CN102061285A - 基于nad+和nadh的药物的应用方法 - Google Patents

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殷卫海
夏伟梁
马英鑫
赵翠平
洪韵仪
韩瑾
陈贺愈
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Abstract

一种生物技术领域的基于NAD+和NADH的药物的应用方法，通过将粉状的NAD+和NADH按0.01％至99.99％的质量比例混合构成含0.001～10mM的NAD+及0.001～10mMNADH的药物；然后向离体培养的恶性肿瘤细胞中加入步骤一所得的药物并进行培养。本发明那个可用于杀死神经胶质肿瘤细胞、神经元肿瘤细胞、胃癌肿瘤细胞、肾癌肿瘤细胞或乳腺癌肿瘤细胞。

Description

基于NAD+和NADH的药物的应用方法
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域的药物制备及其应用方法，具体是一种基于NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；nicotinamide adenine dinucleotide，简称NAD+)和NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(还原态)；nicotinamide adenine dinucleotide，reduced form，简称NADH)的药物的应用方法。
背景技术
恶性肿瘤是严重危害人民群众身体健康的最严重的多发病之一。目前采用的放射性治疗和化学治疗等方法都有着对正常组织、细胞杀伤大等不良副作用。因此寻找对正常组织无杀伤，而对肿瘤细胞有杀伤作用或者抑制生长作用的药物有着重要的临床意义。
NAD+和NADH都是在脱氢酶的作用中转移氢离子的辅酶它出现在细胞很多代谢反应中，如乙醇脱氢酶(ADH)催化的氧化乙醇反应中。NAD+是接受氢离子的辅酶，而NADH是在脱氢酶的作用中接受氢离子的辅酶。NAD+和NADH是参与能量代谢、线粒体功能、老化等重要生物过程的重要的体内生物分子；它们在糖酵解、糖异生、三羧酸循环及呼吸链中发挥着不可替代的作用。除基础研究外，NAD+现在医疗行业没有直接应用。在临床上有初步的关于NADH对帕金森氏病作用的研究。在细胞培养研究和动物脑缺血模型的研究中，NAD+的施加极大地减少了有脑缺血和氧化应激造成的原代神经元和星状胶质细胞坏死。在细胞培养研究中，NADH也可以减少由于DNA损伤剂诱导的星状胶质细胞坏死。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于NAD+和NADH的药物的应用方法，可用于杀死神经胶质肿瘤细胞、神经元肿瘤细胞、胃癌肿瘤细胞、肾癌肿瘤细胞或乳腺癌肿瘤细胞。
本发明是通过以下的技术方案实现的，本发明包括如下步骤：
步骤一，将粉状的NAD+和NADH按0.01％至99.99％的质量比例混合构成含0.001～10mM的NAD+及0.001～10mM NADH的药物；
步骤二，向离体培养的恶性肿瘤细胞中加入步骤一所得的药物并进行培养。
所述的恶性肿瘤细胞为神经胶质肿瘤细胞、神经元肿瘤细胞、胃癌肿瘤细胞、肾癌肿瘤细胞或乳腺癌肿瘤细胞。
所述的培养是指：加入NAD+和NADH之后培养恶性肿瘤细胞24～48h。
与现有技术相比，本发明中的NAD+和NADH可大量杀死神经胶质肿瘤细胞、神经元肿瘤细胞、胃癌肿瘤细胞、肾癌肿瘤细胞或乳腺癌肿瘤细胞；为以后进一步制作以NAD+和NADH作为主要成分的药物提供了科学依据。
本发明涉及的恶性肿瘤细胞均可通过公开的市售的商业渠道获得，例如：中国科学院上海生科院细胞资源中心，上海市岳阳路320号细胞库。
附图说明
图1为以99.99％NAD+及0.01％NADH为主要成分的药物减少神经元肿瘤(Neuro2A)细胞存活的结果图。
图2为以99.99％NAD+及0.01％NADH作为主要成分的药物减少神经胶质瘤(C6)细胞存活的结果图。
图3为以99.99％NAD+及0.01％NADH作为主要成分的药物减少乳腺癌(MCF-7)细胞存活的结果图。
图4为以99.99％NAD+及0.01％NADH作为主要成分的药物减少胃癌(MKN-45)细胞存活的结果图。
图5为以99.99％NAD+及0.01％NADH作为主要成分的药物减少肾癌(HEK293)细胞存活的结果图。
图6为以99.99％NADH及0.01％NAD+为主要成分的药物减少神经元肿瘤(Neuro2A)细胞存活的结果图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
以NAD+和NADH作为主要成分的药物减少神经元肿瘤(Neuro2A)细胞的存活
