CN102109527B - 一种重组人p43蛋白生物学活性的检测方法 - Google Patents

Abstract

提供了一种测量重组人p43蛋白的生物学活性的方法，所述方法包括以下步骤：(1)使重组人p43蛋白诱导小鼠单核巨噬细胞Raw264.7，产生TNFα；(2)通过酶联免疫法测定步骤(1)生成的TNFα含量；(3)根据步骤(2)得到的TNFα含量得到重组人p43蛋白的生物学活性。本发明利用活性状态下的p43具有活化免疫***的功能性反应以进行p43生物学活性测定，具有特异强、反应快速、重复性好，并能定量反应p43生物学活性的优点。

Description

一种重组人p43蛋白生物学活性的检测方法

技术领域

本发明涉及生物制品活性检测技术领域，具体涉及一种重组人p43蛋白生物学活性的检测方法。

背景技术

恶性肿瘤是威胁人类健康的大敌，医学界对恶性肿瘤的治疗主要采取杀死癌细胞为主的方法，即：手术治疗、化疗、放疗等。这些方法在杀死癌细胞的同时也损伤正常细胞，并且容易使肿瘤细胞产生耐药性。因而，人们一直在探索一种能专一性地杀死肿瘤细胞且不损伤正常细胞，同时又不易使肿瘤产生耐药性的治癌方法。目前用于***的新药不断涌现。近年来，随着分子生物学技术的快速发展，人们逐渐关注运用基因工程药物治疗恶性肿瘤的方法。传统的肿瘤化疗大多使用细胞毒性药物，在杀死肿瘤细胞的同时也对正常细胞造成损害，削弱人的体质。所以很多癌症晚期患者最后多因为无法承受治疗而致死亡。恶性肿瘤有一个共同的特性，那就是局部的细胞疯狂地、不受遏制地增殖，而维持这种增殖就意味着需要大量营养供应。在肿瘤形成的同时，瘤体的内部及周围会形成大量供应养分的血管。那么如果能切断这些供养“管道”，阻断肿瘤的营养来源，肿瘤也就会衰竭而死。

当前兴起的新生血管抑制疗法为彻底***带来了曙光。研究发现肿瘤特别是实体瘤的生长需要大量的营养供应，在肿瘤周围会形成大量的新生血管。抗血管生成疗法主要是通过抑制快速异常增殖的血管内皮细胞的生长，特异性抑制肿瘤血管内皮细胞增殖，从而阻止肿瘤血管生成，使肿瘤毛细血管发生萎缩，切断肿瘤的营养供应，使肿瘤细胞凋亡或退化到最初的休眠状态，从而达到治疗癌症的目的。

经过近十年的不断努力，现在已发现了多种有希望成为肿瘤治疗药物的新生血管抑制剂。其中最具代表性的是人血管内皮抑制素(human endostatin)。有关人血管内皮抑制素(Endostatin)国际上首先报道是1997年1月Cell杂志上刊登的美国哈佛医学院福尔克曼(Folkman)研究小组关于鼠内皮抑素基因的论文，该研究发现Angiostatin和Endostatin可以消除小鼠体内恶性肿瘤，而且未再复发。这两种药物是以阻止为肿瘤提供营养的血管的生长从而***的。当时引起了国际轰动，Endostatin迅速成为肿瘤治疗领域的研究热点。美国FDA在没有完成临床前研究的情况下特批30例对其它药物已无反应的晚期癌症病人于99年初用人血管内皮抑制素(Angiostatin)和鼠内皮抑素(Endostatin)混合基因工程针剂进行临床试验。目前，Endostatin已经通过了FDA的一期临床，目前正处于二期临床阶段。但由于Endostatin的溶解性较差，使得它的制备成本升高，同时在使用上也只能采用水针剂型，这使它的应用受到了很大的限制。

