CN102094030B

CN102094030B - 编码杀虫蛋白基因Cry1Ab-Ma、其表达载体及应用

Info

Publication number: CN102094030B
Application number: CN201010574708A
Authority: CN
Inventors: 李新海; 铁双贵; 岳润清; 翁建峰; 谢传晓; 郝转芳
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences; Henan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences; Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2010-11-30
Filing date: 2010-11-30
Publication date: 2012-08-29
Anticipated expiration: 2030-11-30
Also published as: CN102094030A

Abstract

本发明提供了一种抗虫基因Cry1Ab-Ma，其是在依据原始苏云金芽胞杆菌Bt蛋白(Cry1Ab)N端氨基酸序列，使用单子叶植物(玉米)偏爱密码子，通过人工改造合成新的Cry1Ab DNA序列，以及进行原核表达载体和植物表达载体的构建，并进行相应宿主细胞的转化。体外实验证明改造合成的Bt基因产毒蛋白对玉米螟有显著的杀虫效果，本发明的抗虫基因Cry1Ab-Ma能够在单子叶植物中稳定高效表达，进而用于生产抗虫转基因植物。

Description

编码杀虫蛋白基因Cry1Ab-Ma、其表达载体及应用

技术领域

本发明涉及基因工程和生物防治领域，具体地说，涉及抗虫基因Cry1Ab-Ma、其表达载体及应用。

背景技术

Bt基因编码杀虫晶体蛋白，来自苏云金芽孢杆菌(BacillusthuringHansis)。它在芽孢形成过程中产生δ-内毒素的杀虫伴胞晶体蛋白，这些蛋白具有很高的杀虫活性。其作用原理为这种抗虫蛋白能被碱性肠液溶解，水解为更小的活性毒素片段-核心片段(Hofte和Whiteley，1989)。该活性片段能抗蛋白酶的进一步水解，被激活的蛋白质结合在昆虫肠道上的刷状小泡上，引起穿孔从而影响渗透平衡，细胞膨胀并溶解，靶标生物停止取食并最后死亡。研究表明许多靶标害虫的肠道上皮细胞都具有Bt蛋白高亲和性的结合位点(Hofte和Whiteley，1989)。在过去的几十年里，已确定数十种苏云金芽孢杆菌菌系及130多种它们编码的杀虫晶体蛋白。

1986年，首批转基因植物(抗虫、抗除草剂)被批准进入田间试验。1987年，比利时Vaeck等人首次获得转Bt杀虫蛋白的抗虫烟草，但只能检测到微弱的抗虫性，其表达蛋白几乎检测不到，只占可溶性蛋白的0.001％。同年又有两次获得Bt转基因植株的报道(Barton等，1987；Fischhoff等，1987)。1989年哺乳动物抗体重链和轻链基因在烟草中成功表达并正确组装成有功能的抗体。到1990年，至少有7个研究小组获得Bt转基因植物并应用于大田试验(Estruch J等，1996)。Adang等(1993)改造了Cry3A基因，该基因在马铃薯中高效表达。1993年，Michael等人对Cry1Ab基因进行改造，获得Bt转基因植株，对玉米螟有很好的抗性。KozHal(1993)等培育出了抗虫转基因玉米，转基因植株能高水平表达Cry1A(b)抗虫基因。1996年，Joachim W等人将Cry1Ab进行截短修饰，转化水稻，获得转Bt水稻，靶标害虫死亡率达100％。1998年，Cheng等人根据植物所偏爱的密码子，改造了Cry1Ab和Cry1Ac基因用农杆菌转化法转化水稻获得转基因植株，R2代虫试，5天内有100％致死率。Bohotova等(2001)人工改造合成Cry1B基因，转化热带玉米得到转基因玉米能有效防治玉米螟。

我国对Bt杀虫蛋白基因的研究主要是：1992年，郭三堆等人采用植物优化密码子方法首先在国内人工合成全长1824bp的GFMCry1A杀虫基因，获得了中国第一代单价抗虫棉。丁群星等(1993)和王国英等(1995)分别用子房注射法和基因枪法将pB48.415质粒转入玉米愈伤组织中获得转基因植株，抗虫性测定表明其具有一定抗虫性。1994年，中国农业大学在国内外首次用子房注射的方法把抗虫基因Bt转入玉米并获得转基因植株，以自主知识产权基因Bt为代表的抗虫玉米已展示了良好的开发前景。1998年，中国农业科学院将GFM杀虫基因构建到pMG6质粒上，导入到玉米中(周逢勇等，1998)，后代检测表明Bt基因以孟德尔遗传方式遗传到下一代(Liu YJ等，2003)。我国在转基因技术研究方面，已经建立了比较成熟的玉米转基因技术体系。

