CN102046789A - 检测酪氨酸酶mRNA用引物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种检测TYR mRNA的手段及方法。所选用的TYR mRNA检测用试剂在5’末端一侧有第一序列，在3’末端一侧有第二序列，第一序列的长度为10-30个核苷酸，是可与序列号1的部分区域——第一区域的互补链杂交的多聚核苷酸序列，第二序列长度为10-30个核苷酸，是可与序列号1中比第一区域靠近3’末端一侧的第二区域杂交的多聚核苷酸序列。
Description
技术领域：
本发明涉及一种用于检测酪氨酸酶(以下称“TYR”)mRNA(信使核糖核酸)的引物。更具体地，涉及一种适宜检测试样中TYR mRNA的引物、引物对及TYR mRNA的检测方法。
背景技术：
TYR是动物和植物细胞中酪氨酸氧化合成黑色素这一反应的催化酶之一。近年来的研究表明，TYR作为检测黑色素瘤的***转移的分子标记十分有用。例如，非专利文献1中公开了一种技术，用从生物体采集的***制备测定试样，通过RT-PCR法检测测定试样中的TYR mRNA，以此可判断有无黑色素瘤的***转移。
在先技术文献
非专利文献
非专利文献1：亚伯拉罕森(Abrahamsen)等人，《在前哨***中定量黑色素瘤mRNA标记：临床前评价单步实时逆转录聚合酶链反应检测(Quantification of Melanoma mRNA Markers in Sentinel Nodes：Pre-Clinical Evaluation of a Single-Step Real-Time ReverseTranscriptase-Polymerase Chain Reaction Assay)》，2004年8月第6卷第3号P.253-259
发明内容：
如上所述，TYR mRNA作为检测黑色素瘤等癌症的分子标记十分有用。但是，非专利文献1中记述的技术在检测时应用的是可以灵敏地检测靶核酸的RT-PCR法，因此，虽然也能检测出癌细胞向***的微小转移，但检测非常费时间(2-4个小时)。
本发明的目的之一是提供可以用比过去的技术更短的时间检测出TYRmRNA的TYR mRNA检测用引物、TYR mRNA检测用引物对、TYR mRNA检测用试剂盒以及TYR mRNA检测方法。
即本发明涉及
[1]一种酪氨酸酶mRNA检测用引物，该酪氨酸酶mRNA检测用引物用于检测试样中的酪氨酸酶的mRNA，
它在5’末端一侧包含第一序列，在3’末端一侧包含第二序列，
上述第一序列
(a1)长度为10-30个核苷酸
(b1)是一种能与序列号1的部分区域——第一区域的互补链杂交的多聚核苷酸序列，
上述第二序列
(c1)长度为10-30个核苷酸
(d1)是一种可与序列号1中比第一区域靠近3’末端一侧的第二区域杂交的多聚核苷酸序列，
上述第二区域含有
(i)序列号1的第901及902位核苷酸、或
(ii)序列号1的第1118及1119位核苷酸；
[2]一种酪氨酸酶mRNA检测用引物对，该酪氨酸酶mRNA检测用引物对用于检测试样中的酪氨酸酶的mRNA，
其包括第一引物、第二引物及第三引物，
上述第一引物是权利要求1所记述的引物，
上述第二引物在5’末端一侧含有第三序列，在3’末端一侧含有第四序列，
上述第三序列
(a2)长度为10-30个核苷酸
(b2)是一种可与序列号1中比第一区域靠近5’末端一侧的第三区域杂交的多聚核苷酸序列，
上述第四序列
(c2)长度为10-30个核苷酸
(d2)是一种可与上述序列号1中比第三区域靠近5’末端一侧的第四区域的互补链杂交的多聚核苷酸序列，
上述第三引物由可与上述序列号1中比第四区域靠近5’末端一侧的第五区域的互补链杂交的多聚核苷酸序列组成；
[3]一种酪氨酸酶mRNA检测用试剂盒，包括
上述[2]所记述的引物对、
dNTPs、
具有以RNA为模板合成DNA的作用和边进行链置换边以DNA为模板合成DNA的作用的酶、或RNA依赖性DNA聚合酶及DNA依赖性DNA聚合酶；
[4]一种酪氨酸酶mRNA检测方法，包括以下步骤：
使试样、上述[2]所述引物对及RNA依赖性DNA聚合酶发生反应，由上述试样中的酪氨酸酶mRNA合成cDNA，
使上述引物对、DNA依赖性DNA聚合酶和在上述步骤合成的cDNA发生反应，扩增上述cDNA，以及
通过检测在上述步骤扩增的cDNA，检测上述试样中的酪氨酸酶mRNA；
[5]一种酪氨酸酶mRNA检测方法，包括以下步骤：
使试样和上述[2]所述引物对与具有以RNA为模板合成DNA的作用和边进行链置换边以DNA为模板合成DNA的作用的酶发生反应，以上述试样中的酪氨酸酶mRNA为模板合成cDNA，并以此cDNA为模板再合成该cDNA进行扩增，
通过检测在上述步骤扩增的cDNA，检测上述试样中的酪氨酸酶mRNA。
采用本发明的TYR mRNA检测用引物、TYR mRNA检测用引物对、TYR mRNA检测用试剂盒以及TYR mRNA检测方法，可以在短时间内检测出TYR mRNA。
附图说明：
图1为引物及引物杂交的区域的示意图。
具体实施方式：
(引物及引物对)
首先就检测TYR mRNA用的TYR mRNA检测用引物进行说明。
在本说明书中，所谓“检测”不仅指判断试样中是否存在靶物质——TYR mRNA，还包括定量试样中的TYR mRNA。
在本说明书中，所谓“引物”指在LAMP(环介导等温扩增反应，Loop-mediated Isothermal Amplification)法(参照美国专利第6410278号公报以及美国专利第6974670号公报)等核酸扩增技术中，与扩增目标核酸的特定区域杂交的多聚核苷酸，该多聚核苷酸具有能作为聚合酶扩增反应起点的功能(以下，称为“引物功能”)。待检测核酸是mRNA，故可以通过包括逆转录反应的核酸扩增反应(例如：RT-LAMP法等等)加以检测。
所谓“杂交”是指在严格条件下，基于多聚核苷酸碱基之间的互补性，某多聚核苷酸的一部分或全部序列通过氢键与其它多聚核苷酸的一部分或全部序列结合。
