CN102079775A - 一种花生分离蛋白提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种花生分离蛋白提取方法，它包含有以下步骤：将花生蛋白粉溶于碱液，恒温水浴振荡，离心，取上清液1；将沉淀以相同方法二次浸提，离心，得上清液2；将上清液1和2合并，酸沉，离心，取沉淀物醇洗2次，再水洗至中性，冷冻干燥，得花生分离蛋白。利用本方法提取花生分离蛋白质含量高，经济效益和社会效益显著。

Description

一种花生分离蛋白提取方法 

技术领域

本发明涉及花生食品深加工技术领域，尤其是一种花生分离蛋白提取方法。 

背景技术

我国是花生生产大国，花生年产量居世界首位。花生在古代被称为“长生果”，经常食用可养血补血、补脾润肺、滋润肌肤，可预防高血压、动脉硬化和心血管等方面的疾病。花生中的蛋白质含量达20％～30％，仅次于大豆，花生也是一种重要的油料蛋白资源。在植物蛋白资源中，花生蛋白居第三位，占蛋白总量的11％，是较理想的食用蛋白资源。花生蛋白是一种营养价值较高的植物蛋白，它含有人体所需的8种必需氨基酸，而且谷氨酸、天门冬氨酸含量较高，与动物蛋白相近，且不含胆固醇，可消化性高，其消化系数达90％以上与应用较广的大豆蛋白相比，花生蛋白不含胀气因子，抗营养因子含量较少。目前国际上花生蛋白产品根据蛋白质的含量，主要分为花生蛋白粉(纯度＜65％)、浓缩蛋白(纯度65％～70％)、分离蛋白(纯度85％～96％)，其中花生蛋白粉又分为全脂、半脱脂和脱脂花生蛋白粉。花生分离蛋白制备方法主要包括碱提酸沉法、超滤膜法、超声波提取法及水酶法。我国对花生蛋白产品的开发研究主要集中在：花生蛋白粉、花生蛋白饮料、花生蛋白炼乳、花生蛋白膜、花生多肽以 及花生蛋白改性等方面。现有技术分离的花生蛋白纯度低，蛋白得率低，生产时间长。因此，需寻求一种提取率高及分离蛋白纯度高的分离方法。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种花生分离蛋白提取方法，以提高花生浓缩蛋白的得率。 

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现： 

将花生蛋白粉溶于pH值10的NaOH溶液，料液比1∶10～1∶12溶解充分，40～50℃水浴振荡，浸提90～150min，离心，取上清液1；将沉淀以相同方法二次浸提，离心，得上清液2；将上清液1和2合并，盐酸沉淀，离心，取沉淀物醇洗2次，再水洗至中性，冷冻干燥，得花生分离蛋白。 

优选地，本发明的分离方法为： 

将花生蛋白粉溶于pH值10的NaOH溶液，料液比(重量体积比)1∶12溶解充分，50℃水浴振荡，浸提131min，离心，取上清液1；将沉淀以相同方法二次浸提，离心，得上清液2；将上清液1和2合并，盐酸沉淀，离心，取沉淀物醇洗2次，再水洗至中性，冷冻干燥，得花生分离蛋白。 

