CN102037917B - 蛭弧菌蛭质体菌液在斑节对虾养殖中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明特别涉及蛭弧菌蛭质体在斑节对虾等海产品养殖中的应用，其通过在水体和饲料中添加蛭弧菌蛭质体实现。具体包括养殖池塘条件，放养前的准备工作，虾苗选择和放养，投饲管理和养殖期的水环境管理。关键技术是在水体中添加蛭弧菌蛭质体菌液，使水体蛭弧菌蛭质体浓度为101-107pfu/mL，同时饲料要用浓度为101-107pfu/mL的蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min，养殖期间可达30天换水一次。本发明为生物养殖方法，绿色、安全、无污染，效果显著，能够改善水质，促进斑节对虾生长，提高免疫力，提高成活率，有极好的发展前景。对提高经济效益和食用安全性，保障人类健康具有十分重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种细菌的应用，特别涉及蛭弧菌蛭质体菌液在斑节对虾等海产品养殖中的应用。
背景技术
斑节对虾(Penaeus monodon)俗称鬼虾、草虾、花虾、竹节虾、斑节虾、牛形对虾，***粮农组织通称大虎虾。是对虾中个体最大的一种，成熟个体一般体长22.5cm～32cm，体重137g～211g，为当今世界上虾类养殖普遍的品种之一。
目前不排污的养殖方式，造成对虾的***物、残存饲料、浮游生物的残体等有机废物均在池塘中积累，到了养殖的中后期，不可避免地出现底质污染，水体质量下降，条件致病菌和致病菌增多，生态环境恶化，从而引发虾病的发生。因此，在养殖生产中寻求一种新的方法，既可减少换水，又可提高其存活率和生长率，是广大养殖者之所盼。
中草药对斑节对虾生长性能具有无药物残留、经济效益高的优点，但有见效慢的缺点。抗生素对抑制病原微生物的繁殖，减少其代谢毒素对虾的毒害作用等方面起到了积极的作用，但是长期使用抗生素，特别是滥用抗生素，其种种弊端也逐渐显露出来。如破坏虾塘中自然生态平衡，对虾的机体免疫力产生不良影响，产生耐药性和药物残留等副作用，给养殖业和作为消费者的人类的健康都带来了潜在的危害。因此，开发一种简便易行、安全、优质、营养的无公害健康的斑节对虾养殖新技术已经成为当今社会的共识。
蛭弧菌是寄生于其他细菌，并能导致宿主细菌裂解的一类细菌；比一般细菌小，能通过细菌滤器，有类似噬菌体的作用；革兰氏染色呈阴性，可以裂解包括副溶血弧菌、溶藻弧菌等引发虾病害的潜在致病菌。
蛭弧菌的生活史可分为脱离宿主细菌、具有鞭毛、自由游泳的游泳体状态和在宿主细菌内生长发育的蛭质体状态。蛭弧菌游泳体侵入宿主时，在宿主细胞壁上产生一个孔隙，当蛭弧菌侵入到宿主的周质空间后孔隙重新封闭。游泳体失去鞭毛，和宿主细胞一起被称为″蛭质体″。与游泳体相比，蛭质体不仅具有制备、保存更为方便，环境耐受力强，作用时间虽略慢但更久的特点，同时还具有潜在的灭活疫苗功能。当蛭弧菌游泳体入侵宿主细胞后，宿主细胞的呼吸作用(respiration)很快被停止。蛭弧菌也进入蛭质体状态，开始分泌多种酶，消解宿主细胞的大分子为小分子物质，进而整合为自身的营养物质，使自身生长，变长。最终，长条状的蛭质体分成很多短的节段，长出鞭毛，重新成为游泳体。之后，它们分泌必需的酶类，破壁而出，再次成为脱离宿主细菌、具有鞭毛、自由游泳的游泳体。在此蛭质体发育期间，蛭弧菌并不改变宿主细胞的表面结构，使原宿主仍具有免疫原性，可刺激生物体，产生免疫应答反应。这一功能使得应用蛭弧菌蛭质体于斑节对虾养殖中，可提高对虾抗病能力，有效预防对虾弧菌病。
