CN102083980A - 调节平滑肌增殖和分化的微小rna及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及鉴定调节平滑肌细胞增殖和分化的微小RNA，包括miR143/miR-145簇。公开了通过增加miR-143和/或miR-145的表达来治疗再狭窄(restenosis)和新内膜(neointima)形成。本发明亦涉及两种在心脏中调节细胞存活的微小RNA，miR-486和miR-422a的鉴定。亦公开了通过增加心脏组织中miR-486和/或miR-422a的表达来治疗或预防心脏肥大、心力衰竭或心肌梗死的方法。

Description

调节平滑肌增殖和分化的微小RNA及其用途

对相关申请的交叉引用

本发明要求提交于2008年2月21日的美国临时申请No.61/030467的权益，其以全文引用的方式并入本文中。

政府支持声明

本发明是来自National Institutes of Health的赞助号HL53351-06的赞助支持下完成的。政府在该发明中具有一定权利。

发明领域

本发明一般性涉及发育生物学和分子生物学领域。更具体而言，其涉及平滑肌细胞中的基因调节和细胞生理学，包括那些存在于血管***中的。具体而言，本发明涉及参与调节平滑肌细胞分化和增殖的miRNA。公开了上调这些miRNA以治疗或抑制再狭窄(restenosis)和新内膜(neointima)形成。

发明背景

目前，心血管疾病仍然是西方国家中最主要的死亡原因，并带来无与伦比的健康和经济负担。已经显示通过气囊血管形成术(经皮腔内血管形成术，percutaneous transluminal angioplasty，或PTA)的治疗改善生命期望(lifeexpectancy)。尽管血管形成术是用于缓解梗阻性动脉粥样硬化血管的狭窄的分流手术(bypass surgery)的替代疗法，所述血管形成术的长期成功通常受再狭窄和新内膜形成的发病所损害。在PTA手术中，将配置在导管远端的膨胀气囊置于狭窄区域。气囊在流体压力下膨胀以重构(reconfigure)变狭窄的内腔，从而使通过受影响的动脉的血流增加成为可能。会重复膨胀-收缩循环并不罕见，当狭窄严重时，可进行数次。这种对动脉壁的机械暴力(mechanicalviolence)可产生所期望的动脉张开(opening)，但该手术伴随着估计25％到50％的再狭窄发生率，通常在手术后6个月到2年内，发生于受损位置或其附近。

系列血管内超声研究显示在配置支架后的再狭窄几乎完全是因为平滑肌增生以及基质增生。支架内新内膜形成因而仍然是支架使用在手术上主要的限制，限制了其应用和长期的临床效益(benefit)。

血管损伤，如内皮剥蚀、对血管壁的损伤以及血管滋养管(vasa vasorum)的破裂，可导致血管形成术不受欢迎的结果，从而使得受治疗的位置易发生再狭窄。在损伤时，随后的血小板的沉积，连同所述血管的治疗机制，发信号予平滑肌细胞使其在动脉壁内增生。血小板的沉积在一些情况下可导致急性血栓形成。更显著的是，平滑肌细胞的增殖是经常经久不衰进行的过程并因此被广泛认为是再狭窄结果的主要因素。迄今为止，并未证明任何药理学或机械的干预足够有效的预防血管形成术后的再狭窄。因此，需要预防再狭窄并增强血管形成术效益的新颖疗法。

发明内容

本发明部分基于下述发现，即miR-143和miR-145在平滑肌组织中富集，能调节平滑肌增殖，并能在血管损伤后减少新内膜形成。相应的，本发明提供了在有需要的受试者中抑制再狭窄或新内膜形成的方法。在一个实施方案中，所述方法包括施与所述受试者miR-143和/或miR-145的激动剂。miR-143和/或miR-145的激动剂可为包含miR-143和/或miR-145的初miRNA(pri-miRNA)、前miRNA(pre-miRNA)或成熟miRNA序列的多核苷酸。在一些实施方案中，所述miR-143和/或miR-145激动剂在体内从表达载体表达。

在另一个实施方案中，在有需要的受试者中抑制再狭窄或新内膜形成包括施与所述受试者miR-486的抑制剂。miR-486下调PTEN，一种细胞增殖的负调节剂，其促进平滑肌细胞增殖和新内膜形成。miR-486抑制剂可为微小RNA拮抗剂(antagomir)、反义寡核苷酸或抑制性RNA分子。在本发明另一个实施方案中，所述方法包括施与所述受试者miR-143/miR-145激动剂和miR-486抑制剂。又在另一个实施方案中，所述方法进一步包括施与所述受试者第二种抑制再狭窄或新内膜形成的作用剂。

本发明亦包括一种抑制平滑肌细胞增殖的方法。在一个实施方案中，所述方法包括将平滑肌细胞与miR-143和/或miR-145的激动剂接触。在另一个实施方案中，所述方法包括将平滑肌细胞与miR-486的抑制剂接触。

本发明亦涵盖包含miR-143和/或miR-145的激动剂和药学上可接受载体的药物组合物。在另一个实施方案中，所述组合物进一步包含miR-486的抑制剂。在另一个实施方案中，所述组合物配制成医疗装置，如导管或支架的涂层(coating)。

本发明亦提供在有需要的受试者中治疗病理性心脏肥大、心力衰竭或心肌梗死的方法，包括施用miR-486和/或miR-422a的激动剂。miR-486和/或miR-422a的激动剂包括下述多核苷酸，其包含miR-486和/或miR-422a的初miRNA、前miRNA或成熟miRNA序列。在一些实施方案中，所述miR-486和/或miR-422a激动剂从表达载体表达。

又在另一个实施方案中，提供了转基因的非人哺乳动物，其细胞无法表达有功能的miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486。另一个实施方案包括转基因的非人哺乳动物，其细胞包含置于在该非人哺乳动物细胞中有活性的异源启动子控制下的miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486编码区。所述启动子可为组织特异性启动子，如平滑肌特异性启动子，或心肌特异性启动子。另外又一个实施方案提供了转基因的非人哺乳动物细胞，其缺乏miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486的一个或全部两个天然等位基因。所述细胞可缺乏miR-143、miR-145、miR-422a或miR-486的全部两个天然等位基因。

在另一个实施方案中，提供了在血管平滑肌或心肌中鉴定miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486活性的调节剂的方法，包括(a)将血管平滑肌细胞或心肌细胞与候选化合物接触；(b)评价miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486活性或表达；和(c)将步骤(b)中的活性或表达与不存在所述候选化合物时的活性或表达相比较，其中所测得的活性或表达之间的差异表明所述候选化合物是miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486的调节剂。所述细胞可与所述候选化合物在体外或体内接触。所述miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486的调节剂可为miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486的激动剂或miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486的抑制剂。在一些实施方案中，对miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486活性或表达的评价包括评价由miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486调节的基因的表达或活性。由miR-143和/或miR-145调节的基因包括Slit-Robo GTP酶激活蛋白1和2、Smad3、Sema3、Cited2、KLF5或MRTFb。由miR-486调节的基因包括PTEN和Foxola。

附图简述

本发明可通过参照这些附图中的一个或多个，辅以在本文中给出的特定实施方案的详细描述来更好的理解。

图1.A.微小RNA微阵列分析鉴定出与骨骼肌(趾长伸肌，EDL)和心肌比较富集于平滑肌(主动脉，Ao)的微小RNA基因。miR-145和miR-143在平滑肌中显著富集。B.多种成年小鼠组织的Northern印迹显示miR-143(左边小图)和miR-145(右边小图)的组织分布。在主动脉(Ao)、胃、肺和膀胱平滑肌中观察到显著的富集。骨骼肌(Skm)；血管平滑肌细胞(VSMC)。

图2.对在大鼠主动脉血管平滑肌细胞(RVSMC)分化过程中miR-143和miR-145表达10日的分析。miR-143和miR-145两者的表达在RVSMC分化过程中增加，如Northern印迹评价所示。

图3.描述miR-143和miR-145及上游调节DNA进化保守性的示意图。高亮显示(highlights)了保守的SRF结合位点(CArG)位置。亦显示了多种用于构建体以定位启动子活性的截断(truncation)。

图4.A.在转基因动物中的lacZ报道基因分析说明平滑肌和心脏的表达由miR-143miR-145位点(locus)上游1.5kb(构建体F)驱动。在心新月(cardiaccrescent)中的表达早至7.5胚日(E7.5)就很明显。B.在成体组织中检测miR-143/145调节的βGal表达揭示了在心(Ht)和平滑肌衍生物中的表达。在主动脉(Ao)、膀胱(Bl)、以及肺(Lu)和骨骼肌(Sk)的血管中观察到了强力表达。C.保守CArG盒的突变在携带突变的lacZ报道构建体(Mut CArG)的转基因动物中与在野生型(WT)动物中相比，去除了心脏表达，并减少了血管表达。

图5.A.由具有野生型(WT)或突变CArG位点(CArG mut)的心肌素和1.5kb miR143/145萤光素酶报道构建体(构建体F)共转染的COS细胞的相对萤光素酶活性。心肌素对所述1.5kb miR143/145萤光素酶报道基因的激活完全依赖于单个保守CArG盒。B.在新生心肌细胞中从构建体F的萤光素酶报道基因表达表明在心肌素过表达时强烈的反应性和增加的活性。CArG位点的突变显著减少相应于心肌素的报道基因表达。

图6.如凝胶移位(gel shift)所示的血清应答因子(SRF)在所述miR-143/145调节DNA中与保守CArG序列的结合。突变体探针无法结合SRF，而无放射性的野生型寡聚物有效的与SRF竞争对探针的结合。突变体无放射性竞争者并不去除凝胶移位。

图7.A.进行微小RNA微阵列分析以揭示在小鼠表位调节模型中在由颈动脉结扎引起的平滑肌损伤之后改变的微小RNA。在受损的颈动脉中miR-143、miR-145和miR-486与在未结扎的对照动脉中比较均显著下调。B.微阵列结果通过实时RT-PCR分析证实。miR-143和miR-145的表达水平分别在受损的颈动脉中减少～85％和92％，而miR-486减少～75％。miR-21和miR-126分别用作阳性和阴性对照。

图8.A.在颈动脉结扎后减少新内膜形成的实验设计，即用miR-143/145模拟物(mimic)施用来回复微小RNA水平。B.miR-模拟物(mm)递送到不同组织的有效性通过Northern印迹在注射两日后检测。miR-143和miR-145显示在心、肺、肾和肝中显著富集。C.在结扎28日后通过H&E和弹性蛋白染色对颈动脉的组织学检查。在所有检查的水平下，注射盐水的对照小鼠显示广泛的(profound)新内膜形成。代表性的组织学切片为结扎线下的水平I(1.5mm)和水平II(1.9mm)的。miR-143模拟物注射的小鼠在结扎线下的相应水平处显示了显著减少的新内膜形成。

图9.在TargetScan 5.0上鉴定miR-143和miR-145的预期靶。将潜在的靶3’UTR克隆入CMV驱动的萤光素酶报道基因，并与miR-143或miR-145一起共转染到COS细胞中。miR-145阻抑Slit-Robo GTP酶激活蛋白1(A)和2(B)(Srgap)、Smad3(C)、Sema3(D)和Cited2(E)的3’UTR。亦预期miR-145靶向KLF53’UTR(F)。预期miR-143(G)和miR-145(H)均靶向MRTFb 3’UTR。

图10.鉴定由心肌素或MRTFa富集的微小RNA。A.将心肌细胞用引导βgal、MRTFa或心肌素表达的腺病毒感染。通过微阵列鉴定富集的微小RNA。B.如观察Northem印迹可知，在MRTFa而非心肌素(myocd)过表达时，miR-486特异性的显著富集。C.miR-486位于Ank1基因的最后一个内含子中，所述基因含有引导肌肉特异性表达的另一个启动子。显示了茎环结构(SEQ ID NO：69)和成熟微小RNA(SEQ ID NO：70)序列。对表达MRTFa或GFP的心肌细胞的实时PCR分析显示miR-486(D)和Ank1(E)迅速的受MRTFa诱导。

图11.miR-486A的表达。A.描述在成年小鼠中miR-486表达的多组织Northern印迹。表达富集于心肌、骨骼肌和平滑肌衍生物。B.在胚胎发生中miR-486宿主基因，sAnk1的表达。描述在体节中表达的E11.5胚胎的全标本原位杂交(ISH)。放射性切片ISH表明在E10.5和E12.5sAnk1在体节中的表达。在发育中的骨骼肌祖细胞、舌、隔膜中观察到表达，而在心房和肝中观察到弱表达。C.在胚胎阶段miR-486宿主基因Ank1在心脏中的表达，如半定量RT-PCR所示。D.miR-486表达与骨骼肌细胞系C2C12分化相关。

图12.鉴定miR-486/Ank1调节序列。A.miR-486和Ank1表达在心肌细胞中由MRTFa特异性诱导。心肌素不足以诱导miR-486或Ank1。B.描述在所述sAnk1基因调节区中预期的转录因子结合位点的示意图。C.携带1080bp Ank1-hsp68lacZ报道构建体的转基因动物显示骨骼肌特异性βgal活性。在E9.5观察到体节染色，而体节与发育中的骨骼肌染色在E11.5和E13.5观察到。D.COS细胞用50ng、100ng和200ng的MyoD、Nkx2-5、GATA-4、心肌素或MRTFa与所述萤光素酶报道构建体共转染。在COS细胞中sAnk1基因上游的1080bp区域由MyoD、Nkx2-5和GATA-4，但非心肌素或MRTFa激活。E.在瞬时转染的COS细胞中，650bp的sAnk1内含子1由MRTFa而非心肌素或MRTFb特异性激活。F用不同的萤光素酶报道基因转染用10MOI的βgal、心肌素、MRTFa或Nkx2-5腺病毒转导的心肌细胞。在心肌细胞中，sAnkl内含子-luc(内含子)对MRTFa有反应。在心肌细胞中，含有sAnk1启动子区(prom.)的构建体对MRTFa无反应。G.在COS细胞中sAnk1内含子-萤光素酶报道基因的突变分析。远端CArG2(mutC2)的3’截断(trunc)或突变导致活性丧失。10QB、25QB和50QB代表不同浓度的MRTFa。

图13.miR-486靶向PTEN和Foxola并调节Akt信号传导。A.对PTEN和Foxola进化上保守的预期靶3’UTR位点，以及相应的miR-486种子序列(seed sequence)的说明。B.在COS细胞中，连接于PTEN和Foxola基因3’UTR以及人工miR-486结合位点(海绵)的萤光素酶构建体受miR-486转染的阻抑。C.在MRTFa诱导miR-486过表达时，内源PTEN蛋白质水平在心肌细胞中减少，同时亦显示磷酸化Akt的增加。D.STARS和MRTFa共表达在心肌细胞中与MRTFa单独相比导致更加强的对PTEN的阻抑。在STARS和MRTFa共表达时，下游Akt信号传导的指征(readout)，磷酸-Akt和磷酸-GSK3β，受协同诱导。E.在心肌细胞中由siRNA介导的miR-486敲低(knockdown)完全去除了响应MRTFa的miR-486水平的增加。F.在心肌细胞中，针对miR-486的siRNA去除了对PTEN和Foxola的阻抑和Akt信号传导的激活。G.在心肌细胞中，腺病毒引导的miR-486表达导致PTEN蛋白质水平的降低。

图14.在心脏胁迫应答中miR-486表达的调节。A.在心肌梗死(MI)三日后，miR-486表达在缘带(border zone)内显著降低，而在远端组织中未变化。MI后14日时，miR-486水平在缘带中为正常，而在远端组织中增加。B.Northern印迹显示miR-486在MHCα-miR-486转基因小鼠心脏中与非转基因的同窝小鼠(littermate)相比表达升高。C.MHCα-miR-486转基因动物与非转基因的同窝动物相比在心脏中显示磷酸-Akt增加。

