CN102066407A

CN102066407A - 新型禽星状病毒

Info

Publication number: CN102066407A
Application number: CN2009801136970A
Authority: CN
Inventors: S·德威特; C·C·斯彻厄; M·梵德拉; I·万斯特根
Original assignee: Intervet International BV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 2008-04-28
Filing date: 2009-04-27
Publication date: 2011-05-18
Also published as: MX2010011874A; EP2271663A1; WO2009133054A1; RU2010148430A; TW201004972A; AR071220A1; EP2271663B1; ES2567712T3; US20110104178A1; JP2011520430A; US8277814B2; RU2547589C2; TWI445715B

Abstract

本发明涉及兽医病毒学和免疫学的领域。具体地，本发明涉及新型禽星状病毒；抗该新型病毒的抗体或其片段；该新型禽星状病毒的抗原性制剂、蛋白质和DNA分子；该新型病毒或者其抗原性制剂、蛋白质或DNA的疫苗；用于制造此类疫苗的方法以及诊断试剂盒。

Description

新型禽星状病毒

星状病毒是小的圆形无包膜病毒，其具有有义单链RNA基因组。大多数星状病毒与引起一些类别的肠炎、产生腹泻、呕吐、吸收障碍(malabsorbtion)、全身不适和生长迟缓(growth retardation)相关。感染在不太易于恢复活力的人或动物例如年幼、年老或免疫减弱的个体中可以是致命的。参见：Matsui和Greenberg(在：Fieldsvirology，第3版，1996，ed.：B.Fields等人，ISBN：781702534，第26章中)和：Moser和Schultz-Cherry(2005，Viral Immunology，第18卷，p.4-10)。

此外，星状病毒诱导的病状的严重性可因星状病毒种类之间或株系本身之间的毒性差异而变化。这已使得人们相信一些星状病毒充当二级病原体(secondary pathogen)，它们本身只引起亚临床疾病，而完全临床症状只有当存在来自另一种病原体的另外的病因时才得以体现。

籍以获得抗星状病毒感染的免疫力的机制还不完全清楚；病毒中和抗体确实似乎在防御和免疫记忆中起作用，但可能不是抗星状病毒感染的免疫反应的唯一效应物。这由M.Koci(2005，ViralImmunology，第18卷，p.11-16)进行了综述。

已在世界范围内检测到星状病毒，并且从众多种动物分离了星状病毒。而在感染某一靶动物的星状病毒种类当中，已描述了几个血清型。在分类学上将星状病毒科分成两个主要的属，即哺乳动物星状病毒——哺乳动物星状病毒属(Mamastrovirus)和禽星状病毒(avianAstroviruse)——禽星状病毒属(Avastrovirus)。现在禽星状病毒属包括正式承认的种类：禽肾炎病毒(Avian nephritis virus)1和2(ANV1，2)(来自鸡)和火鸡星状病毒(turkey Astrovirus)1和2(TastV1，2)。

已从鸭、鸡、驼鸟和火鸡分离了几种另外的禽星状病毒。例如，鸡星状病毒2(CAstV2)已由Baxendale和Mebatsion(2004，Avianpathology，第33卷，p.364-370；和于国际专利公开案WO2004/027053中)进行了描述，Todd等人描述了CAstV3(WO2007/077464)，其与CAstV2关系密切。此类星状病毒仍未被正式分类，如由Koci和Schulz-Cherry(2002，Avian Pathology第31卷，p.213-227)所综述的。

星状病毒在环境中非常稳定，例如，它们可抗常用的脂溶剂(lipid-solvent)和去垢剂，具有宽广的pH耐受性，并且具有相当的热稳定性。这一性质符合它们的高传染性和容易的传播(通过粪口途径)，解释了可在全世界这么多的人和动物中发现星状病毒或抗它们的抗体的原因。

当需要更新以适合新的实验数据时，此类小RNA病毒的分类和命名一直经历频繁的改变。例如：鸭星状病毒(DAstV)以前被分类为细小核糖核酸病毒(Picorna virus)，并且最初被称为II型鸭肝炎病毒，因为其引起肝炎。类似地，ANV1以前被描述为细小核糖核酸病毒，特别地肠病毒(enterovirus)，但被重新分类至星状病毒(Imada等人，2000，J.of Virology，第74卷，p.8487-8493)。ANV1也被称为：鸡星状病毒1(CAstV1)，其引起肾炎。

一旦获得关于它们的病毒基因组的序列和组织的新信息，则需要重新分类此类病毒。特别地对于星状病毒科，已显示物理、电子显微镜和生物化学表征通常不足以将星状病毒科与其他所谓的“小圆病毒”或“肠病毒样病毒”例如细小RNA病毒科(Picornaviridae)、嵌杯病毒科(Caliciviridae)或肝炎病毒科(戊型肝炎样病毒)或甚至与引起的疾病症状与星状病毒非常相似的包膜RNA病毒(enveloped RNAviruse)例如呼肠孤病毒(Reoviruse)、轮状病毒(Rotaviruse)或冠状病毒相区别。这是因为这些表征的结果随使用的方法和条件变化而变化。因此这些表征的一致性不足以至不能正确确定。

在另一个方面，与免疫学表征组合的分子生物学表征例如基因分型的全面性和重现性足以将微生物分配至恰当的分类群(VanRegenmortel等人，2000，在：Virus Taxonomy，7th report of theICTV，Academic press，New York中)。因此理想地，这样的确定基于核苷酸测序、聚合酶链式反应(PCR)测定和血清分型测定。

星状病毒科的RNA基因组大小大致为大约7kb，该病毒科典型的基因组组织参见：Jiang等人(1993，PNAS-USA，vol.90，p.10539-10543)和Koci等人(2000，J.of Virology，第74卷，p.6173-6177)。根据目前的理解，基因组从5′至3′整合了3个明确可辨认的开放阅读框架(ORF)：

ORF 1a：大小为大约3kb，编码具有丝氨酸蛋白酶基序的非结构蛋白。

ORF 1b：大小为大约1.5kb，与ORF 1a部分重叠，其编码非结构的RNA依赖性RNA聚合酶。

ORF 2：通过大约2kb的亚基因组RNA编码结构性病毒蛋白。表达的多蛋白在病毒装配之前可能被切割成更小的部分，并且包含a.o.衣壳或外壳蛋白。

在这3个ORF中，当在可公开获得的星状病毒核苷酸序列之间进行比较时，ORF 1b具有最保守的核苷酸序列，ORF 2是序列变异性最大的ORF。

从1987年至目前，在荷兰、德国和***联合酋长国的家禽养殖业中观察到一些特珠疾病问题：鸡和火鸡遭受腹泻、饲料转化和生长的降低以及遭受关节和腿肌腱的肿胀和疼痛的问题。在不同年龄的肉禽、种禽和产蛋型禽中和在不同的无明显相互毗连的农场中均发现了此类问题。

在禽类中在它们的第一周龄直至数月龄中观察到跛行。动物表现出肿胀的后踝(踝)关节和小腿的肌腱移位(两者过度充盈澄清的轻微粘稠的液体)和关节炎的症状。在这些禽类中观察到饲料转化率和生长率的减少，最可能地是由运动问题造成的。在最坏的情况下，这些禽类不再能够运动，从而不能获得饲料或饮水，从而导致死亡。这些腿部畸形在更重的肉用型禽类中最突出，然而持续的经济损失在所有类型的禽类中是相当大的。

主要在更幼小的禽类中但也在产蛋龄的禽类中观察到的腹泻具有甚至更大的影响。症状从消化不良变化至明显的肠炎，并且导致饲料转化的降低；生长抑制或甚至体重减轻；产蛋量下降(“减蛋(egg-drop)”)；质量差的蛋的数目增加；和死亡。

在一些农场中，在数年中观察到这些问题，导致持续的较差产量数据而无明确的病因。

在死后检查时，在几个情况下发现除了肠或腿关节外的身体部分也受到影响，例如由砂囊糜烂或肝肿胀所展示的。

为了检测这些症状的病因，对管理和饮食方面进行调查，但这些方面可与在这些情况下观察到的问题不相关。此外还研究了可能是造成感染，特别地由呼肠孤病毒引起的感染的原因的病原体，因为众所周知该病毒引起吸收障碍和关节问题。然而，尽管使用许多种测定，但在许多情况下未能检测到呼肠孤病毒。

还常规地或特别地检查了已知引起相似问题的几种其他病原体，例如细菌：沙门氏菌(Salmonella)、支原体(Mycoplasma)、嗜血杆菌(Haemophilus)和巴斯德菌(Pasteurella)；和病毒：腺病毒、传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis virus，IBV)、新城疫病毒(NDV)、传染性腔上囊病病毒(Infectious Bursal Diseasevirus，IBDV)、减蛋综合症(Egg Drop Syndrome，EDS)和禽流感病毒(AIV)。

直至今日，还没有致病因子可与观察到的腿和肠的问题(无论严重度)、动物福利的问题以及所造成的这些家禽养殖业的不利经济性能相关联。

因此需要鉴定与观察到的疾病症状关联的试剂以及提供疫苗和诊断剂，以提供对该疾病的预防和致病因子的鉴定。

令人惊讶地，已在患有肠和运动疾病的鸡和火鸡中发现一种新型病毒。该病毒可从不同年龄、种类和来源的患病禽类分离到(从关节和肌腱以及从各种内脏器官分离)。所分离的病毒反过来在感染健康测试动物后诱导相似的疾病症状，并且可从患病的测试动物中再分离到，从而满足了柯赫氏法则。

可将该新型病毒用于开发检测和抵抗该病毒和其在家禽中引起的疾病问题(特别地关节和肌腱以及胃肠道的疾病)的诊断测定和疫苗。

已用许多方法分析了新型病毒，令人惊讶地该病毒被鉴定为星状病毒。由于其在鸡和火鸡中流行，暂时将其定性为禽星状病毒。

除许多其他特征外，从两个使用氯仿的连续提取的结果还发现本文中描述的新型病毒是无包膜的(抽提之后，所抽提的病毒样品仍然能够在SPF鸡胚蛋中引起特定的致病作用)。

可用于进一步分析的核酸只可在RNA提取和RT-PCR后获得、而不能在DNA分离和常规PCR后获得这一事实，揭示了该新型病毒中存在RNA基因组这一特点。

令人惊讶地，发现最接近(然而可区别的)的亲缘病毒为ANV1型病毒，因此本文中描述的新型禽星状病毒代表了暂时分类为ANV3病毒的新型禽肾炎病毒组。

然而，本发明者已令人惊讶地发现了一些特征，它们可以区分本文中描述的新型禽星状病毒与ANV1和其他(星状-)病毒，并且将新型禽星状病毒的不同分离株独特地鉴定为属于其自己的新的独立的组。

主要的鉴定特征涉及可通过核苷酸序列分析和通过PCR测定鉴定的特定核苷酸序列的存在。

还观察到当感染胚胎时诱导的不同的病理学症状。使用VN-或IFT-测定通过血清分型可检测到特定的免疫差异。所有这些将在下面通过实验结果和数据来进行描述。

本发明涉及具有开放阅读框架(ORF)1a基因组区域的分离的新型禽星状病毒，其特征在于所述禽星状病毒的ORF 1a，当与禽肾炎病毒1的ORF 1a相比较时，包含12个核苷酸的***物，所述***物位于相应于SEQ ID NO：1的第2485和2486号核苷酸之间。