这些特性使得蛭弧菌蛭质体适合作为一种微生物制剂，以应用于对虾的养殖过程中。笔者通过实验，证明了蛭弧菌蛭质体在成虾养殖过程中能够明显地提高虾的存活率、免疫力以及促进虾生长。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的弊端，提供蛭弧菌蛭质体菌液在斑节对虾养殖中的应用方法。其特征按照养殖生态学原理，海洋生物的生长环境要求，生物之间的相互关系及无公害养殖标准，人工创造养殖环境，减少投入成本，提高斑节对虾免疫力，促进斑节对虾快速生长，提高经济效益。
本发明的目的通过下述方案实现：
蛭弧菌蛭质体菌液在斑节对虾养殖中的应用。
所述蛭弧菌蛭弧菌为(Bdellovibrio sp.)BDFM05，于2009年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 209172。
所述蛭弧菌蛭质体菌液在斑节对虾养殖中的应用是将饲料在蛭弧菌蛭质体菌液中浸泡15-45min。
所述蛭弧菌蛭质体菌液在斑节对虾养殖中的应用是在水体中添加蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭弧菌蛭质体浓度为101～107pfu/mL。
所述蛭弧菌蛭质体菌液的制备方法为：
接种宿主于营养肉汤液体培养基中，在35℃和200rpm摇床培养12h，培养液经4℃，5000～8000rpm离心10～20min后，沉淀加入至DNB液体培养基中，接入蛭弧菌BDFM05，在温度25～35℃下，以150～300rpm摇床培养36～48h，得到含蛭弧菌蛭质体和蛭弧菌游泳体的培养液，培养液在4℃温度下以6000～8000rpm离心15～20min后，去除含蛭弧菌游泳体的上清，得到的沉淀即为蛭弧菌蛭质体；将蛭弧菌蛭质体用DNB液体培养基、水、生理盐水或0.2mol/L pH值为7.2～7.6的磷酸盐缓冲液悬浮，得到浓度为1011～1012pfu/mL的蛭弧菌蛭质体菌液。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
1、蛭弧菌蛭质体对致病或潜在致病菌有较强的裂解力，而且能改善养殖生物肠道环境，促进生长。因此，与现有斑节对虾养殖方法相比，本发明具有使虾抗病能力强，存活率提高，生长快等特点。
2、本发明采用蛭弧菌蛭质体预防和调节、环境调控相结合的方案，达到了提高斑节对虾的免疫力，促进斑节对虾摄食和快速生长，最长可达到30天不换水，降低生产成本，提高经济效益的效果。
3、本发明所述蛭弧菌蛭质体菌液在斑节对虾的应用中安全性好，现有的研究表明蛭弧菌对虾类无毒性作用，对人类无致病性。
4、本发明所述蛭弧菌蛭质体潜在灭活疫苗功能可刺激对虾产生免疫应答反应，可提高对虾抗病能力，有效预防对虾弧菌病。
因此，此方法也可以推广到其他的虾或水产动物的养殖，增加经济效益，是新时期渔业增效农民增收的可靠技术支撑。
具体实施方式
下面结合实施例及表格对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1蛭弧菌蛭质体菌液的制备
所述的蛭质体通过以下方法得到：在含有副溶血弧菌(接种浓度为107cfu/mL的菌1mL)(Vibrio parahaemolyticus，购于美国典型物种保藏中心American Type Culture Collection，ATCC 17802)的1L DNB(dilute nutrient broth)液体培养基(营养肉汤0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母精提物0.1g，溶于1000mL蒸馏水中，pH值为7.6)中接入1mL浓度为103pfu/mL蛭弧菌，于28℃、250rpm培养48h，培养液经4℃ 6000rpm离心15min后，去除上清，沉淀用100mL DNB悬浮，即得蛭质体；蛭弧菌BDFM05蛭质体菌体的浓度达到109pfu/mL。