Cry1Ab蛋白是一类由苏云金芽孢杆菌产生的对鳞翅目害虫具有毒杀作用的伴胞晶体，其在生物防治领域具有重要的应用前景。苏云金杆菌δ-内毒素基因Cry1Ab来源于微生物，但其转基因植物存在表达量低、表达产物不稳定、抗虫性效果差等问题。通过改造碱基序列提高GC含量能提高其在转基因植物中的表达量，达到杀虫目的(Koziel，1993)。通过比较苏云金芽孢杆菌和玉米的密码子使用情况，可以发现两者在密码子偏好上存在很大差异，利用植物的偏好密码子，重新设计和改造Cry1Ab并获得新型抗虫基因Cry1Ab-Ma，以实现转新基因作物具有较好的抗虫性。

玉米是重要的粮食作物，又是重要的饲料和工业原料，当前玉米虫害(以玉米螟为主)严重，造成玉米大量减产，因此采取有效措施控制其危害对提高玉米产量、增加农民收入具有重要的意义。由于缺乏合适的抗虫品种，目前解决虫害的主要方法是在生长过程中喷施化学杀虫剂；但是化学杀虫剂同时杀死害虫及其天敌，造成生态不平衡和环境污染。通过转基因技术，可以将抗虫基因导入玉米品种中，进而提高转基因玉米的抗虫性，降低农药的使用量，节省人力、物力及社会资源。因此，应用新的抗虫基因、提高杀虫蛋白的表达量以及培育新型抗虫转基因玉米是解决上述问题的最有效途径之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够在植物中稳定高效表达的抗虫基因Cry1Ab-Ma及其表达载体。

本发明的另一目的是提供抗虫基因Cry1Ab-Ma在提高转基因植物抗虫性中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种抗虫基因Cry1Ab-Ma，其具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或该序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸形成的编码同等功能蛋白的由SEQ ID No.1衍生的核苷酸序列。

上述抗虫基因Cry1Ab-Ma编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

含有抗虫基因Cry1Ab-Ma的载体，优选双价载体。

含有上述载体的宿主细胞，优选EHA105。

含有抗虫基因Cry1Ab-Ma的转化植物细胞。

抗虫基因Cry1Ab-Ma在提高转基因植物抗虫性中的应用。优选，所述植物为农作物、果树或蔬菜，如玉米、水稻、马铃薯、棉花等。

本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现：

去掉原始Bt基因Cry1Ab 3’端1623bp的一段碱基序列，只留下部分缺失的5’端1845bp的一段碱基序列；在保持序列Cry1Ab N端蛋白的氨基酸组成总体不变的情况下，用植物偏爱的密码子进行碱基置换，初步获得一个改造的DNA序列；排除DNA序列中存在的造成植物转录不稳定的富含AT序列以及常用限制性酶切位点(SacI)，然后通过置换密码子的方法进行改正消除；并在3’端加上终止密码子TAG；确定并化学合成改造的Bt基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；根据克隆需要在序列两端加上限制性内切酶识别位点序列并构建到相应的表达载体上。

将本发明基因Cry1Ab-Ma与原核表达载体可操作地连接，能够快速初步检测本发明合成的Bt基因表达产物对玉米螟的毒性。将本发明基因Cry1Ab-Ma与植物表达载体可操作地连接，并将表达载体导入相应的农杆菌中，进而通过农杆菌介导法进行遗传转化，培育抗虫转基因玉米。也可以对其它农作物或者果树等进行遗传转化，使其具备抗虫活性。

本领域技术人员还可以将本发明基因转化细菌或真菌，通过大规模发酵生产Bt蛋白，并将其制备成杀虫剂，用于农作物害虫的防治。

本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明人工合成的抗虫基因Cry1Ab-Ma序列与原始Cry1Ab序列相比，大大增强了其在植物中的表达。使用植物偏爱性密码子，减少了原始DNA序列中的富含AT序列和存在的反向重复序列以及不明确的真核DNA内含子序列，改造后的Cry1Ab-Ma基因G+C含量为63.04％，与原始DNA序列的同源性为66％。本发明的抗虫基因Cry1Ab-Ma可在植物细胞中高效稳定的表达。

将抗虫基因Cry1Ab-Ma导入玉米后，可以得到稳定遗传的Cry1Ab-Ma转化体。此外，该基因也可以转化棉花、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗虫活性，从而降低农药的使用量，以减少环境污染，具有重要的经济价值和广阔的应用前景。