利用含10％(体积分数)小牛血清的Dulbecco′s Modified Eagle Medium(见Dos-Anjos等在《Analytical Biochemistry》(《分析化学》)378辑99～101页上发表的题为“Quantitative gene expression analysis in a brain slice model：influence of temperature and incubation media”(一个脑片模型的数字化基因分析：温度和培养液的影响)一文)将NAD+(Sigma公司)及NADH配成分别含10mM NAD+和1μM NADH的溶液，然后用含10％(体积分数)小牛血清的Dulbecco′s Modified Eagle Medium稀释配制的10mM的NAD+，进而得到0.1mM NAD+和0.01μM NADH，以及1mM NAD+和0.1μM NADH作为主要成分的药物，然后将这些浓度的NAD+和NADH加入神经元肿瘤(Neuro2A)细胞(中国科学院上海生科院细胞资源中心，上海市岳阳路320号细胞库)中，细胞存活的程度采用LDH方法(乳酸脱氢酶测量法)加以观测。如图1及图6所示：在24小时以NAD+与NADH作为主要成分的药物处理后，含0.1mM～10mM NAD+的以及0.01-1μM NADH的药物可以杀死20％～35％的神经元肿瘤Neuro-2A细胞；在48小时NAD+处理后，含0.1mM～10mM NAD+的以及0.01-1μM NADH的药物可以杀死60％～80％的神经元肿瘤Neuro-2A细胞。实验还表明，含0.1mM～10mM NAD+的以及0.01-1μM NADH的药物处理后，以NAD+和NADH作为主要成分的药物可以杀死40％～60％的神经元肿瘤Neuro-2A细胞。
实施例2
以NAD+和NADH作为主要成分的药物减少神经胶质瘤(C6)细胞的存活
利用含10％(体积分数)小牛血清的Dulbecco′s Modified Eagle Medium(见Dos-Anjos等在《Analytical Biochemistry》(《分析化学》)378辑99～101页上发表的题为“Quantitative gene expression analysis in a brain slice model：influence of temperature and incubation media”(一个脑片模型的数字化基因分析：温度和培养液的影响)一文)将NAD+(Sigma公司)及NADH配成分别含10mM NAD+和1μM NADH的溶液，然后用含10％(体积分数)小牛血清的Dulbecco′s Modified Eagle Medium稀释配制的10mM的NAD+，进而得到0.1mM NAD+和0.01μM NADH，以及1mM NAD+和0.1μM NADH作为主要成分的药物，然后将这些浓度的NAD+和NADH加入神经胶质瘤细胞(中国科学院上海生科院细胞资源中心，上海市岳阳路320号细胞库)中，细胞存活的程度采用LDH方法(乳酸脱氢酶测量法)加以观测。如图2所示：在24小时以NAD+与NADH作为主要成分的药物处理后，含0.1mM～10mM NAD+的以及0.01-1μM NADH的药物可以杀死20％～35％的神经胶质瘤细胞；在48小时NAD+处理后，含0.1mM～10mM NAD+的以及0.01-1μM NADH的药物可以杀死60％～80％的神经胶质瘤细胞。实验还表明，含0.1mM～10mM NAD+的以及0.01-1μM NADH的药物处理后，以NAD+和NADH作为主要成分的药物可以杀死40％～60％的神经胶质瘤细胞。
实施例3
以NAD+和NADH作为主要成分的药物减少乳腺癌(MCF-7)细胞的存活
利用含10％(体积分数)小牛血清的Dulbecco′s Modified Eagle Medium(见Dos-Anjos等在《Analytical Biochemistry》(《分析化学》)378辑99～101页上发表的题为“Quantitative gene expression analysis in a brain slice model：influence of temperature and incubation media”(一个脑片模型的数字化基因分析：温度和培养液的影响)一文)将NAD+(Sigma公司)及NADH配成分别含10mM NAD+和1μM NADH的溶液，然后用含10％(体积分数)小牛血清的Dulbecco′s Modified Eagle Medium稀释配制的10mM的NAD+，进而得到0.1mM NAD+和0.01μM NADH，以及1mM NAD+和0.1μM NADH作为主要成分的药物，然后将这些浓度的NAD+和NADH加入乳腺癌(MCF-7)细胞(中国科学院上海生科院细胞资源中心，上海市岳阳路320号细胞库)中，细胞存活的程度采用LDH方法(乳酸脱氢酶测量法)加以观测。如图3所示：在24小时以NAD+与NADH作为主要成分的药物处理后，含0.1mM～10mM NAD+的以及0.01-1μM NADH的药物可以杀死20％～35％的乳腺癌(MCF-7)细胞；在48小时NAD+处理后，含0.1mM～10mM NAD+的以及0.01-1μM NADH的药物可以杀死60％～80％的乳腺癌(MCF-7)细胞。实验还表明，含0.1mM～10mM NAD+的以及0.01-1μM NADH的药物处理后，以NAD+和NADH作为主要成分的药物可以杀死40％～60％的乳腺癌(MCF-7)细胞。
实施例4
以NAD+和NADH作为主要成分的药物减少胃癌(MKN-45)细胞的存活