发明详述

微小RNA(miRNA或miR)最近被认为与多种生物过程中有关联，包括调节发育时机(development timing)、细胞凋亡、脂肪代谢和造血细胞分化等。miRNA是小的、非蛋白质编码RNA，长度为约18到约25个核苷酸，其以序列特异性的方式调节基因表达。miRNA作为靶mRNA的阻抑物起作用，其作用机理是，当它们的序列完全互补时，miRNA促进靶mRNA的降解，或当它们的序列含有错配时，miRNA抑制靶mRNA的翻译。

miRNA通过RNA聚合酶II(Pol II)或RNA聚合酶III(Pol III；参见Qi等(2006)Cellular & Molecular Immunology Vol.3：411-419)转录，并从初始转录物产生，称为初级miRNA转录物(初-miRNA)，其通常长数千碱基，并来源于单独的miRNA基因、蛋白质编码基因的内含子或通常编码多个紧密联系的miRNA的多顺反子(poly-cistronic)转录物。参见Carrington等(2003)的综述。初-miRNA在细胞核中受RNA酶Drosha的加工成为约70-到约100-核苷酸的发夹形前体(前-miRNA)。在转运到细胞质后，所述发夹前-miRNA进一步受Dicer加工以产生双链的miRNA(Lee等，2003)。成熟的miRNA链随后掺入RNA-诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)中，在此处其与其靶mRNA通过碱基对互补性相联。在相对罕见的情况下，当miRNA的碱基与mRNA靶完美配对时，其促进该mRNA降解。更常见的是，miRNA与靶mRNA形成不完美的异源双链体(heteroduplex)，影响mRNA稳定性或抑制mRNA翻译。

使用无偏(unbiased)微阵列方法，本发明人鉴定出一簇两个mRNA，它们在主动脉平滑肌细胞中富集。使用多组织Northern印迹，验证了miR-143/miR-145簇在小鼠平滑肌细胞衍生物中的表达。miR-143和miR-145均在血管损伤后下调，且施用miR-143激动剂减少了由颈动脉结扎诱导的新内膜形成(参见实施例3)。因此，本发明部分基于下述发现：即miR-143和miR-145在平滑肌组织中富集、可调节平滑肌增殖并可减少血管损伤后的新内膜形成。相应的，本发明提供了抑制平滑肌细胞增殖的方法。在一个实施方案中，所述方法包括将平滑肌细胞与miR-143或miR-145的激动剂接触。在另一个实施方案中，所述平滑肌细胞是人平滑肌细胞。

本发明人亦显示miR-486，一种富集于心肌、骨骼肌和平滑肌中的miRNA的过表达，阻抑含PTEN 3’UTR报道基因在体外的翻译(参见实施例6)。所述PTEN基因，其为促存活(pro-survival)的Akt信号传导的负调节物，已成为对于动脉再狭窄和心肌梗死的治疗性调查研究中引人注目的靶(Huang等，2004；Mocanu和Yellon，2007)。在大鼠中PTEN在气囊损伤的颈动脉中的过表达导致了新内膜形成的减少(Huang等，2004)。因此，在平滑肌组织中抑制miR-486可导致PTEN表达的增加并随后导致新内膜形成的减少。因此，在另一个实施方案中，本发明提供了抑制平滑肌细胞增殖的方法，包括将平滑肌细胞与miR-486的抑制剂接触。

在人染色体5的基因间区中，miR-143和miR-145构成(comprise)微小RNA簇。邻近的调节序列含有SRF蛋白质的保守结合位点，所述SRF蛋白质为之前描述过的心肌素和MRTF的共同激活剂。将miR-143和miR-145的前miRNA序列加工为成熟序列和星序列(star sequence)。所述星序列从所述茎环结构的另一条链加工而成。下面给出miR-143和miR-145的成熟和星序列：

人成熟miR-143(SEQ ID NO：38)

UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC

人miR-143*(SEQ ID NO：91)

GGUGCAGUGCUGCAUCUCUGGU

人成熟miR-145(SEQ ID NO：51)

GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU

人miR-145*(SEQ ID NO：92)

GGAUUCCUGGAAAUACUGUUCU

miR-486位于最后一个内含子中，其为人染色体8上的Ank7基因在肌肉细胞中特异性表达的另选转录物(alternative transcript)的一部分。邻近的调节序列包含SRF蛋白的保守结合位点。人miR-486-5p的序列为UCCUGUACUGAGCUGCCCCGAG(SEQ ID NO：70)。人miR-486-3p的序列为CGGGGCAGCUCAGUACAGGAU(SEQ ID NO：93)，其从所述茎环结构的另一条链加工而成。

miR-422a是位于染色体15上基因间的微小RNA。亦发现miR-422a，正如miR-486，由MRTFa调节。邻近的调节序列包含SRF蛋白的保守结合位点。miR-422a的序列为5′-ACUGGACUUAGGGUCAGAAGGC-3′(SEQ IDNO：94)。

在一个实施方案中，本发明提供了通过使用miR-143和/或miR-145的激动剂或miR-486的抑制剂来抑制平滑肌细胞增殖的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了在有需要的受试者中抑制再狭窄或新内膜形成的方法。在一个实施方案中，所述方法包括施与所述受试者miR-486的抑制剂。在另一个实施方案中，所述方法包括施用miR-143和/或miR-145的激动剂。在另一个实施方案中，所述方法包括施用miR-143和/或miR-145激动剂以及miR-486抑制剂。又在另一个实施方案中，所述受试者是人。再狭窄字面上意为狭窄的复发。再狭窄通常在动脉中，或其他血管中发生，但可能发生于任何已经“疏通的”(unblocked)中空器官中。该术语常见于血管手术、心脏手术、介入性放射学或血管形成术后的介入性心脏学中，上述所有皆为经常治疗狭窄性损伤和新内膜的医学分支。优选的，一种或多种再狭窄或新内膜形成的症状在施用miR-486抑制剂和/或miR-143/miR-145激动剂后减轻。上述症状包括但不仅限于，心绞痛或心肌梗死，以及对额外的血管形成术或支架术的需求。

在一个实施方案中，miR-143和/或miR-145的激动剂可为包含成熟miR-143和/或miR-145序列的多核苷酸。在另一个实施方案中，miR-143和/或miR-145的激动剂可为包含miR-143和/或miR-145星序列的多核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：51、SEQID NO：91或SEQ ID NO：92的序列。在另一个实施方案中，miR-143和/或miR-145的激动剂可为包含miR-143和/或miR-145的初-miRNA或前-miRNA序列的多核苷酸。包含成熟miR-143/miR-145、前-miR-143/前-miR-145或初-miR-143/初-miR-145序列的多核苷酸可为单链的或双链的。所述多核苷酸可包含一个或多个化学修饰，如锁定核酸(locked nucleic acid)、肽核酸、糖修饰如2’-O-烷基(例如，2’-O-甲基，2’-O-甲氧乙基)，2’-氟和4’-硫修饰，以及主链修饰，如一个或多个硫代磷酸酯、吗啉代或膦酰羧酸酯(phosphonocarboxylate)连接。在一个实施方案中，所述包含miR-143和/或miR-145序列的多核苷酸与胆固醇偶联。在另一个实施方案中，所述miR-143和/或miR-145的激动剂可为与miR-143或miR-145不同，起增加、补充或替代miR-143和/或miR-145功能的作用的试剂。举例而言，血清应答因子(SRF)或心肌素，两者均上调miR-143和miR-145的表达，可为miR-143和/或miR-145的激动剂。

在另一个实施方案中，miR-143和/或miR-145的激动剂可在体内从载体表达。“载体”为可用于将目标核酸递送到细胞内的组合物。本领域已知多种载体，包括但不仅限于，线性多核苷酸、与离子的或两亲性的化合物相关联的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。病毒载体的实例包括但不仅限于，腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体以及类似物。表达构建体可在活细胞中复制，或可通过合成制备。就本申请而言，术语“表达构建体”、“表达载体”和“载体”可互换使用以表明本发明的应用是一般性，说明性意义上的，而并不意欲对本发明加以限定。

在一个实施方案中，表达miR-143和/或miR-145的表达载体包含“可操作连接于”编码miR-143和/或miR-145的多核苷酸的启动子。在另一个实施方案中，所述多核苷酸可编码miR-143和/或miR-145簇。短语“可操作连接”或“置于转录控制下”在本文中使用时意指该启动子处于相对于多核苷酸的正确位置和朝向以控制由RNA聚合酶引发的转录以及该多核苷酸的表达。编码miR-143和/或miR-145的多核苷酸可编码初级微小RNA-miR-143和/或miR-145序列(初-miR-miR-143/初-miR-145)、前体-微小RNA-miR-143和/或miR-145序列(前-miR-miR-143/前-miR-145)、成熟miR-143和/或miR-145序列或miR-143和/或miR-145星序列。在另一个实施方案中，所述表达载体包含可操作连接于启动子的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ IDNO：38的序列。在另一个实施方案中，所述表达载体包含可操作连接于启动子的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO：51的序列。又在另一个实施方案中，所述表达载体包含可操作连接于启动子的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：92的序列。所述包含SEQ IDNO：38、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：92的序列的多核苷酸长度可为约18到约2000个核苷酸、长度为约70到约200个核苷酸、长度为约20到约50个核苷酸或长度为约18到约25个核苷酸。

在某些实施方案中，编码目标多核苷酸的核酸置于启动子的转录控制下。“启动子”指由细胞的合成装置(synthetic machinery)，或导入的合成装置识别的、起始基因的特异性转录所需的DNA序列。术语启动子可在此用于指一组簇集于RNA聚合酶I、II或III起始位点周围的转录控制模块。

在一些实施方案中，人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因(immediate earlygene)启动子、SV40早期启动子、劳氏肉瘤病毒长末端重复(long terminalrepeat)、大鼠胰岛素启动子和甘油醛-3-磷酸脱氢酶可用于获取目标多核苷酸序列的高水平表达。亦同样考虑了使用其他本领域公知的病毒或哺乳动物细胞或细菌噬菌体启动子以实现目标多核苷酸序列的表达，只要表达水平对于给定的目的而言是足够的即可。

通过使用具有公知性质的启动子，可优化转染或转化后目标多核苷酸的表达水平和样式。此外，选择响应特定生理信号而受调节的启动子可使所述多核苷酸的诱导型表达成为可能。表1和2列举了数个在本发明的背景下可用来调节目标多核苷酸(例如，miR-143、miR-145、miR-486和/或miR-422a的激动剂或抑制剂)表达的调节元件。该列表并不意欲穷尽所有涉及促进基因表达的可能元件，而是仅为其例示。

下面列出可与目标多核苷酸组合用于表达构建体的病毒启动子、细胞启动子/增强子和诱导型启动子/增强子(表1和表2)。此外，任何启动子/增强子组合(根据Eukaryotic Promoter Data Base(真核启动子数据库)EPDB)也可用于驱动所述多核苷酸表达。如果提供合适的细菌聚合酶(或者作为递送复合物的一部分，或者作为附加的基因表达构建体)，真核细胞可支持从一些细菌启动子的细胞质转录。

特别引人注目的是肌肉特异性启动子，而更具体而言，心脏特异性启动子。这些包括肌球蛋白轻链-2启动子(Franz等，1994；Kelly等，1995)、α-肌动蛋白启动子(Moss等，1996)，肌钙蛋白1启动子(Bhavsar等，1996)；Na⁺/Ca²⁺交换器启动子(Barnes等，1997)、抗肌萎缩蛋白启动子(Kimura等，1997)、α7整联蛋白启动子(Ziober和Kramer，1996)、脑钠肽(natriuretic peptide)启动子(LaPointe等，1996)和αB-晶体蛋白/小热休克蛋白启动子(Gopal-Srivastava，1995)、α肌球蛋白重链启动子(Yamauchi-Takihara等，1989)和ANF启动子(LaPointe等，1988)。

可包括多腺苷酸化信号以在期望时实现基因转录物的适当多腺苷酸化。并不认为多腺苷酸化信号的性质对本发明的成功实施是至关重要的，且任何这样的序列均可使用，如人生长激素和SV40多腺苷酸化信号。亦考虑将终止子作为表达盒的元件。这些元件可用于增强信息水平并使从该盒进入到其他序列中的通读(read through)。

在本发明的某些实施方案中，含有本发明核酸构建体的细胞可在体外或体内通过在表达构建体中包含标记物而得以鉴定。上述标记物可赋予细胞可鉴定的变化，容许容易地鉴定含有所述表达构建体的细胞。通常包括药物选择标记物有助于克隆和选择转化体，例如赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和组氨醇的抗性的基因为有用的选择标记。或者，可使用酶，如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。亦可使用免疫标记物。并不认为使用的选择标记是重要的，只要其能够与编码基因产物的核酸同时表达即可。选择标记的其他实例对本领域技术人员是公知的。

有多种可将表达载体导入细胞的方法。在本发明的某些实施方案中，所述表达构建体包含病毒或来源于病毒基因组的经工程改造的构建体。某些病毒通过受体介导胞吞作用进入细胞、整合入宿主细胞基因组并稳定有效表达病毒基因的能力使其成为将外源基因转移入哺乳动物细胞的有力候选者(Ridgeway，1988；Nicolas and Rubenstein，1988；Baichwal和Sugden，1986；Femin，1986)。

一种优选的体内递送方法涉及使用腺病毒表达载体。“腺病毒表达载体”意为包括那些包含足以(a)支持构建体的包装和(b)表达已克隆于其中的多核苷酸的腺病毒序列的构建体。所述表达载体包含腺病毒的经遗传工程改造的形式。对腺病毒(一种36kB的线性双链DNA病毒)的知识，使得用长至7kB的外来序列取代大段腺病毒DNA成为可能(Grunhaus和Horwitz，1992)。与逆转录病毒不同，腺病毒对宿主细胞的感染不导致染色体整合，这是因为腺病毒DNA能以附加体的方式复制而没有潜在的遗传毒性。而且，腺病毒在结构上是稳定的，且在广泛扩增后未检测出基因组重排。腺病毒实际上能够感染所有上皮细胞，无论其处于细胞周期哪个阶段。

腺病毒特别适合用作基因转移载体，这是因为其中等大小的基因组、易于操作、高滴度、广泛的靶细胞范围和高感染率(infectivity)。该病毒基因组两端都含有100-200碱基对的反向重复序列(ITR)，其为病毒DNA复制和包装所必需的顺式元件。

除需要所述腺病毒载体具有复制缺陷，或者至少是条件性缺陷的外，相信所述腺病毒载体的性质对于本发明的成功实施而言并不是至关重要的。所述腺病毒可为任何42个不同的已知血清型或亚群A-F之一。亚群C的5型腺病毒是为了获取供本发明使用的条件性复制缺陷型腺病毒载体的优选起始材料。这是因为5型腺病毒是人腺病毒，已知大量关于它的生物化学和遗传信息，且从历史上看，其用在大多数采用腺病毒作为载体的构建中。

根据本发明的典型载体是复制缺陷的，且不会具有腺病毒E1区。因此，在去除了E1编码序列的位置导入编码目标基因的多核苷酸最为便利。然而所述构建体在腺病毒序列中的***位置对本发明并非关键。编码目标基因的多核苷酸在E3替换载体中亦可***并替代被删除的E3区，如Karlsson等(1986)所述，或当辅助细胞系或辅助病毒补足E4缺陷时，***E4区。

腺病毒载体已经用于真核基因表达(Levrero等，1991；Gomez-Foix等，1992)和疫苗开发(Grunhaus和Horwitz，1992；Graham和Prevec，1991)。最近，动物研究提示重组腺病毒可用于基因疗法(Stratford-Perricaudet和Perricaudet，1991；Stratford-Perricaudet等，1990；Rich等，1993)。向不同组织施用重组腺病毒的研究包括气管滴注(Rosenfeld等，1991；Rosenfeld等，1992)、肌肉注射(Ragot等，1993)、外周静脉内注射(Herz和Gerard，1993)和立体定向(stereotactic)接种入脑内(Le Gal La Salle等，1993)。

逆转录病毒亦适用于在细胞中表达miR-143、miR-145、miR422a和/或miR-486的激动剂。逆转录病毒为一组单链RNA病毒，其特征为能够在受感染的细胞内通过逆转录过程将其RNA转换为双链DNA(Coffin，1990)。所得的DNA随后稳定的作为原病毒整合入细胞染色体中并指导病毒蛋白质的合成。所述整合导致病毒基因序列在受体细胞及其后代中保持。逆转录病毒基因组包括三个基因：gag、pol和env，分别编码壳体蛋白、聚合酶以及被膜组分。gag基因上游发现的序列包含将所述基因组包装入病毒体的信号。两个长末端重复(LTR)序列位于病毒基因组的5’和3’端。其中包含强启动子和增强子序列，并亦为整合入宿主细胞基因组所需(Coffin，1990)。