p43蛋白是哺乳动物氨酰tRNA合成酶的辅助因子，一方面直接调节内皮细胞形成毛细血管的生理过程，另一方面p43也受到上游细胞因子的作用而从多种细胞中分泌，进一步活化巨噬细胞和树突细胞，从而抑制肿瘤生长。p43蛋白的抗血管生成活性及抑制肿瘤生长作用已经在体外及动物实验获得证实。人基因重组p43蛋白显示出其被开发成新型治疗癌症药物的潜力，对抗多种原发性和转移性实体肿瘤均有效，并可与化疗和放疗协同治疗。

p43蛋白作为人体氨酰tRNA合成酶系的家族成员并且是内皮单核细胞激活肽的前体于1997年被Sophie Q等人发现。p43蛋白为单链蛋白，全长312个氨基酸。韩国Imagene公司(WO01/95927)对人p43蛋白的结构、生物活性进行了深入的研究，结果显示人p43蛋白可以抑制快速异常增殖的血管内皮细胞的生长，以及抑制鸡胚***新生血管生成，这说明p43蛋白具有潜在的抗肿瘤作用。

定性和定量地测定重组人p43蛋白的生物学活性对于该药物的研发具有重要意义。目前血管生成抑制类药物的生物学活性测定还没有很好的解决办法，现有测定方法的原理主要建立在该类药物调节血管生成相关生理功能的基础上，具体实验方法包括体外的内皮细胞迁移试验、内皮细胞增殖试验和体内的鸡胚***血管生成试验、小鼠肿瘤抑制试验、Matrigel试验以及角膜新生血管生成试验。经研究，现有的这些测活方法均存在重复性较差，人为及实验材料影响因素较大，操作较难控制等问题。

因此，目前急需一种能够准确测量重组人p43蛋白生物学活性的方法和产品。

发明内容

本发明依据活性状态下的p43蛋白具有诱导小鼠单核巨噬细胞Raw264.7分泌TNFα的功能，进而通过研究确定重组人p43蛋白与诱导产生TNFα间的量效关系，提供一种简便、精确、快速定性和定量测定重组人p43蛋白的生物学活性的方法。

本发明一方面提供了一种测定重组人p43蛋白的生物学活性的方法，

本发明提供了一种测量重组人p43蛋白的生物学活性的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)使重组人p43蛋白诱导小鼠单核巨噬细胞Raw264.7，产生TNFα；

(2)通过酶联免疫法测定步骤(1)生成的TNFα含量；

(3)根据步骤(2)得到的TNFα含量得到重组人p43蛋白的生物学活性。

在本发明的一个优选实例中，所述步骤(1)中的诱导方法包括用缓冲液梯度稀释待测样品，并作出不少于五个稀释度，再将稀释液分别与小鼠单核巨噬细胞混合孵育培养。

在本发明的一个优选实例中，所述缓冲液是无血清DMEM培养基。

在本发明的一个优选实例中，所述酶联免疫法是双抗夹心法。

在本发明的一个优选实例中，所述步骤(3)是根据《中华人民共和国药典》2005年版三部和《生物技术药物研究开发和质量控制》第二版进行的。

在本发明的一个优选实例中，所述步骤(3)如下进行：以p43浓度的对数值lgC_p43为X值，以相应的TNFα浓度为Y值，采用Nonlinear regression曲线拟合，得到重组人p43蛋白的剂量-反应曲线，从而得到四参数分析结果。