优选的“禽类”生物是家禽；更优选的禽类生物选自鸡、火鸡、鸭和鹅。最优选是鸡。

术语“星状病毒”显示了本发明新型病毒组与目前已描述和/或分类为属于星状病毒科分类学科的病毒的关系。然而，本领域技术人员将认识到这样的分类学分类可随时间而改变，因为新的知识可导致重新分类至新的或其他分类群。然而，由于这不改变本发明病毒的特征而只改变其分类，因此这样的重新分类的生物仍然在本发明的范围内。

特别地，本发明包括从本发明禽星状病毒亚分类至亚种、株系、基因型、血清型、变体或亚型等的所有病毒。

因此，对于本发明，“星状病毒”是具有分类为星状病毒的病毒的表征特性的病毒。此类表征特征涉及例如分子、生物化学和生物学特征；例如涉及具有包含可辨认为1a、1b和2的ORF的有义单链RNA基因组；为大约28-30nm的无包膜病毒粒；和引起肠炎。

术语“基因组区域”指本发明新型禽星状病毒的遗传材料的一部分。这样的区域将由核酸组成；在本发明新型禽星状病毒的情况下，核酸是RNA。

如所有其他星状病毒科一样，本发明新型禽星状病毒的基因组包括可辨认为和相应于ORF 1a、1b和2的区域。

然而，令人惊讶地发现该新型禽星状病毒在其ORF 1a基因组区域具有一些不存在于ANV1或任何其他类型的(禽)星状病毒ORF 1a中的核苷酸。这些核苷酸以12个核苷酸的线性连续区段的形式存在，并且当与ANV1的ORF 1a序列相比较时，代表了至该区域内的***物。该12个核苷酸的“***物”存在于本文中描述的新型禽星状病毒的组群的所有检测过的分离株的ORF 1a中。

通过参照对于ANV1参照株的基因组序列所描述的编号(所述编号由1mada等人(2000，J.of Virology，第74卷，p.8487-8493)描述)来标示所述12个核苷酸的***物在本文中描述的新型禽星状病毒分离株的ORF1a中存在的位置。该ANV1株的基因组序列的cDNA序列也可在登录号：AB033998下从称为GenBank的美国国立卫生研究院的互联网核苷酸数据库获得，并且在本文中表示为SEQ ID NO：1。

对于本发明新型禽星状病毒的所有分离株，该ORF中的12核苷酸***物位于相应于SEQ ID NO：1的第2485和2486号核苷酸的核苷酸之间。

目前不知道本发明新型禽星状病毒的ORF 1a中的该12核苷酸***物(其不存在于ANV1的ORF 1a中)是否或如何影响该新型禽星状病毒的行为。不受任何理论束缚，本发明者假设，由于此***物以12个核苷酸的形式存在，从而存在4个三联体，仍然使ORF1的翻译阅读框保持完整，这一事实使得将编码的4个额外氨基酸整合在从ORF 1a表达的非结构蛋白中。这极可能影响病毒的病理-生物学行为，例如其毒性和其引起肠以及腿、关节和肌腱的疾病的能力。

然而，这12个核苷酸存在于本文中描述的新型禽星状病毒的ORF

1a基因组区域但不存在于ANV1或其他(禽)星状病毒的ORF 1a中这一事实提供了该新型病毒组群的阳性遗传标记。

如在本领域中所熟知的，遗传标记是生物体遗传材料的特征，其位于某一基因组位置上，可用于进行某种区分或产生某种关联，并且可通过技术方法来检测。当一个特征存在于待鉴定的组群中(如本发明中的情形)时，其是该组群的“阳性”遗传标记。

表征本发明新型禽星状病毒的该12核苷酸***物的核苷酸序列对于本文中描述的新型禽星状病毒的所有分离株而言不是完全相同的，然而大小和位置是相同的。该12核苷酸***物的核苷酸序列的共有序列为：

5′-TCYGGDMARYYT-3′，在本文中表示为SEQ ID NO：2。

因此，在一个优选实施方案中，本发明的特征在于该12核苷酸***物具有如SEQ ID NO：2中所示的核酸序列。

本领域技术人员将知道，SEQ ID NO：2的序列是所谓的‘变性的’引物序列，表明其中有一些位置(此处为：Y、D、M和R)处可以存在多个核苷酸中的一个。用于标示变性碱基的常用代码是IUPAC代码(Biochem.J.，1985，第229卷，p.281-286中公开的)，其中：R＝G或A；Y＝T或C；M＝A或C；K＝G或T；S＝G或C；W＝A或T；H＝A、C或T；B＝G、T或C；V＝G、C或A；D＝G、A或T；和N＝G、A、T或C。

对于本文中描述的新型禽星状病毒，该可检测的遗传标记的存在允许通过检测例如通过DNA测序或PCR进行检测来鉴定该新型病毒和其新型组群。

DNA测序是一项熟知的技术；例如用于高速自动化测序的标准方案和设备是可广泛获得的。最常见地此类方案利用基于PCR的“循环-测序”，然后进行高分辨力电泳。

为了进行RNA病毒例如星状病毒科病毒的核酸测序，待检查的核酸需要以拷贝DNA(cDNA)的形式存在，因为RNA测序仍然是不可行的。对于cDNA的制备，有许多标准方案和商业试剂盒可供利用。此类方案使用逆转录酶。通常使用引物起始拷贝过程。

用于RT反应的合适引物的一个实例是在本文中表示为SEQ ID NO：3的DNA寡核苷酸，其为：5′-TCG WTS CTA CYC-3′。本发明者将该引物称为引物17。

该引物杂交至许多禽星状病毒的基因组的远端3′区，该区域始于相应于SEQ ID NO：1第6731号核苷酸的核苷酸并且反向延伸。

在图1中，展示了来自选定数目的本发明禽星状病毒分离株的ORF1a部分的cDNA序列的多重比对。将这些cDNA序列与SEQ ID NO：1中所示的ANV1参照病毒基因组的相应部分进行比对。如在加框区域中清楚可见的，所有分离株具有不存在于ANV1 ORF 1a中的一个12核苷酸区域。本发明禽星状病毒分离株的ORF 1a cDNA序列的序列编号SEQID NO列于表1中。

类似地，图2显示了通过图1中所列cDNA序列的计算机翻译制备的推定氨基酸序列的多重比对。如加框的区域中可见的，由本发明禽星状病毒的ORF 1a编码的蛋白质包含不存在于由ANV1的ORF 1a编码的蛋白质中的4个氨基酸。本发明禽星状病毒分离株的翻译ORF 1a序列的序列编号SEQ ID NO列于表1中。

关于本发明禽星状病毒的分离株：在一段时间内从遭受上述腿和/或肠疾病的鸡和火鸡收集大量野外分离株(field isolate)。分析了这些分离株当中的许多株，得到了本文中描述的新型禽星状病毒组群这一发明。然而，在本文中只提供所有经分析的分离株中选出的一些分离株，以在该组群中发生的天然变异的背景中定义该新型禽星状病毒。

表1提供了本文所述的本发明禽星状病毒分离株的描述。此外，表1还列出了来自所选分离株的ORF 1a、1b和2的cDNA和推定蛋白质序列的序列编号SEQ ID NO。

表1：所选的本发明禽星状病毒分离株的特征；以及已测序的cDNA区域(“nt”)和推定的编码蛋白质(“aa”)的SEQ ID NO。

“nt”＝核苷酸序列；“aa”＝氨基酸序列；“-”＝未知的。

本发明禽星状病毒的分离株可从遭受肠或腿问题的禽类通过从一个或多个器官或者从关节和腿的肌腱采集样品来获得。在需要时可将样品匀浆，然后将其例如与适当的缓冲液(优选含有抗生素)混合。

为了扩增此类分离株的病毒滴度，可使用不同的底物例如禽类细胞系或禽类胚胎蛋(embryonised avian egg)。当使用蛋时，可将悬浮液接种入禽类胚胎蛋并且在其中进行培养。不同的接种途径是可能的，例如接种在尿囊浆膜(CAM)上，或接种入卵黄囊或尿囊液腔。优选地，前几轮接种入卵黄囊，后几轮接种(必要时)可接种入尿囊液。可使用大约5至7天龄的SPF鸡胚蛋。此类技术对于本领域技术人员来说是熟知的，并且合适质量和时期的SPF鸡蛋可以例如从

或

商购获得。

在适当的条件下孵育2至7天后，可收获胚胎、CAM或(优选)尿囊液。需要时可通过接种入卵黄囊或尿囊液来在蛋上进行更多轮的扩增。最后可收获包含大量本发明禽星状病毒的尿囊液。

为了进行ORF 1a的代表性部分的两条链的PCR测序，可常规地使用下列引物：

SEQ ID NO：28：5′-AAA GGK AAG ACD AAG ARR RAC MG-3′，和

SEQ ID NO：29：5′-TCG CCT TCT GGA AGG TCT TCA-3′。

本发明者将这些测序引物分别称为引物F-II和R-II-3。SEQ ID NO：28杂交至由相应于ANV1(SEQ ID NO：1)的nt 2171开始并向前延伸的核苷酸；SEQ ID NO：29杂交至由SEQ ID NO：1的nt 2640开始并且以反向延伸的核苷酸(参见表4)。这样，包含ANV1中不存在的12个核苷酸的本发明禽星状病毒ORF 1a的基因组区域被测序的ORF 1a部分所覆盖。

为了进行已确定的DNA序列的计算机分析，裁剪这些序列以使它们不包含来自引物本身的变性序列。此外，比较的序列还必需等长以获得代表性比对。同样地，在经裁剪的序列的全长范围内进行比对。这意味着，例如在使用引物SEQ ID NO：28和29的情况下，待比较的序列的长度为大约400-425个核苷酸。

用于此类操作和比对的简便计算机程序是Clone Manager^TM(由：Scientific and Educational software^TM提供)，或者程序可通过互联网获得：“ClustalW”(用于多重比对)和“Translate”(用于翻译)，两者可在www.expasy.org上获得；或在www.ncbi.nlm.nih.gov上获得的“Blast”程序。优选使用缺省评分参数。

对本发明禽星状病毒的许多分离株进行使用引物SEQ ID NO：28和29的cDNA测序。选择的所得经裁剪的核苷酸序列在本文中示于SEQID NO：4、10、12、14、16、18、20、22、24和26，如表1中所示的。

使用来自鸡的一个分离株(编号为161319，本发明者将其称为“分离株19”)的序列作为参照将这些序列彼此进行比对。此外，还将可在GenBank中获得的来自其他星状病毒(例如ANV1(AB033998，SEQ IDNO：1)、火鸡星状病毒1(TastV1)(Y15936)、火鸡星状病毒2(AF206663)、绵羊星状病毒(Y15937)、貂星状病毒(AY179509)和人星状病毒(Z25771))的ORF 1a相应部分的几个DNA序列进行比对；连字符之间是各自的GenBank登录号。