为了构建逆转录病毒载体，将编码目标基因的核酸***到病毒基因组某些病毒序列处以产生复制缺陷的病毒。为了产生病毒体，构建了含有gag、pol和env基因，但是不含LTR以及包装组分的包装细胞系(Mann等，1983)。当将含有cDNA的重组质粒与所述逆转录病毒LTR以及包装序列一起导入该细胞系(例如，通过磷酸钙沉淀法)时，所述包装序列使重组质粒的RNA转录物能够包装到病毒颗粒中，病毒颗粒随后被分泌到培养基中(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann等，1983)。随后收集含有重组逆转录病毒的培养基，视需要进行浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染广泛的细胞类型。然而整合和稳定表达需要宿主细胞的***(Paskind等，1975)。

其他病毒载体可在本发明中用作表达构建体。可使用来源于如牛痘病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988)、腺伴随病毒(AAV)(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Hermonat和Muzycska，1984)和疱疹病毒的病毒的载体。其为不同哺乳动物细胞提供了数种吸引人的特征(Friedmann，1989；Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988；Horwich等，1990)。

为了实现有义和反义基因构建体的表达，所述表达构建体必须递送入细胞。该递送可在体外完成，如在用于转化细胞系的实验步骤中，或在体内或回体完成，如在对某些疾病状态的治疗中。一种递送机制是通过病毒感染进行的，其中所述表达构建体包裹于感染性病毒颗粒的壳体中。

本发明亦考虑了数种将表达构建体转移至培养的哺乳动物细胞中的非病毒方法。这些包括磷酸钙沉淀(Graham和Van Der Eb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe等，1990)、DEAE-葡聚糖(Gopal，1995)、电穿孔(Tur-Kaspa等，1986；Porter等，1984)、直接显微注射(Harland和Weintraub，1985)、装载DNA的脂质体(Nicolau和Sene，1982；Fraley等，1979)以及Lipofectamine-DNA复合物、细胞超声处理(Yang等，1990)和受体介导的转染(Wu和Wu，1987；Wu和Wu，1988)。这些技术中的一些可成功的调整以供体内或回体使用。

一旦将所述表达构建体递送到细胞内，编码目标基因的核酸可置于不同位置并在该处表达。在某些实施方案中，编码所述基因的核酸可稳定的整合入所述细胞的基因组中。该整合可为通过同源重组(基因替代)在相关(cognate)位置以同样取向整合，或其可以整合入随机、非特异性的位置(基因增强，gene augmentation)。又在其他实施方案中，所述核酸可作为单独的、附加体DNA区段(segment)稳定的保持在细胞中。上述核酸区段或“附加体”编码足以使维持和复制不依赖于宿主细胞周期，或与之同步的序列。所述表达构建体如何递送到细胞和所述核酸保留在细胞中何处取决于使用的表达构建体的类型。

在本发明又一个实施方案中，所述表达构建体可简单的由裸的(naked)重组DNA或质粒组成。构建体的转移可通过任何上面提及的方法进行，所述方法物理的或化学的透化细胞膜。这特别适用于体外转移，但亦可同样适用于体内的用途。Dubensky等(1984)成功的将多瘤病毒DNA以磷酸钙沉淀的形式注射入成年小鼠和新生小鼠的肝和脾，表现出活跃的病毒复制和急性感染。Benvenisty和Neshif(1986)也证明了直接腹膜内注射经磷酸钙沉淀的质粒导致转染基因的表达。编码目标基因的DNA亦可以相似的方式在体内转移并表达所述基因产物。

又在本发明另一个实施方案中，将裸的DNA表达构建体转移到细胞内可能涉及颗粒轰击(particle bombardment)。该方法依赖于将涂布了DNA(DNA-coated)微弹加速至高速使其得以在细胞膜上穿孔并进入细胞，但并不杀灭细胞(Klein等，1987)。已开发了用于加速小颗粒的数种装置。一种上述装置依赖高压放电生成电流，其继而提供动力(Yang等，1990)。使用的微弹由生物学惰性的物质组成，如钨或金珠。

经选择的器官包括大鼠和小鼠的肝、皮肤和肌肉在体内被轰击(Yang等1990；Zelenin等，1991)。这可能需要用手术暴露所述组织或细胞，以消除任何位于枪和靶器官之间的居间组织，亦即，回体处理。同样，编码特定基因的DNA可通过该方法递送，并仍然包含在本发明中。

在本发明进一步的实施例中，所述表达构建体可封装(entrapped)于脂质体中。脂质体为以磷脂双层膜和内部水性介质为特征的囊泡结构(vesicularstructure)。多层的脂质体具有由水性介质分隔的多个脂肪层。当将磷脂悬浮于过量水溶液时，其自动形成。在形成封闭结构之前，脂质组分发生自身重排，并在所述脂质双层间封装水和溶解的溶质(Ohosh和Bachhawat，1991)。亦考虑了Lipofectamine-DNA复合物。

在本发明某些实施方案中，所述脂质体可与血细胞凝集病毒(HVJ)复合。已经显示这促进与细胞膜的融合并促进经脂质体封装的DNA进入细胞(Kaneda等，1989)。在其他实施方案中，所述脂质体可与细胞核非组蛋白染色体蛋白质(HMG-1)复合或联合使用(Kato等，1991)。还在进一步的实施方案中，所述脂质体可与HVJ和HMG-1二者复合或联合使用。由于上述表达构建体已经成功的应用于在体外和体内转移并表达核酸，所以它们可用于本发明。当在所述DNA构建体中使用细菌启动子时，亦会期望在所述脂质体中包含合适的细菌聚合酶。

其他可用于将编码特定基因的核酸递送入细胞的表达构建体是受体介导的递送运载体。这些利用了在几乎所有真核细胞中通过受体介导的胞吞对大分子的选择性摄入。因为不同受体的细胞类型特异性分布，所述递送可为高度特异性的(Wu和Wu，1993)。

受体介导基因靶向运载体通常由两个组分组成：细胞受体特异性配体和DNA结合剂。数种配体已用于受体介导的基因转移。被最广泛表征的配体为无唾液酸血清类粘蛋白(asialoorosomucoid，ASOR)(Wu和Wu，1987)和运铁蛋白(Wagner等，1990)。最近，一种合成的拟糖蛋白(neoglycoprotein)(其与ASOR识别相同的受体)已经被用作基因递送运载体(Ferkol等，1993；Perales等，1994)而表皮生长因子(EGF)亦已经用于将基因递送到鳞癌细胞(Myers，EPO 0273085)。

在其他实施方案中，所述递送运载体可包含配体和脂质体。举例而言，Nicolau等(1987)使用乳糖基-神经酰胺(lactosyl-ceramide)(一种末端为半乳糖的无唾液酸神经节苷酯(asialganglioside))掺入脂质体，并观察到肝细胞对胰岛素基因摄入的增加。因此，可将编码特定基因的核酸通过多种含或不含脂质体的受体-配体***特异性的递送到细胞类型中是可行的。举例而言，表皮生长因子(EGF)可用作受体，用于介导将核酸递送入显示出EGF受体上调的细胞中。甘露糖可用于靶向肝脏细胞表明的甘露糖受体。而且，对CD5(CLL)、CD22(淋巴瘤)、CD25(T-细胞白血病)和MAA(黑素瘤)可类似的用作靶向模块(moiety)。

在特定的实例中，所述寡核苷酸可与阳离子脂质组合施用。阳离子脂质的实例包括但不仅限于，lipofectin、DOTMA、DOPE和DOTAP。WO/0071096的公开文本(通过提述将其明确包含于本文中)描述了不同的配制物，如可有效用于基因疗法的DOTAP：胆固醇或胆固醇衍生物配制物。其他的公开亦讨论了不同的脂质或脂质体配制物包括纳米颗粒以及给药方法；这些包括但不仅限于，美国专利公开20030203865、20020150626、20030032615和20040048787，特别以下述范围将其通过提述明确包含于本文中：它们公开了配制物以及给药和递送核酸的其他有关方面。用于形成颗粒的方法亦公开于美国专利5844107、5877302、6008336、6077835、5972901、6200801和5972900，通过提述将它们就这些方面包含于本文中。

在某些实施方案中，基因转移可更加容易的在回体条件下进行。回体基因疗法指从动物分离细胞，将核酸在体外递送入所述细胞，并随后将修饰的细胞送回动物中。这可能涉及从动物手术移除组织/器官，或者细胞和组织的原代培养。

在本发明的另一个实施方案中，抑制平滑肌细胞增殖的方法包括将平滑肌细胞与miR-486的抑制剂接触。还在本发明的另一个实施方案中，在有需要的受试者中抑制再狭窄或新内膜形成的方法包括施与所述受试者miR-486的抑制剂。miR-486的抑制剂可包括微小RNA拮抗剂、反义寡核苷酸和抑制性RNA分子。

对微小RNA功能的抑制可通过施用靶向miR-486的成熟序列的反义寡核苷酸来达成。所述反义寡核苷酸可为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。所述反义寡核苷酸优选具有至少一个化学修饰。反义寡核苷酸可包含一个或多个“锁定核酸”。“锁定核酸(LNA)”为在核糖糖模块的2’和4’碳原子间包含额外的桥联的修饰的核糖核苷酸，其导致其“锁定”的构型，该构型赋予含有该INA的寡核苷酸增强的热稳定性。或者，所述反义寡核苷酸可包含肽核酸(PNA)，其含有基于肽的主链而不是糖-磷酸酯主链。所述反义寡核苷酸可包含的其他化学修饰包括但不仅限于，糖修饰，如2’-O-烷基(例如，2’-O-甲基，2’-O-甲氧乙基)，2’-氟和4’-硫修饰，以及主链修饰，如一个或多个硫代磷酸酯、吗啉代或膦酰羧酸酯连接(参见，例如，美国专利号6693187和7067641，通过提述将其整体包含于本文中)。在一些实施方案中，合适的反义寡核苷酸为2’-O-甲氧乙基“缺口聚物(gapmer)”，其在5’和3’端均包含2’-O-甲氧乙基修饰的核糖核苷酸，并在其间包含至少十个脱氧核糖核苷酸。这些“缺口聚物”能够引发RNA靶的RNA酶H-依赖性降解机制。对于反义寡核苷酸的其他用于增强稳定性和增加有效性的修饰，如描述于美国专利6838283(将其通过提述整体包含于本文中)中的，在本领域是已知的，并适用于本发明的方法。可用于抑制微小RNA活性的优选反义寡核苷酸为约19到约25个核苷酸长。反义寡核苷酸可包含与成熟miRNA序列至少部分互补的序列，例如，与成熟miRNA序列至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％互补。在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸可与成熟miRNA序列基本上互补，即与靶多核苷酸序列为至少约95％、96％、97％、98％或99％互补的。在一个实施方案中，所述反义寡核苷酸包含与成熟miRNA序列100％互补的序列。

在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸为微小RNA拮抗剂。“微小RNA拮抗剂”是单链的、化学修饰的核糖核苷酸，其与所述miRNA序列至少部分互补。微小RNA拮抗剂可包含一个或多个修饰的核苷酸，如2’-O-甲基糖修饰。在一些实施方案中，微小RNA拮抗剂仅包含修饰的核苷酸。微小RNA拮抗剂亦可包含一个或多个硫代磷酸酯连接，导致部分或全部的硫代磷酸酯主链。为促进体内递送和稳定性，微小RNA拮抗剂可在其3’端连接胆固醇或其他模块。适于抑制miRNA的微小RNA拮抗剂可为约15到约50个核苷酸长，较优选约18到约30个核苷酸长，且最优选约20到约25个核苷酸长。“部分互补”指与靶多核苷酸序列至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％互补的序列。微小RNA拮抗剂可与成熟miRNA序列为至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％互补的。在一些实施方案中，微小RNA拮抗剂可与成熟miRNA序列基本上互补，即与靶多核苷酸序列至少约95％、96％、97％、98％或99％互补。在其它实施方案中，微小RNA拮抗剂与所述成熟miRNA序列100％互补。

另一种抑制miR-486功能的方法是施用具有与miR-486的成熟序列至少部分相同和部分互补的双链区的抑制性RNA分子。所述抑制性RNA分子可为双链的小干扰RNA(siRNA)或包含茎环结构的短发夹RNA分子(shRNA)。所述抑制性RNA分子的双链区可包含与成熟miRNA序列至少部分相同和部分互补的序列，例如，约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同和互补的序列。在一些实施方案中，所述抑制性RNA的双链区包含与成熟miRNA序列至少基本上相同和基本上互补的序列。“基本上相同和基本上互补”指与靶多核苷酸序列至少约95％、96％、97％、98％或99％相同和互补的序列。在其他实施方案中，所述抑制性RNA分子的双链区可包含与靶miRNA序列100％的同一性和互补性。

本文描述的抑制性核苷酸分子靶向miR-486的成熟序列(例如，SEQ IDNO：70或SEQ ID NO：93)。在一些实施方案中，miR-486的抑制剂为包含与miR-486的成熟序列完美互补的序列的微小RNA拮抗剂。在一个实施方案中，miR-486的抑制剂是具有与SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：93部分或完美互补的序列的微小RNA拮抗剂。

在一些实施方案中，miR-486的抑制剂是化学修饰的反义寡核苷酸。在一个实施方案中，miR-486的抑制剂是包含与SEQ ID NO：70或SEQ IDNO：93基本上互补的序列的化学修饰的反义寡核苷酸。如本文所使用的“基本上互补”指与靶核苷酸序列(例如成熟或前体miRNA序列)至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％互补的序列。

反义寡核苷酸可包含与miR-486的前体miRNA序列(前-miRNA)(例如，前-miR-486)基本上互补的序列。在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸包含与位于所述前-miRNA序列茎环区外的序列基本上互补的序列。

在本发明的其他实施方案中，miR-486的抑制剂可为抑制性RNA分子，如核酶、siRNA或shRNA。在一个实施方案中，miR-486的抑制剂是包含双链区的抑制性RNA分子，其中所述双链区包含与miR-486的成熟序列(例如，SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：93)具有100％同一性和互补性的序列。在一些实施方案中，miR-486的抑制剂为包含双链区的抑制性RNA分子，其中所述双链区包含与miR-486的成熟序列具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性和互补性的序列。

在本发明的另一个实施方案中，miR-143和/或miR-145的激动剂或miR-486的抑制剂可与其他治疗性形态(modality)，例如，抑制再狭窄或新内膜形成的其他作用剂组合使用。心脏病学家已经尝试了多种方法以减少再狭窄的风险。支架术变得更加常见，替代气囊血管形成术。在支架手术中，将金属网状物(支架)配置在倚靠着动脉壁使之与所述动脉血管吻合。其他方法包括局部放射疗法以及使用免疫抑制药物，其涂覆于所述用作支架的网状物上。因此联合疗法的实例包括上述任意方法。

联合可如下达成，通过将血管平滑肌细胞与单一组合物或包括全部两种作用剂的药物配制物接触，或者通过将所述细胞与两种不同的组合物或配制物同时接触，其中一种组合物包含miR-143/miR-145激动剂和/或miR-486抑制剂而另一种包含第二种试剂。或者，使用miR-143/miR-145激动剂和/或miR-486抑制剂的疗法可在施用其他作用剂之前或之后，间隔从数分钟到数周范围。在将另一作用剂以及miR-143/miR-145激动剂或miR-486抑制剂分别施用于细胞的实施方案中，通常须保证每次递送时间之间的间隔不至于为显著长的期间，从而使得所述作用剂以及miR-143/miR-145激动剂或miR-486抑制剂仍将能够对细胞施加有益的联合作用。在上述例子中，考虑到通常会将细胞与两种形态在彼此相距约12-24小时之内进行接触，且更优选在彼此相距约6-12小时之内，最优选延迟时间仅为约12小时。然而，在一些情况下，当各次施用之间经过数日(2、3、4、5、6或7)到数周(1、2、3、4、5、6、7或8)时，可能期望显著延长处理期间。

亦考虑到会期望超过一次地施用miR-143/miR-145激动剂或miR-486抑制剂，或另一作用剂。就此，可采用多种组合。举例说明的话，当miR-143/miR-145激动剂或miR-486抑制剂为“A”而另一作用剂为“B”时，下列基于总计3和4次施用的排列是示例性的：

