CN102080058B

CN102080058B - 一株干酪乳杆菌及其选育方法

Info

Publication number: CN102080058B
Application number: CN2010105794663A
Authority: CN
Inventors: 陈坚; 吴重德; 张娟; 堵国成
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2010-12-09
Filing date: 2010-12-09
Publication date: 2012-07-25
Anticipated expiration: 2030-12-09
Also published as: CN102080058A

Abstract

本发明公开了一株干酪乳杆菌及其选育方法，属于食品生物技术领域。本发明将干酪乳杆菌ATCC334恒化培养至稳态，降低培养体系pH值，按照一定稀释率流加培养基至稳态，再次降低体系pH值，按照一定稀释率流加培养基至稳态；重复上述过程，直至筛选到一株耐低pH值的干酪乳杆菌（CCTCCNO：M2010292）。选育得到的菌株在pH4.3的培养基中生物量较原始菌株提高了50%，并且对pH3.3的乳酸、pH2.5的盐酸以及1.6%的胆盐的耐受性分别提高了103倍、4.8倍和2.3倍。本发明有效地提高了乳酸菌对环境胁迫的耐受性，可用于选育食品工业中具有环境胁迫抗性的乳酸菌。

Description

一株干酪乳杆菌及其选育方法

技术领域

本发明涉及一株干酪乳杆菌及其选育方法，属于食品生物技术领域。

背景技术

干酪乳杆菌是一类广泛使用的益生菌，作为工业化的细胞工厂，干酪乳杆菌在食品、发酵等领域成为生产的主力军，具有极高的经济价值。然而，在实际的工业生产过程中，干酪乳杆菌却不可避免的面临着来自外界环境的各种不利条件的影响。随着发酵的不断进行，有机酸积累量不断增加，在此过程中，发酵生成的乳酸、乙酸被动扩散进入细胞质，快速解离成不能被细胞膜渗出的质子和携带电荷的酸根离子，并导致胞内pH的急剧下降和ATP合成能力的匮乏，严重影响了细胞的生物量和生理活性，限制了细胞的正常生长和代谢，大大降低了生产效率。同时，以干酪乳杆菌为主题的活菌益生产品，在人体胃肠道中还面临着诸如胃酸、胆盐等环境胁迫。因此，如何保持干酪乳杆菌的菌体活性成为学术界和产业界共同关注的焦点问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一株干酪乳杆菌，该菌株于2010年11月4日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2010292，地址：中国，武汉，武汉大学，其分类学命名为干酪乳杆菌Lb-2 (Lactobacillus casei Lb-2)。

所述干酪乳杆菌在pH 4.3的条件下，OD₆₀₀值达到3.12，相对于选育前提高了56.78%。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种选育耐酸性乳酸菌的方法。

解决上述问题的技术方案为：将出发菌株培养至稳态，降低培养体系pH值，按照一定稀释率流加培养基至稳态，再次降低体系pH值，按照一定稀释率流加培养基至稳态；重复上述过程，直至选育得到一株耐酸性乳酸菌。

所述出发菌株为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，购自美国ATCC，编号为 ATCC No: 334。

所述稳态是指细胞生长达到稳定状态。

所述流加培养基，主要是流加生长限制因子来调控微生物生长繁殖与代谢速度的连续培养方式。

所述按照一定稀释率流加，是以恒定的速率流入培养基，以恒定的速率流出培养液，从而保证了培养基化学成分的稳定，使培养***中的微生物始终保持稳定的生长速度。

本发明选育得到的干酪乳杆菌Lb-2（CCTCC NO：M 2010292）在较低pH的条件下，具有更好生长性能，具有良好的乳酸、盐酸和胆盐耐受性；本发明提供的选育方法，简单易行并且效果明显。

具体实施方式

实施例1干酪乳杆菌（CCTCC NO：M 2010292）的选育方法

以商业化的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) ATCC334为出发菌株，将其在种子培养基中培养至对数生长期，接种于pH5.3的发酵培养基中培养至OD₆₀₀=3.0后，按照稀释率0.1 h^-1的流加速率向恒化器中流加发酵培养基至稳态，再降低培养体系pH至5.0，停止流加 (D=0)。此时细胞在pH5.0的培养基中生长，当菌体浓度达到OD₆₀₀=3.0时，流加流加新鲜的发酵培养基直至达到稳态。如此反复操作逐渐降低发酵pH至4.3，且生长达到平衡。