在此类其他星状病毒ORF 1a序列当中，只有ANV1(特别地来自SEQ ID NO：1的nt 2213-2607的部分)具有显著的序列同一性，指显著高于50％的核苷酸序列同一性百分比。在剩下的其他星状病毒中，只有TAstV1(GenBank登录号：Y15936)在核苷酸编号2450-2856的部分中具有可检测的、但不算显著的序列同一性。这示于表2中。

表2：SEQ ID NO：4(为来自分离株19的ORF 1a的部分)与来自本发明禽星状病毒的其它分离株以及来自其他星状病毒的ORF 1a相应部分的序列之间的核苷酸序列同一性百分比列表。

此类核苷酸序列比对的结果的树状图示于图3中。

因此，令人惊讶地发现本发明新型禽星状病毒的组群与所有其他星状病毒(禽类或哺乳动物的)截然不同，因为当比较相应于SEQ IDNO：4的ORF 1a DNA序列的区域时它们共有88％或更高的核苷酸序列同一性。

因此，在一个优选实施方案中，本发明涉及本发明禽星状病毒，其特征在于所述禽星状病毒的ORF 1a包含与SEQ ID NO：4具有至少88％核苷酸序列同一性的区域。

更优选，本发明涉及本发明禽星状病毒，其特征在于所述禽星状病毒的ORF 1a包含与SEQ ID NO：4具有至少89％的核苷酸序列同一性，甚至更优选90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的区域(按照偏好顺序)。

SEQ ID NO：4之后，SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22、24和26中描述的部分ORF 1a核苷酸序列中的任一个可用于在另外的优选实施方案中表征本发明禽星状病毒。

类似于表2中所示的来自ORF 1a的核苷酸序列的多重比对，可对来自表2的经裁剪的核酸序列SEQ ID NO：4、10、12、14、16、18、20、22、24和26的推定氨基酸序列进行比对。所得的氨基酸序列(通过计算机翻译)在本文中表示为SEQ ID NO：5、11、13、15、17、19、21、23、25和27。参照序列是SEQ ID NO：5(分离株19的ORF 1a的部分的推定氨基酸序列)。也使用Align+程序，通过在SEQ ID NO：5的全长范围内进行排列来进行比对。结果示于表3中。

表3：SEQ ID NO：5(为来自分离株19的ORF 1a的部分的翻译)与来自本发明禽星状病毒的其他分离株以及来自ANV1和TAstV2的ORF 1a的相应部分的序列之间的氨基酸序列同一性百分比列表。

详细的氨基酸比对示于图2中。

该氨基酸序列分析的结果显示了与表2中的结果相当的结果：来自本发明禽星状病毒分离株的氨基酸序列在它们自己之间的相关性比与其他禽星状病毒相比时更高。本发明禽星状病毒不同分离株的氨基酸序列与SEQ ID NO：5的同一性百分比在93％至99％之间，然而与ANV1的同一性百分比较低，为88％。

因此，在一个优选实施方案中，本发明涉及本发明禽星状病毒，其特征在于所述禽星状病毒的ORF 1a编码包含与SEQ ID NO：5具有至少93％氨基酸序列同一性的区域的氨基酸序列。

更优选，本发明涉及本发明禽星状病毒，其特征在于所述禽星状病毒的ORF 1a编码包含与SEQ ID NO：5具有至少94％的氨基酸序列同一性，甚至更优选95、96、97、98、99或100％的同一性(以此偏好顺序)的区域的氨基酸序列。

在SEQ ID NO：5之后，SEQ ID NO：11、13、15、17、19、21、23、25和27中描述的推定翻译的核苷酸序列的部分ORF 1a中的任一个可用于在另外的优选实施方案中表征本发明禽星状病毒。

除了核苷酸测序和比对外，还可通过使用PCR测试检测ANV1的ORF 1a中不存在的12个核苷酸在禽星状病毒的ORF 1a区域中的存在，在例如在患有肠或动运疾病的禽类的样品中鉴定本发明禽星状病毒的阳性遗传标记。

因此，在另外一个优选实施方案中，本发明禽星状病毒的特征在于可使用SEQ ID NO：30和31中所示的一组引物在PCR测定中从所述禽星状病毒的ORF 1a产生大约260个核苷酸的PCR产物。

待使用的PCR引物是：

SEQ ID NO：30：5′-GTY CTY ACC GAR GAR GAR TAY C-3′

SEQ ID NO：31：5′-AAD GTT ATY CTC CTA RGB TKH C-3′

本发明者分别将这些引物称为引物29和30。

这些引物与相应于ANV1(SEQ ID NO：1)核苷酸编号2252并且正向延伸的核苷酸杂交，和与相应于核苷酸编号2499并且反向延伸的核苷酸杂交。产生的PCR产物在凝胶上可见为大约260个核苷酸(其包括引物本身的长度)的条带。该条带只在起始材料包含含有本发明禽星状病毒的ORF 1a区域的DNA时才产生，因为只有这些序列包含ANV1ORF 1a中不存在的这12个核苷酸。与该12个核苷酸的区域的位置相对的引物SEQ ID NO：30和31特异性结合的图示示于图4中。

在这样的PCR测定中，由所使用的特异性PCR引物，特别地由引物的序列和长度确定特异度和灵敏度。可通过改变反应和循环条件，例如反应步骤的温度和持续时间，来获得选择性和灵敏度的最佳化，这对于本领域技术人员来说是熟知的。

在标准教科书如Sambrook&Russell：″Molecular cloning：alaboratory manual″(2001，Cold Spring Harbour Laboratory Press；ISBN：0879695773)；Ausubel等人，in：Current Protocols inMolecular Biology(J.Wiley和Sons Inc，NY，2003，ISBN：047150338X)；C.Dieffenbach&G.Dveksler：″PCR primers：alaboratory manual″(CSHL Press，ISBN 0879696540)；和″PCRprotocols″，by：J.Bartlett和D.Stirling(Humana press，ISBN：0896036421)中详尽地解释了此类和其他分子生物学技术。

方便地，将使用引物SEQ ID NO：30和31的PCR反应与产生cDNA所需的RT反应组合，并且在所述RT反应之后直接进行组合的测定法构成RT-PCR测定，如实施例中所描述的。

所述RT-PCR测定已由本发明者用于许多样品：对于本发明新型禽星状病毒的分离株的样品，获得阳性结果；“阳性”PCR结果是在电泳后，与适当的阳性和阴性对照样品相比较，显现有大约260个碱基对的反应产物。然而，在使用引物SEQ ID NO：30和31的PCR中，相符地发现从相关禽星状病毒ANV1和鸡星状病毒2(CAstV2)制备的RT-PCR样品为阴性。

这样的PCR测试结果的实例示于图5中，该图显示溴化乙锭染色的、紫外光照射的琼脂糖凝胶(在该凝胶上对使用引物SEQ ID NO：30和31的PCR的PCR产物进行了电泳)的照片。只有分离株19的样品反应呈阳性，包含ANV1或CAstV2的样品如阴性对照一样呈阴性。

令人惊讶地，在使用本发明禽星状病毒感染和孵育禽类胚胎蛋后观察到高度显著和惊人的病理学效应：受累胚显示腿和翼尖的鲜红色染色。这在之前从未被观察到或描述过。此外，已感染的胚显示其他的但不太明显的特征：普遍化的淡红色染色、腹部水肿以及相当肿胀并且已转变成暗红色/紫色的肝。

在SPF鸡胚蛋感染后大约2至7天观察到该特定的病状，并且取决于接种的病毒滴度，该病状几乎总是导致胚胎死亡。

为了进行比较，使用相似的检测条件，同时进行ANV1至胚胎蛋中的接种。ANV1也诱导肝的肿胀，但在该情况下肝在颜色上甚至更暗，胚胎的总体颜色是暗红色。然而，ANV1从不诱导对于本发明禽星状病毒的分离株所看到的腿和翼尖的特殊鲜红色着色。

因此，在另外的优选实施方案中，本发明禽星状病毒的特征在于其能够在接种入大约5至7天龄的SPF鸡胚蛋，然后孵育2至7天(或当适当时甚至更长时间)后诱导鸡胚的腿和翼尖的红色着色。

如所描述的，SPF鸡胚蛋和用于它们的孵育的装置可商购获得。通常，在大约35-39℃下于潮湿气氛的孵卵器中进行鸡胚蛋的孵育。

可通过任何方便的途径例如CAM、卵黄囊或尿囊途径进行接种。

如本领域技术人员将理解的，可能在偶然的情况(例如接种的病毒量极低(不允许病毒的“占领(take)”)或极高(在着色可发生之前引起死亡)的情况下；或其中胚胎的质量不足以允许病毒复制)下不能看到腿和翼尖的特殊鲜红色着色。一般地，可在大约10至大约10^6EID50/蛋(EID50＝半数蛋感染剂量)的接种后观察到特珠的鲜红色着色。

进一步纯化和扩增本发明禽星状病毒的一个特定的分离株(称为分离株19)以用作参照样品并且将其保藏。通过在鸡胚肝(CEL)细胞上进行有限稀释来纯化该分离株。每一次将仍然在CEL细胞上诱导细胞病变效应(cpe)的最高稀释物传代。然后通过在SPF鸡胚蛋的尿囊腔中进行三轮病毒扩增来扩增该纯化的病毒。收获尿囊液并且将其冷冻贮存。在SPF鸡胚蛋上滴定该纯化的病毒，发现其具有6.1Log10EID50/ml的滴度。将该材料在标准稳定剂缓冲液中冷冻干燥，然后于-20℃下贮存。确认无菌。然后将该病毒的样品于2008年1月23日以保藏号CNCM I-3895保藏在法国巴黎的巴斯德研究所“国家微生物菌种保藏中心”(CNCM)。

因此，在一个进一步优选的实施方案中，本发明禽星状病毒是以编号CNCM I-3895保藏在法国巴黎的巴斯德研究所国家微生物菌种保藏中心(CNCM)的病毒。

尽管经纯化、扩增和保藏的样品是称为“分离株19”的分离株，然而，表1中描述的本发明禽星状病毒分离株中的任一个均可用作本发明新型禽星状病毒组群的参照样品。

为了进行本发明禽星状病毒的体外培养和检测，可使用几个培养***：例如可有利地使用(禽)细胞系，例如原代细胞如CEL或鸡胚肾(CEK)细胞。从SPF鸡胚蛋制备CEL或CEK细胞培养物对于本领域技术人员来说是熟知的。

特别地，CEK细胞非常适合于监控病毒生长以及测量病毒量和活力。即使本发明禽星状病毒在这些细胞上产生的细胞病变效应(cpe)是非典型的，但已感染的细胞可明显地显示为圆形细胞，其从单层卷起并且向细胞裂解方向发展。

因此可使用病毒样品的渐近稀释(progressive dilution)，然后对仍然产生cpe的最高病毒稀释物评分来设计病毒滴定测定法。然后可将病毒滴度表示为每毫升的半数组织培养物感染剂量(TCID50)，如通过Spearman-Karber法(描述于：D.Finney：Statistical methodin biological assay，C.Griffin&Co.，Londen，ISBN 0195205677中)计算的。此类技术对于本领域技术人员都是熟知的。