A/B/A  B/A/B  B/B/A  A/A/B  B/A/A  A/B/B  B/B/B/A  B/B/A/B

A/A/B/B  A/B/A/B  A/B/B/A  B/B/A/A  B/A/B/A  B/A/A/B  B/B/B/A

A/A/A/B  B/A/A/A  A/B/A/A  A/A/B/A  A/B/B/B  B/A/B/B  B/B/A/B

同样考虑了其他的组合。“其他”疗法的特定实例如下所提供。

在本发明的另一个实施方案中，在有需要的受试者中抑制再狭窄或新内膜形成的方法进一步包括施与所述受试者抑制再狭窄或新内膜形成的第二种作用剂。本文所示的作为抗再狭窄剂的特定作用剂包括血管紧张素转化酶抑制剂；烟碱受体激动剂、增加一氧化氮浓度的作用剂、抗血管生成剂、TGF-β受体的激动剂；死亡结构域受体配体；和凝血酶抑制剂。所述作用剂可以多肽、肽、小有机分子、编码目标多肽的核酸等形式进行递送。多肽可为核酸的任何翻译产物，不考虑其大小和糖化修饰。作用剂亦可为单纯药(simpledrug)、肽、肽片段、DNA、RNA、核酶或经工程改造的核酸与肽或肽片段的杂合体、或上述各种的衍生物的形式。雷帕霉素(rapamycin)的类似物，如他克莫司(tacrolimus，FK-506)、西罗莫司(sirolimus)和依维莫司(everolimus)，通常用作免疫抑制剂但近来发现亦抑制血管平滑肌细胞的增殖，似在临床试验中对预防再狭窄十分有效。反义敲低c-myc，一种对细胞复制的进行而言的关键蛋白质，是另一种抑制动脉壁中细胞增殖的方法，并已经经过使用寡聚物的初步临床试验。

血管紧张素转化酶抑制剂(ACE-I)用于抗高血压和肾保护作用。ACE抑制剂包括但不仅限于，卡托普利(captopril)、贝那普利(benazepril)、依那普利(enalapril)、福辛普利(fosinopril)、赖诺普利(lisinopril)、喹那普利(quinapril)、雷米普利(Ramipril)、咪达普利(imidapril)、培哚普利(peridopril)、特丁胺(erbumine)和群多普利(trandolapril)。ACE受体阻断剂亦可代替ACE抑制剂或与其一同使用，且其包括氯沙坦(losartan)、厄贝沙坦(irbesartan)、坎他沙坦(candesartan)、环庚塞(cilexetil)以及缬沙坦(valsartan)。烟碱受体激动剂，例如，烟碱(S-3-(1-甲基-2-吡咯烷基)吡啶)(nicotine(S-3-(1-methyl-2-pyrrolidinyl)pyridine))以及其他基本上特异性结合烟碱受体并提供药效的化合物。“烟碱受体激动剂”涵盖了天然存在的化合物(包括但不仅限于，小分子、多肽、肽等，特别是天然存在的植物碱等)、内源配体(例如，自天然来源提纯的、重组产生的或合成的，并进一步包括上述内源配体的衍生物和变体)和合成产生的化合物(例如，小分子、肽等)。术语“烟碱”进一步包括烟碱的任何药理学上可接受的衍生物或代谢物，其显示出类似于烟碱的药物治疗性质。上述衍生物、代谢物和代谢物的衍生物在本领域是已知的，且包括但不必然限于，可替宁(cotinine)、去甲可替宁(norcotinine)、去甲烟碱(nornicotine)、烟碱N-氧化物、可替宁N-氧化物、3-羟基可替宁和5-羟基可替宁或其药学上可接受的盐。

增加一氧化氮的作用剂作为抗再狭窄剂是吸引人的，例如，S-亚硝基青霉胺(S-nitrosopenicillamine)、硝普钠(sodium nitroprusside)、N-乙基-2-(1-乙基-2-羟基-2-亚硝基肼基)乙胺(N-ethyl-2-(1-ethyl-2-hydroxy-2 nitrosohydrazino)ethanamine)(NOC 12)等。一氧化氮的产生亦可通过细胞因子，如γ-千扰素、肿瘤坏死因子、IL-1、IL-2和内毒素因其对酶(一氧化氮合酶)的作用来调节。NO合酶的可诱导形式由细胞因子增加，而组成型形式似由细胞因子所减少。已发现HMG-CoA还原酶抑制剂上调内皮细胞NOS活性，如美国专利6147109，Liao等所述。任何形式的一氧化氮合酶可作为蛋白质或自其衍生的活性片段，或者作为供表达用的DNA构建体使用。

具有抗血管生成作用的化合物对于抑制再狭窄也是吸引人的。这些包括抗血管生成多肽：血管他丁(angiostatin)(O’Reilly等，1994)；内皮他丁(endostatin)(O’Reilly等，1997)；以及抗血管生成的抗凝血酶III(Bock等，1982)；以及类似物，且进一步包括其功能上的活性变体和衍生物。其他抗血管生成剂包括基质金属蛋白酶抑制剂，例如氨磷汀(amifostine)、WR-1065；马立马司他(marimastat)、primomastat、α-1抗胰蛋白酶；鞘氨醇等。

或者，阻断凝血酶的化合物和其他抗凝血剂可用于抑制再狭窄，这些化合物基于三肽基序D-Phe-Pro-Arg；例如，LY287045等。很多化合物，如伊诺加群(inogatran)和美拉加群(melagatran)在本领域是已知的。对于非限定性的实例，参见美国专利6326386；6232315；6201006；6174855；6060451和5985833等。

TGF-β受体的激动剂亦是吸引人的。TGF-β受体类型I和类型II介导TGF-β的大部分活性(Ebner等，1993；以及Franzen等，1993)。配体包括TGF-β，及其模拟物(mimetic)和生物学活性衍生物。将雷帕霉素非共价的联结于基于支架的递送***亦是吸引人的。非共价联结可包括氢键、范德华力或高度粘稠表面中的简单的被动纠结(simply passive entanglement)，或其组合。特异于血管他丁的载体可用于紧密调节的结合，且包括对湿度(在体内为时间依赖性)、pH、渗透压(osmolality)或特定抗原等敏感的可剪切接头，也包括未来接头和本领域技术人员公知的相关接头。

共价或非共价联结抗血小板剂亦是吸引人的，包括GPIIb/IIIa抑制剂，例如，RheoPro。

对于诱导细胞凋亡，吸引人的作用剂包括死亡结构域受体配体，其为结合包含死亡结构域、或其同源物或正向同源物的哺乳动物细胞表面受体的化合物，通常是多肽化合物，且其通过该结合将细胞凋亡信号递送到细胞中。由这些受体引发的细胞内蛋白质相互作用可归结于所述死亡结构域的结合相互作用，所述结构域同源于TNF-R1的C-末端附近大约80个氨基酸的结构域，且引起信号传导的细胞毒性(Huang等，1996)。TNF受体死亡结构域家族包括TNF-R1、Fas(CD95)、TRAMP(wsI/Apo-3/DR-3)、TRAIL-R1(DR-4)和TRAIL-R2(DR-5，TRICK2，KILLER)。死亡结构域配体包括通过结合特定死亡结构域受体来调节细胞增殖和分化的蛋白质。这些配体包括TNF家族，例如，TNF、淋巴毒素、CD30配体、4-1BB配体、CD40配体、CD27配体和TRAIL(TNF相关细胞凋亡诱导配体)，及其同源物和类似物。TNF的具功能、可溶性形式以及人FasL以三聚体存在。淋巴毒素β(TNF家族的一员)由在膜上的一个(淋巴毒素-α，或TNF-β)和两个β链(淋巴毒素-β)的异源三聚体组成。

抗再狭窄多肽和肽可以其天然形式施用，或通过施用编码本文所述目标分子的表达载体进行。

药物的复杂***可由支架携带。抗凝血剂或抗血小板剂可包括在装置的最外层表面从而在最初几日非常迅速的洗脱。抗炎和抗复制剂可配制于装置中，以在之后当新内膜生长过度包围所述装置后接触非血细胞时持续洗脱。药物洗脱速率无需均一，且可经修饰以满足患者的需要。

又在本发明另一个实施方案中，如本文所述的miR-143/miR-145激动剂或miR-486抑制剂可配制为医用装置，如支架、气囊或导管的涂层。在治疗受试者中再狭窄的方法中特别有用的是，miR-143/miR-145激动剂或miR-486抑制剂可用于涂覆金属支架以产生药物洗脱支架(drug-eluting stent)。药物洗脱支架是保持变得狭窄的或有病的动脉展开，且释放阻止细胞增殖和/或炎症的化合物的支架。miR-143/miR-145激动剂或miR-486抑制剂可适用于包埋于薄的聚合物中以供经时释放激动剂或抑制剂的金属支架。基于装置的递送方法和涂覆装置的方法在本领域是公知的，药物洗脱支架和其他可移植的装置亦如此。参见，例如，美国专利号7294329、7273493、7247313、7236821、7232573、7156869、7144422、7105018、7087263、7083642、7055237、7041127、6716242和6589286以及WO 2004/004602，将其通过提述全文包含于本文中。因此，本发明包括医用装置，如气囊、导管或支架，其用miR-143激动剂、miR-145激动剂和/或miR-486抑制剂涂覆。在一些实施方案中，miR-143/miR-145激动剂或miR-486抑制剂可与其他如本文所述对抗再狭窄化合物组合使用以产生用于掺入药物洗脱支架的配制物。其他适合与miR-143/miR-145激动剂或miR-486抑制剂组合使用的化合物包括但不仅限于，紫杉醇(paclitaxel)、雷帕霉素(西罗莫司)、他克莫司、zotarolimus、依维莫司、多西他赛(docetaxel)、吡美莫司(pimecrolimus)及其衍生物。

本发明亦包括在有需要的受试者中治疗病理学心脏肥大、心力衰竭或心肌梗死的方法。在一个实施方案中，所述方法包括施与所述受试者miR-486和/或miR-422a的激动剂。优选地，miR-486和/或miR-422a的激动剂的施用导致在受试者中心脏肥大、心力衰竭或心肌梗死一种或多种症状的改善，或延迟从心脏肥大到心力衰竭的转变。一种或多种改善的症状可为，例如，运动能力增加、心脏射血(cardiac ejection)体积增加、左心室舒张末期压降低、肺毛细血管楔压降低、心输出量增加、心指数增加、肺动脉压降低、左心室收缩和舒张末期内径减少、左和右心室壁应力减少、壁张力减少、生活品质提高、以及疾病相关发病率与死亡率减少。此外，使用miR-486/miR-422a激动剂可阻止心脏肥大及其相关症状出现。在一个实施方案中，将miR-486和/或miR-422a的激动剂施与罹患心肌梗死的受试者可通过减少心脏细胞的丧失来减少梗死的大小。在另一个实施方案中，在罹患心肌梗死的受试者中心脏功能在施用miR-486和/或miR-422a的激动剂后稳定下来。

在一个实施方案中，miR-486和/或miR-422a的激动剂可为包含成熟miR-486和/或miR-422a序列的多核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：93或SEQ ID NO：94的序列。在另一个实施方案中，miR-486和/或miR-422a的激动剂可为包含miR-486和/或miR-422a的初-miRNA或前-miRNA序列的多核苷酸。包含成熟miR-486和/或miR-422a，前-miR-486/前-miR-422a或初-miR-486/初-miR-422a序列的多核苷酸可为单链的或双链的。所述多核苷酸可包含一个或多个化学修饰，如锁定(locked)的核酸、肽核酸、糖修饰如2’-O-烷基(例如，2’-O-甲基，2’-O-甲氧乙基)，2’-氟和4’-硫修饰，以及主链修饰，如一个或多个硫代磷酸酯、吗啉代或膦酰羧酸酯连接。在一个实施方案中，所述包含miR-486和/或miR-422a序列的多核苷酸与胆固醇偶联。在另一个实施方案中，所述miR-486和/或miR-422a的激动剂可为与miR-486或miR-422a不同，起增加、补充或替代miR-486和/或miR-422a功能的作用的试剂。举例而言，SRF或MRTFa，两者均上调miR-486的表达，可为miR-486的激动剂。

在一些实施方案中，miR-486和/或miR-422a的激动剂可在体内从本文所述的载体表达。在一个实施方案中，表达miR-486和/或miR-422a的表达载体包含可操作连接于编码miR-486和/或miR-422a的多核苷酸的启动子。所述编码miR-486和/或miR-422a的多核苷酸可编码初级微小RNA-miR-486和/或miR-422a序列(初-miR-miR-486/初-miR-422a)、前体-微小RNA-miR-486和/或miR-422a序列(前-miR-miR-486/前-miR-422a)或成熟miR-486和/或miR-422a序列。在另一个实施方案中，所述表达载体包含可操作连接于启动子的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO：70的序列。在另一个实施方案中，所述表达载体包含可操作连接于启动子的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO：93的序列。还在另一个实施方案中，所述表达载体包含可操作连接于启动子的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO：94的序列。

本发明亦考虑了在处理后清扫或清除(scavenge or clear)miR-143、miR-145、miR-486和/或miR-422a激动剂的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在平滑肌细胞中使用平滑肌特异性启动子过表达miR-143和/或miR-145的结合位点区。在另一个实施方案中，所述方法包括在心肌细胞中使用心脏特异性启动子过表达miR-486和/或miR-422a的结合位点区。所述结合位点区优选包含miR-143、miR-145、miR-486和/或miR-422a的种子区的序列，即横跨2-8个碱基的miRNA的5’部分。在一些实施方案中，所述结合位点可包含来自miR-143和/或miR-145一个或多个靶的3’UTR的序列，如Srgap1、Srgap2、Smad3、Sema3、Cited2，KLF5和MRTFb。在其他实施方案中，所述结合位点可包含来自miR-486的一个或多个靶3’UTR的序列，如PTEN和Foxola。在另一个实施方案中，可将miR-143、miR-145、miR-486和/或miR-422a抑制剂在miR-143、miR-145、miR-486和/或miR-422a激动剂之后施用以减弱或停止所述微小RNA的功能。在另一个实施方案中，本发明提供了在处理后清扫或清除miR-486抑制剂的方法。所述方法可包括在施用了miR-486抑制剂的平滑肌细胞或其他组织中过表达miR-486抑制剂的结合位点。

本发明亦涵盖了包含miR-143、miR-145、miR-486和/或miR-422a激动剂以及药学上可接受载体的药物组合物。在另一个实施方案中，所述药物组合物包含本文所述的miR-486抑制剂以及药学上可接受的载体。当考虑临床应用时，药物组合物会以适合于所希冀的应用的形式制备。一般而言，这会涉及制备基本上不含致热原，以及其他可对人或动物有害的杂质的组合物。

胶体分散***，如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠和基于脂质的体系包括水包油乳剂、微团、混合微团以及脂质体，可用作本文所述微小RNA功能的激动剂或抑制剂的递送运载体。适于将本发明的核酸递送到组织，如心肌组织和平滑肌组织的可市购的脂肪乳剂包括

II、

III、Nutrilipid以及其他类似的脂质乳剂。在体内用作递送运载体的优选胶体***是脂质体(亦即，人工膜囊泡(membrane vesicle))。上述***的制备和用途在本领域是公知的。示例性的配制物亦公开于US5981505；US6217900；US6383512；US5783565；US7202227；US6379965；US6127170；US5837533；US6747014和WO03/093449，将其通过提述全文包含于本文中。

使用合适的盐和缓冲剂以使递送运载体稳定，并允许由靶细胞摄入通常是期望的。当将重组细胞导入患者时，亦使用缓冲剂。本发明的水性组合物包含有效量的所述递送运载体，其溶解或分散在药学上可接受的载体或水性介质中。短语“药学上可接受”或“药理学上可接受”指当施与动物或人时不产生不良的、变应性的或其他不利反应的分子实体和组合物。如本文所使用的“药学上可接受的载体”包括对于配制药物(如适于向人施用的药物)可接受的溶剂、缓冲液、溶液、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂以及类似物。使用上述介质和作用剂用于药学上活性物质在本领域是公知的。除非任何常规的介质或作用剂与本发明的活性成分不相容，其在治疗组合物中的用途是加以考虑的。亦可将补充性的活性成分包括在所述组合物中，只要它们不使组合物中的核酸失活。