附图说明

图1A～图1D为本发明Cry1Ab基因与合成的Cry1Ab-Ma基因编码序列分析图。

图2为CPB(pCAMBIA1300-35S-MCS-Bar)质粒图谱。

图3为采用农杆菌介导法获得的转Cry1Ab基因玉米；其中，愈伤组织的筛选(左)、再生(中)以及转基因植株移栽到大田(右)。

图4为T₀代转化体中目的基因Cry1Ab-Ma的PCR检测结果，其中，M为M:DL2000plus；CK1为阳性质粒对照；CK2为未转基因阴性对照；空白为双蒸水对照；1-8是Ab-Ma1到Ab-Ma8。

图5为T₀代转化体选择标记基因Bar的PCR检测结果，其中，M为M:DL2000plus；CK1为阳性质粒对照；CK2为未转基因阴性对照；空白为双蒸水对照；1-8是Ab-Ma1到Ab-Ma8。

图6为T₀代转化体目的蛋白Cry1Ab-Ma的免疫学检测，其中CK1为未转基因苗阴性对照；1-8为Ab-Ma1到Ab-Ma8。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。以下实施例中所用的试验材料及试剂，如无特别说明，均购自常规生化试剂公司。

实施例1Cry1Ab-Ma基因的合成

根据Bt基因Cry1Ab的原始核苷酸序列，去掉3’端1623bp的一段碱基序列，只留下部分缺失的5’端1845bp的一段碱基序列；在保持序列Cry1Ab N端蛋白的氨基酸组成总体不变的情况下，用植物偏爱的密码子进行碱基置换，初步获得一个改造的DNA序列；排除DNA序列中存在的造成植物转录不稳定的富含AT序列(如ATTTA、AATGAA等)以及常用限制性酶切位点(SacI)，然后通过置换密码子的方法进行改正消除；并在3’端加上终止密码子TAG；确定并化学合成改造的Bt基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；根据克隆需要在序列两端加上限制性内切酶识别位点序列并构建到相应的表达载体上。

将原始Bt基因Cry1Ab与合成的Cry1Ab-Ma基因编码序列进行比对分析(图1)，两个序列的同源性为66％。碱基组成的统计结果为：原始基因的G+C％为37.34％，新合成基因的G+C％为63.04％。编码的氨基酸序列的比对分析显示，两者编码的氨基酸序列(其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示)一致。

新Bt基因Cry1Ab-Ma的合成工作由生工生物工程(上海)有限公司完成。

实施例2Cry1Ab-Ma基因在原核***中的表达和产物的毒性检测

为了检测改造的Cry1Ab-Ma基因体外表达及对玉米螟的毒性情况，我们构建了Bt原核表达载体。根据克隆Bt基因需要，在引物序列的5’端添加NdeI内切酶识别位点序列CATATG，3’端添加HindIII内切酶识别位点序列AAGCTT。设计引物序列(上游引物F1：5“-CATATGGACAACAACCCGAACATC-3’；下游引物R1：5’-AAGCTTCTAGTACTCCGCCTCG-3’)。

以pUCAb-Ma质粒为模板，以F1和R1为引物，扩增Cry1Ab-Ma基因，用限制性内切酶NdeI和HindIII进行酶切，凝胶回收试剂盒回收纯化Cry1Ab-Ma基因片段。用限制性内切酶NdeI和HindIII酶切pET28b+，凝胶回收试剂盒回收纯化5.3kb片段。两个片段进行连接反应，构建所得原核表达质粒命名为pETAb-Ma。用不同限制性内切酶进行酶切鉴定，表明载体构建正确。用pETAb-Ma转化BL21(DE3)感受态细胞。

用含有pETAb-Ma的大肠杆菌BL21菌液经IPTG诱导后，提取Bt蛋白，以清水和含空载体pET28b+大肠杆菌BL21菌液为对照，用玉米螟进行虫试。具体步骤如下：

①接种大肠杆菌BL21单菌落于5ml LB(含卡那霉素)液体培养基中，37℃过夜培养。

②将菌液接种到500ml LB(含卡那霉素)液体培养基中，培养至OD≈0.5。

③加入IPTG至终浓度0.5mM继续摇动诱导4小时。

④4000rpm离心10min，收集菌体。

⑤加入36ml裂解缓冲液(2mM Tris-HCl；0.2mM CaCl₂；PH＝8.0)，重新悬浮菌体，加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，冰上放置30min。

⑥超声波破碎菌体(破碎参数：工作10s，间隔5s，40次，冰浴破碎)，4000rpm离心10min，收集上清。

⑦将收集的上清加入到饲养玉米螟的饲料中。以含空载体pET28b大肠杆菌BL21菌液为阴性对照。

⑧在每个试管中放入一条饲料，并接入10头初孵未进食玉米螟，各接10个试管。放入温度26～28度，相对湿度70％左右的环境中培养，8天后进行毒性鉴定：结果表明，分泌表达的Cry1Ab-Ma基因编码的Bt蛋白有较好的杀虫效果，玉米螟的死亡率达到90.67％，而且对玉米螟的生长有明显的抑制作用(表1)。