利用含10％(体积分数)小牛血清的Dulbecco′s Modified Eagle Medium(见Dos-Anjos等在《Analytical Biochemistry》(《分析化学》)378辑99～101页上发表的题为“Quantitative gene expression analysis in a brain slice model：influence of temperature and incubation media”(一个脑片模型的数字化基因分析：温度和培养液的影响)一文)将NAD+(Sigma公司)及NADH配成分别含10mM NAD+和1μM NADH的溶液，然后用含10％(体积分数)小牛血清的Dulbecco′s Modified Eagle Medium稀释配制的10mM的NAD+，进而得到0.1mM NAD+和0.01μM NADH，以及1mM NAD+和0.1μM NADH作为主要成分的药物，然后将这些浓度的NAD+和NADH加入胃癌(MKN-45)细胞(中国科学院上海生科院细胞资源中心，上海市岳阳路320号细胞库)中，细胞存活的程度采用LDH方法(乳酸脱氢酶测量法)加以观测。如图4所示：在24小时以NAD+与NADH作为主要成分的药物处理后，含0.1mM～10mM NAD+的以及0.01-1μM NADH的药物可以杀死20％～35％的胃癌(MKN-45)细胞；在48小时NAD+处理后，含0.1mM～10mM NAD+的以及0.01-1μM NADH的药物可以杀死60％～80％的胃癌(MKN-45)细胞。实验还表明，含0.1mM～10mM NAD+的以及0.01-1μM NADH的药物处理后，以NAD+和NADH作为主要成分的药物可以杀死40％～60％的胃癌(MKN-45)细胞。
实施例5
NAD+杀死肾癌(HEK293)细胞
利用含10％(体积分数)小牛血清的Dulbecco′s Modified Eagle Medium(见Dos-Anjos等在《Analytical Biochemistry》(《分析化学》)378辑99～101页上发表的题为“Quantitative gene expression analysis in a brain slice model：influence of temperature and incubation media”(一个脑片模型的数字化基因分析：温度和培养液的影响)一文)将NAD+(Sigma公司)及NADH配成分别含10mM NAD+和1μM NADH的溶液，然后用含10％(体积分数)小牛血清的Dulbecco′s Modified Eagle Medium稀释配制的10mM的NAD+，进而得到0.1mM NAD+和0.01μM NADH，以及1mM NAD+和0.1μM NADH作为主要成分的药物，然后将这些浓度的NAD+和NADH加入肾癌(HEK293)细胞(中国科学院上海生科院细胞资源中心，上海市岳阳路320号细胞库)中，细胞存活的程度采用LDH方法(乳酸脱氢酶测量法)加以观测。如图5所示：在24小时以NAD+与NADH作为主要成分的药物处理后，含0.1mM～10mM NAD+的以及0.01-1μM NADH的药物可以杀死20％～35％的肾癌(HEK293)细胞；在48小时NAD+处理后，含0.1mM～10mM NAD+的以及0.01-1μM NADH的药物可以杀死60％～80％的肾癌(HEK293)细胞。实验还表明，含0.1mM～10mM NAD+的以及0.01-1μM NADH的药物处理后，以NAD+和NADH作为主要成分的药物可以杀死40％～60％的肾癌(HEK293)细胞。
实施例6
以NADH和NAD+作为主要成分的药物减少神经胶质瘤(C6)细胞的存活
利用含10％(体积分数)小牛血清的Dulbecco′s Modified Eagle Medium(见Dos-Anjos等在《Analytical Biochemistry》(《分析化学》)378辑99～101页上发表的题为“Quantitative gene expression analysis in a brain slice model：influence of temperature and incubation media”(一个脑片模型的数字化基因分析：温度和培养液的影响)一文)将NADH(Sigma公司)及NAD+配成分别含10mM NADH和1μM NAD+的溶液，然后用含10％(体积分数)小牛血清的Dulbecco′s Modified Eagle Medium稀释配制的10mM的NADH，进而得到0.1mM NADH和0.01μM NAD+，以及1mM NADH和0.1μM NAD+作为主要成分的药物，然后将这些浓度的NAD+和NADH加入神经胶质瘤细胞(中国科学院上海生科院细胞资源中心，上海市岳阳路320号细胞库)中，细胞存活的程度采用LDH方法(乳酸脱氢酶测量法)加以观测。如图1所示：在24小时以NADH与NAD+作为主要成分的药物处理后，含0.1mM～10mM NADH的以及0.01-1μM NAD+的药物可以杀死10％～40％的神经胶质瘤细胞。

Claims (3)

1.一种基于NAD+和NADH的药物的应用方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，将粉状的NAD+和NADH按0.01％至99.99％的质量比例混合构成含0.001～10mM的NAD+及0.001～10mM NADH的药物；
步骤二，向离体培养的恶性肿瘤细胞中加入步骤一所得的药物并进行培养。
2.根据权利要求1所述的基于NAD+和NADH的药物的应用方法，其特征是，所述的培养是指：加入NAD+和NADH之后培养恶性肿瘤细胞24～48h。
3.根据权利要求1或2所述的基于NAD+和NADH的药物的应用方法，其特征是，所述的恶性肿瘤细胞为神经胶质肿瘤细胞、神经元肿瘤细胞、胃癌肿瘤细胞、肾癌肿瘤细胞或乳腺癌肿瘤细胞。
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