本发明的活性组合物可包括经典的药物制备物。根据本发明施用这些组合物可通过任何常用的途径，只要靶组织经由该途径是可及的。这包括经口、经鼻或含服。或者，施用可通过皮内、皮下、肌肉内、腹膜内、动脉内或静脉内注射，或者通过直接注射入心脏组织。包含miRNA抑制剂或激动剂的药物组合物亦可通过导管***或分离冠状循环以供将治疗剂递送到心脏中的***来施用。多种用于将治疗剂递送到心脏和冠状脉管***的导管***在本领域是已知的。适用于本发明的基于导管的递送方法或冠状动脉分离方法的一些非限定性的实例公开于美国专利号6416510；美国专利号6716196；美国专利号6953466、WO2005/082440、WO2006/089340、美国专利公开号2007/0203445、美国专利公开号2006/0148742以及美国专利公开号2007/0060907中，将它们全部通过提述全文包含于本文中。上述组合物可通常作为药学上可接受的组合物施用，如上文所述。在一个实施方案中，本发明的药物组合物可通过涂覆有所述药物组合物的支架施用。该实施方案对治疗或抑制再狭窄和新内膜形成特别有用。

所述活性化合物亦可通过胃肠外或者腹膜内施用。举例说明，所述活性化合物的溶液可作为游离碱或者药理学上可接受的盐在与表面活性剂，如羟丙基纤维素适当混合后的水中制备。分散体亦可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中以及在油中制备。在普通储藏和使用条件下，这些制备物通常包含防腐剂以防止微生物的生长。

适于注射使用或导管递送的药物形式包括，例如，无菌水溶液或分散体和供临场制备无菌注射溶液或分散体无菌粉末。一般而言，这些制备物是无菌的，并以存在易于注射性的程度流动。制备物应在制造和储藏条件下稳定，且应避免微生物，如细菌和真菌的污染作用来储藏。合适的溶剂或分散介质可含有，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物，以及植物油。适当的流动性可通过，例如，使用涂层，如卵磷脂，通过保持所需的颗粒大小(在分散体的情况下)，以及通过使用表面活性剂来维持。阻止微生物的作用可通过多种抗细菌和抗真菌剂，例如，尼泊金(paraben)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞(thimerosal)以及类似物来达成。在许多情况下，优选包含等渗剂，例如，糖或氯化钠。可注射的组合物的延长吸收可通过在所述组合物中使用吸收延迟剂，例如，单硬脂酸铝和明胶来达成。

无菌可注射溶液可通过将合适量的活性化合物与所期望的任何其他成分(例如，上面列举的)一同加入溶剂，然后过滤灭菌来制备。一般而言，分散体通过将不同的经灭菌的活性成分加入无菌媒介来制备，所述无菌媒介含有基本的分散介质和所期望的其他成分，例如，上面列举的。对于供制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，优选的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，其自先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何附加的期望成分的粉末。

本发明的组合物通常可以以中性或者盐形式配制。药学上可接受的盐包括，例如，酸加成盐(与所述蛋白质的游离氨基形成)，其衍生自无机酸(例如，盐酸或磷酸)，或衍生自有机酸(例如，乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)。与所述蛋白质的游离羧基形成的盐亦可衍生自无机碱(例如，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铝、氢氧化钙或氢氧化铁)或有机碱(例如，异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等)。

在配制后，溶液优选以与剂型相容的方式并以治疗上有效的量施用。所述配制物可容易的以多种剂型，如可注射溶液、药物释放胶囊等来施用。对用水溶液的胃肠外施用，例如，所述溶液通常适当缓冲，且首先使液体稀释剂等渗，例如使用足量的盐水或葡萄糖。例如，上述水溶液可用于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。优选使用无菌水性介质，如本领域技术人员已知的那样，尤其是根据本发明的公开内容。举例而言，一次剂量可溶解于1ml的等渗NaCl溶液中并或者添加至1000ml的皮下输液或在推荐的输注部位注射(参见，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第15版，1035-1038页和1570-1580页)。依照受治疗的受试者的情况，剂量必然会发生一些变化。无论如何，由负责施用的人决定对于单个受试者合适的剂量。另外，对于对人施用，制备物必需符合FDA生物制品办公室标准(FDA Office of Biologicsstandards)的无菌度、致热原性、一般安全和纯度标准。

任何本文所述的组合物可包含在试剂盒中。在一个非限定性的实例中，miR-143、miR-145、miR-486和/或miR-422a激动剂包含在一个试剂盒中。所述试剂盒可进一步包含水以及杂交缓冲液以促进所述miRNA两条链的杂交。所述试剂盒亦可包括一种或多种转染试剂以促进所述多核苷酸激动剂向细胞的递送。

所述试剂盒的组分可在水性介质中或以冻干形式包装。所述试剂盒的容器装置通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器装置，组分可置于其中，且优选是合适等分的。当所述试剂盒中存在多于一个组分(标记试剂和标记物可一同包装)，所述试剂盒亦应通常包含第二、第三或其他附加的容器，附加的组分可单独的置于其中。然而，组分的不同组合可包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒亦会通常包括容纳核酸的装置，或任何其他紧密密封的试剂容器以供商业销售。上述容器可包括注射或吹制的塑料容器，将所期望的小瓶保存其中。

当所述试剂盒的组分以一种和/或多种液体溶液的形式提供时，所述液体溶液是水溶液，特别优选无菌水溶液。然而，所述试剂盒的组分可作为干燥的粉末提供。当试剂和/或组分作为干粉提供时，所述粉末可通过添加合适溶剂来重构。考虑了所述溶剂亦可在另一个容器装置中提供。

所述容器装置通常会包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器和/或其他容器装置，所述核酸配制物置于其中，优选为适当分配的。所述试剂盒亦可包括第二容器装置以装有无菌的药学上可接受的缓冲液和/或其他稀释剂。

上述试剂盒亦可包含保存并维持miRNA/多核苷酸或防止其降解的组分。这些组分可为无RNA酶的或针对RNA酶进行保护的。这些试剂盒通常会以合适的手段为每个单独试剂或溶液包含相异的容器。

试剂盒亦会包括使用所述试剂盒组分以及使用任何未包含在试剂盒中的其他试剂的说明书。说明书可包括能执行的变化形式。试剂盒亦可包含供通过不同施用途径，如胃肠外或导管施用或涂覆的支架施用所述miRNA激动剂或抑制剂的器具或装置。

本发明进一步包含鉴定miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486的调节剂的方法。经鉴定的miR-143和/或miR-145功能的激动剂在预防或治疗再狭窄或新内膜形成或抑制平滑肌细胞增殖上是有用的。经鉴定的miR-486和/或miR-422a功能的激动剂在预防或治疗或逆转心脏肥大、心力衰竭或心肌梗死上是有用的。miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486的调节剂(例如，激动剂)可包含在根据本发明方法治疗再狭窄或心脏病症的药物组合物中。

这些分析法可包括随机筛选候选物质的大文库；或者，所述分析法可用来专注于特定类型的化合物，其着眼于被认为使其更可能促进miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486的表达和/或功能的结构特征来进行选择。

为鉴定miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486的调节剂，通常会确定miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486在候选化合物存在或不存在时的表达或活性。例如，方法通常包括：

(a)提供候选化合物；

(b)将候选化合物与表达miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486的细胞混合；

(c)测定miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486表达或活性；和

(d)将步骤(c)中的表达或活性与所述候选化合物不存在时的活性相比，其中所测得的表达或活性之间的差异表明所述候选化合物确实是miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486的调节剂。

分析法亦可在分离的组织、器官或在活生物体中进行。

评价miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486的活性或表达可包括评价miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486的表达水平。本领域技术人员会熟悉多种评价RNA表达水平的方法，包括，例如，Northern印迹或RT-PCR。评价miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486的活性或表达可包括评价miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486的活性。在一些实施方案中，评价miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486的活性包括评价由miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486调节的基因的表达或活性。由miR-143和/或miR-145调节的基因包括，例如，Slit-Robo GTP酶活化蛋白1、Slit-Robo GTP酶活化蛋白2、Smad3、Sema3、Cited2、KLF5或MRTFb。由miR-486调节的基因包括，例如，PTEN和Foxola。本领域技术人员会熟悉多种评价由miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486调节的基因的活性或表达的方法。这些方法包括，例如，Northern印迹、RT-PCR、ELISA或western印迹。

当然，应理解所有本发明的筛选方法本身是有用的，即使事实是可能未发现有效的候选物。本发明提供的是筛选这些候选物的方法，而不只是找到它们的方法。

如本文所使用的术语“候选化合物”指任何可潜在调节miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486的表达或增值调节方面的分子。通常会从不同的商业渠道获取相信为满足对有用药物的基本标准的分子文库，以致力于使对有用化合物的鉴定是“盲目(brute force)”的。对这些文库的筛选，包括重组生成的文库，是快速而有效的筛选大量相关(和不相关)化合物的活性的方法。通过以有活性但其他方面不令人满意的化合物作为模型，产生第二、第三和***化合物，组合方法亦为潜在药物的快速演化作出了贡献。可根据本发明的方法筛选的候选化合物的非限定性实例有蛋白质、肽、多肽、多核苷酸、寡核苷酸或小分子。miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486的调节剂亦可为miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486中任何一个的上游调节剂的激动剂或抑制剂。

快速、廉价而容易运行的分析法是体外分析法。这些分析法通常使用分离的分子，可迅速且以大量运行，从而增加了在短时间内可得到的信息量。多种容器可用于运行所述分析法，包括试管、平板、皿以及其他表面如浸渍杆(dipstick)或珠。

高通量筛选化合物的技术描述于WO84/03564。大量小化合物可在固体基质，如塑料钉或一些其他表面上合成。可迅速对这些分子就其诱导miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486的能力进行筛选。本发明亦考虑了就其在细胞中调节miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486活性和表达的能力筛选化合物。多种细胞系，包括那些来源于血管平滑肌细胞的，可用于这类筛选分析，包括经专为此目的特别工程改造的细胞。

体内分析法涉及使用多种再狭窄的动物模型，包括转基因动物，其经工程改造具有特定的缺陷，或携带可用于测定候选物质达到并作用于所述生物体内不同细胞的能力的标记物。由于其大小、方便操作以及关于其生理学和遗传学构成的信息，小鼠是优选的实施方案，特别对于转基因而言。然而，其他的动物亦为适合的，包括大鼠、兔、仓鼠、豚鼠、沙鼠(gerbil)、土拨鼠(woodchuck)、猫、狗、绵羊、山羊、猪、牛、马和猴(包括黑猩猩、长臂猿和狒狒)。对抑制剂的分析可使用来源于任何这些物种的动物模型。

用测试化合物治疗动物会涉及以合适的形式将所述化合物施与所述动物。施用将通过任何可用于临床目的的途径。确定化合物在体内的有效性可涉及多种不同标准，包括但不仅限于改变血管平滑肌细胞的增殖。

本发明包括调节细胞中Slit-Robo GTP酶活化蛋白1、Slit-Robo GTP酶活化蛋白2、Smad3、Sema3、Cited2、KLF5或MRTFb的表达的方法，包括将所述细胞与miR-143和/或miR-145的调节剂接触。在一个实施方案中，细胞中Slit-Robo GTP酶活化蛋白1、Slit-Robo GTP酶活化蛋白2、Smad3、Sema3、Cited2、KLF5或MRTFb的表达在施用miR-143和/或miR-145激动剂后减少。在另一实施方案中，细胞中Slit-Robo GTP酶活化蛋白2、Smad3、Sema3、Cited2、KLF5或MRTFb的表达在施用miR-143和/或miR-145抑制剂后增加。

本发明包括在受试者中调节Slit-Robo GTP酶活化蛋白1、Slit-Robo GTP酶活化蛋白2、Smad3、Sema3、Cited2、KLF5或MRTFb的表达或活性以供治疗或预防再狭窄的方法。合适的调节剂包括本文所述的miR激动剂，以及小分子、肽、蛋白质和抑制性核酸(例如，核酶、siRNA、反义寡核苷酸)。

在另一个实施方案中，本发明提供了在细胞中调节PTEN或Foxola表达的方法，包括将所述细胞与miR-486的调节剂接触。在一个实施方案中，PTEN或Foxola在所述细胞中的表达在施用miR-486激动剂后降低。在另一个实施方案中，PTEN或Foxola在所述细胞中的表达在施用miR-486抑制剂后升高。本发明亦涵盖了调节受试者中PTEN或Foxola的表达或活性的方法以供治疗或预防心脏肥大、心力衰竭或心肌梗死。

还在另一个实施方案中，本发明提供了调节细胞中Akt信号传导的方法，包括将所述细胞与miR-486的调节剂接触。在一个实施方案中，在所述细胞中Akt信号传导在施用miR-486激动剂后增强。在另一个实施方案中，在所述细胞中Akt信号传导在施用miR-486抑制剂后受阻抑。

本发明的一个特定实施方案提供了缺乏一个或全部两个功能性miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486等位基因的转基因动物。而且在诱导型、组织选择性或组成型启动子控制下表达miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486的转基因动物、来源于这些动物的重组细胞系以及转基因胚胎在决定这些miR在控制平滑肌细胞分化和增殖以及因而在再狭窄和新内膜形成中的准确作用方面是有用的。使用可诱导或可阻抑的miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486编码核酸提供了过度或欠调节表达的模型。而且，考虑“敲除”miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486的一个或全部两个等位基因的转基因动物。而且，考虑“敲除”miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486在一个或全部两个簇的一个或全部两个等位基因的转基因动物。

在一般方面，转基因动物通过将给定的转基因以容许该转基因表达的方式整合入基因组而产生。产生转基因动物的方法一般性的描述于Wagner和Hopper(美国专利4873191；通过提述将其包含于本文中)，以及Brinster等(1985；通过提述将其包含于本文中)。

通常，两边是基因组序列的基因通过微注射转移至受精卵中。将经微注射的卵植入宿主雌性中，并对其后代筛选所述转基因的表达。转基因动物可从多种动物，包括但不仅限于，爬行类、两栖类、鸟类、哺乳类和鱼类的受精卵产生。

供微注射的DNA克隆可通过任何本领域已知手段制备。举例而言，供微注射的DNA克隆可用适于去除细菌质粒序列的酶切割，并将所得DNA片段在1％琼脂糖凝胶上在TBE缓冲液中使用标准技术电泳。所得DNA条带通过用溴化乙锭染色来显现，并将含有表达序列的条带切出。然后将被切出的条带置于包含0.3M乙酸钠，pH7.0的透析袋中。将DNA电洗脱(electroelute)到所述透析袋中，用1∶1酚∶氯仿溶液抽提，并用两倍体积的乙醇沉淀。将DNA再溶解于1ml的低盐缓冲液(0.2M NaCl、20mM Tris、pH7.4和1mM EDTA)中，并在Elutip-Dr^TM柱上纯化。该柱首先用3ml的高盐缓冲液(1M NaCl、20mM Tris、pH 7.4和1mM EDTA)初始化(prime)，然后用5ml的低盐缓冲液洗涤。将DNA溶液通过该柱三次以将DNA结合到柱基质上。在用3ml低盐缓冲液洗涤一次后，用0.4ml高盐缓冲液洗脱DNA，并用两倍体积的乙醇沉淀。DNA浓度通过在UV分光光度计中在260nm处的吸光度来测定。对于微注射，DNA浓度以5mM Tris，pH 7.4和0.1mM EDTA调节为3μg/ml。其他纯化DNA以供微注射的方法描述于Palmiter等(1982)；以及Sambrook等(2001)。

在示例性的微注射方法中，用5IU怀孕母马血清***(PMSG；Sigma)注射(0.1cc，ip)，48小时后进行5IU人绒毛膜***(hCG；Sigma)注射(0.1cc，ip)，诱导六周龄的雌性小鼠超***(superovulate)。在hCG注射后立即将雌性与雄性置于一起。在hCG注射二十一小时后，用CO₂窒息或颈脱位法处死交配后的雌性，并将胚胎从切开的输卵管中回收，并置于含0.5％牛血清白蛋白(BSA；Sigma)的Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水中。周围的丘细胞用透明质酸酶(1mg/ml)去除。然后将前核胚(pronuclear embryo)洗涤并置于含0.5％BSA的Earle’s平衡盐溶液(EBSS)中，置于具有5％CO₂，95％空气的增湿大气下的37.5℃培养箱中直至注射时。胚胎可以在双细胞阶段植入。