所谓“严格条件”指进行多聚核苷酸杂交时该行业专业人士普遍使用的条件，只要满足本实施方式的引物能与TYR mRNA或其cDNA杂交这一条件即可，无特别限定。已知，杂交时的严格条件是指温度、盐浓度、引物链长、引物中GC含量以及杂交缓冲液中的离液剂浓度函数。例如作为严格条件，可以使用Sambrook，J.等，1998，分子克隆：实验室手册(第2版)，冷泉港实验室，纽约(1998，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nd ed.)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)所记载的条件等。更具体地，比如可以列举出：“在含有50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠、pH7.6，5×登哈特(Denhardt’s)溶液、10％硫酸葡聚糖以及20μg/ml核酸的溶液中，杂交温度为42℃”，但不限定于此。
TYR mRNA的核苷酸序列是与序列号1所示序列相对应的序列。虽然mRNA中含有的是尿嘧啶而不是胸腺嘧啶，但在序列号1为方便起见，将尿嘧啶表示为胸腺嘧啶(t)。这个序列在基因库(GenBank)数据库中的登录号为：NM_000372。
本发明一实施方式(实施方式1)涉及的引物是用于从试样中检测酪氨酸酶mRNA的TYR mRNA检测用引物，其特征在于：
它在5’末端一侧包含第一序列，在3’末端一侧包含第二序列，
上述第一序列
(a1)长度为10-30个核苷酸，
(b1)是一种能与序列号1的部分区域——第一区域的互补链杂交的多聚核苷酸序列，
上述第二序列
(c1)长度为10-30个核苷酸，
(d1)是一种可与序列号1中比第一区域靠近3’末端一侧的第二区域杂交的多聚核苷酸序列，
上述第二区域含有
(i)序列号1的第901及902位核苷酸；或
(ii)序列号1的第1118及1119位核苷酸。
本实施方式1的引物是一种特别适用于通过RT-LAMP法检测TYR mRNA的引物。用本实施方式1的引物，由于其在5’末端一侧包含上述第一序列，在3’末端一侧包含上述第二序列，因此，可以高效地、高再现性地检测出TYR mRNA。
在上述RT-LAMP法中，首先通过逆转录反应(RT反应)从TYR mRNA合成cDNA，再通过LAMP反应扩增合成的cDNA。
使用RT-LAMP法检测TYR mRNA时，比如如图1所示，可以使用由下述多聚核苷酸构成的引物作为本实施方式1的引物，该多聚核苷酸在5’末端侧有第一序列——即可与TYR mRNA的一部分区域(图1中“R1c”)的互补区域(图1中“R1”)杂交的多聚核苷酸序列，在3’末端侧有第二序列——即可与TYRmRNA中位于上述R1c区域下游(3’末端)的区域(图1中“R2c”)杂交的多聚核苷酸序列。
上述第一序列和第二序列，从本实施方式1的引物和该引物杂交的区域之间的杂交特异性的角度考虑，其各自长度最好分别为10个核苷酸以上，检测TYR mRNA时，为保证易于进行操作的杂交温度，其最好长度是30个核苷酸以下。
在本实施方式1的引物中，第一序列与第二序列既可直接连接，也可通过间插序列连接。间插序列最好是与TYR mRNA或TYR cDNA相关性低的序列。例如，可举出5’-tttt-3’等。间插序列长度以1-50个核苷酸为宜，1-40个核苷酸更好。
本实施方式1的引物在上述RT-LAMP法所使用的引物当中，可以作为反向内引物(以下，称为“RIP”)发挥作用。
要用RT-LAMP法检测TYR mRNA，可以使用上述实施方式1的引物(RIP)、正向内引物(以下称“FIP”)以及F3引物。本发明中也包括含有这些引物的TYR mRNA检测用引物对。
本发明一实施方式涉及的TYR mRNA检测用引物对是一种用于检测试样中的酪氨酸酶mRNA的TYR mRNA检测用引物对，其特征在于：
该引物对包括第一引物、第二引物及第三引物，
上述第一引物是上述实施方式1的引物，
上述第二引物在5’末端一侧含有第三序列，在3’末端一侧含有第四序列，
上述第三序列
(a2)长度为10-30个核苷酸
(b2)是一种可与在序列号1中比第一区域靠近5’末端一侧的第三区域杂交的多聚核苷酸序列，
上述第四序列
(c2)长度为10-30个核苷酸，
(d2)是一种可与序列号1中比第三区域靠近5’末端一侧的第四区域的互补链杂交的多聚核苷酸序列，
上述第三引物由可与比上述序列号1中第四区域靠近5’末端一侧的第五区域的互补链杂交的多聚核苷酸序列组成。
使用本实施方式的引物对，由于其包含上述第一引物、第二引物及第三引物，可以高效、快速、高再现性地检测出TYR mRNA。
本实施方式的引物对也可以包含第四引物，该第四引物可以与比上述序列号1中第二区域靠近3’末端一侧的第六区域杂交。本实施方式的引物对还可以包含第五引物，该第五引物可以与位于上述序列号1中第三区域和第四区域之间的第七区域杂交。本实施方式的引物对还可以包含第六引物，该第六引物与位于上述序列号1中第一区域和第二区域之间的第八区域的互补区域杂交。
下面根据图1进一步说明上述引物及引物对。
图1是引物和引物杂交区域的示意图。图1中，F1、F2、L、F1、R1c、R2c及R3c各区域为TYR mRNA上的区域，F3c、F2c、F1c、R1、M、R2及R3各区域是TYR mRNA互补链TYR cDNA上的区域。F1和F1c、F2和F2c、F3和F3c、R1和R1c、R2和R2c及R3和R3c分别互补。这些区域在考虑TYR mRNA的检测效率和再现性等的基础上进行选择。
在图1，RIP对应上述第一引物，FIP对应上述第二引物，F3引物对应上述第三引物，R3引物对应上述第四引物，环状引物F对应上述第五引物，环状引物R对应上述第六引物。
FIP(第二引物)为多聚核苷酸，其在5’末端一侧有可与TYR mRNA的互补链TYR cDNA的F1区域(F1c互补区域)杂交的多聚核苷酸序列——第三序列，在3’末端一侧有可与TYR cDNA的F2c区域杂交的多聚核苷酸序列——第四序列。第三序列和第四序列可以直接连接，也可以通过上述间插序列连接。在FIP，第三序列和第四序列的长度与上述第一序列和第二序列的长度相同。
F3引物(第三引物)由可以与比TYR cDNA的F2c更靠近下游(3’末端一侧)的F3c区域杂交的多聚核苷酸构成。
本发明的引物对除FIP、RIP及F3引物外，还也可以包含R3引物。此R3引物由可与比TYR mRNA的R2c更靠近下游(3’末端一侧)的R3c区域杂交的多聚核苷酸构成。
本发明的引物对还可以含有环状引物。环状引物如有可与TYR mRNA上位于F2与F1之间的L区域杂交的多聚核苷酸——环状引物F、及可与在TYR cDNA上位于R1和R2之间的M区域杂交的多聚核苷酸——环状引物R等。本发明的引物对也可以包含环状引物F及R其中之一或二者均包括。
当本发明的引物对包含环状引物F及R其中之一或全部时，利用该引物对可以更快速地通过LAMP反应进行cDNA扩增。