这样，可将病毒培养在组织培养瓶或微量滴定板中以进行许多检测和目的。通常在用于病毒检测或滴定之前通过在此类细胞上进行少数几次传代来使从野外分离的病毒首先适应细胞体外培养是有益的。

备选地，可在鸡胚蛋，优选SPF鸡胚蛋中进行检测和滴定。例如，可通过将不断稀释的病毒样品接种入6天龄的SPF鸡胚蛋的卵黄囊中来进行病毒滴定。在对感染或死亡的胚胎数目评分后，可以例如使用Spearman-Karber法(同上)将所得的检测样品的滴度以每毫升的EID50表示。

对于保藏的病毒，在实验室条件下在许多实验性受试鸡中确认其引起孵化的鸡和火鸡的病理的能力。通过多个途径：肌内、口服和经眼途径进行接种。几只已接种的鸡发生严重的病征，然而模拟物感染的鸡无症状。观察到的症状是死亡、总体萎靡(general depression)以及中度至严重的腹泻。通过组织病理学观察到肾炎和肠炎。然而未观察到腿或关节的疾病，然而这些疾病并不是预期会有，因为用于这些实验的鸡太幼小(3-6周)和/或不够重(产蛋型SPF鸡)，不会表现此类问题。

在保藏的病毒当中，在本文中提供了该基因组的另外区域的核苷酸序列用于进一步表征：ORF 1b和ORF 2。各自的核苷酸和推定的氨基酸序列在本文中表示为SEQ ID NO：5-8，参见表1。

用于确定此类额外的核苷酸序列的不同引物在本文中表示为SEQID NO：32-34，并且描述于表4中；为方便起见，该表还包括本文中描述的其他PCR-和测序引物。

表4：本文中描述的PCR-和测序引物的描述

AAstV＝禽星状病毒；rev＝反向；fwd＝正向

使用保藏的病毒样品作为参照，提供本发明禽星状病毒的额外表征的另一种方法是通过血清分型，优选通过使用VN-或IFT-测定确定其免疫学特征。

在所有检测中，新型禽星状病毒证实在免疫学上与其他禽病毒不同，因为其不能被特异于许多其他禽病毒(呼肠孤病毒、鸡腺病毒(1、2、4、5和8型)、传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、传染性腔上囊病病毒、禽肠道病毒(分离株1821/9和FP3)、减蛋综合征和禽流感病毒)的抗体中和以及不能被所述抗体特异性结合。对于特异于禽星状病毒ANV1或CAstV2的抗体情况也是这样，然而这些血清确实有效地中和它们的供体病毒：ANV1和CAstV2(分别达到1∶640或1∶10240的稀释度)。

然而，保藏的分离株19病毒的样品被在使用分离株19病毒实验性感染的SPF鸡中产生的针对分离株19的鸡抗血清有效地且选择性地中和。在提供加强接种后，可获得特异性抗血清。在该测定中用于病中和作用的读出结果是中和作用对胚胎病状的预防。

其中特异性抗体只识别和中和本发明禽星状病毒的免疫实验的结果证明此类病毒属于新型和独特的病毒血清型。

可在例如另外的优选实施方案中实施该实验，其中本发明禽星状病毒的特征在于所述禽星状病毒可在病毒中和测定中被针对以编号CNCM I-3895保藏在法国巴黎的巴斯德研究所国家微生物菌种保藏中心(CNCM)的星状病毒样品的抗体所中和。

使用本发明保藏病毒产生抗体的备选方法也是可能的。例如，就作为(来源于)本发明禽星状病毒而待检查的病毒样品本身可以被用于诱导抗体，然后可反过来就它们结合或甚至中和本发明禽星状病毒的能力检测所述抗体。方便地可在本发明保藏病毒的样品上检测此类抗体。

为此目的，可将检测病毒或其部分或制剂接种入动物。用于产生此类抗体的动物原则上可以是任何动物，但优选使用小鼠、大鼠、兔、仓鼠、山羊或鸡。可以例如方便地通过从CNCM订购本发明保藏病毒的样品，测试以此方式产生的抗体对本发明禽星状病毒的结合或中和作用。可以例如在蛋、CEK或CEL细胞或其他底物上培养该病毒，最后将其与使用受试病毒样品产生的抗体一起孵育。可以例如通过IFT或VN测定进行抗体结合的检测。

这从而构成了用于鉴定和表征活病毒或灭活病毒或者其部分或制剂是或来源于本发明禽星状病毒的方法。

因此，在另外的优选实施方案中，本发明提供了本发明禽星状病毒，其特征在于所述病毒能够诱导可在VN测定中中和本发明的保藏星状病毒的样品的抗体。

用于建立VN测定的方案在本领域内是熟知的，并且在本领域技术人员的一般能力范围内。上文中描述了用于VN测定的优选方面和细节。

如根据使用特异于本发明禽星状病毒的抗体的免疫测定的结果所表明的，本发明还提供了可结合和可中和本发明禽星状病毒的抗体。

因此，本发明的又一方面是可在病毒中和测定中中和本发明禽星状病毒的抗体或其片段。

可以以对于本领域技术人员来说都是熟知和可获得的许多方法获得和产生本发明此类抗体。例如可如上所述通过(重复的)接种在实验动物中产生抗体。

备选地，可如在杂交瘤技术中那样通过永生化B淋巴细胞来产生抗体。对经典杂交瘤技术的现代改进(例如通过在融合之前增加期望的脾细胞的量，通过阳性选择(淘选)，然后在使用细胞因子混合物的培养物中扩增)已使该技术更有效率和多产。此外，还通过将经典的多聚乙醇融合改变成电融合来改进融合技术。

在另外的备选方法中，可通过使用分子生物学技术和在重组表达***中的表达来获得抗体。分子生物学技术允许改造此类抗体以使之更好地匹配来自待处理的靶物种的抗体的标识特征，或设计拥有两个具有不同特异性的结合区域的抗体。表达***的开发允许建立高容量表达***，例如在植物中的表达。

重组表达***在本领域内也是熟知的，并且例如使用：细菌(例如，大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)、芽孢杆菌(Bacillus)、柄杆菌(Caulobacter)等、酵母(例如酵母菌(Saccharomyces))、昆虫(斜纹夜蛾、粉纹夜蛾(Trichoplusia))、哺乳动物(例如，中国仓鼠卵巢)或植物(烟草、马铃薯等)细胞。可用具有待表达异源序列的表达构建体转化此类细胞。此外，使用包含待表达核酸的重组微生物的重组***也是已知的，可将该微生物在体外培养于细胞上以便以期望的规模产生期望的蛋白质。一个实例是杆状病毒/昆虫细胞表达***。最后，所谓的无细胞表达***可商购获得用于合适的重组DNA分子的无细胞表达。

术语“抗体或其片段”旨在表示完整的免疫球蛋白分子或其部分都被认为在本发明抗体的范围内。本发明抗体的片段是仍然可结合本发明禽星状病毒的表位的蛋白质分子。实例是在本领域内全都是熟知的FAB、scFv、Fv、dAb或Fd片段。

可通过例如化学或酶促消化从完整抗体获得此类片段。备选地，此类片段可以例如从重组表达***例如噬菌体展示***获得。

如本领域技术人员熟知的，抗体或其片段对病毒的结合包括对病毒颗粒上的表位的识别。最常见地，这些表位是由病毒颗粒上展示的分子的线性或三维构象形成。因此，病毒或其部分的制剂可被本发明的抗体或其片段结合，只要这些制剂或部分仍然包含和以正确的形式提供正确的表位即可。在本发明禽星状病毒的情况下，最主要地呈递给免疫***的病毒蛋白是从ORF 2编码的衣壳蛋白。

本领域技术人员也将理解，当通过接种动物产生本发明抗体时，获得的动物血清是多克隆抗血清，意指该抗血清包含可结合许多种表位的抗体的混合物。实际上，这提供了多种相互作用，其允许病毒蛋白的制剂或片段的高效结合，即使这些病毒蛋白可能不具有或可能不正确地提供通常可在完整的活病毒颗粒上获得的所有表位。

备选地，本发明抗体可以是单克隆抗体，例如通过杂交瘤技术产生的抗体，或本发明抗体可以是抗体片段例如Fab片段。在该情况下，抗体或片段具有大大降低的识别不同表位的能力，因为其通常将只特异性结合单个表位。因此，当该特定表位不存在或未展示在病毒片段或制剂上时，其可能根本不被这样的单克隆抗体或抗体片段结合。

可以以许多方式使用本发明抗体，例如用于表征本发明禽星状病毒，用于诊断，用于治疗和/或用于质量保证目的。

本发明提供了以工业规模进行本发明禽星状病毒的生产。这可通过在体内或体外***中在宿主细胞上培养所述病毒来实现。体外***包括原代或永生化的细胞系。原代细胞的实例是CEK或CEL细胞。永生化的细胞系的实例是LMH细胞系(Kawaguchi等人，Cancer Res.，第47卷，p.4460-4464)。体内***的实例是在禽类胚胎蛋或接种的禽类中进行的培养。特别地，可方便地按比例放大在细胞或蛋上的培养；例如可将细胞培养物保持在不同大小的容器例如培养瓶、转瓶或甚至发酵罐中。用于任何规模的细胞培养技术的技术和设备是熟知的并且可容易地从商业提供商获得。

因此本发明在另外的方面提供了用本发明禽星状病毒感染的宿主细胞。

此外，本发明还提供了产生本发明禽星状病毒的方法，包括在适当的***中增殖本发明禽星状病毒和收获病毒材料。

本文中描述的本发明禽星状病毒的表征不仅指以完整的复制型形式存在的这样的禽星状病毒。如本领域技术人员将理解的，本发明提供了以许多不同形式存在的该病毒的制剂。此类制剂包括例如其中本发明禽星状病毒已被灭活的制剂，或其中这样的病毒已通过一种或多种方式(通过(生物)化学或物理方式)，例如通过提取、裂解、消化、匀浆或超声处理进行分级分离的制剂。

用于灭活病毒的方法是熟知的，例如包括化学或物理灭活，例如使用***、β-乙醇胺或β-丙内酯的灭活；此外还有加热或使用紫外光、X射线的辐照或放射性辐射。

用于分级分离的方法是众所周知的，例如使用去垢剂例如

-100的提取或裂解；使用胰蛋白酶的消化；使用冷冻-解冻或弗细胞压碎器的匀浆；或使用超声的超声处理。

用于此类制剂的起始材料可以是纯化的(活的或灭活的)本发明禽星状病毒，还可以是本发明宿主细胞或包含本发明宿主细胞或禽星状病毒的细胞培养物或其部分。例如这样的培养物的部分可以是经离心的培养物的上清液或沉淀。很明显，此类细胞培养物或其部分本身可转变成制剂例如所描述的提取物、裂解物、消化产物、匀浆物或经超声处理的物质。