将随机循环的成年雌性小鼠与切除了输精管的雄性配对。为此目的可使用C57BL/6或Swiss小鼠或其他相当的品系。受体雌性与供体雌性同时交配。在胚胎转移时，用腹膜内注射每克体重0.015ml的2.5％三溴乙醇(avertin)麻醉受体雌性。通过一次中线背部切开暴露输卵管。然后在输卵管正上方的体壁上切一个口。随即用制表镊子(watchmaker forceps)剥开卵巢囊。将待转移的胚胎置于DPBS(Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水)中，并置于转移移液管(transferpipet)的头中(约10到12个胚胎)。将所述移液管头***漏斗(infundibulum)中，转移所述胚胎。转移后，用两次缝合封闭切口。

包括了下列实施例用于进一步说明本发明的不同方面。本领域技术人员应理解公开于下列实施例中的技术代表本发明人发现的在在本发明的实践中运转良好的技术和/或组合物，并因而可视为构成本发明的优选实施模式。然而，本领域技术人员应理解，根据本公开内容，可以在公开的特定实施方案中作出多种变化，并仍然获得相似或类似的结果，而不背离本发明的精神和范围。

实施例

实施例1.miR-143和miR-145在平滑肌细胞中富集

为鉴定在平滑肌中富集的微小RNA，进行了微阵列分析以比较来自主动脉的平滑肌富集组织的微小RNA与心脏和骨骼肌的那些。miR-143/145微小RNA簇经鉴定为在主动脉中与在心脏和骨骼肌中相比较高度表达(图1A)。miR-143/145在平滑肌富集组织中的表达进一步通过Northern印迹确证。miR-143/145高度表达于主动脉、胃、肺和膀胱。这两种微小RNA在心脏和骨骼肌中亦在较低程度上表达(图1B)。此外，对在大鼠主动脉血管平滑肌细胞(RVSMC)中miR-143和miR-145的Northern印迹分析揭示了这两种miRNA的表达在平滑肌细胞分化期间增加(图2)，表明miR-143/145在这个过程中的潜在作用。

为更好的理解miR-143/145的转录调节，本发明人将miR-143/145的5kb上游调节区克隆入lacZ报道载体并产生了多种所述调节区的截断形式以定位启动子活性(图3)。miR-143/145的调节区包含保守的血清应答因子(SRF)结合位点(CArG)。对于七个不同物种，包含所述CArG位点的调节区的序列(标有下划线的)如下所示：

小鼠    GGCTCCTGCCCTTATATGGCAAGGCTGCTCTGA(SEQ ID NO：1)

大鼠    GGCTCCTGTCCTTATATGGCAAGGCTGCTCTGA(SEQ ID NO：2)

人      AGCTCCTTCCCTTATATGGCCAGGCTGCTCTGG(SEQ ID NO：3)

猩猩    GGCTCCTTCCCTTATATGGCCAGGCTGCTCTGG(SEQ ID NO：4)

狗      GGCTCCTTCCCTTATATGGCCAAGCCGCTCCGG(SEQ ID NO：5)

马      GGCTCCTTCCCTTATATGGCCAGGCCGCTCTGG(SEQ ID NO：6)

负鼠    TGTTCCTTCCCTTATATGGCTATGTAGGTCCAA(SEQ ID NO：7)

突变体CArG    CCTTATATTT  (SEQ ID NO：8)

携带miR-143/145位点的1.5kb上游区(图3中的构建体F)的转基因胚胎显示出在早至E7.5在心新月表达lacZ报道基因(图4A)。在E8.0和E8.5在整个心脏和发育中的背主动脉观察到了lacZ报道基因表达。到了E10.75，在整个发育中的血管***和心脏中检测到了βGal活性。在成体中，βGal表达在心脏和平滑肌中观察到(图4B)。在主动脉、膀胱以及骨骼肌和肺的血管中观察到了强表达。在所述lacZ报道构建体中保守的CArG盒(SEQ ID NO：8)的突变去除了心脏表达并减少了血管表达(图4C)。这些数据表明SRF及其辅因子包括心肌和平滑肌转录因子在调节miR-143/145在心血管***中的体内表达方面具有重要作用。

具体方法

RNA纯化、微阵列分析和实时RT-PCR总RNA从小鼠组织以及培养的心肌细胞中使用Trizol(Invitrogen)纯化。微阵列分析使用哺乳动物微小RNA探针组(LC Sciences)进行。微小RNA水平使用TagMan微小RNA实时探针(Applied Biosystems)确定。

Northern印迹将10μg的总RNA上样到20％聚丙烯酰胺变性凝胶上，并转移至Zetaprope GT膜(Bio-Rad)上，通过UV照射交联，然后在85℃烘烤。印迹在39℃用³²p-标记的针对miR-143或miR-145成熟序列的反义STARFIRE探针(Integrated DNA Technologies)杂交过夜。U6RNA水平用作上样对照。

启动子构建体和转基因小鼠miR-143/145的5’上游区的不同部分通过PCR分离并克隆到hsp68最小启动子-驱动的lacZ基因上游。携带miR-143/145调节DNA不同片段融合于hsp68-lacZ报道构建体的转基因小鼠如先前报道的(Cheng等，1992)生成。

实施例2.心肌素通过SRF激活miR-143和miR145的调节区

为检查在分子水平对miR-143/145的调节，本发明人生成了一系列由miR-143/145的5kb上游区的截断形式组成的萤光素酶构建体(参见图3)，并确定了miR-143/145调节性DNA在COS细胞中对心肌素的响应性(图5A)。心肌素对1.5kb miR-143/145萤光素酶报道基因(构建体F)的激活完全依赖于所述单一的保守CArG盒，如在经转染的COS细胞中通过突变分析所表明的。在新生心肌细胞中从构建体F的萤光素酶报道基因表达表明了在心肌素过表达时强烈的响应性和增加的活性(图5B)。在心肌细胞中miR-143/145萤光素酶报道基因对心肌素的响应性完全依赖于所述单一的保守CArG盒，如在图5B中由萤光素酶表达的消除所显示的。为确定血清应答因子(SRF)是否能够结合在miR-143/145调节区中的保守CArG序列，本发明人进行了凝胶移位分析。如图6所示，SRF结合野生型CArG序列。然而，突变体CArG探针无法结合SRF而无放射性的野生型寡聚物有效的与所述探针竞争SRF结合。这些结果提示miR-143/145表达是由SRF通过其与保守CArG序列的相互作用来调节的。

具体方法

细胞培养和萤光素酶分析使用Fugene 6.0(Roche)转染COS细胞。通过PCR分离了miR-143/145的5’上游区的不同部分，并克隆到E1b最小启动子驱动的萤光素酶基因的上游。对于miR-143/145启动子分析，将不同的miR-143/145-萤光素酶报道构建体用50ng、100ng或200ng的心肌素转染。使用空pcDNA3.1保持总DNA恒定。

凝胶移位分析EMSA主要如之前所描述(McFadden等，2000)进行。每个结合反应由3μl来自过表达以表位标记的蛋白质的COS细胞的细胞提取物组成，如所指明的。抽提物体积用经空pcDNA3.1转染的裂解液保持恒定。使用对应于保守CArG的退火的寡聚物：

上面的链：5′ggGCCTTGCCATATAAGGGCAGGA 3′(SEQ ID NO：9)

下面的链：5′ggTCCTGCCCTTATATGGCAAGGC 3′(SEQ ID NO：10)

(CArG盒序列用下划线表示)。寡核苷酸如之前描述的退火并用Klenow标记，且DNA-蛋白质复合物在6％非变性聚丙烯酰胺凝胶上在0.5x TBE中分辨。寡聚物是供非放射性竞争用而设计的，且突变的核苷酸用小写字母标记。

实施例3.在平滑肌损伤后miR-143和miR145下调

为了鉴定在平滑肌损伤后改变了表达的微小RNA，在通过颈动脉结扎诱导平滑肌损伤后对动脉组织进行了微小RNA微阵列分析。miR-143、miR-145和miR-486在受损的颈动脉中与未结扎的对照动脉相比均显著下调(图7A)。微阵列结果由实时RT-PCR分析证实。miR-143和miR-145的表达水平在受损的颈动脉中分别减少～85和92％(图7B)。miR-486的表达水平减少～75％(图7B)。将miR-21和miR-126的表达用作对照。

为了检查miR-143和miR-145在血管损伤中的潜在作用，连续两日通过尾静脉向小鼠注射125mg/kg的miR-143模拟物、miR-145模拟物或盐水。指定miRNA的模拟物为偶联于胆固醇的包括成熟miR-143或miR-145序列的双链RNA分子。每只小鼠的左颈动脉在第二次注射后翌日结扎(图8A)。在结扎28日后从每只动物收集心脏、颈动脉、肺、肝和肾的组织样品。在第二次注射后两日收集的组织的Northern印迹分析显示施用miR-143或miR-145的模拟物导致了这两种miR在心脏、肾、肝和肺中的过表达，表明了向这些组织的有效递送(图8B)。如图8C所示，在结扎28日后对颈动脉的组织学检查显示了注射盐水的对照小鼠在所有检查的水平产生了显著的新内膜形成(代表性的切片取于结扎线下的水平I(1.5mm)和水平II(1.9mm))。用miR-143模拟物注射的小鼠在结扎线下的相应水平处显示了新内膜形成的显著减少。这些发现说明通过施用所述两种miR的模拟物上调miR-143和miR-145可在血管损伤后减少新内膜形成。

实施例4.miR-145靶向Slit-Robo GTP酶活化蛋白1和2、Smad3、Sema3和Cited2

miR-143和miR-145的预期靶在TargetScan 5.0上鉴定。将潜在靶的3’UTR克隆入CMV驱动的萤光素酶报道基因并与miR-143或miR-145共转染到COS细胞中。miR-145阻抑了Slit-Robo GTP酶活化蛋白1(Srgap1；图9A)、Srgap2(图9B)、Smad3(图9C)、Sema3(图9D)和Cited2(图9E)的3’UTR。miR-143的表达对萤光素酶从含有这些靶的3’UTR的构建体的表达无显著作用。miR-145亦预期靶向KLF53’UTR(图9F)，且miR-143(图9G)和miR-145(图9H)预期靶向MRTFb 3’UTR。

实施例5.MRTFa诱导miR-486在心肌细胞中的表达

为了鉴定其他可能在心血管发育或疾病中起作用的微小RNA，本发明人进行了设计用来选择由平滑肌和心富集转录因子，即心肌素和MRTFa诱导的miRNA的微小RNA微阵列分析。用引导βgal(对照)、MRTFa或心肌素表达的腺病毒感染心肌细胞。与之前的结果一致，miR-143/145簇在过表达MRTFa的心肌细胞中上调。此外，miR-486通过miRNA微阵列鉴定为在MRTFa过表达时显著富集(图10A)。MRTFa对miR-486的诱导独立的通过Northern印迹证实(图10B)。miR-486位于Ank1基因的最后一个内含子中，其含有替代的启动子来引导肌肉特异性表达。茎环结构和成熟微小RNA示于图10C。定量实时PCR分析显示了在新生心肌细胞中表达由腺病毒介导的MRTFa一日后对miR-486(图10D)和Ank1(图10E)的显著诱导。这些数据表明miR-486与Ank1基因一同转录并作为内含子miRNA进行加工。

为了确定miR-486在成体中的组织分布，对多个组织进行了Northern印迹分析(图11A)。miR-486的表达在含心肌、骨骼肌和平滑肌的组织中富集。检查miR-486宿主基因，sAnk1，在胚胎发生期间的表达显示了在E11.5在体节中的表达，以及在发育中的骨骼肌祖细胞、舌、隔膜中的表达，以及在心房和肝中的弱表达(图11B)。在E17.5，特别是在心房中表达强烈，并在P1时在心房中增加。亦在传导***的His束支(bundle branch)中观察到了受限的表达。在P5时，可在心室中观察到Ank1表达，且Ank1在成体期在心房和心室中均强烈表达。原位杂交的数据通过在不同胚胎阶段期间对心脏的半定量RT-PCR分析得到验证(图11C)。此外，miR-486表达与骨骼肌分化相关，如miR-486在分化的C2C12细胞中增加的表达所示(图11D)。

为了进一步探索对miR-486表达的调节，用增加浓度的表达MRTFa或心肌素的构建体转染心肌细胞。miR-486和Ank1表达由MRTFa特异性诱导(图12A)。然而，心肌素不足以诱导miR-486或Ank1。sAnk1基因的调节区包含数个推定的转录因子结合位点，包括CarG位点、Nkx位点，GATA位点以及Ebox(图12B)。为了更好的理解miR-486的转录调节，本发明人将miR-486的1080bp上游调节区克隆入lacZ报道载体。携带所述miR-486位点上游的1080bp区的转基因胚胎(1080bpAnk1-hsp68lacZ)显示了骨骼肌特异性βgal活性(图12C)。在E9.5观察到了体节染色，并在E11.5和E13.5观察到了体节和发育中的骨骼肌染色。

为了在分子水平检查对miR-486的调节，本发明人生成了由所述miR-486的1080bp上游区或内含子1的650bp区组成的萤光素酶构建体(参见图12B)，并在COS细胞中确定了miR-486调节性DNA对MyoD、Nkx2-5、GATA-4、心肌素或MRTFa的响应性(图12D-E)。将50ng、100ng和200ng的表达质粒与所述萤光素酶报道构建体共转染。在COS细胞中sAnk1序列上游的1080bp调节区由MyoD、Nkx2-5和GATA-4激活，而非由心肌素或MRTFa(图12D)。在瞬时转染的COS细胞中sAnk1的650bp内含子1区由MRTFa特异性激活，而非由心肌素或MRTFb(图12E)。类似的结果在用转导了10MOI的βgal、心肌素、MRTFa或Nkx2-5腺病毒的不同萤光素酶报道基因转染的心肌细胞中观察到(图12F)。在心肌细胞中sAnk1内含子-luc对MRTFa有反应。为了进一步说明对miR-486表达的调节，进行了对sAnk1内含子-萤光素酶报道构建体的突变分析，并在COS细胞中测定了萤光素酶响应于增加浓度的MRTFa的表达(图12G)。对远端CarG2位点的3’截断或突变导致了萤光素酶表达的丧失。

具体方法

RNA纯化、微阵列分析和实时RT-PCR总RNA从小鼠组织以及培养的心肌细胞中使用Trizol(Invitrogen)纯化。微阵列分析使用哺乳动物微小RNA探针组(LC Sciences)进行。微小RNA水平使用TagMan微小RNA实时探针(Applied Biosystems)确定。

Northern印迹将10μg的总RNA上样到20％聚丙烯酰胺变性凝胶上，并转移至Zetaprope GT膜(Bio-Rad)上，通过UV照射交联，然后在85℃烘烤。印迹在39℃用³²p-标记的针对miR-486成熟序列的反义STARFIRE探针(Integrated DNA Technologies)杂交过夜。将U6RNA水平用作上样对照。

转基因小鼠 携带包含sAnk1基因的1080bp上游调节区或650bp sAnk1内含子1区的hsp68-lacZ报道构建体的转基因小鼠如先前报道(Cheng等，1992)的生成。

实施例6.PTEN和FoxolA是miR-486的靶

在鉴定可在平滑肌细胞表型调节中起作用的miR-486的潜在靶的尝试中，本发明人基于TargetScan 3.0检查了预期的靶。PTEN(磷酸酶和张力蛋白(tensin)同源物，位于染色体10)是miR-486的高质量靶，其包含两个在物种间保守的八聚体种子区(图13A)。PTEN是Akt信号传导的非冗余抑制剂，其通过将PI3激酶脱磷酸化发挥作用。用TargetScan 3.0进一步检查miR-486的预期靶揭示了Foxola，其活性由Akt信号传导所抑制。Foxola亦包含保守的miR-486结合位点(图13A)。

为了证实miR-486靶向PTEN和Foxola，将连接于PTEN和Foxola基因3’UTR和人工miR-486结合位点(海绵)的萤光素酶构建体与miR-486在COS细胞中共转染。所有三个报道构建体均显示了萤光素酶表达随miR-486表达的剂量依赖性减少，表明miR-486靶向这些3’UTR序列(图13B)。