F3引物、R3引物、环状引物F及R的链长只要足够表达引物功能即可，无特别限定。众所周知的催化核酸合成反应的聚合酶所识别的引物链长为5个核苷酸以上，因此，上述各引物的链长最好分别是5-100个核苷酸。从引物的核苷酸序列与引物杂交的区域之间的特异性来考虑，所述各引物的链长最好为10个核苷酸以上，从引物的杂交温度来考虑，引物链长最好在30个核苷酸以下。FIP以及RIP的链长以20-200个核苷酸为宜，20-60个核苷酸更好。
在本发明的引物对中，最好上述引物中至少有一个与TYR mRNA含有外显子连接点的区域杂交。TYR基因由9个外显子组成，外显子与外显子之间由内含子连接。当在细胞中由TYR基因合成mRNA时，剪接作用切掉了内含子，外显子与外显子直接连接起来。外显子与外显子之间连接处的部分称为外显子连接点。例如，在基因组中外显子1与外显子2被内含子隔离，但是在mRNA合成过程中上述内含子被剪切，所以mRNA中，外显子1的3’末端与外显子2的5’末端挨着。因为序列号1由5个外显子组成，所以序列号1有以下4个外显子连接点(外显子连接点1-4)。
外显子1与2之间的外显子连接点1：序列号1的第901位与902位的结合部分
外显子2与3之间的外显子连接点2：序列号1的第1118位与1119位的结合部分
外显子3与4之间的外显子连接点3：序列号1的第1266位与1267位的结合部分
外显子4与5之间的外显子连接点4：序列号1的第1448位与1449位的结合部分
可与包含外显子连接点的区域杂交的引物虽然能与TYR基因的mRNA杂交，但是与TYR基因的基因组DNA杂交的可能性极低。通过使用这样的引物，可以防止以上述RT-LAMP反应检测mRNA时非特异性地扩增核酸。
根据RT-LAMP反应的反应机理(参照美国专利第6410278号公报以及美国专利第6974670号公报)，最先与试样中的TYR mRNA杂交的是RIP的由第二序列构成的多聚核苷酸部分。因此，本发明的引物对更为理想的是，上述引物中，RIP的第二序列构成的多聚核苷酸部分与含有外显子连接点的区域杂交。即，较为理想的是上述R2c区域中含有外显子连接点。这样，能够防止在反应初期阶段非特异性地扩增核酸。
从TYR mRNA与来源于试样中其它基因的mRNA的相同性及检测速度、检测再现性等观点出发，本发明的引物对最好包括与含有上述外显子连接点中外显子连接点1或2的区域杂交的引物，包括与含有外显子连接点2的区域杂交的引物更好。
本实施方式的引物与该引物杂交的TYR mRNA的特定区域，不要求完全互补，二者只要具有可杂交的互补性即可(这一点美国专利第4800159号公报上也有记述)。即只要是有引物功能的多聚核苷酸，此引物也可以是在与上述特定区域完全互补的序列中导入了一个或复数个即多个置换、缺失、***、附加等变异的多聚核苷酸。这种变异的多聚核苷酸与未变异的多聚核苷酸相比，以具有80％以上的相同性为宜，具有90％以上的相同性更好，最好是具有95％以上的相同性。
在RT-LAMP反应中，引物与靶核酸TYR mRNA杂交后，通过聚合酶的作用，以引物3’末端为起点进行核酸合成反应。为此，引物的3’末端部分与TYRmRNA的互补性越高，核酸合成反应越容易进行。所以，本发明的引物最好3’末端的3个核苷酸是与该引物杂交的区域完全互补的多聚核苷酸，如果3’末端的5个核苷酸是完全互补的多聚核苷酸就更好了。
尤其当检测TYR mRNA时，从提高特异性的角度看，上述第二序列最好在3末’端含有与上述第二区域的序列完全互补的连续3个核苷酸构成的序列，含有与上述第二区域的序列完全互补的连续5个核苷酸构成的序列更好。
各区域F3、F2、F1、R1c、R2c、R3c、L以及M设定在序列号1所示的TYR mRNA序列中。以下列举这些区域的具体例子。
(F1)
第795-817位区域
第1005-1024位区域
第1015-1036位区域
第1016-1040位区域
第1031-1054位区域
(F2)
第731-751位区域
第963-977位区域
第964-986位区域
第971-992位区域
第972-992位区域
第986-1008位区域
(F3)
第703-722位区域
第931-953位区域
第945-962位区域
第950-962位区域
第966-985位区域
(R1c)
第825-848位区域
第1026-1049位区域
第1041-1062位区域
第1044-1064位区域
第1044-1068位区域
第1057-1080位区域
(R2c)
第886-908位区域
第1110-1133位区域
第1114-1131位区域
第1114-1133位区域
(R3c)
第917-936位区域
第1135-1153位区域
第1138-1155位区域
第1138-1156位区域
第1141-1160位区域
第1142-1161位区域
(L)
第752-776位区域
第981-1004位区域
第982-1004位区域
第982-1006位区域
第986-1010位区域
第987-1011位区域
第988-1011位区域
第988-1012位区域
第989-1011位区域
第989-1012位区域
第989-1013位区域
第990-1012位区域
第990-1013位区域
第990-1014位区域
第992-1015位区域
第993-1016位区域
第994-1016位区域
第995-1016位区域
第995-1018位区域
第996-1018位区域
第1000-1019位区域
第1001-1020位区域
第1003-1022位区域
第1004-1022位区域
第1005-1024位区域
第1006-1024位区域
第1008-1027位区域
第1009-1027位区域
第1009-1028位区域
第1010-1029位区域
(M)
第860-884位区域
第1063-1087位区域
第1065-1089位区域
第1066-1090位区域
第1067-1089位区域
第1067-1090位区域
第1068-1091位区域
第1068-1092位区域
第1069-1091位区域
第1069-1092位区域
第1069-1093位区域
第1070-1093位区域
第1070-1094位区域
第1073-1097位区域
第1074-1098位区域
第1075-1099位区域
第1082-1104位区域
第1083-1105位区域
第1084-1105位区域
第1085-1107位区域
(F3引物)
序列号2：5’-AATGGAACGCCCGAGGGA-3’(与第950-967位区域是相同的序列)