表1Cry1Ab-Ma基因原核表达产物的毒性检测结果

实施例3Cry1Ab-Ma基因在转基因植物中的表达和表达产物的毒性检测

用XbaI和SacI双酶切T载体质粒pUCCry1Ab-Ma，用凝胶回收纯化试剂盒回收Cry1Ab-Ma片段。同时用XbaI和SacI双酶切植物表达载体CPB，用凝胶回收纯化试剂盒回收酶切后的CPB片段。两个片段进行连接反应，构建得到真核表达质粒pCAMBIA1300-Cry1Ab-Ma-Bar(启动子为CaMV35S，标记基因为吸水链霉菌的抗除草剂基因Bar)。进行酶切鉴定，表明载体构建正确。

其中，CPB(pCAMBIA1300-35S-MCS-Bar，图2)质粒是在pCAMBIA1300质粒基础上构建的质粒，含有一个目的基因***盒(35S-多克隆酶切位点-Tnos)和一个来自吸水链霉菌的抗除草剂基因Bar。该基因序列位于花椰菜花叶病毒35S启动子(pCaMV)和3’尾部(TCaMV)之间。

质粒pCAMBIA1300购自澳大利亚CAMBIA(Center for theApplication of Molecular Biology to International Agriculture)，参考网址http://www.cambia.org/daisy/cambia/585.html。该载体可用于玉米受体材料的遗传转化。

采用农杆菌介导转化方法(菌种EHA105)将***序列导入受体植株的愈伤组织，经除草剂双丙氨膦筛选后获得转基因植株(图3)。移栽成活的转化植株长出7-8叶时，取叶片提取DNA，采用PCR技术检测外源基因。图4显示了T₀代转化体目的基因Cry1Ab-Ma的PCR检测结果，其中M：M:DL2000plus；CK1：阳性质粒对照；CK2：未转基因阴性对照；空白：双蒸水对照；1-8：Ab-Ma1到Ab-Ma8。

引物序列：

Cry1Ab-Ma：5′-AACAACCCGAACATCAACGAG-3′

Cry1Ab-Ma：5′-CGCGTCCGTGTAGATCGTGA-3′

目的片段大小：921bp，退火温度58℃，35个循环。

图5显示了T₀代转化体选择标记基因Bar的PCR检测结果，其中M：M:DL2000plus；CK1：阳性质粒对照；CK2：未转基因阴性对照；空白：双蒸水对照；1-8：Ab-Ma1到Ab-Ma8。

引物序列：

F-Bar：5′-ATGAGCCCAGAACGACGCC-3′

R-Bar：5′-TCAAATCTCGGTGACGGGC-3′

目的片段大小：552bp，退火温度60℃，35个循环。

目的蛋白Cry1Ab-Ma的检测(Bt-Cry1Ab/1Ac免疫学检测)：

1、取约1cm²左右新鲜幼嫩叶片放在1.5ml的Eppendorf管中。然后将放有叶子的管插在冰盒中，以保持新鲜度。

2、取液氮，将材料速冻，用钻头将材料研磨成粉，向管中迅速加入500μL-1ml SEB4样品提取缓冲液。

3、取出检测条(北京真尼斯生物技术有限公司；货号：STX06200/0050)，手持检测条顶端，做好检测标记。不要去掉保护膜。保持检测条垂直，将标记的末端***至离心管或提取袋中。***部分不要超过0.5cm。在检测过程中始终保持***状态。

4、3-5分钟内出现质控线，最长反应时间为30分钟，此时检测条可取出。质控线是用来确保试验结果的准确性。如果质控线没有出现，检测无效。由于样品的流动性不同，产生信号的时间也不同。如果样品是阳性的，检测线将出现。如果样品是阴性的，检测线将不出现。如果想长期保存检测结果，可剪掉样品垫，用纸巾吸干，这将阻止残存的液体干扰结果。检测线的深浅反应了被检测蛋白的含量(图6)。

图6为T₀代转化体目的蛋白Cry1Ab-Ma的免疫学检测，其中CK为未转基因苗阴性对照；1-8为Ab-Ma1到Ab-Ma8。上条带为质控线，下条带为检测线指示被检测蛋白。该结果表明，抗虫基因Cry1Ab-Ma表达的目的蛋白在转基因玉米中高效表达。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.抗虫基因Cry1Ab-Ma，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.含有权利要求1所述基因的载体。

3.如权利要求2所述的载体，其为双价载体。

4.含有权利要求3所述载体的宿主细胞，其为EHA105。

5.权利要求1所述的基因在提高转基因植物抗虫性中的应用，

其中，所述植物为玉米，所述抗虫性为对玉米螟的抗虫性。