实施例2蛭弧菌蛭质体菌液在斑节对虾普通养殖中的应用实验
本发明的具体实施地点为华南地区某养殖场，实施时间为3个月。
(1)养殖池塘条件，养殖池底面积为10亩，池深2m，池底为泥沙质，池底平整，养殖池配备水泵、增氧机，并配备泵站闸门和较完备的进排水***；
(2)放养前的准备，试验地海域的水源水质符合中华人民共和国国家标准渔业水质标准(GB11607-89)要求，海水经过砂滤、沉淀处理后进入养殖池，符合农业部《无公害食品海水养殖用水水质》(NY5052-2001)要求。放苗前10天，用80目的袖状网过滤后进水，同时施氮、磷、钾复合肥培养饵料生物，使池水透明度达到40cm，养殖池水盐度10‰；
(3)虾苗选择与放养，虾苗选择个体大小整齐，体长1.1-1.3cm的黑壳虾苗，群体发育整齐，肌肉饱满透明，附肢中色素正常，胃肠充满食物，虾苗活动活泼，对水流刺激反应灵敏，无外部寄生物及附着污物，放苗时水温20℃，3月20日放苗。养成池水色为黄绿色、透明度30cm，pH在8.5，投放密度为5万只/亩。虾苗运至养殖池边，用充氧气头向苗袋内充氧半小时，同时逐步加入塘内池水，使逐步缩小温差和醒苗；
(4)投饲管理，配合饲料1号(购买于广东恒兴集团有限公司，下同)为常规的对虾养殖饲料，符合中华人民共和国农业行业标准《无公害食品渔用配合饲料安全限量》(NY5072-2002)的规定。每次投饵前，将配合饲料1号用蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min，菌液中的蛭弧菌蛭质体的浓度达到101、103、105、107pfu/mL，养殖前期和中期，虾平均体长6cm以下时，日投2次，日投放量控制在虾重的15％；养殖后期，平均体长达到6cm时，日投5次，日投放量控制在虾重的8％；
(5)养殖期的水环境管理，养殖期间正常曝气，使水中溶解氧达到5mg/L。采取不同换水周期，5、10、15、20、25、30天换水一次，每次换水控制在25cm深的水量，透明度保持在30cm，每次换水后加蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中的菌体浓度达到101、103、105、107pfu/mL，加菌方法为：用相应的池水稀释菌液后，均匀泼洒全池，使菌液混合均匀。
实验分组
采用随机区组试验设计，平均分为A-D4个试验组，B、C、D每个试验组有6个小组，分别为B1、C1、D1；B2、C2、D2；B3、C3、D3；B4、C4、D4；B5、C5、D5；B6、C6、D6；B1-D6每小组再分为4组，即B1-1-B1-4...D6-1-D6-4，每组2个重复。对5组试验对虾初始体重进行方差整齐性检验，组间差异不显著(P＞0.05)。五组试验组的处理如下：
A组：工厂生产的养殖方式，池塘水透明度低于20cm时进行换水，每次换水换掉50cm深的水(量)，维持池水透明度在35cm，投放配合饲料1号
B组：在水体中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭质体菌体浓度分别达到101、103、105、107pfu/mL，投放配合饲料1号
C组：投喂经浓度为101、103、105、107pfu/mL的蛭弧菌蛭质体菌液浸泡后的配合饲料1号
D组：在水体中加入蛭弧菌蛭质体菌液，使菌体浓度分别达到101、103、105、107pfu/mL，同时分别投喂经浓度为101、103、105、107pfu/mL的蛭弧菌蛭质体菌液浸泡后的配合饲料1号