利用本方法分离的花生蛋白蛋白质提取率和含量高，经凯氏定氮法检测，花生分离蛋白的纯度为90％以上，提取率达到65％以上，经济效益和社会效益显著。 

附图说明

图1浸提温度对花生分离蛋白制备的影响 

图2碱液pH值对花生分离蛋白制备的影响 

图3浸提时间对花生分离蛋白制备的影响 

图4料液比对花生分离蛋白制备的影响 

图5双因素的响应面图 

a.浸提时间和温度对蛋白纯度的影响 

b.浸提时间和碱液pH对蛋白纯度的影响 

c.浸提时间和液料比对蛋白纯度的影响 

d.浸提温度和碱液pH对蛋白纯度的影响 

e.浸提温度和液料比对蛋白纯度的影响 

f.碱液pH和液料比对蛋白纯度的影响 

图6花生分离蛋白的制备工艺流程 

实验例 

1、材料与方法 

1.1材料与试剂 

一级脱脂花生蛋白粉：山东天申生物蛋白有限公司 

95％乙醇、蒸馏水、盐酸、氢氧化钠、硼酸等均为分析纯。甲基红、溴甲酚绿指示剂。 

1.2仪器与设备 

冷冻干燥机北京博医康实验仪器有限公司；SHA-B双功能水浴恒温振荡器金坛市杰瑞尔电器有限公司；FE20实验室pH计梅 特勒-托利多仪器有限公司；DZ-2自动电位滴定装置；全自动凯氏定氮仪 

1.3实验方法 

1.3.1单因素实验设计 

依次改变花生蛋白粉碱提酸沉淀的温度、碱液pH值、碱提时间和碱提固液比，以花生蛋白纯度和蛋白得率作为评价指标进行研究和分析，并确定四因素三水平的最佳参数进行响应面分析。 

1.3.2蛋白纯度和蛋白得率的测定 

蛋白纯度：凯氏定氮法 

蛋白提取率(％)＝所得花生分离蛋白中总蛋白质量/花生蛋白粉中总蛋白质量×100％ 

1.3.3原料组分含量的测定 

蛋白含量的测定：GB/T5009，5-2003；脂肪含量的测定：GB/T5009，6-2003 

水分含量的测定：GB/T5009，3-2003；灰分含量的测定：GB/T5009，4-2003 

2结果与分析 

2.1花生蛋白粉的主要成分 

表1花生蛋白粉的主要成分 

2.2单因素实验结果与分析 

2.2.1浸提温度对花生分离蛋白制备的影响 

用碱液浸提花生蛋白粉的过程中控制体系的pH值为9、浸提时间为90min、固液比为1∶10，设置不同的温度，但是温度不宜过高，以免使蛋白变性，研究浸提温度对花生分离蛋白制备的影响(图1)。从图中可知，随着温度的升高，蛋白纯度逐渐提高，40℃以上蛋白纯度趋于不变；蛋白提取率随温度升高，先升高再降低，40℃时蛋白提取率最高。综合考虑两评价指标确定温度为40、45、50℃继续做响应面分析以确定最佳的浸提温度。 

2.2.2碱液pH值对花生分离蛋白制备的影响 

碱液浸提花生蛋白粉过程中控制体系的温度为40℃、固液比是1∶10、浸提时间是90min，设置不同pH值的碱液。实验前测得实验用花生蛋白粉溶于水显酸性，蛋白粉溶于pH值≤10.5的碱液时，显弱碱性或中性，不会使蛋白变性。碱液pH值对花生分离蛋白制备的影响结果见图2所示。花生蛋白主要成分是花生球蛋白和伴花生球蛋白，还有10％左右的清蛋白。全部的球蛋白和清蛋白都可溶于稀碱溶液中，蛋白质溶解度随pH升高而增大，蛋白质溶出增多。从图中可知，随着碱液pH值增加，蛋白纯度及提取率都呈增加的趋势，其中pH值＝10时蛋白提取率最高，而蛋白含量在pH＝9时趋于稳定。综合考虑两评价指标的最佳pH值点，选取pH为9、9.5、10继续做响应面分析以确定最佳的碱液pH值。 

2.2.3浸提时间对花生分离蛋白制备的影响 

碱液浸提花生蛋白粉过程中控制体系的温度为40℃、固液比是1∶10、碱液pH值＝9.5设置不同的浸提时间，研究浸提时间对花生分 离蛋白制备的影响，结果见图3。如图所示，蛋白纯度随着时间的增加而增加，90min以后增加幅度减缓，而蛋白提取率随时间增加先提高再下降。这个过程可能是浸提时间延长，蛋白的溶出增加，当一定时间后，蛋白的溶出达到饱和，则溶出率趋于平衡，若再进一步延长浸提时间，可能因为微生物生长等因素使蛋白质变性从而使提取率降低。综合评价两指标的最佳浸提时间段，选取90min、120min、150min继续做响应面分析以确定最佳的浸提时间。 