取恒化培养的最终培养液，经适当稀释涂布pH4.3的平板，挑选单菌落,将单菌落于pH为4.3条件下发酵，根据生物量大小筛选出突变菌株。得到多株具有耐受高浓度环境胁迫抗性的干酪乳杆菌，其中一株命名为干酪乳杆菌Lb-2，其分类学命名为干酪乳杆菌Lb-2 (Lactobacillus casei Lb-2)，于2010年11月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO：M 2010292。

所述恒化培养的装置称为恒化器，购自New Brunswick公司，大小为1.3 L，装液量为0.7 L。

实施例2 干酪乳杆菌Lb-2酸胁迫条件下的生长特性

1、菌种活化

将保藏于-70^oC甘油管中的出发菌株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) ATCC 334及选育到的干酪乳杆菌Lb-2以2%的接种量接入种子培养基，在37^oC静置培养16h。

2、种子培养

以2%的接种量分别取活化好的干酪乳杆菌ATCC 334和干酪乳杆菌Lb-2到种子培养基，37^oC，静置培养至至对数中期。

3、发酵罐培养

以2 %的接种量将培养好的种子培养液分别转入发酵培养基，控制发酵灌的pH为4.3，以乳酸和盐酸作为pH调节剂，于37 ^oC、100 rpm条件下培养64 h。发酵结束后测定发酵液中菌体，在pH分别为4.3的条件下，最终干酪乳杆Lb-2，菌体浓度比干酪乳杆菌ATCC 334提高了56.78%，结果如表1所示。

所述种子培养基为：葡萄糖20 g L^-1，蛋白胨10 g L^-1，牛肉膏10 g L^-1，酵母浸出汁5 g L^-1，无水乙酸钠5 g L^-1，磷酸二氢钾2 g L^-1，柠檬酸三铵2 g L^-1，MgSO₄·7H₂O 0.2 g L^-1，MnSO₄·H₂O 0.05 g L^-1，pH 6.5。

所述发酵培养基为：葡萄糖8 g L^-1，蛋白胨10 g L^-1，牛肉膏10 g L^-1，酵母浸出汁5 g L^-1，无水乙酸钠5 g L^-1，磷酸二氢钾2 g L^-1，柠檬酸三铵2 g L^-1，MgSO₄·7H₂O 0.2 g L^-1，MnSO₄·H₂O 0.05 g L^-1。

表1 酸胁迫条件下菌体生长特性

菌株	L．casei ATCC334	L．casei Lb-2
			OD₆₀₀	1.99	3.12

实施例3 环境耐受性实验

1、菌种活化

将保藏于-70^oC甘油管中的出发菌株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) ATCC 334及选育得到的干酪乳杆菌Lb-2以2%的接种量接入种子培养基，在37^oC静置培养16h。

2、种子培养

以2%的接种量分别取活化好的干酪乳杆菌ATCC 334和干酪乳杆菌Lb-2到种子培养基，37^oC，静置培养至对数中期。

3、胁迫实验

取对数生长中期的细胞，经4℃、 8000 rpm离心5 min收集菌体，菌体经过磷酸盐缓冲液（pH 7.0）洗涤离心2次后，分别重悬于pH 4.3的乳酸、pH 2.5的盐酸和1.6%的胆盐中胁迫3 h，再重新用相同的缓冲液离心洗涤细胞2次，并重悬于等体积的缓冲液中，取1 mL菌体经恰当稀释后涂布平板，于37^oC培养48 h，分别计算存活率大小 (如表2 所示)。干酪乳杆菌Lb-2对乳酸、盐酸和胆盐的耐受性较干酪乳杆菌ATCC 334分别提高了103倍、4、8倍和2.3倍。

表2环境耐受性实验

存活率（%）	L．casei ATCC334	L．casei Lb-2
			乳酸	0.12	12.36
盐酸	14.92	71.62
			胆盐	1.18	2.71

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一株干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei )，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2010292。

2.一株权利要求1所述干酪乳杆菌，其特征在于，将菌株置于pH 4.3的乳酸中胁迫3 h，存活率为12.36%。

3.一株权利要求1所述干酪乳杆菌，其特征在于，将菌株置于pH 2.5的盐酸中胁迫3 h，存活率为71.62%。

4.一株权利要求1所述干酪乳杆菌，其特征在于，将菌株置于1.6%的胆盐中胁迫3 h，存活率为2.71%。