B1、C1、D1组每5天换水一次，换掉25cm深的水(量)
B2、C2、D2组每10天换水一次，换掉25cm深的水(量)
B3、C3、D3组每15天换水一次，换掉25cm深的水(量)
B4、C4、D4组每20天换水一次，换掉25cm深的水(量)
B5、C5、D5组每25天换水一次，换掉25cm深的水(量)
B6、C6、D6组每30天换水一次，换掉25cm深的水(量)
B1-1、C1-1、D1-1...D6-1换水后加入蛭弧菌蛭质体菌液使水体中菌体浓度为101pfu/mL
B1-1、C1-2、D1-2...D6-2换水后加入蛭弧菌蛭质体菌液使水体中菌体浓度为103pfu/mL
B1-1、C1-3、D1-3...D6-3换水后加入蛭弧菌蛭质体菌液使水体中菌体浓度为105pfu/mL
B1-1、C1-4、D1-4...D6-4换水后加入蛭弧菌蛭质体菌液使水体中菌体浓度为107pfu/mL
斑节对虾实验效果检测
(1)生长指标的测定
每组随机抽取50尾对虾检测生长情况，对虾长度测定采用精度为0.1mm的游标卡尺度量，体重采用电子天平称量。试验生长指标按如下公式计算：
成活率(％)＝Nt/No×100％；
增重率(％)＝(Wt-Wo)/Wo×100％；
体长增长率(％)＝(Lt-Lo)/Lo×100％；
式中No为试验开始时斑节对虾总尾数；Nt为试验结束时斑节对虾总尾数；Wo为试验开始时斑节对虾体重；Wt为试验结束时斑节对虾体重；Lo为试验开始时斑节对虾体长；Lt为试验结束时斑节对虾体长；
试验测得的斑节对虾各项生长指标见表一～表四：与A组相比，B、C、D组的成活率、增重率、体长增长率均有明显提高，B、C、D组成活率的增加值分别≥25.08％、25.78％、28.55％；增重率的增加值分别≥40.54％、65.62％、86.35％；体长增长率增加值分别≥0.09％、0.17％、3.19％。
从表一-表四可以看出，在对虾养殖过程中，在相同的换水周期下，随着蛭弧菌蛭质体的浓度升高，成活率、增重率、体长增长率都明显升高，且都明显高于工厂生产对照A组，说明采用新型的添加蛭弧菌蛭质体的方法，能明显提高斑节对虾的成活率、增重率、体长增长率，这在实际生产过程中，不仅大大节约了用水量，而且节省了大量的人力，物力资源，节约了养殖成本；从不同换水周期来看，相同浓度下的各组对虾成活率、增重率、体长增长率没有显著的变化。说明新型养殖方法下，5-30天不换水蛭弧菌蛭质体都能催进对虾的生长。就B、C、D三组不同处理方式而言，均提高对虾的养殖成活率、增重率和体长增长率，但同时在水体与饲料中添加蛭弧菌蛭质体菌液效果最佳。
因此，无论在水中添加蛭弧菌蛭质体菌液，使水体蛭弧菌蛭质体菌液浓度为101-107pfu/mL，或者是在饲料中添加浓度为101-107pfu/mL蛭弧菌游泳质体菌液，或是两者兼用，虽长达30天不换水，都会促进斑节对虾的摄食和快速生长，并且同时在水中与饲料中添加菌液的效果最好。
表一斑节对虾生长指标的检测
表二斑节对虾生长指标的检测
表三斑节对虾生长指标的检测
表四斑节对虾生长指标的检测
(2)、免疫指标的检测
用1mL的无菌注射器自对虾心脏抽取血液，每组抽取50尾对虾血液合并置于无菌离心管中4℃静置过夜后，3000r/min离心10min，取上层血清置于-80℃超低温冰箱保存待测。
1、溶菌酶活力测定血清溶菌酶活性通过浊度比色法测定(Ellis A E.Lysozyme assays.[M]//Stolen J S，Fletcher T C，Anderson D P，et al.Techniques in Fish Immunology I.USA：SOS Publications，1990：101-103.)