2.2.4料液比对花生分离蛋白制备的影响 

碱液浸提花生蛋白粉过程中控制体系的温度为40℃、浸提时间为90min、碱液pH值＝9.5，设置不同的固液比，研究固液比对花生分离蛋白制备的影响，结果见图4。如图所示，蛋白纯度随固液比的增加变化不大，而蛋白提取率则随固液比增加而提高。因为单位碱液只能溶解一定量的蛋白，该单因素实验选用的碱液量不能使花生蛋白充分溶解或者花生蛋白刚刚完全溶解，所以，在不同的固液比条件下，蛋白纯度趋于平衡。而随碱液量增加，蛋白的溶解量增加，从而使得蛋白的提取率增加。从图中可以看出，在固液比1∶11左右即为蛋白溶解充分的点，所以选取固液比＝1∶10、1∶11、1∶12继续做响应面分析以确定最佳的料液比。 

2.3花生分离蛋白提取工艺的优化 

根据采用Box-Behnken中心组合实验设计原理，结合单因素试验结果，考察浸提时间(X1)、温度(X2)、碱液pH值(X3)和料液比(X4)对蛋白纯度(Y)的影响，试验因素及水平见表2，试验设 计与结果见表3。试验设计与分析采用Design-expert软件。 

表2中心组合试验因素水平编码表 

表3试验设计与结果 

2.3.1模型的建立及显著性检验 

根据试验数据，对自变量编码X1、X2、X3和X4进行回归分析，得二次多项回归方程为： 

Y＝93.85+1.02X1+0.67X2+0.97X3-0.47X4+0.76X1X2-0.85X1X3+0.42X1X4-0.32X2X3+0.55X2X4+0.91X3X4-1.76X12+0.084X22-0.19X32+0.010X42 

通过Design-Expert软件进行方差分析来验证回归模型及各参数的显著度，结果见表4 

表4模型的ANOVA分析结果 

注：P值小于0.05说明模型或考察因素有显著影响；P值小于0.01说明影响极显著。 

由方差分析可以看出，模型P值远小于0.05，表示模型方程极显著，模型失拟项不显著，模型选择适合。变异系数反映模型的置信度，变异系数越低，模型的置信度越好；本试验的变异系数是1.07％，说明模型方程能很好的反应真实的试验值。因此可以用该模型方程来分析和预测不同浸提条件下，花生蛋白纯度的变化情况。由表4的P值可以知道，方程中X1、X2、X3、X12对Y的影响显著，表明试验因素对响应值的影响并非呈线性关系。通过直接比较方程中一次项系 数绝对值的大小，可以判断因素影响的主次性。对提取分离蛋白的纯度影响的大小依次是浸提时间、碱液pH值、温度、料液比，即浸提时间对分离蛋白的提取影响最显著。 

RSM的图形是特定的响应面Y对应因素X1、X2、X3、X4值构成的一个三维空间在二维平面上的等高图，可以直观地反映各因素对响应值的影响，从所得响应面分析图上可以分析出它们之间的相互作用。从响应面分析图5中可以看出响应值与影响因素的关系。 

图5中a-f直观地反映了各因素对响应值的影响，由等值线图可以看出存在极值的条件应该在圆心处。比较6组图可知：浸提时间对蛋白纯度的影响最为显著，表现曲线较陡；而碱液pH、浸提温度、料液比次之，表现为曲线较为平滑，且随其数值的增加或减少，响应值变化较小。 

2.3.2提取条件的优化及验证 

进一步用Design-Expert软件对试验模型进行典型性分析，以获得最优的提取条件。经分析得，在X1＝130.77min、X2＝50℃、X3＝10、X4＝12，即浸提时间130.77min、温度50℃、碱液pH值10、料液比1∶12得到的理论最大值是96.32％ 