这样的本发明禽星状病毒的制剂包含本发明禽星状病毒的一个或多个抗原和表位。

因此在另一方面，本发明涉及可从本发明禽星状病毒获得的抗原性制剂。

本发明抗原性制剂可被本发明抗体或其部分结合，或其本身可用于诱导抗体或其部分的结合或中和。有利地可将这用于疫苗和诊断剂，如将在下文中描述的。

本发明抗原性制剂是例如来自本发明禽星状病毒的蛋白质或此类蛋白质的部分。此类蛋白质或其部分可通过从这样的病毒分离来获得。然而，还可方便地使用来自本发明禽星状病毒的核酸，通过重组DNA表达技术来产生此类蛋白质或其部分。例如，可使用如SEQ ID NO：4、10、12、14、16、18、20、22、24或26的任一个中描述的ORF 1a区域的部分的核酸序列；如所描述的，此类cDNA序列是相关的，因为它们与SEQ ID NO：4具有至少88％的核苷酸序列同一性。

因此本发明在另一个方面提供了包含与SEQ ID NO：4具有至少88％核苷酸序列同一性的区域的DNA分子。

此外，还可使用SEQ ID NO：6或8中描述的ORF 1b或ORF 2的核酸。

可使用本领域内熟知的重组DNA技术，例如通过亚克隆入重组DNA分子以进行进一步操作来克隆和表达此类核酸序列和cDNA片段。重组DNA分子可以是载体例如细菌质粒。优选将来自本发明禽星状病毒的核酸可操作地连接至表达控制序列，例如启动子，从而允许其在适当的宿主细胞或表达***中表达。备选地，可将所述核酸、cDNA或重组DNA分子引入活的重组载体微生物例如细菌或病毒。

类比地，基于SEQ ID NO：5、11、13、15、17、19、21、23、25和27中描述的推定氨基酸序列和它们的亲缘关系，本发明在另一个方面提供了包含与SEQ ID NO：5具有至少93％氨基酸序列同一性的区域的蛋白质。

这些实施方案在疫苗和诊断剂的应用中具有巨大的实用和有利的功用，如将在下文中描述的。

可从活的或灭活的微生物病原体例如病毒或者从此类微生物的片段制备疫苗。通常通过在细胞、器官或组织、胚胎蛋上或宿主动物中培养，以或大或小的量工业化生产此类微生物。在收获包含所述微生物的上清液后，将该上清液配制成疫苗，然后包装终产物。在就质量、数量和无菌度进行广泛的检测后，此类疫苗产品被准予销售。

疫苗学中的一般技术和考虑的问题在本领域内是熟知的，并且描述于例如政府规定和手册中，例如：″Veterinary vaccinology″(P.Pastoret等人ed.，1997，Elsevier，Amsterdam，ISBN：0444819681)，和：″Remington：the science and practice of pharmacy″(2000，Lippincot，USA，ISBN：683306472)中。

在本领域中普通知晓疫苗代表包含免疫原性化合物(于药学上可接受的载体中)的药物组合物。该免疫原性化合物是能够诱导靶免疫***激活的活的或灭活的微生物或其亚单位。

令人惊讶地，发现本发明禽星状病毒和抗原性制剂、宿主细胞、抗体、核酸、蛋白质以及用于它们的制备、培养、鉴定和定量的方法可用于疫苗和用于诊断目的。此类疫苗用于保护靶动物免受禽星状病毒的感染，或减少所述病毒的复制或减轻其引起的疾病的症状。此类诊断测定允许检测例如动物野外样品或病毒制剂中的病毒或其抗原。

组合疫苗和诊断剂允许鉴定由本发明禽星状病毒引起的感染和/或疾病和抵抗所述感染和/或疾病。

疫苗能力通过所述动物实验来证明，在所述实验中用本发明禽星状病毒接种鸡。这导致高度特异的抗体的产生。此外，此类抗体经证明能够特异性中和本发明禽星状病毒。如在本领域内熟知的，中和抗体的诱导是有效的免疫保护性疫苗可供利用的重要步骤。

受试动物的重复接种不仅提高了产生的抗体水平，而且还用作在试验中可被许多禽类耐受和克服的攻击性感染。

因此可将本发明禽星状病毒或其部分配制在适当的药物组合物中和作为疫苗用于禽类。

进一步优化该疫苗(例如通过细调疫苗的功效和安全性以使其在可接受的接种反应水平上提供足够的保护作用)在本领域内技术人员可达到的能力范围内。这可通过改变疫苗剂量或通过以另一种形式或制剂使用疫苗或通过改变疫苗中的其它成分(例如稳定剂或佐剂)或通过经不同途径施用来进行。

用于本发明的疫苗的熟知变体例如可使用以活的或灭活的形式存在的新型禽星状病毒；当使用本发明抗原性制剂和/或蛋白质时，可以是亚单位疫苗；当使用本发明抗体或其片段时，可以是被动疫苗(passive vaccine)的形式；或当使用本发明DNA分子时，可以以DNA疫苗的形式存在。

因此本发明的另一个方面提供了疫苗，所述疫苗包含本发明禽星状病毒、抗体或其片段、抗原性制剂、DNA分子或蛋白质以及药学上可接受的载体。

类似地，本发明在另外一些方面涉及用于家禽疫苗的化合物或组合物，其中所述化合物或组合物是本发明禽星状病毒、抗体或其片段、抗原性制剂、DNA分子或蛋白质。

在另外的方面，本发明涉及化合物或组合物用于制造家禽的疫苗的用途，其中所述化合物或组合物是本发明禽星状病毒、抗体或其片段、抗原性制剂、DNA分子或蛋白质。

在另外的方面，本发明涉及用于制造用于家禽疫苗的方法，其中将化合物或组合物与适当的药物载体混合，并且其中所述化合物或组合物是全都根据本发明的禽星状病毒、抗体或其片段、抗原性制剂、DNA分子或蛋白质。

“药学上可接受的载体”可以是例如适合于该目的的无菌水、生理盐溶液或缓冲液。在更复杂的形式中，载体本身可包含其他化合物例如佐剂、另外的抗原、细胞因子等。

本发明疫苗可用于预防性和治疗性治疗。

术语“疫苗”意指免疫有效量的本发明禽星状病毒的存在以及药学可接受的载体的存在。

组成本发明疫苗的“免疫有效量”的物质取决于期望的效果和禽星状病毒和靶生物的特征。有效量的确定完全在常规专业人员的能力之内，例如可通过与在未接种的动物中看到的反应相比较，监控接种后或攻击性感染后的免疫反应，例如通过监控靶的临床病征、血清学参数，或通过病原体的再分离，来进行。

极高量的本发明禽星状病毒、抗原性制剂、抗体或其片段、DNA分子或蛋白质在疫苗中的使用尽管在免疫学上非常有效，但仍将因商业原因而不太吸引人。本发明疫苗中包含的本发明此类化合物或组合物任一种的优选量为疫苗终体积的0.1％至90％。更优选，所述量以偏好顺序为1至50％、1至25％和1至10％。

在灭活疫苗或亚单位疫苗的情况下，本发明化合物或组合物可以以ELISA单位表示。有效的ELISA单位的量需要相对于产生一定功效的标准化样品的Elisa单位来确定。

在本发明活疫苗的情况下，取决于采用何种方法可方便定量禽星状病毒疫苗剂量，可使用pfu(噬斑形成单位)、cfu(菌落形成单位)、TCID50、EID50或ELD50(半数胚胎致死剂量)的量。例如可有利地使用在1至10^6EID50/剂疫苗的范围、优选10至10^5EID50/剂、更优选10^2至10^4EID50/剂的范围内的活禽星状病毒疫苗剂量。

在一个优选实施方案中，本发明涉及其中本发明禽星状病毒以活的形式存在的本发明疫苗。

活疫苗一般具有只需要极少接种物的有利特性，因为该微生物本身可复制。此外，活疫苗通常还通常诱导可靠且有效的具有足够免疫记忆的免疫反应。

如本领域中已知的，可以以减毒活疫苗的形式方便地应用活疫苗，这意味者疫苗病毒具有与原始病毒分离株相比较有所减少的毒性或致病性。用于病毒减毒的方法在本领域内是熟知，其包括例如：通过动物或经历细胞培养物连续传代；化学减毒；或通过分子生物学技术进行的减毒。

在一个备选的优选实施方案中，本发明涉及其中本发明禽星状病毒被灭活的本发明疫苗。

用于病毒灭活的方法和材料已在上文中进行了描述。此类灭活疫苗通常具有比活疫苗更安全的有利方面，因为它们不会使宿主暴露于任何潜在致病的复制型活禽星状病毒。

在另外一个优选实施方案中，本发明疫苗额外地包含佐剂。

佐剂是以非特异性方式增强宿主的免疫反应的免疫刺激物。许多不同的佐剂在本领域内是已知的。经常使用的佐剂的实例是胞壁酰二肽、脂多糖、几种葡聚糖或聚糖(glycan)、

氢氧化铝(Al(OH)₃)。可将此类佐剂与不同的乳液例如油包水(w/o)乳液、o/w乳液和w/o/w双重乳液组合。适合用于油性乳液的油性佐剂是例如矿物油或可代谢的油。矿物油是例如

和

可代谢的油是例如植物油，例如花生油和大豆油，或动物油例如鱼油角鲨烯。备选地，可有利地使用EP 382,271中描述的维生素E(生育酚)溶解化物(solubilisate)。

非常适合的o/w乳液是例如由5-50％w/w的水相和95-50％w/w的油佐剂起始而获得的，更优选使用20-50％w/w的水相和80-50％w/w的油佐剂。

加入的佐剂的量取决于佐剂本身的性质和关于由制造商提供的这样的量的信息。

然而通常的做法是将佐剂与灭活疫苗组合使用，几种活疫苗已显示包含佐剂也有好处。因此此实施方案也在本发明的范围内。

在另外的优选实施方案中，本发明疫苗额外地包含稳定剂。

可向本发明疫苗中加入稳定剂，以便例如保护其免受降解，增强贮存期限，或提高冷冻干燥效率。有用的稳定剂是例如i.a.SPGA(Bovarnik等人，1950，J.Bacteriology，第59卷，p.509)、脱脂奶、明胶、牛血清白蛋白、碳水化合物例如山梨醇、甘露醇、海藻糖、淀粉、蔗糖、葡聚糖或葡萄糖、蛋白质例如白蛋白或酪蛋白或其降解产物、缓冲剂例如碱金属磷酸盐和多胺例如精胺。

还可加入防腐剂例，如水杨乙汞(thimerosal)、硫柳汞(merthiolate)或庆大霉素。

此外，疫苗可包含一种或多种合适的表面活性化合物或乳化剂例如

或

疫苗还可包含所谓的“媒介物(vehicle)”。媒介物是本发明多肽或蛋白质附着至其而不与其共价结合的化合物。此类媒介物是例如本领域内全都已知的生物微胶囊(bio-microcapsule)、微藻酸盐(micro-alginate)、脂质体和大分子物(macrosol)。这样的媒介物的特定形式是免疫刺激复合物(immune stimulatory complex，ISCOM)。

不用说，将其他稳定剂、载体、稀释剂、乳液等与本发明疫苗混合也在本发明的范围内。此类添加剂描述于熟知的手册例如：″Remington″和″Veterinary Vaccinology″(两者同上)中。