在本发明的一个优选实例中，由所述步骤(3)得到的能诱导50％最大反应的重组人p43蛋白最高稀释度的倒数作为活性值。

本发明还提供了一种制备p43蛋白制品的方法，所述方法包括本发明所述的测量重组人p43蛋白的生物学活性的方法。

本发明利用活性状态下的p43具有活化免疫***的功能性反应以进行p43生物学活性测定，具有特异强、反应快速、重复性好，并能定量反应p43生物学活性的优点。

附图简述

图1为实施例1中重组人p43蛋白样品促进小鼠单核巨噬细胞Raw264.7分泌TNFα的剂量-效应S型曲线。

具体实施方式

在本发明中，如果没有特别的说明，百分数(％)或者份都指相对于组合物的重量百分数或者重量份。

在本发明中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。

在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方式可以相互组合形成新的技术方案。

在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。

在本发明中，如果没有相反的说明，组合物中各组分的含量之和为100％。

在本发明中，如果没有相反的说明，组合物中各组分的份数之和可以为100重量份。

在本发明中，除非有其他说明，数值范围“a-b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0-5”表示本文中已经全部列出了“0-5”之间的全部实数，“0-5”只是这些数值组合的缩略表示。

在本发明中，除非有其他说明，整数数值范围“a-b”表示a到b之间的任意整数组合的缩略表示，其中a和b都是整数。例如整数数值范围“1-N”表示1、2……N，其中N是整数。

在本发明中，除非有其他说明，“其组合”表示所述各元件的多组分混合物，例如两种、三种、四种以及直到最大可能的多组分混合物。

如果没有特别指出，本说明书所用的术语“一种”指“至少一种”。

如果没有特别指出，本发明所述的百分数(包括重量百分数)的基准都是所述组合物的总重量。

本文所公开的“范围”以下限和上限的形式。可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的。选定的下限和上限限定了特别范围的边界。所有可以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，针对特定参数列出了60-120和80-110的范围，理解为60-110和80-120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到：1-3、1-4、1-5、2-3、2-4、和2-5。

在本文中，除非另有说明，各组分的比例或者重量都指干重。

在本文中，除非另有说明，所述“生物学活性”是按照《生物技术药物研究开发和质量控制》第二版所述，以能诱导50％最大反应的样品的稀释度中所含样品量为1单位(U)。

本发明一方面提供了一种测量重组人p43蛋白的生物学活性的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)使重组人p43蛋白诱导小鼠单核巨噬细胞Raw264.7，产生TNFα；

(2)通过酶联免疫法测定步骤(1)生成的TNFα含量；

(3)根据步骤(2)得到的TNFα含量得到重组人p43蛋白的生物学活性。

虽然不希望受到理论的限制，但是通常诱导方法的机理是以一定浓度的p43蛋白或者是其他物质加入到细胞培养基中，即以含有一定浓度p43的培养基来培养Raw263.7细胞，如果加入的p43具有生物学活性，则在一定的时间内能诱导Raw264.7细胞分泌TNFα。在本发明中，上述步骤(1)中的诱导方法是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合其专业技术可以直接得到该诱导方法。具体的诱导方法可参见Park H，Park SG，Kim J，Ko YG，Kim S.Signalingpathways for TNF production induced by human aminoacyl-tRNAsynthetase-associating factor，p43.Cytokine.2002 Nov 24；20(4)：148-53。

在本发明的一个优选实例中，所述诱导方法包括：

以适用于细胞培养的缓冲液梯度稀释待测样品，并作出不少于五个稀释度，再将稀释液分别与一定数量的特定细胞(例如小鼠单核巨噬细胞)混合孵育培养。在一定的优化培养时间后，该细胞会产生可供检测的效应(例如TNFα)。

在本发明中，上述步骤(2)中的酶联免疫法是常规的，本领域的普通技术人员根据本发明的描述再结合其专业技术可以直接得到该酶联免疫法。虽然不希望受到理论的限制，但是通常酶联免疫法依据的基本原理是抗原与抗体间的特异性反应，其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行。本发明所述的酶联免疫法可包括但不限于双抗夹心法。所述双抗夹心法可包括例如将特异性抗体(抗TNFα的抗体)与固相载体(酶标板)联结，形成固相抗体；洗涤除去未结合的抗体及杂质；加待检样品(含有TNFα的细胞培养上清液)，保温反应；样品中的抗原(TNFα)与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物；洗涤除去其他未结合物质；加酶标抗体(酶标记的抗TNFα抗体)，保温反应；固相免疫复合物上的抗原(TNFα)与酶标抗体结合(酶标记的抗TNFα抗体)；彻底洗涤未结合的酶标抗体，此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关；加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。颜色的深浅和样品中的目标蛋白呈正相关。通过比色可测知标本中抗原的量。

