霍乱弧菌和单增李斯特菌的多重荧光定量PCR检测方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种水产品中主要病原菌的多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于包括
①取待测样品在增菌液中进行增菌培养4～8小时；
②培养后的样品采用煮沸法抽提基因组DNA；
③利用特异性的引物与TaqMan探针进行多重荧光定量PCR检测；
④根据检测后的特异性S扩增曲线和循环值进行结果判断，
其中步骤③中的特异性的引物与TaqMan探针如下：
探针的5’则要根据所采用的荧光定量PCR仪的多种荧光通道进行区别标记，探针的3’淬灭基团可以选择ECLIPSE或BHQ系列。
步骤①所述的增菌液中包括如下浓度的培养基：蛋白胨8～11g/L，酵母浸粉或牛肉浸粉17～18g/L，葡萄糖1～3g/L，磷酸二氢钠2～3g/L，氯化钠25～35g/L，并且pH值保持在8.1～8.5。
步骤③中多重荧光定量PCR检测时的反应体系含Mg2+的PCR buffer 2～3μL，dNTP为0.4～0.5μL，Taq酶为0.5～0.6μL，tlh、vcc、hly基因上下游引物各取6～6.5pmol，针对tlh、vcc、hly基因的TaqMan探针各取4～4.5pmol，样品DNA取2μL，ddH2O补充体积至20μL。
步骤③中多重荧光定量PCR检测时的反应参数为95℃预变性3～5min；95℃变性10～15sec，62℃退火并延伸45～60sec，40个循环，在每个循环的62℃退火并延伸阶段收集荧光信号。
首先，根据营养要求、盐浓度和pH值等条件筛选并配制出一种选择性培养基，能同时对三种细菌进行增菌培养，其次，据NCBI上公布的核苷酸序列，设计出多种特异性引物与探针，通过后续验证与条件摸索选出最适引物与探针，并进行不同的荧光素标记。最后，经反复试验，优化多重荧光定量PCR反应体系和反应参数，建立一管多检的荧光定量PCR方法。
基于本发明研制的水产品中主要致病菌多重荧光定量PCR检测试剂盒，包括下列试剂：
a、TZ液1管，用于DNA抽取，保存于-20℃；
b、PCR反应混合液1管，内有Taq酶(巿购)、dNTP(巿购)、含Mg2+的PCR buffer(巿购)，ddH2O，三对引物与探针(序列由发明人设计，见权利要求书表1)，-20℃避光保存；
c、阳性对照1管，内装适当浓度(1-5×106CFU/mL)的副溶血弧菌、霍乱弧菌和单增李斯特菌抽提的DNA，保存于-20℃；
d、阴性对照1管，内装无特定病原菌的水产品经同法增菌后提取的DNA，保存于-20℃。
基于本发明建立的三重荧光定量PCR反应体系，可以采用以下具体实施方案：
样品的处理与DNA抽提方法，优选采用如下方案：取25g水产品类样品，用上述增菌液225mL制成匀浆后置37±1℃培养4-8h。取培养后的增菌液1.5mL至离心管中，12000rpm离心3min，并弃去上清；用1mL的ddH2O重悬沉淀，12000rpm离心2min，并弃去上清，重复此步操作一次；在沉淀中分别加入30uL的2×TZ和ddH2O，混匀于-20℃放置30min；100℃沸水浴10min；冰水浴10min，12000rpm离心1min，上清液即为所需的DNA。
加样步骤，优选采用如下方案：取18μL的PCR反应混合液加入PCR反应管中，然后分别加入2μL DNA抽提液。另外，设定的阳性对照孔内加入阳性对照DNA液2μL，阴性对照孔内则加阴性对照DNA液或ddH2O 2μL。轻微离心，使样品混匀并落入管底，即可准备进行多重荧光定量PCR反应。
反应程序设置，优选采用如下方案：在多通道检测模式下，分别用不同颜色标记FAM、TAMRA、TEXAS RED三个荧光通道，并将待测样品放入对应的位置。设置反应程序如下：95℃预变性3min；95℃变性15sec，62℃退火并延伸1min，40个循环，在每个循环的62℃退火并延伸阶段收集荧光信号。
结果判断方法，优选采用如下方案：根据三重荧光定量PCR反应中的特异性S曲线与对应的阈值大小判断被检样品中是否有副溶血弧菌、霍乱弧菌和单核细胞增多性李斯特菌。对于无S曲线产生且Ct值≥40者，判定结果为阴性，可直接报告未检出；Ct值≤35，可判定该样品结果为阳性；Ct值＞35而＜40，建议样本重做。重做Ct值≥40者为阴性，否则为阳性。
与现有技术相比，本发明的优点在于：可以实现一管多检的实际需要，为上述副溶血弧菌、霍乱弧菌和单增李斯特菌的快速、灵敏、特异检出提供重大技术保障。同时，可以应用于日常的微生物检验中，为提高食品卫生质量、促进我国食品出口等方面做出重要贡献。
附图说明
图1为利用本发明涉及的检测试剂盒检测阳性和阴性样品的副溶血弧菌、霍乱弧菌和单增李斯特菌扩增曲线图；
图2为利用本发明涉及的检测试剂盒检测阳性和阴性样品的副溶血弧菌扩增曲线图；
图3为利用本发明涉及的检测试剂盒检测阳性和阴性样品的霍乱弧菌扩增曲线图；
图4为利用本发明涉及的检测试剂盒检测阳性和阴性样品的单增李斯特菌扩增曲线图；
图5为利用本发明涉及的检测试剂盒检测阳性和阴性样品的副溶血弧菌、霍乱弧菌扩增曲线图；
图6为利用本发明涉及的检测试剂盒检测阳性和阴性样品的副溶血弧菌、单增李斯特菌扩增曲线图；
图7为利用本发明涉及的检测试剂盒检测阳性和阴性样品的霍乱弧菌、单增李斯特菌扩增曲线图；
图8为利用本发明涉及的检测试剂盒进行的干扰性试验研究扩增曲线图；