接着，本发明人检查了PTEN和磷酸Akt在过表达MRTFa、心肌素或β-Gal的心肌细胞中的内源蛋白质水平。在MRTFa-诱导miR-486过表达时，内源PTEN蛋白质水平在心肌细胞中减少(图13C)。此外，观察到相应的磷酸化Akt的减少，其由PTEN抑制。STARS(横纹肌rho信号传导激活剂，其激活血清应答因子)以及MRTFa共表达导致在心肌细胞中比单独的MRTFa更加强烈的对PTEN的阻抑。在STARS和MRTFa共表达时，协同诱导了下游Akt信号传导读数、磷酸-Akt和磷酸-GSK3β(图13D)。

为了进一步检查miR-486在MRTFa诱导的PTEN下调中的作用，采用了siRNA方法来敲低miR-486。图13E显示在心肌细胞中siRNA介导的miR-486敲低完全去除了响应于MRTFa的miR-486水平的增加。将miR-486siRNA递送到心肌细胞中去除了对PTEN和Foxola的阻抑以及对Akt信号传导的激活，表明miR-486介导MRTFa对PTEN和Akt信号传导的作用(图13F)。腺病毒引导的miR-486在心肌细胞中的表达导致了PTEN蛋白质水平的降低(图13G)。这一系列实验的结果表明MRTFa通过借由miR-486诱导抑制PTEN来激活Akt存活信号传导。

因为miR-486在成体心脏中高表达，且在心肌梗死(MI)后在心脏中发生可观的血管重塑(remodeling)，本发明人检查了在MI后miR-486的表达。miR-486在缘带中的表达在心肌梗塞(MI)3日后显著降低，而在远端组织中的表达未变化(图14A)。在MI后14天，miR-486在缘带中的水平正常，而在远端组织中增加。为了进一步探索miR-486在心脏中的作用，生成了在心脏特异性αMHC启动子下过表达miR-486的转基因小鼠。对来自这些动物的心脏组织的Northern印迹分析显示了与非转基因的同窝动物相比升高的miR-486表达(图14B)。miR-486转基因动物显示了与非转基因同窝动物相比心脏中PTEN水平的降低和磷酸-Akt水平的升高(图14C)。这些结果表明miR-486在心脏损伤后受到调节，并通过下调PTEN调节Akt信号传导。

具体方法

心肌梗死12周龄雄性小鼠的心肌梗死通过左冠状动脉的结扎进行。从左心室的远端区域和梗死的缘带在3日和2周后使用Trizol分离RNA。

细胞培养和萤光素酶分析使用Fugene 6.0(Roche)转染了COS细胞。对于3’UTR靶分析，将40ng的pMIR-Report萤光素酶载体用增加量的CMV-miR-486表达载体转染。空CMV表达载体用作对照，并维持总质粒DNA量恒定。

心肌细胞培养和腺病毒感染原代大鼠心肌细胞如别处所述(Molkentin等，1998)制备。铺板四十八小时后，将细胞用腺病毒在含10％FBS的培养基中以10MOI MRTFa、50MOI STARS或两者一起感染3小时。βgal腺病毒用作对照。表达βgal、STARS和Flag-MRTFa的腺病毒之前已经描述(Kuwahara等，2005)。

质粒构建将小鼠PTEN和Foxola的3’UTR使用序列特异性引物扩增并克隆入pMIR-Report萤光素酶载体的SacI/HindIII位点。PTEN：For5′-GGCAATAGGACATTGTGTCAG-3′(SEQ ID NO：87)，Rev5′-TGACAAGAATGAGACTTTAAT-3′(SEQ ID NO：88)；Foxola：For 5′-GTTAGTGAGCAGGCTACATTT-3′(SEQ ID NO：89)，Rev5′-AAGACTTGGTGCTATGCGCTG-3′(SEQ ID NO：90)。

Western印迹用针对PTEN、Akt、Akt-磷酸Ser473和磷酸-GSK3β的抗体(Cell Signaling Technologies)来通过western印迹确定蛋白质水平。

将本文讨论和引用的所有出版物、专利和专利申请通过提述全文包含于本文中。本文公开和要求保护的所有组合物和方法可根据本公开内容而无需不必要的实验即可制备和实施。当本发明组合物和方法以优选实施方案的方式描述时，对于本领域技术人员显然可对所述组合物和方法，以及本文所述方法中的步骤和步骤的顺序加以变化，而不背离本发明的概念、精神和范围。更具体而言，显然化学和生理学相关的某些试剂可用来替代本发明所描述的试剂而得到相同或相似的结果。对本领域技术人员明显的是所有这类相似的替代和修饰都视为包含于如所附权利要求所限定的本发明的精神、范围和概念中。

当与术语“包含”一同使用时，在权利要求和/或说明书中词“一个(a)”或“一种(an)”的使用可意指“一个/一种(one)”，但亦并不与“一个或多个/一种或多种”、“至少一个/至少一种”以及“一个或多于一个/一种或多于一种”的含意矛盾。考虑到任何本文所讨论的实施方案可考虑本发明的任何方法或组合物而加以实施，反之亦然。此外，本发明的组合物和试剂盒可用于实现本发明的方法。

在本申请全文中，术语“约”用于表明一个值包括用来确定该值的装置或方法的误差的标准偏差。

在权利要求书中使用术语“或”是用来表示“和/或”，除非明确的指明仅用于指两者择一的或替代物为彼此排斥的，即使公开文本支持仅用于指代替代物和“和/或”的定义。

如用于本说明书和权利要求书中，词“包含(comprising)”(及其任何形式，如“comprise”和“comprises”)，“具有(having)”(及其任何形式，如“have”和“has”)，“包括(including)”(及其任何形式，如“includes”和“include”)，为包含性或开放式的，并不排除其他的、未提及的要素或方法步骤。

参考文献：

通过提述将下述参考文献明确包含于本文中，其程度为它们提供例示性的规程或其它详情来补充本文所列的那些。

美国专利6147109

美国专利4873191

美国专利5844107

美国专利5877302

美国专利5972900

美国专利5972901

美国专利5985833

美国专利6008336

美国专利6060451

美国专利6077835

美国专利6100237

美国专利6174855

美国专利6200801

美国专利6201006

美国专利6232315

美国专利6326386

美国专利6589286

美国专利6682728

美国专利6716242

美国专利7041127

美国专利7048939

美国专利7055237

美国专利7083642

美国专利7087263

美国专利7105018

美国专利7156869

美国专利7232573

美国专利7236821

美国专利7247313

美国专利7273493

美国专利7294329

美国专利公开20020150626

美国专利公开20030032615

美国专利公开20030203865

美国专利公开20040048787

Abraham等，Mol.Med.，8：750-760，2002.

Ambros，Cell，113(6)：673-676，2003.

Angel等，Cell，49：729，1987b.

Angel等，Mol.Cell.Biol.，7：2256，1987a.

Atchison和Perry，Cell，46：253，1986.

Atchison和Perry，Cell，48：121，1987.

Babak等，RNA 10：1813-1819，2004.

Baichwal和Sugden，In：Gene Transfer，Kucherlapati(Ed.)，Plenum Press，NY，117-148，1986.

Baldwin和Haddad，J.Appl.Physiol.，90：345-357，2001.

Banerji等，Cell，27(2 Pt 1)：299-308，1981.

Banerji等，Cell，33(3)：729-740，1983.

Barad等，Genome Res.14：2486-2494，1997.

Barnes等，J Biol.Chem.，272(17)：11510-11517，1997.

Bartel，Cell，116：281-297，2004.

Benvenisty和Neshif，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83(24)：9551-9555，1986.

Berk等，J Clin.Invest.117：568-575，2007.

Berkhout等，Cell，59：273-282，1989.

Bhavsar等，Genomics，35(1)：11-23，1996.

Blanar等，EMBO J，8：1139，1989.

Bock等，Nucleic Acids Res.，10(24)：8113-8125，1982.

Bodine和Ley，EMBO J，6：2997，1987.

Boshart等，Cell，41：521，1985.

Bosze等，EMBO J，5(7)：1615-1623，1986.

Braddock等，Cell，58：269，1989.

Brennecke等，Cell，113：25-36，2003.

Brinster等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82(13)：4438-4442，1985.

Bristow，Cardiology，92：3-6，1999.

Bulla和Siddiqui，J Virol.，62：1437，1986.

Calin等，Proc.Natl.Acd.Sci.USA，99：15524-15529，2002.

Campbell和Villarreal，Mol.Cell.Biol.，8：1993，1988.

Campere和Tilghman，Genes and Dev，3：537，1989.

Campo等，Nature，303：77，1983.

Care等，Nat.Med.13：613-618，2007.

Carrington等Science，301(5631)：336-338，2003.

Celander和Haseltine，J Virology，61：269，1987.

Celander等，J Virology，62：1314，1988.

Chandler等，Cell，33：489，1983.

Chang和Karin，Nature，410(6824)：37-40，2001.

Chang等，Biochim.Biophys.Acta，1092(2)：153-160，1991.

Chang等，Mol.Cell.Biol.，9：2153，1989.

Chang等，Nature，430(7001)：785-789，2004.

Chatterjee等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：9114，1989.

Chen和okayama，Mol.Cell Biol.，7(8)：2745-2752，1987.

Chen等，Mol.Cell Endocrinol.，162：45-55，2000.

Chen等，Science，303(5654)：83-86，2004.

Choi等，Cell，53：519，1988.

Coffin，In：Virology，Fields等(Eds.)，Raven Press，NY，1437-1500，1990.

Cohen等，J Cell.Physiol.，5：75，1987.

Costa等，Mol.Cell.Biol，8：81，1988.

Couch等，Am.Rev.Resp.Dis.，88：394-403，1963.

Coupar等，Gene，68：1-10，1988.

Cripe等，EMBO J，6：3745，1987.

Culotta和Harner，Mol.Cell.Biol.，9：1376，1989.

Dandolo等，J Virology，47：55-64，1983.

De Villiers等，Nature，312(5991)：242-246，1984.

Deschamps等，Science，230：1174-1177，1985.

Dubensky等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：7529-7533，1984.

Durand等，Ann.Med.，27：311-317，1995.

Ebner等，Science，260：1344-1348，1993.

Edbrooke等，Mol.Cell.Biol.，9：1908，1989.

Edgerton和Roy，J Appl.Physiol.，89：1224-1231，2000.

Edlund等，Science，230：912-916，1985.

Eichhorn和Bristow，Circulation，94：2285-2296，1996.

EPO 0273085

Fatkin等，J Clin.Invest.，106(11)：1351-1359，2000.

Fechheimer，等，Proc Natl.Acad.Sci.USA，84：8463-8467，1987.

Feng和Holland，Nature，334：6178，1988.

Ferkol等，FASEB J，7：1081-1091，1993.

Firak和Subramanian，Mol.Cell.Biol.，6：3667，1986.

Fitts等，J Appl.Physiol.，89：823-839，2000.

Foecking和Hofstetter，Gene，45(1)：101-105，1986.

Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76：3348-3352，1979.

Franz等，Cardioscience，5(4)：235-43，1994.

Franzen等，Cellm 75：681-692，1993.

Frey等，Circulation109：1580-1589，2004.

Friedman等，Genes Devel.，3：1314，1989.

Fujita等，Cell，49：357，1987.

Ghosh和Bachhawat，In：Liver Diseases，Targeted Diagnosis and TherapyUsing Specific Receptors and Ligands，Wu等(Eds.)，Marcel Dekker，NY，87-104，1991.

Ghosh-Choudhury等，EMBO J，6：1733-1739，1987.

Gilles等，Cell，33：717，1983.

Gloss等，EMBO J.，6：3735，1987.

Godbout等Mol.Cell.Biol.，8：1169，1988.

Gomez-Foix等，J Biol.Chem.，267：25129-25134，1992.

Goodbourn和Maniatis，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：1447，1988.

Goodbourn等，Cell，45：601，1986.

Gopal，Mol.Cell Biol.，5：1188-1190，1985.

Gopal-Srivastava等，J Mol.Cell.Biol.15(12)：7081-7090，1995.

Graham和Prevec，In：Methods in Molecular Biology：Gene Transfer andExpression Protocol，Murray(Ed.)，Humana Press，Clifton，NJ，7：109-128，1991.

Graham和Van Der Eb，Virology，52：456-467，1973.

Graham等，J Gen.Virl.，36(1)：59-74，1977.

Greene等，Immunology Today，10：272，1989

Grishok等，Cell，106：23-34，2001.

Grosschedl和Baltimore，Cell，41：885，1985.

Grunhaus和Horwitz，Seminar in Virology，3：237-252，1992.

Harland和Weintraub，J Cell Biol.，101(3)：1094-1099，1985.

Haslinger和Karin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：8572，1985.

Hauber和Cullen，J Virology，62：673，1988.

Huang，J Am.Soc.Nephrol.，15：1690，2004.

Huang等，Nature，384：372-375，1996.

Hen等，Nature，321：249，1986.

Heineke和Molkentin，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.7：589-600，2006.

Hensel等，Lymphokine Res，8：347，1989.

Hermonat和Muzycska，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6466-6470，1984.

Herr和Clarke，Cell，45：461，1986.

Hersdorffer等，DNA Cell Biol.，9：713-723，1990.

Herz和Gerard，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2812-2816，1993.

Hill等，Circulation，101：2863-2869，2000.

Hirochika等，J Virol.，61：2599，1987.

Hirsch等，Mol.Cell.Biol.，10：1959，1990.

Holbrook等，Virology，157：211，1987.

Horlick和Benfield，Mol.Cell.Biol.，9：2396，1989.

Horwich等J.Virol.，64：642-650，1990.

Huang等，Cell，27：245，1981.

Huang等，Nature，384：372-375，1996.

Hug等，Mol.Cell.Biol.，8：3065，1988.

Hutvagner等，PLoS Biol.，2(4)：E98，2004.

Hwang等，Mol.Cell.Biol.，10：585，1990.

Imagawa等，Cell，51：251，1987.

Imbra和Karin，Nature，323：555，1986.

Imler等，Mol.Cell.Biol.，7：2558，1987.

Imperiale和Nevins，Mol.Cell.Biol.，4：875，1984.

Ito和Roeder，Trends Endocrinol.Metab.，12：127-134，2001.

Jakobovits等，Mol.Cell.Biol.，8：2555，1988.

Jameel和Siddiqui，Mol.Cell.Biol.，6：710，1986.

Jaynes等，Mol.Cell.Biol.，8：62，1988.

Johnson等，Mol.Cell.Biol.，9：3393，1989.

Jones和Shenk，Cell，13：181-188，1978.

Kadesch和Berg，Mol.Cell.Biol.，6：2593，1986.

Kaneda等，Science，243：375-378，1989.

Karin等，Mol.Cell.Biol.，7：606，1987.

Karin等，Mol.Cell.Biol.，7：606，1987.

Karlsson等，EMBO J.，5：2377-2385，1986.

Katinka等，Cell，20：393，1980.

Katinka等，Nature，290：720，1981.

Kato等，J.Biol.Chem.，266：3361-3364，1991.

Kawamoto et aI.，Mol.Cell.BioI.，8：267，1988.

Kelly等，J.Cell Biol.，129(2)：383-396，1995.

Kiledjian等，Mol.Cell.Biol.，8：145，1988.

Kimura等，Dev.Growth Differ.39(3)：257-265，1997.

Kinugawa等，Circ.Res.，89：591-598，2001.

Kinugawa等，J.Clin.Endocrinol.Metab.，86：5089-5090，2001.

Kiriazis和Kranias，Annu.Rev.Physiol.，62：321-351，2000.

Klamut等，Mol.Cell.Biol.，10：193，1990.

Klein等，Nature，327：70-73，1987.

Koch等，Mol.Cell.Biol.，9：303，1989.

Krek等，Nat.Genet.，37：495-500，2005.

Krek等，Nature Genetics，37：495-500，2005.

Krenz和Robbins，J Am.Coll.Cardiol.，44：2390-2397，2004.

Kriegler和Botchan，In：Eukaryotic Viral Vectors，Gluzman(Ed.)，ColdSpring Harbor：Cold Spring Harbor Laboratory，NY，1982.