在本发明中，通过TNFα含量得到重组人p43蛋白的生物学活性的方法是常规的，本领域的普通技术人员根据其专业知识可以直接得到具体的方法。具体的测试方法可参见例如《中华人民共和国药典》2005年版三部和《生物技术药物研究开发和质量控制》第二版进行。例如，按照《中华人民共和国药典》2005年版三部要求，采用GraphPad Prism软件进行处理。根据检测结果，以p43浓度的对数值lgC_p43为X值，以相应的TNFα浓度为Y值，采用Nonlinear regression曲线拟合，得到重组人p43蛋白的剂量-反应曲线，从而得到四参数分析结果。样品的生物学活性按照《生物技术药物研究开发和质量控制》第二版所述，用能诱导50％最大反应的待测样品最高稀释度作为参考效价(或滴度)，也可将此稀释度中所含的细胞因子的量作为1个活性单位(U)，即以此稀释度的倒数为待测样品所含的单位数。

本发明还提供了一种制备p43蛋白制品的方法，所述方法包括本发明所述的测量重组人p43蛋白的生物学活性的方法。

实施例

实施例1

1.重组人p43蛋白成品的制备

1.1材料

20％甘露醇，上海百特医疗用品有限公司；超滤器及0.22μm无菌滤器为PALL公司产品；生物安全柜品牌为Heraeus，型号为KS12；-70℃低温冰箱品牌为Thermo，型号为HETO ULTRA FREEZE UF5410；冻干机品牌为Thermo，型号为Heto Lyolab3000。

1.2方法

以pH7.4的磷酸盐缓冲液PBS对纯化后的重组人p43蛋白原液(p43蛋白原液的制备方法参见CN101225371A)进行超滤透析，加入20％甘露醇，甘露醇的终浓度为5％，所得溶液经0.22μm无菌滤器过滤除菌，分装于2ml体积无热源西林瓶中，将分装的半成品置-70℃预冻12小时，预冻好的半成品放入冻干机中，在-50℃冻干，冻干时间为24小时，冻干后成品于无菌条件下加塞、随后压盖、贴标签。制剂规格为4mg/支的p43样品。

2.样品检测

2.1检测步骤

2.1.1Raw264.7细胞培养

2.1.1.1材料

小鼠单核巨噬细胞RAW264.7，购自中国科学院上海生命科学研究院；DMEM高糖、胎牛血清(FBS)、青霉素链霉素双抗、PBS及TryPLE Express为Invitrogen，GIBCO产品；25cm²细胞培养瓶为Corning公司产品；CO₂细胞培养箱品牌为Heraeus，型号为HERAcell 150；生物安全柜品牌为Heraeus，型号为KS12。

2.1.1.2方法

Raw264.7细胞以10％FBS DMEM的培养基(完全培养基)培养，培养条件为5％CO₂，37℃培养箱；细胞呈贴壁生长，隔天更换完全培养基，待培养瓶内细胞生长到约90％汇合度，即可进行活性检测，各代次生长状态良好的细胞均可用于活性检测。

2.1.2测活细胞接种至96孔板

2.1.2.1材料

96孔细胞培养板为Corning公司产品；血球计数板购自上海求精生化试剂仪器有限公司；倒置显微镜品牌为Olympus，型号为IX51。

2.1.2.2方法

以PBS洗涤约90％汇合度且状态良好的细胞，加TryPLE Express消化液于室温消化细胞，镜下观察消化进程，待细胞回缩变圆时以完全培养基终止消化，以吸管吹打混匀细胞，镜下计数，用完全培养基稀释细胞到1×10⁵/ml。以100μl/well接种，在5％CO₂，37℃培养箱内静置培养4小时。