序列号3：5’-GACCTTTACGGCGTAATCCT-3’(与第966-985位区域是相同的序列)
序列号4：5’-TATGCAATGGAACGCCCG-3’(与第945-962位区域是相同的序列)
序列号5：5’-CAGCCATCAGTCTTTATGCAATG-3’(与第931-953位区域是相同序列)
序列号6：5’-TCTGCCTTGGCATAGACTCT-3’(与第703-722位区域是相同序列)
(FIP)
序列号7：5’-CAAACTCAGGCAAAATTCTACATCTTACGGCGTAATCCTGGAAACC-3’(连接第1031-1054位区域的互补序列和与第971-992位区域相同的序列的序列)
序列号8：5’-CAAACTCAGGCAAAATTCTACATCGGAAACCATGACAAATCCAGAAC-3’(连接第1031-1054位区域的互补序列和与第986-1008位区域相同的序列的序列)
序列号9：5’-TACATCAGCTGAAGAGGGGAGCAGGGACCTTTACGGC-3’(连接第1015-1036位区域的互补序列和与第963-977位区域相同的序列的序列)
序列号10：5’-CAAACTCAGGCAAAATTCTACATCTACGGCGTAATCCTGGAAACC-3’(连接第1031-1054位区域的互补序列和与第972-992位区域相同的序列的序列)
序列号11：5’-AGAGGGGAGCCTTGGGGTTCAGGGACCTTTACGGC-3’(连接第1005-1024位区域的互补序列和与第963-977位区域相同的序列的序列)
序列号12：5’-ATTCTACATCAGCTGAAGAGGGGAGGGGACCTTTACGGCGTAATCCTG-3’(连接第1016-1040位区域的互补序列和与第964-986位区域相同的序列的序列)
序列号13：5’-GTCACACTTTTCTGCATCCCGCCCGGTGGGAACAAGAAATCCAG-3’(连接第795-817位区域的互补序列和与第731-751位区域相同的序列的序列)
(RIP)
序列号14：5’-CCAATATGAATCTGGTTCCATGGAGTGGACTAGCAAATCCTTCC-3’(连接与第1057-1080位区域相同的序列和第1114-1133位区域的互补序列的序列)
序列号15：5’-TTTGCCTGAGTTTGACCCAATAGGACTAGCAAATCCTTCC-3’(连接与第1041-1062位区域相同的序列和第1114-1131位区域的互补序列的序列)
序列号16：5’-GCCTGAGTTTGACCCAATATGGTGGACTAGCAAATCCTTCC-3’(连接与第1044-1064位区域相同的序列和第1114-1133位区域的互补序列的序列)
序列号17：5’-CAGCTGATGTAGAATTTTGCCTGAGTGGACTAGCAAATCCTTCC-3’(连接与第1026-1049位区域相同的序列和第1114-1133位区域的互补序列的序列)
序列号18：5’-GCCTGAGTTTGACCCAATATGAATCGTGGACTAGCAAATCCTTCCAGTG-3’(连接与第1044-1068位区域相同的序列和1110-1133位区域的互补序列的序列)
序列号19：5’-CAGATGAGTACATGGGAGGTCAGCAGACAATCTGCCAAGAGGAGAAG-3’(连接与第825-848位区域相同的序列和第886-908位区域的互补序列的序列)
(R3引物)
序列号20：5’-GAGGCATCCGCTATCCCA-3’(第1138-1155位区域的互补序列)
序列号21：5’-TTTGAGAGGCATCCGCTATC-3’(第1141-1160位区域的互补序列)
序列号22：5’-GGCATCCGCTATCCCAGTA-3’(第1135-1153位区域的互补序列)
序列号23：5’-AGAGGCATCCGCTATCCCA-3’(第1138-1156位区域的互补序列)
序列号24：5’-CTTTGAGAGGCATCCGCTAT-3’(第1142-1161位区域的互补序列)
序列号25：5’-TGGCTGTTGTACTCCTCCAA-3’(第917-936位区域的互补序列)
(环状引物F)
序列号26：5’-GCCTTGGGGTTCTGGATTTGTCA-3’(第994-1016位区域的互补序列)
序列号27：5’-CTGAAGAGGGGAGCCTTGGG-3’(第1009-1028位区域的互补序列)
序列号28：5’-GCCTTGGGGTTCTGGATTTGTCAT-3’(第993-1016位区域的互补序列)
序列号29：5’-TGAAGAGGGGAGCCTTGGG-3’(第1009-1027位区域的互补序列)
序列号30：5’-GGAGCCTTGGGGTTCTGGAT-3’(第1000-1019位区域的互补序列)
序列号31：5’-GCCTTGGGGTTCTGGATTTGTC-3’(第995-1016位区域的互补序列)
序列号32：5’-GGGTTCTGGATTTGTCATGGTTTCC-3’(第986-1010位区域的互补序列)
序列号33：5’-GGGAGCCTTGGGGTTCTGGA-3’(第1001-1020位区域的互补序列)
序列号34：5’-GAGCCTTGGGGTTCTGGATTTGT-3’(第996-1018位区域的互补序列)
序列号35：5’-GCTGAAGAGGGGAGCCTTGG-3’(第1010-1029位区域的互补序列)
序列号36：5’-TCTGGATTTGTCATGGTTTCCAGGA-3’(第982-1006位区域的互补序列)
序列号37：5’-GAGCCTTGGGGTTCTGGATTTGTC-3’(第995-1018位区域的互补序列)
序列号38：5’-TGGGGTTCTGGATTTGTCATGGTT-3’(第989-1012位区域的互补序列)
序列号39：5’-GGGGTTCTGGATTTGTCATGGTTTC-3’(第987-1011位区域的互补序列)
序列号40：5’-TGAAGAGGGGAGCCTTGGGG-3’(第1008-1027位区域的互补序列)
序列号41：5’-CTTGGGGTTCTGGATTTGTCATGGT-3’(第990-1014位区域的互补序列)
序列号42：5’-TGGGGTTCTGGATTTGTCATGGT-3’(第990-1012位区域的互补序列)