实验条件下，每mL血清每min吸光值减少0.001为1个酶活性单位(U)。
2、酚氧化酶(PO)活力的测定
酚氧化酶活性测定采用Hernández-López等(Hernández-LópezJ，Gollas-Galvan T.Vargas-Albores F.Activation of the prophenoloxidasesystem of the brown Penaeus californiensis Holmes[J].Comp BiochemPhysiol，1996.113C：61-66.)的方法。以实验条件下，每mL血清每min吸光增加0.001，定义为1个酶活性单位(U)。
3、超氧化物歧化酶(SOD)活力
超氧化物歧化酶(SOD)活力测定采用YI Sun等(A Simple Methodfor Clinical Assay of Superoxide Dismutase[J].Clin.Chem.1988：497-500)的方法。一个酶活力单位定义为：在试验条件下，硝基四氮唑溶液(NBT)被SOD抑制50％所需的酶蛋白量。
斑节对虾各项免疫指标的测定结果见表五～表八：
从表中可以看出，与A组相比，B、C、D组的溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力、酚氧化酶活力均有明显提高。B、C、D组溶菌酶活力增加值分别≥8.19U/mL、9.28U/mL、9.9U/mL；超氧化物歧化酶活力增加值分别≥53.58U/mL、79.98U/mL、97.48U/mL；酚氧化酶活力增加值分别≥10.1U/mL、10.8U/mL、11U/mL。
从表五～表八可以看出，在斑节对虾养殖过程中，在相同的换水周期下，随着蛭弧菌蛭质体的浓度升高，成活率都明显升高，且都明显高于工厂生产对照A组，说明采用新型的添加蛭弧菌蛭质体的方法，能明显提高斑节对的免疫力，增强酶的活力，这在实际生产过程中，不仅节约了养殖成本，而且增强对虾的免疫能力，促进生长；从不同换水周期来看，相同浓度下的各组对虾酶活力没有显著差异，说明新型对虾养殖方法下，5-30天不换水蛭弧菌蛭质体都能提高对虾免疫力。就B、C、D三组不同处理方式而言，均提高免疫力，但同时在水体与饲料中添加蛭弧菌蛭质体菌液效果最佳。
因此，无论在水中添加蛭弧菌蛭质体菌液，使水体蛭弧菌蛭质体菌体浓度为101-107pfu/mL，或者是在饲料中添加浓度为101-107pfu/mL蛭弧菌蛭质体菌液，或是两者兼用，虽长达30天不换水，都能够显著提高斑节对虾的溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力、酚氧化酶活力等免疫指标，在水中和饲料中同时添加，效果更佳。5-30天之间换水，对溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力、酚氧化酶活力均无明显影响。
表五免疫指标的测定结果
表六免疫指标的测定结果
表七免疫指标的测定结果
表八免疫指标的测定结果
(3)、水质检测
1、氨态氮用次溴酸纳氧化法测定(GB12763.4-91)；
2、亚硝酸盐氮用重氮-偶氮光度法测定(GB12763.4-91)
3、H2S用对二甲氨基苯胺分光光度法测定(GB16489-1996)
经过测定，A组水池中的各项水质测定值均高于试验组B、C、D的。其中，A组氨态氮的检测结果为0.506mg/L，高于B组的0.431-0.456mg/L，C组的0.467-0.492mg/L，D组的0.403-0.441mg/L；A组亚硝酸盐氮检测结果为0.015mg/L，高于B组的0.008-0.009mg/L，C组的0.011-0.013mg/L，D组的0.007-0.008mg/L；A组H2S检测结果为0.2mg/L，高于B组的0.056-0.137mg/L，C组的0.114-0.179mg/L，D组的0.024-0.106mg/L；由以上结果分析可知，应用浓度为101-107pfu/mL蛭弧菌蛭质体可有效改善养殖水体环境，调节水中氨态氮、亚硝酸盐氮、H2S的含量，从而提供有利于斑节对虾生存的水体环境，并且同时在水体和饲料中添加蛭弧菌蛭质体的效果最佳。