2.1.3样品稀释加药

2.1.3.1材料

阳性对照：脂多糖LPS(E.Coli 0111：B4)购自Sigma，以无血清DMEM培养基稀释至80μg/ml，分装冻存于-70℃；阴性对照：以无血清DMEM培养基稀释p43样品至2000μg/ml，沸水浴变性5min；空白对照：无血清DMEM培养基；20μl、200μl、1000μl移液器枪头，1.5ml离心管均为Axygen公司无菌无热源产品；移液器为Gilson公司产品。

2.1.3.2方法

1)细胞接种至96孔板约3小时后，以无血清DMEM培养基稀释p43样品、阴性及阳性对照：p43样品平行稀释至4000ug/ml、2000μg/ml、500μg/ml、125μg/ml、31.25μg/ml、15.625μg/ml、7.8125μg/ml、3.90625μg/ml八个浓度；阴性对照含2000μg/ml沸水浴变性p43样品；阳性对照含0.8μg/mlLPS；以无血清DMEM培养基做空白对照。

2)将完全培养基和上步制备的各组样品按7∶1比例稀释混合，使得p43样品的终浓度为500μg/ml、250μg/ml、62.5μg/ml、15.625μg/ml、3.90625μg/ml、1.953125μg/ml、0.9765625μg/ml、0.48828125μg/ml，阴性对照的终浓度为250μg/ml，阳性对照的终浓度为0.1μg/ml。

3)吸弃96孔板内原培养基，以每孔150μl体积加入稀释后各样品，每组设三个复孔，在5％CO₂、37℃培养箱内静置培养18小时。

2.1.4培养上清中TNFα含量检测

2.1.4.1材料

Mouse TNFα Elisa Kit为上海依科赛生物制品有限公司产品；手动八通道排枪为HTL公司产品；生化培养箱品牌为Heraeus，型号为BK-600；酶标仪品牌为Thermo，型号为Multiskan Spectrum。

2.1.4.2方法

1)药品处理细胞18小时后，取各组每组各三个孔中培养液混合并离心取上清待用，后操作均依照Mouse TNFα Elisa试剂盒说明书。

2)取出ELISA试剂盒，平衡至室温，并混匀各试剂。

3)稀释TNFα标准品：取1ml试剂稀释液加至1支冻干TNFα标准品中，静置15分钟以充分溶解并混匀，得2000pg/ml起始管，随后对半稀释标准品至终浓度为1000pg/ml，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.25pg/ml，同时取试剂稀释液做0pg/mlTNFα标准品。

4)以注射水稀释20×浓缩洗涤液。

5)以每孔100μl体积分别加入第3步稀释的标准品及第1步收集的样品，每组样品设三个复孔，薄膜封板，37℃孵育90分钟。

6)以1∶1000比例用稀释液稀释浓缩生物素化抗体。

7)洗板5次，每次340μl洗涤液。

8)每孔加100μl第6步准备的生物素化抗体工作液，薄膜封板，37℃孵育60分钟。

9)以1∶1000比例稀释液浓缩酶结合物。

10)洗板5次，每次340μl洗涤液。

11)每孔加100μl第9步准备的酶结合工作液，薄膜封板，37℃孵育30分钟。

12)洗板5次，每次340μl洗涤液。

13)每孔加100μl显色底物，薄膜封板，37℃孵育15分钟。

14)每孔加100μl终止液，10分钟内于450nm波长测定光吸收，并通过酶标仪自带软件且选择Quadratic Polynomial法绘制标准曲线。软件自动计算出各样品的TNFα浓度。