序列号43：5’-AGGGGAGCCTTGGGGTTCT-3’(第1004-1022位区域的互补序列)
序列号44：5’-AGAGGGGAGCCTTGGGGTTC-3’(第1005-1024位区域的互补序列)
序列号45：5’-TTGGGGTTCTGGATTTGTCATGGT-3’(第990-1013位区域的互补序列)
序列号46：5’-AGAGGGGAGCCTTGGGGTT-3’(第1006-1024位区域的互补序列)
序列号47：5’-TGGATTTGTCATGGTTTCCAGGAT-3’(第981-1004位区域的互补序列)
序列号48：5’-TGGGGTTCTGGATTTGTCATGGTTT-3’(第988-1012位区域的互补序列)
序列号49：5’-GGGGTTCTGGATTTGTCATGGTT-3’(第989-1011位区域的互补序列)
序列号50：5’-CCTTGGGGTTCTGGATTTGTCATG-3’(第992-1015位区域的互补序列)
序列号51：5’-TGGATTTGTCATGGTTTCCAGGA-3’(第982-1004位区域的互补序列)
序列号52：5’-GGGGTTCTGGATTTGTCATGGTTT-3’(第988-1011位区域的互补序列)
序列号53：5’-TTGGGGTTCTGGATTTGTCATGGTT-3’(第989-1013位区域的互补序列)
序列号54：5’-AGGGGAGCCTTGGGGTTCTG-3’(第1003-1022位区域的互补序列)
序列号55：5’-TGAAGTTTTCATCTCCTGTCAGCTT-3’(第752-776位区域的互补序列)
(环状引物R)
序列号56：5’-AAAGCTGCCAATTTCAGCTTTAG-3’(与第1082-1104位区域相同的序列)
序列号57：5’-AGCTGCCAATTTCAGCTTTAGA-3’(与第1084-1105位区域相同的序列)
序列号58：5’-GCTGCCAATTTCAGCTTTAGAAA-3’(与第1085-1107位区域相同的序列)
序列号59：5’-AAGCTGCCAATTTCAGCTTTAGA-3’(与第1083-1105位区域相同的序列)
序列号60：5’-ATCTGGTTCCATGGATAAAGCTGCC-3’(与第1066-1090位区域相同的序列)
序列号61：5’-AATCTGGTTCCATGGATAAAGCTGC-3’(与第1065-1089位区域相同的序列)
序列号62：5’-CTGGTTCCATGGATAAAGCTGCCAA-3’(与第1068-1092位区域相同的序列)
序列号63：5’-TGGTTCCATGGATAAAGCTGCCAA-3’(与第1069-1092位区域相同的序列)
序列号64：5’-GGTTCCATGGATAAAGCTGCCAAT-3’(与第1070-1093位区域相同的序列)
序列号65：5’-TCCATGGATAAAGCTGCCAATTTCA-3’(与第1073-1097位区域相同的序列)
序列号66：5’-CTGGTTCCATGGATAAAGCTGCCA-3’(与第1068-1091位区域相同的序列)
序列号67：5’-TCTGGTTCCATGGATAAAGCTGCC-3’(与第1067-1090位区域相同的序列)
序列号68：5’-TGAATCTGGTTCCATGGATAAAGCT-3’(与第1063-1087位区域相同的序列)
序列号69：5’-TGGTTCCATGGATAAAGCTGCCA-3’(与第1069-1091位区域相同的序列)
序列号70：5’-CATGGATAAAGCTGCCAATTTCAGC-3’(与第1075-1099位区域相同的序列)
序列号71：5’-GGTTCCATGGATAAAGCTGCCAATT-3’(与第1070-1094位区域相同的序列)
序列号72：5’-CCATGGATAAAGCTGCCAATTTCAG-3’(与第1074-1098位区域相同的序列)
序列号73：5’-TCTGGTTCCATGGATAAAGCTGC-3’(与第1067-1089位区域相同的序列)
序列号74：5’-TGGTTCCATGGATAAAGCTGCCAAT-3’(与第1069-1093位区域相同的序列)
序列号75：5’-CCTAACTTACTCAGCCCAGCATCAT-3’(与第860-884位区域相同的序列)
上述引物中，序列号19所示核苷酸序列构成的引物，可与含有外显子连接点1的区域杂交。
序列号14-18的引物，可与含有外显子连接点2的区域杂交。
上述引物中，可根据扩增区域适当组合F3引物、FIP、RIP以及R3引物，并将其作为含有四种引物的引物对使用。也可以再加上环状引物F和R可以组成含有六种引物的引物对使用。这种引物对的具体例示见以下表1。
[表1]
逆转录酶和链置换型DNA聚合酶可以使用众所周知的酶。也可以使用具有以RNA为模板合成DNA的作用和在进行链置换的同时以DNA为模板合成DNA的作用的一种酶取代这二种酶(逆转录酶和链置换型DNA聚合酶)。
最好还使用为酶反应创造适宜条件的缓冲剂。
上述物质可以分别装在不同的容器中，也可以将逆转录酶和链置换型DNA聚合酶装在同一容器中。dNTPs、缓冲剂以及各种引物中，可以将至少两种物质放在同一个容器中。向用户提供这些试剂时，也可以提供含有上述部分或全部试剂的试剂盒。
[TYR mRNA的检测方法及TYR mRNA检测用试剂盒]
下面说明TYR mRNA的检测方法。本发明的TYR mRNA的检测方法可以通过以下二种途径实现：
使用上述引物对、RNA依赖性DNA聚合酶及DNA依赖性DNA聚合酶(以下称“实施方式1的检测方法”)；或者
使用上述引物对、以及具有以RNA为模板合成DNA作用和边进行链置换边以DNA为模板合成DNA作用的酶(以下称“实施方式2的检测方法”)。
上述实施方式1的检测方法包括以下步骤：
(I-1)使试样、上述引物对及RNA依赖性DNA聚合酶发生反应，由上述试样中的酪氨酸酶mRNA合成cDNA；
(II-1)使上述引物对、DNA依赖性DNA聚合酶和在上述步骤(I-1)合成的cDNA发生反应，扩增cDNA；
(III-1)通过检测在上述步骤(II-1)扩增的cDNA，检测上述试样中的酪氨酸酶mRNA。
上述实施方式2的检测方法包括以下步骤：
(I-2)使试样和上述引物对与具有以RNA为模板合成DNA作用和边进行链置换边以DNA为模板合成DNA作用的酶发生反应，以上述试样中的酪氨酸酶mRNA为模板合成cDNA，并以此cDNA为模板再合成该cDNA，进行扩增；及