(4)、细菌数测定：
1、菌落总数用营养琼脂培养基检测(GB4789.2-2010)
2、弧菌总数用TCBS培养基检测(SN/T 0173-2010)
3、pH用PHB-3便携式pH计测定
工厂生产对照A组的总细菌数和总弧菌数分别高达4.63×103cfu/mL和6.09×102cfu/mL。B、C、D组的总细菌数分别为4.15×102cfu/mL、4.34×102cfu/mL、4.21×102cfu/mL；总弧菌数8.2×10cfu/mL、7.8×10cfu/mL、6.6×10cfu/mL，与A组比明显都降低了1个数量级。各组的pH都在7.5-9之间，变化不大。
说明蛭弧菌蛭质体能有效控制水体的细菌数，并达到改善水质的目的。综合来看，添加蛭弧菌蛭质体，能明显的提高斑节对虾，增强对虾的免疫力，而且能够改善水质，达到节水节能、提高成活率的良好效果。
同时，由实验数据可知无论在水中添加蛭弧菌蛭质体菌液，使水体蛭弧菌蛭质体菌液浓度为101-107pfu/mL，或者是在饲料中添加浓度为101-107pfu/mL蛭弧菌蛭质体菌液，或是两者兼用，虽长达30天不换水，但也可促进对虾成活，增强免疫力，提高养殖期抗病能力，并且在水体和饲料中同时添加蛭弧菌蛭质体菌液效果最好。
(5)感染实验
感染试验于预先消毒的盛有5L砂滤海水(盐度10‰)的水池中进行。从实验A组、B1-1、B1-2...D6-3、D6-4共73组中每个组随机取对虾50只，规格体长20～25cm。向各组水体中添加副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，购于美国典型物种保藏中心AmericanType Culture Collection，ATCC 17802)使水体中副溶血弧菌浓度达到108cfu/mL；A组为该实验的对照组。实验期间正常投饵，连续充气培养。人工感染后，连续观察7天，最终计算成活率，采用相对存活率(Relative Percentage Survival，RPS)计算式：
RPS(％)＝(1-免疫组死亡率/对照组死亡率)×100％
表九攻毒感染实验相对存活率
感染实验的结果显示，A组的相对存活率(Relative PercentSurvival，RPS)为0，与A组相比，B、C、D组的相对存活率均有明显提高，B、C、D组相对存活率的增加值分别≥93.2％、86.6％、100％。
从表可以看出，在对虾感染实验过程中，在相同的换水周期下，随着蛭弧菌蛭质体的浓度升高，相对存活率逐渐升高，且都明显高于工厂生产对照A组，说明采用新型的添加蛭弧菌蛭质体的方法，能明显提高斑节对虾的相对存活率，即提高对虾免疫抵抗力；从不同换水周期来看，相同浓度下的各组对虾相对存活率没有显著的变化。说明新型养殖方法下，5-30天不换水蛭弧菌蛭质体都能增强对虾的生免疫能力。就B、C、D三组不同处理方式而言，均提高对虾的相对存活率，但同时在水体与饲料中添加蛭弧菌蛭质体菌液效果最佳。
因此，无论在水中添加蛭弧菌蛭质体菌液，使水体蛭弧菌蛭质体菌液浓度为101-107pfu/mL，或者是在饲料中添加浓度为101-107pfu/mL蛭弧菌蛭质体菌液，或是两者兼用，虽长达30天不换水，都会提高斑节对虾免疫抵抗力，并且同时在水中与饲料中添加菌液的效果最好。从而进一步表明蛭弧菌蛭质体具有潜在的疫苗作用，能够刺激对虾产生免疫应答反应，抵御副溶血弧菌的侵害，有助于提高对虾的成活率。