将本发明疫苗配制为组合疫苗将会非常高效，因为这样可一次施用多种免疫药剂，从而减少时间和人工成本，以及减少被接种的靶动物的不舒适感。

可通过将本发明疫苗与另一种抗原性化合物例如(活的或灭活的)病毒、细菌、寄生虫或其部分例如蛋白质、碳水化合物或能够编码抗原的核酸组合来获得此类组合疫苗。由于本发明疫苗旨在用于禽类靶动物，因为有利地将其与作为或来源于其他家禽病原体的另外的抗原组合。

因此，在另外的优选实施方案中，本发明疫苗包含至少一种可从家禽的致病微生物获得的另外的抗原。

许多禽病原体是已知的，然而一些更相关的兽医-经济病原体是：

-病毒：传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、禽流感病毒、腺病毒、减蛋综合征病毒、传染性腔上囊病病毒(即盖姆波罗病毒(Gumborovirus))、鸡贫血病毒、禽脑脊髓炎病毒(Avianencephalo-myelitis virus)、鸡痘病毒、火鸡鼻气管炎病毒、鸭疫病毒(Duck plague virus)(鸭病毒性肠炎)、鸽痘病毒、Marek氏病、禽类白血病病毒(Avian Leucosis virus)、传染性喉气管炎病毒、禽肺病毒和呼肠孤病毒；

-细菌：大肠杆菌、沙门氏菌(Salmonella spec.)、鼻气管鸟杆菌(Ornitobacterium rhinitracheale)、副鸡嗜血杆菌(Haemophilis paragallinarum)、多杀巴斯德菌(Pasteurellamultocida)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、Erysipelas spec.、支原体(Mycoplasma spec.)和梭菌(Clostridiumspec.)；

-寄生虫：艾美耳球虫(Eimeria)；

-真菌：例如曲霉菌(Aspergillus)等。

还可想象的是两种或更多种本发明禽星状病毒在本发明疫苗中的组合(例如以形成更广泛有效地抗本发明禽星状病毒的变体的组合疫苗)。可用于形成组合疫苗的禽星状病毒的实例是表1中所述的分离株。

本发明疫苗可采取适合于给家禽施用和匹配期望的施用途径和期望的效果的任何形式。

通过对于本领域技术人员来说是熟知的方法进行本发明疫苗的制备。优选以适合于注射的形式(例如悬浮液、溶液、分散体、乳液等)配制本发明疫苗。通常将此类疫苗制备为无菌的。

可使用在本领域内已知的许多施用方法。优选通过注射施用灭活的本发明疫苗；优选通过大量施用(例如通过饲养、喷雾或饮水)的方法施用活疫苗。

理想地将用于本发明疫苗的施用的方案整合入现有的其他疫苗的接种程序。

本发明疫苗的优选靶是禽类动物。更优选靶选自鸡、火鸡、鸭子和鹅。最优选靶是鸡。

对靶生物施用本发明疫苗的给药方案可以是以与疫苗的制剂相容的方式和以将为免疫有效的量进行的单次剂量或多剂量(可同时或相继提供的)给药。

待接种的禽类靶的年龄、体重、性别、免疫状态和其他参数不是至关重要的，尽管接种健康的靶明显是有利的，并且尽早接种以预防野外感染。例如可因此在孵化的当天，或甚至更早(然而在孵化前3-4天仍然在卵内)接种家禽；例如在胚胎发育(ED)的第18天(对于鸡)和在ED的第24天(对于火鸡)接种家禽。

由于稳定性或经济原因，可冷冻干燥本发明疫苗。通常这将使得能够在高于0℃的温度下，例如4℃下延长贮存。用于冷冻干燥的方法对于本领域内的技术人员来说是已知的，用于在不同的规模上冷冻干燥的设备是可商购获得的。

因此，在一个优选实施方案中，本发明疫苗以冷冻干燥的形式存在。

为了重建冷冻干燥的疫苗组合物，将其悬浮于生理上可接受的稀释剂中。这样的稀释剂可以例如简单如无菌水或生理盐溶液例如(磷酸盐缓冲的)盐溶液，或稀释剂还可包含辅助化合物(adjuvatingcompound)例如生育酚，如EP 382,271所描述的。在更复杂的形式中，可将冷冻干燥的疫苗悬浮于乳液中，例如EP 1,140,152中所描述的。

因此在另外的优选实施方案中，本发明涉及可通过重建本发明冷冻干燥的疫苗获得的疫苗组合物。

除了本发明化合物和组合物在疫苗中的各种用途外，此类化合物和组合物还可有利地用于诊断剂中，以在例如动物野外样品或病毒制剂中检测本发明病毒或其抗原或核酸。

这也可通过利用上述的IFT和VN测定进行的血清分型实验的结果来证明，其中将抗保藏的本发明禽星状病毒的抗血清用于区分落在本发明范围内的病毒(表1中描述的分离株)与不在本发明范围内的病毒(ANV1、CAstV2、呼肠孤病毒等)。同样地，所描述的PCR实验证明了选择性鉴定本发明禽星状病毒的能力。

如本领域技术人员将理解的，这不仅适用于本发明抗体，而且还适用于本发明其他化合物和组合物。此类诊断测定例如使用本发明抗体或其片段检测抗原；或使用抗原(本发明病毒、抗原性制剂或蛋白质)检测抗其的抗体；或使用核酸(来自病毒的RNA或本发明DNA分子)建立杂交或PCR测定。

因此，在另外的一个方面，本发明涉及诊断试剂盒，其包含本发明禽星状病毒、抗原性制剂、抗体或其片段、DNA分子或蛋白质。

术语“诊断试剂盒”涉及与用于商业销售的包装相关的特征，例如包括全都以商业上可行的包装形式存在的许多用于进行诊断检测的组分和一次性用品(disposable)以及说明书。

这样的诊断试剂盒因此例如包括进行抗体ELISA所需的材料。在这样的检测中，例如用本发明禽星状病毒包被ELISA板的小孔以形成用于检测抗本发明禽星状病毒或其制剂或蛋白质的抗体的抗体ELISA试剂盒。在与测试样品一起温育后，向小孔中加入与测试样品的免疫球蛋白(如果存在的话)反应的标记抗体。然后颜色反应显示测试样品中特异性抗体的存在情况。

类似地，可设计抗原ELISA试剂盒，其包括例如用本发明病毒、抗原性制剂或蛋白质包被的微量滴定板。

此类免疫测定的设计可以变化。例如，免疫测定可基于竞争而非直接结合。此外，此类检测还可使用微粒或细胞材料而非装置的固体支持物。检测中形成的抗体-抗原复合物的检测可包括标记抗体的使用，其中标记可以是例如酶或荧光分子、化学发光分子、放射性分子或染料分子。

有利地，现可将本发明疫苗和诊断剂协作用于设计用于消除某个区域或动物群体中本发明禽星状病毒的方法。

附图说明：

图1：显示来自选择数目的本发明禽星状病毒分离株的ORF 1a部分的cDNA序列的多重比对。参照是来自分离株19的序列。外部参照物是ANV1参照病毒基因组的cDNA序列的相应部分(SEQ ID NO：1)。加框的区域标出了不存在于ANV1ORF 1a中的该12核苷酸区域。

图2：显示通过表1中所列cDNA序列的计算机翻译制备的推定氨基酸序列的多重比对。加框的区域标出了ANV1的ORF 1a所编码的蛋白质中并不存在的4个氨基酸。

图3：显示图1中所示的核苷酸序列比对的结果的树状图。

图4：提供了相对于本发明的禽星状病毒独特的该12核苷酸区域(以粗体标示的)的位置而言引物SEQ ID NO：30和31的杂交区域的图示。

图5：显示溴化乙锭染色的、紫外光照射的琼脂糖凝胶的照片，在所述凝胶上对使用引物SEQ ID NO：30和31对许多cDNA样品进行的PCR测定产物进行了电泳。只在泳道5中可清楚地看到预期的阳性PCR的产物，大约260个碱基对的条带。前期的RT反应是使用SEQ IDNO：3的引物进行的。

泳道1：阴性对照(在PCR反应中无cDNA)

泳道2：来自未感染的鸡的肝匀浆物

泳道3：ANV1；1991的德国分离析，进行1x CAM、4x卵黄囊扩增，收集尿囊液。

泳道4：CAstV2；来源于以编号CNCM I-2932保藏在CNCM的病毒，尿囊液。

泳道5：本发明禽星状病毒的分离株19，尿囊液

M：DNA大小标志物泳道：200、400、600、800、1000bp等处的条带。

本发明现将通过参考下列非限定性实施例来进一步描述。

实施例：

实施例1：以野外样品分离禽星状病毒：

已从荷兰和德国的不同农场从鸡和火鸡分离了本发明禽星状病毒的许多分离株。作为一个典型的实例，在此处详细地描述了样品编号161319(“分离株19”)的分离。

从荷兰农场的4只36周龄产蛋鸡的气管的汇合物分离出分离株19星状病毒，所述产蛋鸡显示饲料消耗的下降、蛋产量的下降和次级蛋(second grade egg)的增加。通常还遭受消化不良、腹泻和运动问题。

将4只鸡的气管的汇合组织(0.5-1.0g)与大约10ml“漂洗介质”(包含：500ml HBSS[Hank′s碱性盐溶液]+2ml苄基青霉素钠(1.000.000I.E/ml)+8ml链霉素(250mg/ml)+0,5ml两性霉素B(2.000μg/ml)+2ml NaHCO₃7.5％)混合，然后在2分钟的时间内使用stomacher匀浆。将悬浮液在2-8℃下2000xg离心15分钟。然后使用450nm过滤器过滤上清液。

将所得的流体接种入4个8至9天的SPF鸡胚蛋的尿囊腔(1ml/蛋)、4个5至6天的SPF鸡胚蛋的卵黄囊(1ml/蛋)和4个9天的SPF鸡胚蛋的CAM(0.5ml/蛋)，然后在36.5至38.5℃下于40至55％的湿度中温育。每天将鸡蛋进行对光检查。在接种一天内发生的胚胎死亡被认为是非特异性的。

卵黄囊接种的蛋的胚胎在接种后第7天不显示任何异常。尽管如此，收获卵黄液并且将其用于第2次传代。

将4ml来自第一代的收获卵黄液(1ml/蛋)与0.5ml“传代介质(passage medium)”(包含：HBSS 90ml+2ml苄基青霉素钠(1.000.000I.E/ml)+8ml链霉素(250mg/ml)+0,5ml两性霉素B(2.000g/ml)+2ml NaHCO₃7.5％)混合。以1ml/蛋将该混合物接种在5个5天的SPF鸡胚蛋中，然后在36.5至38.5℃和40至55％的湿度下进行温育。每天将蛋进行对光检查。