2.2结果

检测结果如下表所示：

表1重组人p43蛋白样品诱导TNFα的检测结果

2.3结果分析

试验数据按照《中华人民共和国药典》2005年版三部要求，采用GraphPadPrism软件进行处理。根据表1检测结果，以p43浓度的对数值lgC_p43为X值，以相应的TNFα浓度为Y值，采用Nonlinear regression曲线拟合，得到图1所示的重组人p43蛋白样品的剂量-反应曲线。所得分析结果如表2所示：

表2重组人p43蛋白样品诱导TNFα检测数据的四参数分析结果

表注：Bottom、Top：上下临界值，HillSlope：斜率，EC₅₀：半效量浓度，R²：相关系数

重组人p43蛋白诱导小鼠单核巨噬细胞Raw264.7分泌TNFα的反应存在量效关系，且相关系数大于0.98。采用上述方法检测加热失活处理后的样品，检测不出其生物学活性。

样品的生物学活性按照《生物技术药物研究开发和质量控制》第二版所述，可用能诱导50％最大反应的待测样品最高稀释度作为参考效价(或滴度)，也可将此稀释度中所含的细胞因子的量作为1个活性单位(U)，即以此稀释度的倒数为待测样品所含的单位数。

据此计算，本实施例中本批重组人p43蛋白样品诱导50％最大反应时的浓度为5.505×10^-3mg/ml，反应体积为0.1ml，即1U中含有5.505×10^-4mg p43蛋白，其比活性为1816.5U/mg。

实施例2

对同一批次样品按照实施例1的方法重复试验6次，结果样品的比活性均值为1585.762U/mg，相对标准偏差为24.9304％，见表3。以本方法检测重组人p43蛋白生物学活性的重现性较好，符合体外细胞测活实验中对于测定结果控制在30％附近的要求。

表3重组人p43蛋白生物学活性批间重现性检测

表注：n：检测批次，R²：相关系数，EC₅₀：半效量浓度，SD：标准偏差，RSD：相对标准偏差

Claims (6)

1.一种测量重组人p43蛋白的生物学活性的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)使重组人p43蛋白诱导小鼠单核巨噬细胞Raw264.7，产生TNFα；

(2)通过酶联免疫法测定步骤(1)生成的TNFα含量；

(3)根据步骤(2)得到的TNFα含量得到重组人p43蛋白的生物学活性，

其中步骤(1)如下进行：细胞接种至96孔板约3小时后，以无血清DMEM培养基稀释p43样品、阴性及阳性对照：p43样品平行稀释至4000μg/ml、2000μg/ml、500μg/ml、125μg/ml、31.25μg/ml、15.625μg/ml、7.8125μg/ml、3.90625μg/ml八个浓度；阴性对照含2000μg/ml沸水浴变性p43样品，阳性对照含0.8μg/ml LPS，以无血清DMEM培养基做空白对照；

将完全培养基和制备的各组样品按7∶1比例稀释混合，使得p43样品的终浓度为500μg/ml、250μg/ml、62.5μg/ml、15.625μg/ml、3.90625μg/ml、1.953125μg/ml、0.9765625μg/ml、0.48828125μg/ml，阴性对照的终浓度为250μg/ml，阳性对照的终浓度为0.1μg/ml；

吸弃96孔板内原培养基，以每孔150μl体积加入稀释后各样品，每组设三个复孔，在5％CO₂、37℃培养箱内静置培养18小时。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶联免疫法是双抗夹心法。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)是根据《中华人民共和国药典》2005年版第三部和《生物技术药物研究开发和质量控制》第二版进行的。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)如下进行：以p43浓度的对数值lgC_p43为X值，以相应的TNFα浓度为Y值，采用Nonlinear regression曲线拟合，得到重组人p43蛋白的剂量-反应曲线，从而得到四参数分析结果。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，由步骤(3)得到的能诱导50％最大反应的重组人p43蛋白最高稀释度的倒数作为活性值。

6.一种制备p43蛋白制品的方法，所述方法包括权利要求1所述的测量重组人p43蛋白的生物学活性的方法。