为了考虑验证试验的可行性，采用得到的最佳提取条件进行花生分离蛋白的提取试验，同时考虑操作和生产的便利性，将提取条件修正为浸提时间X1＝131min，其他条件不变，3次平行试验得到的蛋白纯度平均为95.05％，与理论值相差1.27％，因此响应面法对花生分离蛋白提取条件的优化是可行的，得到的花生分离蛋白提取条件具有 实际应用价值。 

3结论 

本实验是在单因素基础上进行四因素三水平的响应面分析方法，优化了提取花生分离蛋白的工艺条件，响应面实验分析出，在提取时间为90～150min、提取温度为40～50℃、碱液pH值为9～10、料液比为1∶10～1∶12的范围内，各因素对提取分离蛋白的纯度影响的大小依次是浸提时间、碱液pH值、温度、料液比；提取花生分离蛋白最佳提取工艺参数为浸提时间131min、温度50℃、碱液pH值10、料液比1∶12。 

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作详细描述。 

实施例1 

将花生蛋白粉溶于pH值10的NaOH溶液，料液比1∶10溶解充分，40℃水浴振荡，浸提90min，离心，取上清液1；将沉淀以相同方法二次浸提，离心，得上清液2；将上清液1和2合并，盐酸沉淀，离心，取沉淀物醇洗2次，再水洗至中性，冷冻干燥，得花生分离蛋白。 

经凯氏定氮法检测，花生分离蛋白的纯度为90.02％，提取率达到66.05％。 

实施例2 

将花生蛋白粉溶于pH值10的NaOH溶液，料液比1∶11溶解充 分，45℃水浴振荡，浸提150min，离心，取上清液1；将沉淀以相同方法二次浸提，离心，得上清液2；将上清液1和2合并，盐酸沉淀，离心，取沉淀物醇洗2次，再水洗至中性，冷冻干燥，得花生分离蛋白。 

经凯氏定氮法检测，花生分离蛋白的纯度为92.15％，提取率达到67.51％。 

实施例3 

将花生蛋白粉溶于pH值10的NaOH溶液，料液比1∶12溶解充分，50℃水浴振荡，浸提131min，离心，取上清液1；将沉淀以相同方法二次浸提，离心，得上清液2；将上清液1和2合并，盐酸沉淀，离心，取沉淀物醇洗2次，再水洗至中性，冷冻干燥，得花生分离蛋白。 

经凯氏定氮法检测，花生分离蛋白的纯度为95.05％，提取率达到71％ 

实施例4 

将花生蛋白粉溶于pH值10的NaOH溶液，料液比1∶12溶解充分，48℃水浴振荡，浸提140min，离心，取上清液1；将沉淀以相同方法二次浸提，离心，得上清液2；将上清液1和2合并，盐酸沉淀，离心，取沉淀物醇洗2次，再水洗至中性，冷冻干燥，得花生分离蛋白。 

经凯氏定氮法检测，花生分离蛋白的纯度为94.76％，提取率达到70.80％。 

Claims (3)

1.一种花生分离蛋白的制备方法，包括以下步骤：

将花生蛋白粉溶于pH值10的NaOH溶液，料液比1∶10～1∶12溶解充分，40～50℃水浴振荡，浸提90～150min，离心，取上清液1；将沉淀以相同方法二次浸提，离心，得上清液2；将上清液1和2合并，盐酸沉淀，离心，取沉淀物醇洗2次，再水洗至中性，冷冻干燥，得花生分离蛋白。

2.根据权利要求1所述的花生分离蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将花生蛋白粉溶于pH值10的NaOH溶液，料液比1∶12溶解充分，50℃水浴振荡，浸提131min，离心，取上清液1；将沉淀以相同方法二次浸提，离心，得上清液2；将上清液1和2合并，盐酸沉淀，离心，取沉淀物醇洗2次，再水洗至中性，冷冻干燥，得花生分离蛋白。

3.根据权利要求2所述的花生分离蛋白的制备方法，其特征在于，所述的醇是95％的乙醇。

Images