在接种后第6天，一个胚胎已死亡并且显示身体发红。在琼脂糖凝胶沉淀(AGP)测定中就呼肠孤病毒检测来自该蛋的尿囊液；其对于呼肠孤病毒是阴性的。

收获大约4至5ml的具有异常胚胎的该蛋的卵黄，然后以与第2次传代相同的方式将其用于进一步传代。

在第3次传代中，在接种后第5天，3个胚胎已死亡，并且其中2个显示身体发红。混合的尿囊液在AGP中对于呼肠孤病毒和1型腺病毒是阴性的。

在进一步的传代中，分离株的滴度增加，因为胚胎在接种后更早地死亡或显示症状。在第6和第7次传代后，腿和翼尖的典型的鲜红色染色变得明显。

相符地，尿囊液在HA或AGP检测中对于IBDV、呼肠孤病毒、腺病毒、NDV、AIV和IBV是阴性的。对于IBDV，PCR测定也是阴性的。

将收获的CAM和尿囊液在-80℃下冷冻贮存，并且用于进一步的表征。

实施例2：病毒RNA分离：

为了分离总病毒RNA，按照制造商的说明书，使用

ViralRNA mini试剂盒(QiaGen^TM)。简而言之：将140μl含有病毒的流体例如尿囊液或者组织-或胚胎匀浆物(通常以5-50％w/v的量)与之前制备的提取缓冲液和载体RNA混合。将该溶液在室温下温育10分钟。然后加入纯乙醇(96-100％)，混合，然后将混合物施加到QIAamp微型离心柱(于2ml收集管中)。将其以6000xg离心1分钟。弃去流出液(flow-through)。用含有纯乙醇的清洗缓冲液清洗柱子。最后用60μl洗脱缓冲液洗脱柱子。通常在RNA分离后直接通过RT反应产生cDNA。

通过标准琼脂糖/甲酰胺RNA凝胶电泳验证星状病毒RNA的存在。

实施例3：通过RT反应产生cDNA：

按照制造商的说明书，使用Amersham-Pharmacia^TMReady-To-

You-Prime First-Strand珠粒进行第一链cDNA合成。简而言之：将29μl来自总病毒RNA分离的洗脱RNA在65℃下变性10分钟，然后在冰上进行2分钟。将其加入至装有2个珠粒的管中，加入4μl 10μM引物17(SEQ ID NO：3)至33μl的终体积。将该溶液在室温下温育1分钟，然后通过小心地移液器抽吸来混合，在37℃下温育1小时。将cDNA在低于-20℃的温度下冷冻贮存直至进一步使用。

实施例4：PCR反应：

将PCR用于从RT反应产生的cDNA制备双链(ds)DNA。还将PCR用作诊断类型的检测测定法，以特异性鉴定本发明禽星状病毒是否存在于样品中。

PCR反应成分来自HT Biotechnolgy^TM Ltd.：以1x浓度使用的

缓冲液(10x浓度)；以1U/μl使用的Plus聚合酶(5U/μl)和以2mM使用的预混dNTP′s(10mM)。将这些物质在不含RNA酶的蒸馏水中混合。

使用的引物是表4中所列的引物。引物由Invitrogen^TM(荷兰)合成，以100μM的浓度在TE缓冲液(pH 8.0)中制备引物原液；工作液以10μM的稀释度直接使用。

为了进行标准PCR，使用下列成分：27μl蒸馏水(Aqua dest)、5μl 10x Supertaq Plus缓冲液；1μl(相当于1个单位)SupertaqPlus酶；5μl 2Mm dNTP混合物；正向引物和反向引物每一种各5l(以10μM)；和最终2μl的来自RT反应混合物的cDNA；达到50μl的总体积。

例如用于使用引物F-II和R-II-3(SEQ ID NO：28，29)扩增ORF1a或使用引物20和21(SEQ ID NO：32，33)扩增ORF 1b的典型反应条件是：

-在95℃下进行1分钟，

-40个循环：在94℃下进行30秒；在48℃下进行1分钟；和在72℃下进行40秒，

-在72℃下进行10分钟

-保持在20℃下。

NB：所有PCR温度都是±大约1℃

在最优化过程中，可使用一些变化：45个而非40个循环，和循环步骤中退火温度和时间的变化：以30秒或1分钟的持续时间使用46至53℃的温度。

为了特异性检测本发明禽星状病毒，使用引物29和30(SEQ ID NO：30，31)，用于循环相的最适宜条件是：45个循环，使用在51℃下进行30秒的退火步骤。其它条件与引物20/21反应的条件一样。

用于循环测序反应的PCR条件具有根本不同的设置：25个循环：在96℃下进行10秒；在50℃下进行5秒；和在60℃下进行2分钟，参见下文。

实施例5：通过琼脂糖凝胶电泳、纯化和亚克隆进行DNA分析：

将琼脂糖凝胶电泳用于检测和显现产生的PCR产物。此外还采用电泳通过切割和提取来纯化PCR产物，从而用于此类分离PCR产物的测序或亚克隆。

简而言之，在TAE缓冲液(pH 8.0)中配制0.8％的琼脂糖(低内渗类型)凝胶，其中每100ml琼脂糖溶液含有大约50μl的0.5mg/ml溴化乙锭溶液。将PCR产物的样品以1∶10与标准样品上样缓冲液(甘油/SDS//溴酚蓝)混合。通常还包括标志物泳道，使用来自Eurogentec^TM的对于20x 20x 1cm的凝胶，通常在100V下进行电泳(浸没在TAE缓冲液中)，进行1小时，或直至蓝色染料到达琼脂糖末端。利用紫外光进行显现。使用数码相机给凝胶拍照。

琼脂糖凝胶电泳还用于估计经切取并且纯化的条带的DNA浓度；在该情况下，在许多具有不同量的DNA标志物梯度的泳道旁边对样品进行电泳。

按照制造商的说明书，使用微型离心机或

真空岐管(vacuum manifold)，利用

Gel Extraction试剂盒(QiaGen^TM)从琼脂糖凝胶纯化PCR产物的特定条带。

将从琼脂糖凝胶切取并且纯化的DNA条带亚克隆入细菌质粒以进行进一步使用，例如克隆、测序、表达或杂交检测测定。按照制造商的说明书，使用TOPO-

载体和TOPO-

克隆试剂盒(Invitrogen^TM)将DNA片段克隆入质粒pCR2.1。

实施例6：DNA测序：

全都按照厂商的说明书，使用Big

Terminator Ready反应混合物(ABI Prism^TM)和ABI Prism^TM 310自动测序仪通过标准PCR循环测序法进行DNA测序。

通常在测序反应中于蒸馏水中使用20至70ng DNA(纯化的PCR产物，或载体上的克隆片段)和8μl Big

Terminator Ready反应混合物、1μl 10μM引物，达到20μl的总体积。用于测序的引物通常与用于从cDNA制备ds DNA产物的PCR中使用的引物相同。循环测序PCR进行25个循环：在96℃下进行10秒，在50℃进行5秒，和在60℃下进行2分钟。

在PCR之后，按照制造商的说明书，使用管和微型离心机，利用

Spin柱(QiaGen^TM)纯化样品以除去Dye-Terminator。使用蒸馏水将终洗脱物以1∶2重悬浮至40μl的总体积。

然后通过使用Data Collection version 1.0.4en SequenceAnalysis version 3软件在ABI

310Genetic分析仪上进行序列确定。

使用许多程序进行序列分析，最常用的是

(GeneCodes^TM)和Clone

(Sci.Ed.Software^TM)。修整起始和末端序列以除去基于使用的变性PCR引物而引入的核苷酸读出。

在本文中示于SEQ ID NO：4-26(偶数)中的DNA序列是来源于多个测序反应的共有序列。大多数时候也使用正向和反向测序引物从两条链读取序列；只有SEQ ID NO：8只从一条链来进行确定。平均冗余度是每个核苷酸大约4次。

实施例7：在鸡胚蛋上进行星状病毒滴定

使用23G 1″针将星状病毒悬浮液的系列10倍稀释物接种入6天龄的SPF鸡胚蛋的卵黄囊。然后，将蛋在蛋孵育箱中于37℃下孵育7天。

每天将蛋进行对光检查。在接种后24小时内发生的死亡被认为是非特异性的，因此弃去包含早期死亡胚胎的此类蛋，并且不将其用于感染性滴度的计算中。

对接种后2至7天死亡的胚胎检查本发明星状病毒感染特征性的损害的存在情况；如果死亡的胚胎展示鲜红的腿和翼尖以及肿胀暗红的肝，就算感染。使用基于Spearman&Karber的方法的计算机程序计算感染性滴度，将其表示为每ml的ELD50。

实施例8：在鸡胚蛋上产生星状病毒

使用22G 1¹/₂”针用每蛋10^5ELD50的星状病毒在卵黄囊中接种9天龄的SPF鸡胚蛋。然后，将蛋在37℃下于蛋孵育箱中温育。

在接种后24小时，将蛋进行对光检查。在24小时内发生的死亡被认为是非特异性的，除去这些蛋。

在接种后48小时，收获所有剩下的蛋的尿囊液。将尿囊液在低于-60℃下冷冻贮存。

如上所述通过在鸡胚蛋中或细胞上进行滴定来确定感染性滴度。

实施例9：原代细胞的产生：

通过从胚胎分离肝来从14至16天龄的SPF鸡胚蛋制备CEL细胞。用PBS/酚红清洗肝，然后在室温下于PBS中含有胰蛋白酶的溶液中温育8至10分钟。通过100μm网纱(gauze)收获上清液。重复该步骤2次以上，然后通过离心收集细胞，将细胞重悬浮于合适的含有5％胎牛血清(FCS)的丰富培养基中。

使用来自大约18天龄的SPF鸡胚胎的肾以相似的方法制备CEK细胞。轻轻地剥离肾脏，清洗，并且在室温下用胰蛋白酶处理一次，进行20分钟。然后，过滤CEK细胞，将其置于培养基+FCS中。

实施例10：IFT测定：

使用免疫荧光检测(IFT)检查某些抗血清的物种交叉特异性(cross-species specificity)以及进行病毒滴定。通常在微量滴定板中在原代细胞上进行IFT。

当将CEK细胞用于IFT时，将这些细胞以10^5个细胞/100μl接种在96孔微量滴定板的小孔中。将细胞置于具有2％FCS和抗生素的标准丰富培养基中，在37℃下于5％CO₂的气氛中进行温育。第二天，将病毒接种到细胞上。

为了滴定目的，使用病毒的系列稀释物。然后将板再温育2天。然后，除去上清液，在-70℃下用纯乙醇固定细胞。将板在-20℃下贮存直至使用。为了显现用于滴定的病毒，用特异性抗血清将板染色。因此，使板调到室温，倒出乙醇，然后用PBS清洗板。以已知产生良好荧光但无太强背景的强度制备抗星状病毒血清的稀释物。然后将该第一抗血清加入板中，在37℃下于潮湿的气氛中温育1小时。然后用PBS清洗板3次。然后制备第二抗体-缀合物，山羊抗鸡IgG-FITC缀合物(Nordic^TM)。将该抗体缀合物以需要的稀释度加入板中，再次于37℃下温育1小时。在该温育后，再次用PBS清洗板3次，之后加入1∶1的PBS∶甘油混合物。然后将板在黑暗处于4℃下贮存直至利用荧光显微镜读取。阳性信号是检测到与细胞层中cpe的征兆相关的特定荧光。