(II-2)通过检测在上述步骤扩增的cDNA，检测上述试样中的酪氨酸酶mRNA。
实施方式1和2的检测方法从高效、准确、快速地检测TYR mRNA的角度看，最好使用RT-LAMP法进行。
在上述实施方式1的检测方法中，当使用RT-LAMP法时，通过混合上述引物对、RNA依赖性DNA聚合酶(以下称“逆转录酶”)、有链置换活性的DNA依赖性DNA聚合酶(以下称“链置换型DNA聚合酶”)、dNTPs(包括dATP、dGTP、dTTP及dCTP)及试样，使其进行反应，就可检测出试样中的TYR mRNA。因此，此时上述步骤(I-1)及(II-1)可以一步进行。
另一方面，在上述实施方式2的检测方法中，如果使用RT-LAMP法，则混合上述引物对、具有以RNA为模板合成DNA作用和边进行链置换边以DNA为模板合成DNA作用的酶、dNTPs及试样，使其产生反应，就可检测出试样中的TYRmRNA。
逆转录酶和链置换型DNA聚合酶可以使用众所周知的酶。
另外，实施方式1的检测方法的步骤(I-1)及(II-1)以及实施方式2的检测方法的步骤(I-2)最好还使用为各步骤的酶反应创造适宜条件的缓冲剂。
用于TYR mRNA检测的试样如采自生物体的组织(***、淋巴液、血液等)和粪便等。
在实施方式1的检测方法中，在使用RT-LAMP法的情况下，检测TYR mRNA要经过扩增步骤[上述步骤(I-1)及(II-1)]和检测步骤[上述步骤(III-1)]。
首先，将含有从生物体采集的TYR mRNA的试样与上述引物对、逆转录酶、dNTPs以及链置换型DNA聚合酶混合在一起。再将所得混合物加热到一定温度(例如65℃)，进行RT反应和LAMP反应，以TYR mRNA为模板合成TYR cDNA，同时以此TYR cDNA为模板再合成该TYR cDNA，进行扩增[上述步骤(I-1)及(II-1)]。
RT反应和LAMP反应的反应机理如下：
首先，RIP的第二序列与反应液中TYR mRNA的R2c区域杂交。然后，通过逆转录酶，从该RIP的3’末端开始，以TYR mRNA为模板合成TYR cDNA 。通过这一反应，合成由TYR mRNA与从该RIP延长出的TYR cDNA(RIP延长链)组成的双链核酸。
接着，R3引物与TYR mRNA的R3c区域杂交。由于链置换型DNA聚合酶的作用，从该R3引物的3’末端开始，以TYR mRNA为模板，剥离(置换)已与TYRmRNA结合的上述RIP延长链，同时合成TYR cDNA。
上述RIP延长链为单链状态，具有与TYR mRNA互补的序列，因此，该RIP延长链中包含与TYR mRNA的F2区域互补的F2c区域。FIP的第四序列与此RIP延长链的F2c区域杂交。
然后，由于链置换型DNA聚合酶的作用，以上述RIP延长链为模板从FIP的3’末端开始合成DNA。在此合成的DNA因为在其5’末端有第三序列(与F1区域杂交的多聚核苷酸序列)，该第三序列构成的多聚核苷酸与此DNA上的F1区域杂交，形成茎环结构。此DNA在3’末端有第一序列的互补序列(与R1c区域杂交的序列)，该第一序列的互补序列与此DNA上的R1c区域杂交，形成茎环结构。因此，此DNA形成在5’末端以及3’末端两端有茎环结构的哑铃结构。
上述哑铃结构的DNA(哑铃DNA)以该哑铃DNA中的其他部分为模板，从其3’末端开始，在解开5’末端茎环结构的同时，通过链置换型DNA聚合酶进行延长，获得延长链。这个延伸链在其5’末端、3’末端以及它们的中间部分分别具有相互互补的序列，因此，在该延长链中形成了三个茎环结构。而且，该延长链从其3’末端开始，以该延长链的其他部分为模板，一边解开上述茎环结构，一边通过链置换型DNA聚合酶的作用进行延长。通过这个反应实际上在恒温下反复进行，合成分子中含有多个特定序列的核酸(该反应的具体内容参阅美国专利第6410278号公报以及美国专利第6974670号公报)。
如此获得的扩增产物中的核酸大部分为dsDNA(双链DNA)，因此在检测步骤[上述步骤(III-1)]中，可将这些扩增产物用像溴化乙锭、SYBR(注册商标)GREEN 1、Pico Green(注册商标)等荧光嵌入剂进行荧光染色后，照射紫外线使其产生荧光，来检测该扩增产物。
荧光染色也可通过在扩增反应后[上述步骤(II-1)后]的反应液中添加荧光色素来实施，也可以预先在上述反应液中添加荧光色素，在有荧光色素存在的情况下进行核酸扩增。在检测步骤[上述步骤(III-1)]，可通过是否检测出荧光来判断试样中是否有TYR mRNA。另外，还可以通过测定扩增反应后[上述步骤(II-1)后]的反应液的荧光强度来对扩增产物进行定量，也可以此定量结果为基础，对试样中含有的TYR mRNA进行定量。特别是在荧光色素存在的情况下进行核酸扩增时，通过实时测定反应液中荧光强度的增大，以及测定达到一定荧光强度所需的时间，可以换算出试样中的TYR mRNA含量(实时RT-PCR法、实时RT-LAMP法等)。
此外，在上述步骤(II-1)中的LAMP反应中，会生成不溶于水的副产物焦磷酸镁。该焦磷酸镁随着核酸扩增的进行而增多，反应液随着焦磷酸镁的增多而变得白浊。为此，可以通过i)目视判断反应液的浊度；ii)测定反应液的吸光度及散射光强度来测定其浊度；或iii)使用有色过滤器过滤反应液，确认过滤器上的残渣，检测出靶核酸(参照国际公开第01/83817号)。当通过测定反应液的吸光度或散射光强度来测定浊度时，和上述使用荧光色素时一样，可通过实时监测浊度的变化，在封闭***中追踪DNA扩增以及浊度的增加情况。因此，在检测步骤[上述步骤(III-1)]中，可根据反应液是否白浊化，判断试样中是否存在TYR mRNA。此外，通过测定扩增产物的浊度，可以对该扩增产物定量，根据定量结果，还可以对试样中含有的TYR mRNA进行定量。在实时测定浊度增加的时候，也可以测定到达一定浊度所需要的时间(以下，称为“扩增上升时间”)，再将该时间换算成试样中的TYR mRNA含量。
另一方面，在实施方式2的检测方法中，步骤(I-2)是对应于上述实施方式1的检测方法中的扩增步骤[上述步骤(I-1)和(II-1)]的扩增步骤。此步骤(I-2)除用一种既能以RNA为模板合成DNA又可在进行链置换的同时以DNA为模板合成DNA的酶取代上述步骤(I-1)和(II-1)中的两种酶(逆转录酶和链置换DNA聚合酶)外，其他均可与上述步骤(I-1)和(II-1)相同。
在实施方式2的检测方法中，步骤(II-2)可与上述实施方式1的检测方法中的检测步骤[上述步骤(III-1)]相同。