图9为利用本发明涉及的检测试剂盒进行的敏感性试验扩增曲线图；
图10为图9所对应的标准曲线图；
图11为A样品所得的扩增曲线图。
图12为B样品所得的扩增曲线图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例子：虾仁的检测(A，B两个样品)，具体按照如下步骤：
1.取25g虾仁样品，剪碎后分别与225mL增菌液混合，置37±1℃培养4-6h；
2.分别取1.5mL增菌液至离心管中，12000rpm离心3min，弃上清；
3.用1mL的ddH2O重悬沉淀，12000rpm离心2min，并弃上清，重复操作一次；
4.煮沸法，抽提A、B样品的基因组DNA；
5.取18μL的PCR反应混合液加入PCR反应管中，然后分别加入2μL DNA；
6.按前述程序设置后，将PCR反应管放入荧光定量PCR仪中进行检测；
7.分析特异性S曲线与待测样品的Ct值，进行结果判定。
如图11和图12所示，根据实施例中A、B两样品的扩增曲线图谱分析，A样品中同时存在副溶血弧菌与霍乱弧菌，B样品中同时存在副溶血弧菌、霍乱弧菌、单增李斯特菌。A样品中tlh、vcc基因产生了特异性的S型扩增曲线，而hly基因则无特异性的扩增，表明该A样品中同时含有副溶血弧菌和霍乱弧菌，不存在单增李斯特菌。B样品中tlh、vcc、hly三基因均产生明显的S型扩增曲线，表明该样品中同时含有副溶血弧菌、霍乱弧菌和单增李斯特菌。
多重荧光定量PCR检测试剂盒，包括下列试剂：
e、TZ液1管，用于DNA抽取，保存于-20℃；
f、PCR反应混合液1管，内有Taq酶(巿购)、dNTP(巿购)、含Mg2+的PCR buffer(巿购)，ddH2O，三对引物与探针(序列由发明人设计，见权利要求书表1)，-20℃避光保存；
g、阳性对照1管，内装适当浓度(1-5×106CFU/mL)的副溶血弧菌、霍乱弧菌和单增李斯特菌抽提的DNA，保存于-20℃；
h、阴性对照1管，内装无特定病原菌的水产品经同法增菌后提取的DNA，保存于-20℃。
基于本发明建立的三重荧光定量PCR反应体系，可以采用以下具体实施方案：
样品的处理与DNA抽提方法，优选采用如下方案：取25g水产品类样品，用上述增菌液225mL制成匀浆后置37±1℃培养4-8h。取培养后的增菌液1.5mL至离心管中，12000rpm离心3min，并弃去上清；用1mL的ddH2O重悬沉淀，12000rpm离心2min，并弃去上清，重复此步操作一次；在沉淀中分别加入30uL的2×TZ和ddH2O，混匀于-20℃放置30min；100℃沸水浴10min；冰水浴10min，12000rpm离心1min，上清液即为所需的DNA。
加样步骤，取18μL的PCR反应混合液加入PCR反应管中，然后分别加入2μL DNA抽提液。另外，设定的阳性对照孔内加入阳性对照DNA液2μL，阴性对照孔内则加阴性对照DNA液或ddH2O 2μL。轻微离心，使样品混匀并落入管底，即可准备进行多重荧光定量PCR反应。
反应程序设置，在多通道检测模式下，分别用不同颜色标记FAM、TAMRA、TEXASRED三个荧光通道，并将待测样品放入对应的位置。设置反应程序如下：95℃预变性3min；95℃变性15sec，62℃退火并延伸1min，40个循环，在每个循环的62℃退火并延伸阶段收集荧光信号。
结果判断方法，根据三重荧光定量PCR反应中的特异性S曲线与对应的阈值大小判断被检样品中是否有副溶血弧菌、霍乱弧菌和单核细胞增多性李斯特菌。对于无S曲线产生且Ct值≥40者，判定结果为阴性，可直接报告未检出；Ct值≤35，可判定该样品结果为阳性；Ct值＞35而＜40，建议样本重做。重做Ct值≥40者为阴性，否则为阳性。
如图1所示，扩增曲线的横坐标为反应循环数(Cycle Number)，纵坐标为不同循环数所对应的荧光值(Delta Rn)。阳性对照中tlh、vcc、hly三基因的扩增曲线均呈现特异性的S型；而阴性对照中tlh、vcc、hly三基因的扩增曲线平直。被测样品中tlh、vcc、hly三基因均呈现明显的S型扩增曲线，表明该样品中同时含有副溶血弧菌、霍乱弧菌和单增李斯特菌。
如图2所示，被测样品中tlh基因的扩增曲线呈现特异性的S型，表明该样品中含有副溶血弧菌。
如图3所示，被测样品中vcc基因的扩增曲线呈现特异性的S型，表明该样品中含有霍乱弧菌。
如图4所示，被测样品中hly基因的扩增曲线呈现特异性的S型，表明该样品中含有单增李斯特菌。
如图5所示，被测样品中tlh基因的扩增曲线呈现特异性的S型，表明该样品中含有副溶血弧菌。
如图6所示，被测样品中tlh、hly基因的扩增曲线呈现特异性的S型，表明该样品中同时含有副溶血弧菌、单增李斯特菌。
如图7所示，被测样品中vcc、hly基因的扩增曲线呈现特异性的S型，表明该样品中同时含有霍乱弧菌、单增李斯特菌。
如图8所示，图中以霍乱弧菌∶单增李斯特菌∶副溶血弧菌的DNA比等于104∶102∶1为例。表明高浓度细菌所对应的荧光信号收集对中、低浓度细菌所对应的荧光信号收集无干扰作用。
如图9所示，将同时含有副溶血弧菌、霍乱弧菌和单增李斯特菌的阳性样品梯度稀释进行的PCR反应。
如图10所示，横坐标为荧光阈值(Ct value)，纵坐标为起始DNA浓度的对数值，回归方程可以看出标准曲线的相关系数均在0.99以上，线性关系良好。
序列表
<110>中华人民共和国舟山出入境检验检疫局
<120>水产品中主要病原菌的多重荧光定量PCR检测方法