为了进行血清表征和物种交叉反应检测，以相似的方法使用CEK或CEL细胞制备微量滴定板。第二天，用不同的待检测的病毒例如本发明星状病毒分离株，还有ANV1和CAstV2以及其他禽病原体：呼肠孤病毒、IBV、NDV、FPV、腺病毒、AIV等感染这些细胞。病毒的量是固定的量或者稀释度，依方便而定。将板温育2至3天。

为了检测某一抗血清结合不同病毒的能力，将血清在板上温育，通过与缀合物一起温育来增强信号。为了最优化结合-对-背景信号，在不同病毒的不同稀释度上检测抗血清的许多稀释度(于PBS中)。

实施例11：使用星状病毒对鸡感染

在实验条件下于鸡中测试本发明禽星状病毒以再现在野外观察到的疾病症状和从这些二次感染的动物再分离此微生物。这样可遵照柯赫氏法则将测试的该分离株确认为病原性和强毒微生物以及观察到的野外症状的致病性感染因子。

此外，重复感染鸡以检测由活接种物产生的抗后续攻击性感染的接种功效。

最后，从实验性感染的鸡分离总血清以获得抗接种的星状病毒的特异性多克隆抗血清。

为此目的，将白色来亨鸡品种和两种性别的SPF产蛋型鸡在3周龄时转移至负压隔离器。通过随机选择将动物分配至处理组，通过双翼条带各个标记所述动物。可随意获得标准食物和饮水。

在整个实验过程中定期(也在第0天)采集血液样品以确定免疫状态。然后通过3个途径接种15只鸡：以10^5EID50/0.2ml剂量和10^5.4EID50/0.5ml剂量，通过眼睛和通过肌内途径每只使用0.2ml以及通过口服途径使用0.5ml。接种物是悬浮于注射用水中的保藏分离株19星状病毒。5只置于相同隔离器中的鸡不接种以用作对照和标记(sentinel)。每天就临床病征或死亡情况观察动物。

在接种后(p.i.)第20天，将许多鸡放血和进行死后组织病理学检查。在接种后第23天，使用相似剂量的接种物加强其他(之前接种的)鸡，终止实验，将活动物放血并且进行检查。

一些禽类最初未进行接种但豢养在与已接种/感染的禽类相同的隔离器中；如所预期的，这些禽类通过星状病毒的水平传播被感染。

实施例11a：组织病理学结果：

动物试验的组织病理学结果如下：2只鸡死亡，并且5只动物患有腹泻，其中3只是对照。在进行组织病理学检查时，几只动物已从接种后第7天显示或多或少严重程度的肾和肠道病状。火鸡显示严重的间质性肾炎，小管变性(tubular degeneration)作为最显著的征兆。胸腺和粘液囊(bursa)显示淋巴细胞增多；胰腺显示细胞凋亡和腺泡萎缩；以及十二指肠显示钝圆和融合的绒毛。

未接种的对照鸡的水平感染证明了星状病毒接种物的毒性和传染性。

实施例11b：PCR结果：

就本发明禽星状病毒的征兆通过PCR检测所有鸡的肾样品。在匀浆和RNA分离后，制备RT样品。使用SEQ ID NO：30和31的引物通过PCR检测这些样品。所有感染动物的样品经检测为阳性，呈现出可鉴定本发明禽星状病毒的特异性260bp条带。还包括了合适的阳性和阴性对照。

这证明了死亡和组织病理学表现的致病因子是本发明禽星状病毒。观察到的症状，即肾炎和腹泻，与在野外看到的症状一致。关于腿的问题未能再现；这很可能是由于使用的禽类体格太纤弱以至不能展示此类问题，和/或隔离器中SPF鸡的条件不足以模拟禽类在野外经历的多重感染压。

实施例11c：VN结果：

将固定量的星状病毒分离株19与来自接种后第0天、第20天和第46天的鸡抗血清在37℃下一起温育1小时。然后将这些病毒样品接种入6天龄的SPF鸡胚蛋，并且温育数天。在蛋接种后第4天，接受用第0天的血清处理的病毒的胚胎已死亡，并且显示本发明星状病毒的典型感染征兆。

然而，用在第20天采集的血清或第46天的血清温育的病毒不损害胚胎。这证明分离株19病毒可有效地被特异性鸡抗血清中和。

这也证明可在使用本发明禽星状病毒的活疫苗接种后在鸡中诱导具有VN能力的有效抗血清。

实施例11d：IFT结果：

使用鸡多克隆抗血清获得的交叉反应IFT测定的结果证明抗分离株19抗血清不识别除了本发明禽星状病毒的病毒分离株之外的任何病毒。

类似地，特异于ANV1或CAstV2的抗血清同样地只识别针对其产生所述抗血清的特定病毒。同样重要的是抗ANV1和抗ChAstV2血清都不结合本发明禽星状病毒的病毒分离株。这甚至适用于所测试的最高抗体量(最低稀释的样品)。

同样，抗其他禽病原体(最相关地呼肠孤病毒)的抗血清中没有一种可结合本发明禽星状病毒的病毒分离株或反之亦然。

这证明本发明禽星状病毒是其自己的新型独特的血清群，从而确认了已鉴定的独特分子生物学差异。

用分离株19星状病毒(第3代)在该病毒的系列10倍稀释物中感染具有CEK细胞的板。2天后，固定板，然后用不同的抗血清染色，所述抗血清是：

-来自接种后第33天的抗分离株19血清汇合物，1∶20于PBS中，

-鸡中产生的抗ANV1(株系SE-027/2)；1∶20于PBS中(ANV1是德国ANV1分离株，经特定区域的DNA测序后，其似乎与本文中使用的来自GenBank的参照ANV1序列极密切相关)。

-鸡中产生的抗CAstV2(株系TS9L)，1∶500于PBS中(CAstV1来源于以保藏号I-2932保藏于法国巴黎的CNCM的样品)。

-阴性对照，只有PBS。

在用山羊抗鸡IgG缀合后，读取板：

实施例12：另外的接种试验

灭活疫苗：

使用本发明灭活星状病毒的佐剂化疫苗接种火鸡和鸡，以优化抗原剂量。

如所描述的，在CEL上培养星状病毒分离株19，然后按照标准方案，在温度和pH的控制下使用β-丙内酯(BPL)灭活所述病毒。使用标准方案将灭活的星状病毒均质化入由轻质矿物油和适当的乳化剂组成的标准w/o乳液中。

到手时将火鸡和鸡豢养在隔离的单元中：将120只2周龄的普通火鸡分配至6个分开的组群(组群1至6)，以使每个组群包括20只动物。在3周龄时，使用含有灭活的星状病毒分离株19的w/o乳液疫苗，通过肌内途径接种组群1至4中的火鸡。使用相同的W/O乳液疫苗，通过皮下途径接种组群5中的火鸡，组群6中的火鸡将不接种以用作对照。

类似地，到手时将180只一天龄的SPF蛋鸡分配至9个分开的组群(组群7-15)，以使每一组群包括20只鸡。在3周龄时，使用含有灭活的3型星状病毒(Astro type 3virus)的w/o乳液疫苗，通过肌内途径接种组群7至10中的鸡。使用相同的疫苗，通过皮下途径接种组群11至14中的鸡，组群15中的火鸡将不接种以用作对照。

在实验开始前，和在接种后第4、8和12周，从所有火鸡和鸡采集血液样品。通过在CEL细胞上进行IFT或通过VN测定，检测血清中特异于本发明星状病毒的抗体的存在情况和它们的滴度。

可容易地修改该方案以包括免疫持续时间的研究(如果相关的话)；例如通过将接种的禽类保持在隔离器中再进行另外6至12个月，然后施用使用本发明星状病毒的攻击性感染。

活疫苗：

将用一剂本发明活星状病毒接种鸡，然后用星状病毒攻击，以优化活星状病毒疫苗的施用途径。

将100只1天龄的商业MDA+(母源抗体阳性的)品种的鸡分配至5个分开的组群以使每一组群包括20只鸡。

在1天龄时，通过滴眼剂、粗雾滴(coarse spray)、喷雾剂或饮用水，使用来自尿囊液的活星状病毒分离株19接种组群1至4中的鸡。组群5中的鸡将不接种以用作未接种的对照。在接种后第4周，用本发明星状病毒攻击所有鸡。在攻击后3周的时期中，每天观察所有鸡中星状病毒感染特征性的临床征兆和/或死亡的发生。攻击后21天，杀死所有剩下的鸡，对其进行组织病理学检查。

仅供受理局使用

仅供国际局使用

0-5	国际局接收此表格的日期：
			0-5-1	授权官员

Claims

1.具有开放阅读框架(ORF)1a基因组区域的禽星状病毒，其特征在于所述禽星状病毒的ORF 1a，当与禽肾炎病毒1的ORF 1a相比较时，包含12个核苷酸的***物，所述***物位于相应于SEQ ID NO：1的第2485和2486号核苷酸的核苷酸之间。

2.权利要求1的禽星状病毒，其特征在于所述12个核苷酸的***物具有SEQ ID NO：2中所示的核酸序列。

3.权利要求1至2的禽星状病毒，其特征在于所述禽星状病毒的ORF 1a包含与SEQ ID NO：4具有至少88％的核苷酸序列同一性的区域。

4.权利要求1至3的禽星状病毒，其特征在于可在使用SEQ ID NO：30和31中所示的一组引物的PCR测定中从所述禽星状病毒的ORF 1a产生大约260个核苷酸的PCR产物。

5.权利要求1至4的禽星状病毒，其为以编号CNCM I-3895保藏在法国巴黎的巴斯德研究所国家微生物菌种保藏中心(CNCM)的病毒。

6.在病毒中和测定中可中和权利要求1至5的禽星状病毒的抗体或其片段。

7.从权利要求1至5的禽星状病毒可获得的抗原性制剂。

8.包含与SEQ ID NO：4具有至少88％核苷酸序列同一性的区域的DNA分子。

9.包含与SEQ ID NO：5具有至少93％氨基酸序列同一性的区域的蛋白质。

10.一种疫苗，其包含权利要求1至5的禽星状病毒、权利要求6的抗体或其片段、权利要求7的抗原性制剂、权利要求8的DNA分子或权利要求9的蛋白质和药学上可接受的载体。

11.权利要求10的疫苗，其包含至少一种从对家禽有致病性的微生物可获得的另外的抗原。

12.用于家禽的疫苗的化合物或组合物，其中所述化合物或组合物是权利要求1至5的禽星状病毒、权利要求6的抗体或其片段、权利要求7的抗原性制剂、权利要求8的DNA分子或权利要求9的蛋白质。

13.化合物或组合物用于制造家禽的疫苗的用途，其中所述化合物或组合物是权利要求1至5的禽星状病毒、权利要求6的抗体或其片段、权利要求7的抗原性制剂、权利要求8的DNA分子或权利要求9的蛋白质。

14.用于制造家禽的疫苗的方法，其中将化合物或组合物与适当的药物载体混合，所述化合物或组合物是权利要求1至5的禽星状病毒、权利要求6的抗体或其片段、权利要求7的抗原性制剂、权利要求8的DNA分子或权利要求9的蛋白质。

15.一种诊断试剂盒，其包含权利要求1至5的禽星状病毒、权利要求6的抗体或其片段、权利要求7的抗原性制剂、权利要求8的DNA分子或权利要求9的蛋白质。