本发明可提供mRNA检测用试剂盒作为上述步骤(I-1)、步骤(II-1)和步骤(I-2)使用的试剂。该mRNA检测用试剂盒包括上述引物对、dNTPs及兼具以RNA为模板合成DNA功能和在进行链置换同时以DNA为模板合成DNA功能的酶或RNA依赖性DNA聚合酶和DNA依赖性DNA聚合酶。
上述各试剂可以分别装于不同的容器中。逆转录酶和链置换型DNA聚合酶也可以装于同一容器中。也可以将dNTPs、缓冲剂和各种引物中的至少二种试剂装于同一容器中。
下面举实施例详细说明本发明。不过，本发明不限于这些实施例。
(实施例1)
如下验证使用表1中列出的引物对1-45能否检测出TYR mRNA。
(1)制备试样
用无核糖核酸酶(RNase-free)的超纯水对5×1010拷贝/μL的TYR mRNA进行阶段性稀释，制备出2.5×103拷贝/μL的TYR mRNA。
(2)制备反应液
将表1所示F3引物、FIP、RIP以及R3引物按如下配比加入缓冲液[10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCI)(pH8.0)]，制备混合引物(引物MIX)。
16μM FIP
16μM RIP
1μM F3引物
1μM R3引物
12μM 环状引物F
12μM 环状引物R
10mM Tris-HCI(pH8.0)
混合各种试剂，制备出如下配比的RT-LAMP反应用缓冲液。
53m MTris-HCI(pH8.8)
1.8×Thermopol缓冲液(New England Biolabs制)
1.43mM dNTPs(Invitrogen公司制)
5.36mM MgSO4(NACALAI TESQUE(株)制)
8.93mM DTT(和光纯药(株)制)
2体积％Tergitol(Sigma制)
混合各种试剂，制备出配比如下的酶溶液(3.04μL)。
10U/μL AMV逆转录酶(Promega制) 0.14μL
8U/μL Bst DNA聚合酶(New England Biolabs制) 2.27μL
40U/μL Rnase抑制剂(Promega制) 0.63μL
混合各试剂，制备25μL如下配比的反应液。反应液分别针对45种引物对制备。
RT-LAMP反应用缓冲液 14.0μL
酶溶液 3.0μL
混合引物 5.0μL
10mM Tris-HCI(pH8.0) 1.0μL
RNA试样 2.0μL
此外，作为与45种反应液分别对应的阴性对照(NC)，还添加2.0μL超纯水取代2.0μL RNA试样，制备了NC用反应液(45种)。
(3)检测及检测结果
将装有含45种引物对中某一种的反应液的试管放置到预先加温至65℃的浊度实时测定装置(TERAMECS公司制，商品名：LA-200)中。然后，在65℃温度下，培养上述试管中的反应液，进行LAMP反应。测定从反应开始到反应液浊度达到0.1时所需的时间。阴性对照测定进行一次，含RNA试样的反应液测定进行3次(n＝3)。阴性对照测定结果和含RNA试样反应液测定结果的平均值见表2。表中，“NC”表示阴性对照时的测定结果。表中的“-(连字符)”表示在60分钟以内浊度未达到0.1。
[表2]
从表2所示结果可以看出，阴性对照时，60分钟内未发生非特异性核酸扩增，未能检测到TYR mRNA的存在。然而，含RNA试样的反应液中，在60分钟内反应液的浊度达到0.1，故使用本发明一实施方式涉及的引物对1-45种中的任意一种，都能快速检测出TYR mRNA。
Claims (21)
1.一种用于检测试样中的酪氨酸酶mRNA的酪氨酸酶mRNA检测用引物，它在5’末端一侧含有第一序列，在3’末端一侧含有第二序列，
上述第一序列，
(a1)长度为10-30个核苷酸，
(b1)是一种能与序列号1的部分区域——第一区域的互补链杂交的多聚核苷酸序列，
上述第二序列，
(c1)长度为10-30个核苷酸，
(d1)是一种可与在序列号1中比第一区域靠近3’末端一侧的第二区域杂交的多聚核苷酸序列，
上述第二区域含有，
(i)序列号1的第901及902位核苷酸；或
(ii)序列号1的第1118及1119位核苷酸。
2.根据权利要求1所述的引物，其由以下构成，
(A1)序列号14-19中任一所述的核苷酸序列构成的多聚核苷酸；或
(B1)具有将上述(A1)的多聚核苷酸中的一个或多个核苷酸置换、缺失、***、附加的核苷酸序列，并在核酸扩增反应中具有引物功能的多聚核苷酸。
3.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，该引物与以下区域之一杂交：
序列号1的第886-908位区域；
序列号1的第1110-1133位区域；
序列号1的第1114-1131位区域；及
序列号1的第1114-1133位区域。
4.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述第二序列在3’末端含有由与所述第二区域的序列完全互补的连续3个核苷酸构成的序列。
5.一种用于检测试样中的酪氨酸酶mRNA的酪氨酸酶mRNA检测用引物对，包括第一引物、第二引物及第三引物，
所述第一引物是权利要求1所述的引物，
所述第二引物在5’末端一侧含有第三序列，在3’末端一侧含有第四序列，
所述第三序列，
(a2)长度为10-30个核苷酸，
(b2)是一种可与序列号1中比第一区域靠近5’末端一侧的第三区域杂交的多聚核苷酸序列，
所述第四序列，
(c2)长度为10-30个核苷酸，
(d2)是一种可与序列号1中比第三区域靠近5’末端一侧的第四区域的互补链杂交的多聚核苷酸序列，
所述第三引物由可与所述序列号1中比第四区域靠近5’末端一侧的第五区域的互补链杂交的多聚核苷酸序列组成。
6.根据权利要求5所述的引物对，其特征在于，
所述第二引物由以下构成，
(A2)由序列号7-13中任一所述的核苷酸序列构成的多聚核苷酸；或
(B2)具有将所述(A2)的多聚核苷酸中的一个或多个核苷酸置换、缺失、***、附加的核苷酸序列，并在核酸扩增反应中具有引物功能的多聚核苷酸，
所述第三引物由以下构成，
(A3)由序列号2-6中任一所述的核苷酸序列构成的多聚核苷酸；或
(B3)具有将所述(A3)的多聚核苷酸中的一个或多个核苷酸置换、缺失、***、附加的核苷酸序列，并在核酸扩增反应中具有引物功能的多聚核苷酸。
7.根据权利要求5所述的引物对，其特征在于，所述第二引物与以下区域中任一的互补区域杂交：
序列号1的第731-751位区域；
序列号1的第963-977位区域；
序列号1的第964-986位区域；