Kriegler和Botchan，Mol.Cell.Biol.，3：325，1983a.

Kriegler等，Cell，38：483，1984.

Kriegler等，Cell，53：45，1988.

Kriegler等，In.：Gene Expression，Alan Liss(Ed.)，Hamer and Rosenberg，New York，1983b.

Kriitzfeldt等，Nature，438：685-689，2005.

Kuhl等，Cell，50：1057，1987.

Kunz等，Nucl.Acids Res.，17：1121，1989.

Kuwahara等，J Pharmacal.Sci.，99(3)：211-213，2005.

Kuwahara等，J Clin.Invest.，117(5)：1324-1334，2007.

Lagos-Quintana等，Science，294(5543)：853-858，2001.

LaPointe等，Hypertension 27(3 Pt 2)：715-22，1996.

LaPointe等，J Biol.Chem.，263(19)：9075-8，1988.

Larsen等.，Proc Natl.Acad.Sci.USA.，83：8283，1986.

Laspia等，Cell，59：283，1989.

Latimer等，Mol.Cell.Biol.，10：760，1990.

Lau等，Science，294(5543)：858-862，2001.

Le Gal La Salle等，Science，259：988-990，1993.

Lee和Ambros，Science，294(5543)：862-864，2001.

Lee等，Nature，294：228，1981.

Lee等，Nucleic Acids Res.，12：4191-206，1984.

Leung等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，48：18125-18130，2006.

Levinson等，Nature，295：79，1982.

Levrero等，Gene，101：195-202，1991.

Lin等，Mol.Cell.Biol.，10：850，1990.

Liu等，Proc Natl Acad Sci USA 101：9740-9744，2004.

Lowes等，J Clin.Invest.，100(9)：2315-2324，1997.

Luria等，EMBO J.，6：3307，1987.

Lusky和Botchan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：3609，1986.

Luskv等，Mol.Cell.Biol.，3：1108，1983.

Macejak和Samow，Nature，353：90-94，1991.

Majors和Varmus，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：5866，1983.

Mann等，Cell，33：153-159，1983.

Mansen等，Mol.Endocrinol.，15：2106-2114，2001.

Markowitz等，J Virol.，62：1120-1124，1988.

McFadden等，Development，127(24)：5331-5341，2000.

McNeall等，Gene，76：81，1989.

Meister和Tuschl，Nature，431：343-9，2004.

Miksicek等，Cell，46：203，1986.

Molkentin等，Cell 93：215-228，1998.

Mordacq和Linzer，Genes and Dev.，3：760，1989.

Moreau等，Nucl.Acids Res，9：6047，1981.

Morkin，Microsc.Res.Tech.，50：522-531，2000.

Moss等，Biol.Chem.，27l(49)：31688-31694，1996.

Muesing等，Cell，48：691，1987.

Naya等，J Biol Chem.，275(7)：4545-4548，2000.

Ng等，Nuc.Acids Res，17：601，1989.

Nicolas和Rubinstein，In：Vectors：A survey of molecular cloning vectorsand their uses，Rodriguez and Denhardt(Eds)，Stoneham：Butterworth，494-513，1988.

Nicolau和Sene，Biochim.Biophys.Acta，721：185-190，1982.

Nicolau等，Methods Enzymol.，149：157-176，1987.

O′Reilly等，Cell，79：315-328，1994.

O’Reilly等，Cell，88：277-285，1997.

Ojamaa等，Endocrinology，141：2139-2144，2000.

Ondek等，EMBOJ.，6：1017，1987.

Omitz等，Mol.Cell.Biol.，7：3466，1987.

Palmiter等，Nature，300：611，1982.

Pantos等，Horm.Metab.Res.，38：308-313，2006.

Park等，Mol.Cell.，19：643-653，2005.

Paskind等，Virology，67：242-248，1975.

Pasquinelli和Ruvkun，Ann.Rev.Cell Dev.Biol.，18：495-513，2002.

Pavri等，Mol.Cell.，18：83-96，2005.

PCT Appln.WO 0071096

PCT Appln.WO 84/03564

PCT Appln.WO 98/33791

Pech等，Mol.Cell.Biol.，9：396，1989.

Pelletier和Sonenberg，Nature，334(6180)：320-325，1988.

Perales等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：4086-4090，1994.

Perez-Stable和Constantini，Mol.Cell.Biol.，10：1116，1990.

Physicians Desk Reference

Picard和Schaffner，Nature，307：83，1984.

Pinkert等，Genes and Dev.，1：268，1987.

Ponta等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：1020，1985.

Porton等，Mol.Cell.Biol.，10：1076，1990.

Potter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：7161-7165，1984.

Queen和Baltimore，Cell，35：741，1983.

Quinn等，Mol.Cell.Biol.，9：4713，1989.

Racher等，Biotechnology Techniques，9：169-174，1995.

Ragot等，Nature，361：647-650，1993.

Redondo等，Science，247：1225，1990.

Reisman和Rotter，Mol.Cell.Biol.，9：3571，1989.

Remington′s Pharmaceutical Sciences，15th ed.，pages 1035-1038 and1570-1580，Mack Publishing Company，Easton，PA，1980.

Renan，Radiother.Oncol.，19：197-218，1990.

Resendez Jr.等，Mol.Cell.Biol.，8：4579，1988.

Rich等，Hum.Gene Ther.，4：461-476，1993.

Ridgeway，In：Vectors：A Survey of Molecular Cloning Vectors and TheirUses，Rodriguez等(Eds.)，Stoneham：Butterworth，467-492，1988.

Ripe等，Mol.Cell.Biol.，9：2224，1989.

Rippe，等，Mol.Cell Biol.，10：689-695，1990.

Rittling等，Nuc.Acids Res.，17：1619，1989.

Rosen等，Cell，41：813，1988.

Rosenfeld等，Science，252：431-434，1991.

Rosenfeld，等，Cell，68：143-155，1992.

Roux等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：9079-9083，1989.

Sakai等，Genes and Dev.，2：1144，1988.

Sambrook和Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual 3rd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001.

Satake等，J Virology，62：970，1988.

Schaffner等，J Mol.Biol.，201：81，1988.

Schuyler和Yarbrough，Basic Res.Cardiol.，85：481-494，1990.

Searle等，Mol.Cell.Biol.，5：1480，1985.

Sempere等，Genome Biol.，5：R13，2004.

Sharp和Marciniak，Cell，59：229，1989.

Shaul和Ben-Levy，EMBO J，6：1913，1987.

Sherman等，Mol.Cell.Biol.，9：50，1989.

Shingara等，RNA 11：1461-1470，2005.

Sleigh和Lockett，J EMBO，4：3831，1985.

Spalholz等，Cell，42：183，1985.

Spandau和Lee，J Virology，62：427，1988.

Spandidos和Wilkie，EMBO J，2：1193，1983.

Stephens和Hentschel，Biochem.J，248：1，1987.

Stratford-Perricaudet和Perricaudet，In：Human Gene Transfer，Eds，Cohen-Haguenauer and Boiron，John Libbey Eurotext，France，51-61，1991.

Stratford-Perricaudet等，Hum.Gene.Ther.，1：241-256，1990.

Stuart等，Nature，317：828，1985.

Sullivan和Peterlin，Mol.Cell.Biol.，7：3315，1987.

Swartzendruber和Lehman，J Cell.Physiology，85：179，1975.

Takebe等，Mol.Cell.Biol.，8：466，1988.

Tavernier等，Nature，301：634，1983.

Taylor和Kingston，Mol.Cell.Biol.，10：165，1990a.

Taylor和Kingston，Mol.Cell.Biol.，10：176，1990b.

Taylor等，J Biol.Chem.，264：15160，1989.

Temin，In：Gene Transfer，Kucherlapati(Ed.)，NY，Plenum Press，149-188，1986.The Merck Index，Eleventh Edition

Thiesen等，J Virology，62：614，1988.

Top等，J Infect.Dis.，124：155-160，1971.

Treisman，Cell，46(4)：567-174，1986

Tranche等，Mol.Biol.Med.，7：173，1990.

Tronche等，Mol.Cell Biol.，9(11)：4759-4766，1989.

Trudel和Constantini，Genes and Dev.，6：954，1987.

Tsika等，Am.J Physiol.Cell Physiol.，283：CI761-CI775，2002.

Tur-Kaspa等，Mol.Cell Biol.，6：716-718，1986.

Tyndell等，Nuc.Acids.Res.，9：6231，1981.

Vadaszova等，Physiol.Res.53(1)：S57-61，2004.

van Rooij等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103(48)：18255-18260，2006.

Vannice和Levinson，J Virology，62：1305，1988.

Varmus等，Cell，25：23-36，1981.

Vasseur等，Proc Natl.Acad.Sci.USA，77：1068，1980.

Wagner等，Proc.Nat！.Acad.Sci.USA 87(9)：3410-3414，1990.

Wang和Calame，Cell，47：241，1986.

Weber等，Cell，36：983，1984.

Wei等，J Endocrinol.Invest.，28：8-11，2005.

Weinberger等Mol.Cell.Biol.，8：988，1984.

Winoto和Baltimore，Cell，59：649，1989.

Wong等，Gene，10：87-94，1980.

Wu和Wu，Adv.Drug Delivery Rev.，12：159-167，1993.

Wu和Wu，Biochemistry，27：887-892，1988.

Wu和Wu，J Biol.Chem.，262：4429-4432，1987.

Xu等，Curr.Biol.，13：790-795，2003.

Yamauchi-Takihara等，Proc.Natl.Acad Sci.USA，86(10)：3504-3508，1989.

Yang和Russell，Proc.Natl.Acad Sci.USA，87：4144-4148，1990.

Yang等，Nat.Med 13：486-491，2007.

Yao和Eghbali，Circ.Res.71：831-839，1992.

Young等，In：Handbook of Applied Therapeutics，7.1-7.12 and 9.1-9.10，1989.

Yu等，Biochem.Biophys.Res.Cornmun.349(1)：59-68.Epub Aug 11，2006.

Yutzey等Mol.Cell.Biol.，9：1397，1989.

Zelenin等，FEBS Lett.，287(1-2)：118-120，1991.

Zeng等，Cancer Res，62(13)：3630-3635，2002.

Ziober和Kramer，J Biol.Chem.，271(37)：22915-22，1996.

Claims (50)

1.一种抑制平滑肌细胞增殖的方法，包括将平滑肌细胞与miR-486的抑制剂和/或miR-143和/或miR-145的激动剂接触。

2.权利要求1的方法，其中所述激动剂是包含miR-143和/或miR-145的成熟序列的多核苷酸。

3.权利要求2的方法，其中所述激动剂是包含SEQ ID NO：38和/或SEQID NO：51序列的多核苷酸。

4.权利要求2的方法，其中所述激动剂配制在脂质递送运载体中。

5.权利要求2的方法，其中所述激动剂由表达载体编码。

6.权利要求1的方法，其中所述miR-486抑制剂是微小RNA拮抗剂(antagomir)、反义寡核苷酸或抑制性RNA分子。

7.权利要求6的方法，其中所述微小RNA拮抗剂或反义寡核苷酸包含与miR-486的成熟序列互补的序列。

8.权利要求7的方法，其中所述微小RNA拮抗剂或反义寡核苷酸包含与SEQ ID NO：70互补的序列。

9.权利要求6的方法，其中所述抑制性RNA分子包含双链区，其中所述双链区包含与miR-486的成熟序列基本上相同和基本上互补的序列。

10.权利要求9的方法，其中所述双链区包含与SEQ ID NO：70基本上相同和基本上互补的序列。

11.权利要求1的方法，其中所述平滑肌细胞是人平滑肌细胞。

12.一种在有需要的受试者中抑制再狭窄和新内膜形成的方法，包括向所述受试者施用miR-486的抑制剂和/或miR-143或miR-145的激动剂。

13.权利要求12的方法，其中所述激动剂是包含miR-143和/或miR-145的成熟序列的多核苷酸。

14.权利要求13的方法，其中所述激动剂是包含SEQ ID NO：38和/或SEQ ID NO：51的序列的多核苷酸。

15.权利要求13的方法，其中所述激动剂配制在脂质递送运载体中。

16.权利要求13的方法，其中所述激动剂由表达载体编码。

17.权利要求12的方法，其中所述miR-486的抑制剂是微小RNA拮抗剂、反义寡核苷酸或抑制性RNA分子。

18.权利要求17的方法，其中所述微小RNA拮抗剂或反义寡核苷酸包含与miR-486的成熟序列互补的序列。

19.权利要求18的方法，其中所述微小RNA拮抗剂或反义寡核苷酸包含与SEQ ID NO：70互补的序列。

20.权利要求17的方法，其中所述抑制性RNA分子包含双链区，其中所述双链区包含与miR-486的成熟序列基本上相同和基本上互补的序列。

21.权利要求20的方法，其中所述双链区包含与SEQ ID NO：70基本上相同和基本上互补的序列。

22.权利要求12的方法，其中所述miR-486的抑制剂和/或miR-143或miR-145的激动剂是通过动脉内、静脉内、皮下或舌下施用的。

23.权利要求22的方法，其中所述miR-486的抑制剂和/或miR-143或miR-145的激动剂是通过导管或涂覆的支架施用的。

24.权利要求12的方法，其中所述受试者是人。

25.权利要求12的方法，进一步包括向所述受试者施用抑制再狭窄或新内膜形成的第二种作用剂。

26.一种在有需要的受试者中治疗病理性心脏肥大、心力衰竭或心肌梗死的方法，包括向所述受试者施用miR-486和/或miR-422a的激动剂。

27.权利要求26的方法，其中所述激动剂是包含miR-486和/或miR-422a的成熟序列的多核苷酸。

28.权利要求27的方法，其中所述激动剂是包含SEQ ID NO：70和/或SEQ ID NO：94序列的多核苷酸。

29.权利要求27的方法，其中所述激动剂配制在脂质递送运载体中。

30.权利要求27的方法，其中所述激动剂由表达载体编码。

31.一种转基因的非人哺乳动物，其细胞无法表达有功能的miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486。

32.权利要求31的转基因哺乳动物，其中所述哺乳动物是小鼠。

33.一种转基因的非人哺乳动物，其细胞包含置于在所述非人哺乳动物细胞中有活性的异源启动子控制下的miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486编码区。

34.权利要求33的转基因哺乳动物，其中所述哺乳动物是小鼠。

35.权利要求33的转基因哺乳动物，其中所述启动子是组织特异性启动子。

36.权利要求35的转基因哺乳动物，其中所述组织特异性启动子是肌肉特异性启动子。

37.权利要求36的转基因哺乳动物，其中所述组织特异性启动子是心肌特异性启动子。

38.一种在血管平滑肌或心肌中鉴定miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486活性的调节剂的方法，包括：

(a)将血管平滑肌细胞或心肌细胞与候选化合物接触；

(b)评价miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR-486活性或表达；和

(c)将步骤(b)中的活性或表达与不存在所述候选化合物时的活性或表达比较，

其中测定的活性或表达之间的差异表明所述候选化合物是miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR486的调节剂。

39.权利要求38的方法，其中所述细胞与所述候选化合物在体外或体内接触。

40.权利要求38的方法，其中所述miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR486的调节剂是miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR486的激动剂。

41.权利要求38的方法，其中所述miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR486的调节剂是miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR486的抑制剂。

42.权利要求38的方法，其中评价miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR486活性或表达包括评价miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR486的表达。

43.权利要求38的方法，其中评价miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR486活性或表达包括评价miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR486的活性。

44.权利要求43的方法，其中评价miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR486的活性包括评价由miR-143、miR-145、miR-422a和/或miR486调节的基因的表达或活性。

45.权利要求44的方法，其中所述由miR-143和/或miR-145调节的基因是Slit-Robo GTP酶活化蛋白1、Slit-Robo GTP酶活化蛋白2、Smad3、Sema3、Cited2、KLF5或MRTFb。

46.权利要求44的方法，其中所述由miR-486调节的基因是PTEN或Foxola。

47.一种药物组合物，包含miR-143和/或miR-145的激动剂和药学上可接受的载体。

48.权利要求47的药物组合物，其中所述组合物配制为医疗装置的涂层。

49.权利要求48的药物组合物，其中所述医疗装置是导管或支架。

50.权利要求47的药物组合物，进一步包含miR-486的抑制剂。

Images