<160>9
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>vibrio parahaemolyticus
<400>1
gtgcgaaagt gcttgagatg
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>vibrio parahaemolyticus
<400>2
agaagttagc gtctcgaaca ag
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>vibrio parahaemolyticus
<400>3
cgagttcatc aaggcacaag cga
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>vibrio cholera
<400>4
gtctggccat gtgggtaact
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>vibrio cholera
<400>5
cactcattgt ccagagcgaa
<210>6
<211>26
<212>DNA
<213>vibrio cholera
<400>6
taccgctacttagccgccaa cactca
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>listeria monocytogene
<400>7
ttagcttggg aatggtggag
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>listeria monocytogene
<400>8
ttcggataaa gcgtagtgcc
<210>9
<211>27
<212>DNA
<213>listeria monocytogene
<400>9
ttgatgaccg gaacttacca cttgtga
Claims (4)
1.一种水产品中主要病原菌的非诊断目的的多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于包括
①取待测样品在增菌液中进行增菌培养4～8小时；
②培养后的样品采用煮沸法抽提基因组DNA；
③利用特异性的引物与TaqMan探针进行多重荧光定量PCR检测；
④根据检测后的特异性S扩增曲线和循环值进行结果判断，
其中步骤③中的特异性的引物与TaqMan探针如下：
所述的主要病原菌为副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)、霍乱弧菌(V.cholera)或单增李斯特菌(L.monocytohenes)。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤①所述的增菌液中包括如下浓度的培养基：蛋白胨8～11g/L，酵母浸粉或牛肉浸粉17～18g/L，葡萄糖1～3g/L，磷酸二氢钠2～3g/L，氯化钠25～35g/L，并且pH值保持在8.1～8.5。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤③中多重荧光定量PCR检测时的反应体系含Mg2+的PCR buffer 2～3μL，dNTP为0.4～0.5μL，Taq酶为0.5～0.6μL，tlh、vcc、hly基因上下游引物各取6～6.5pmol，针对tlh、vcc、hly基因的TaqMan探针各取4～4.5pmol，样品DNA取2μL，ddH2O补充体积至20μL。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤③中多重荧光定量PCR检测时的反应参数为95℃预变性3～5min；95℃变性10～15sec，62℃退火并延伸45～60sec，40个循环，在每个循环的62℃退火并延伸阶段收集荧光信号。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101140243A (zh) * | 2007-09-29 | 2008-03-12 | 上海水产大学 | 一种用于检测副溶血弧菌的方法 |
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Patent Citations (4)
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| CN101153332A (zh) * | 2007-09-21 | 2008-04-02 | 珠海市疾病预防控制中心 | 霍乱弧菌检测用引物、检测方法、检测试剂盒 |
| CN101140243A (zh) * | 2007-09-29 | 2008-03-12 | 上海水产大学 | 一种用于检测副溶血弧菌的方法 |
| CN101403005A (zh) * | 2008-09-26 | 2009-04-08 | 广州华峰生物科技有限公司 | 霍乱弧菌基因快速诊断试剂盒及其检测方法 |
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