序列号1的第971-992位区域；
序列号1的第972-992位区域；及
序列号1的第986-1008位区域。
8.根据权利要求5所述的引物对，其特征在于，所述第三引物与以下区域之一的互补区域杂交：
序列号1的第703-722位区域；
序列号1的第931-953位区域；
序列号1的第945-962位区域；
序列号1的第950-962位区域；及
序列号1的第966-985位区域。
9.根据权利要求5所述的引物对，还包括可与比所述序列号1的第二区域靠近3’末端一侧的第六区域杂交的第四引物。
10.根据权利要求9所述的引物对，其特征在于，
所述第四引物由以下构成，
(A4)由序列号20-25中任一所述的核苷酸序列构成的多聚核苷酸；或
(B4)具有将所述(A4)的多聚核苷酸中的一个或多个核苷酸置换、缺失、***、附加的核苷酸序列，并在核酸扩增反应中具有引物功能的多聚核苷酸。
11.根据权利要求9所述的引物对，其特征在于，所述第四引物与以下区域之一杂交：
序列号1的第917-936位区域；
序列号1的第1135-1153位区域；
序列号1的第1138-1155位区域；
序列号1的第1138-1156位区域；
序列号1的第1141-1160位区域；及
序列号1的第1142-1161位区域。
12.根据权利要求5所述的引物对，还包括与位于所述序列号1的所述第三区域和所述第四区域之间的第七区域杂交的第五引物。
13.根据权利要求12所述的引物对，其特征在于，
所述第五引物由以下构成，
(A5)由序列号26-55中任一所述的多聚核苷酸；或
(B5)具有将所述(A5)的多聚核苷酸中的一个或多个核苷酸置换、缺失、***、附加的核苷酸序列，并在核酸扩增中具有引物功能的多聚核苷酸。
14.根据权利要求12所述的引物对，其特征在于，所述第五引物与以下区域之一杂交：
序列号1的第752-776位区域；
序列号1的第981-1004位区域；
序列号1的第982-1004位区域；
序列号1的第982-1006位区域；
序列号1的第986-1010位区域；
序列号1的第987-1011位区域；
序列号1的第988-1011位区域；
序列号1的第988-1012位区域；
序列号1的第989-1011位区域；
序列号1的第989-1012位区域；
序列号1的第989-1013位区域；
序列号1的第990-1012位区域；
序列号1的第990-1013位区域；
序列号1的第990-1014位区域；
序列号1的第992-1015位区域；
序列号1的第993-1016位区域；
序列号1的第994-1016位区域；
序列号1的第995-1016位区域；
序列号1的第995-1018位区域；
序列号1的第996-1018位区域；
序列号1的第1000-1019位区域；
序列号1的第1001-1020位区域；
序列号1的第1003-1022位区域；
序列号1的第1004-1022位区域；
序列号1的第1005-1024位区域；
序列号1的第1006-1024位区域；
序列号1的第1008-1027位区域；
序列号1的第1009-1027位区域；
序列号1的第1009-1028位区域；及
序列号1的第1010-1029位区域。
15.根据权利要求5所述的引物对，还包括与位于所述序列号1的所述第一区域和第二区域之间的第八区域的互补区域杂交的第六引物。
16.根据权利要求15所述的引物对，其特征在于，
所述第六引物由以下构成：
(A6)由序列号56-75中任一所述的多聚核苷酸；或
(B6)具有将所述(A6)的多聚核苷酸中的一个或多个核苷酸置换、缺失、***、附加的核苷酸序列，并在核酸扩增反应中具有引物功能的多聚核苷酸。
17.根据权利要求15所述的引物对，其特征在于，所述第六引物与以下区域之一的互补区域杂交：
序列号1的第860-884位区域；
序列号1的第1063-1087位区域；
序列号1的第1065-1089位区域；
序列号1的第1066-1090位区域；
序列号1的第1067-1089位区域；
序列号1的第1067-1090位区域；
序列号1的第1068-1091位区域；
序列号1的第1068-1092位区域；
序列号1的第1069-1091位区域；
序列号1的第1069-1092位区域；
序列号1的第1069-1093位区域；
序列号1的第1070-1093位区域；
序列号1的第1070-1094位区域；
序列号1的第1073-1097位区域；
序列号1的第1074-1098位区域；
序列号1的第1075-1099位区域；
序列号1的第1082-1104位区域；
序列号1的第1083-1105位区域；
序列号1的第1084-1105位区域；及
序列号1的第1085-1107位区域。
18.一种酪氨酸酶mRNA检测用试剂盒，包括：
权利要求5所述的引物对，
dNTPs，
具有以RNA为模板合成DNA的作用以及边进行链置换边以DNA为模板合成DNA的作用的酶、或RNA依赖性DNA聚合酶及DNA依赖性DNA聚合酶。
19.根据权利要求18所述的酪氨酸酶mRNA检测用试剂盒，其特征在于，
所述第二引物由以下构成，
(A2)由序列号7-13中任一所述的核苷酸序列构成的多聚核苷酸；或
(B2)具有将所述(A2)的多聚核苷酸中的一个或多个核苷酸置换、缺失、***、附加的核苷酸序列，并在核酸扩增反应中具有引物功能的多聚核苷酸，
所述第三引物由以下构成，
(A3)由序列号2-6之一所述的核苷酸序列构成的多聚核苷酸；或
(B3)具有将所述(A3)的多聚核苷酸中的一个或多个核苷酸置换、缺失、***、附加的核苷酸序列，并在核酸扩增反应中具有引物功能的多聚核苷酸。
20.一种酪氨酸酶mRNA检测方法，包括以下步骤：
使试样、权利要求5所述的引物对及RNA依赖性DNA聚合酶发生反应，从所述试样中的酪氨酸酶mRNA合成cDNA；
使所述引物对、DNA依赖性DNA聚合酶和在所述步骤合成的cDNA发生反应，扩增所述cDNA；以及
通过检测在所述步骤扩增的cDNA，检测所述试样中的酪氨酸酶mRNA。
21.一种酪氨酸酶mRNA检测方法，包括以下步骤：
使试样和权利要求5所述的引物对与具有以RNA为模板合成DNA的作用和边进行链置换边以DNA为模板合成DNA的作用的酶发生反应，以所述试样中的酪氨酸酶mRNA为模板合成cDNA，同时以此cDNA为模板再合成该cDNA并进行扩增，及
通过检测在所述步骤扩增的cDNA，检测所述试样中的酪氨酸酶mRNA。
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