实施例3蛭弧菌蛭质体在斑节对虾高位池养殖中的应用实验
(1)虾池结构为88m×83m×2.2m，四角为圆角，每个虾池面积为10亩，呈东西方向水平一字型排列。虾池之间距离为5m，海拔高度为10m，虾池四周采用水泥混凝土护坡，池底铺设塑料薄膜，然后在膜上再覆盖沙35cm。
海区最低低潮线挖井，铺设管道至泵，房距离为72m，采用100cm混凝土管；泵房采用3台型号为8BA18、功率为22kW/台的抽水泵，抽水至虾池，距离为110m，采用60cm×70cm明渠，再通过40cm×60cm明渠引水进入各个虾池。采用水车式增氧机，功率为1·1kW/台，每亩水面放置1台。
(2)放苗前1个月，用高压水枪冲洗塘底淤泥，并进行清理，然后干塘晒池15d后，每亩泼洒生石灰150kg，进水30cm浸泡消毒，继续加水90cm，并同时进行施肥，主要投放尿素15kg/亩，磷肥10kg/亩，进行肥水，约3d，水体透明度达到35cm便可放苗。
(3)虾苗选择与放养，虾苗选择个体大小整齐，体长1.0-1.2cm的黑壳虾苗，群体发育整齐，肌肉饱满透明，附肢中色素正常，胃肠充满食物，虾苗活动活泼，对水流刺激反应灵敏，无外部寄生物及附着污物，放苗时水温20℃，养殖池水盐度10‰，放苗时间与普通养殖同步进行。养成池水色为黄绿色、透明度30cm，pH在8.5，投放密度为5.5万只/亩。虾苗运至养殖池边，用充氧气头向苗袋内充氧半小时，同时逐步向袋内加入养殖池水，使逐步缩小温差和醒苗；
(4)投饲管理，饲料(配合饲料1号)为常规的对虾养殖饲料，符合中华人民共和国农业行业标准《无公害食品渔用配合饲料安全限量》(NY5072-2002)的规定。每次投饵前，将饲料用蛭弧菌蛭质体菌液浸泡30min，菌液中的蛭弧菌蛭质体的浓度达到101、103、105、107pfu/mL，养殖前期和中期，虾平均体长6cm以下时，日投2次，日投放量控制在虾重的15％；养殖后期，体平均长达到6cm时，日投5次，日投放量控制在虾重的8％；
(5)养殖期的水环境管理，养殖期间正常曝气，使水中溶解氧达到5mg/L。采取不同换水周期，5、10、15、20、25、30天换水一次，每次换掉25cm深的水(量)，透明度保持在30cm，每次换水后加蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中的菌体浓度达到101、103、105、107pfu/mL，加菌方法为：用相应的池水稀释菌液后，均匀泼洒全池，使菌液混合均匀。
实验分组
采用随机区组试验设计，平均分为A-D 4个试验组，B、C、D每个试验组有6个小组，分别为B1、C1、D1；B2、C2、D2；B3、C3、D3、；B4、C4、D4；B5、C5、D5；B6、C6、D6；B1-D6每小组再分为4组，即B1-1-B1-4...D6-1-D6-4，每组2个重复。对4组试验对虾初始体重进行方差检验，组间差异不显著(P＞0.05)。四组试验组的处理如下：
A组：工厂生产的养殖方式，饲养前期，每7d排污一次，饲养中期每2d排污一次，饲养后期增加排污次数，水色加深变为深褐色时便排污。为补足因蒸发及排污损失的水量，向试验池添加淡水。投放颗粒饲料(配合饲料1号)
B组：在水中泼洒蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭质体菌体浓度分别达到101、103、105、107pfu/mL，投放颗粒饲料(配合饲料1号)
C组：投喂浓度为101、103、105、107pfu/mL的蛭弧菌蛭质体菌体浸泡后的颗粒饲料(配合饲料1号)
D组：在水中加入蛭弧菌蛭质体菌液，使菌体浓度分别达到101、103、105、107pfu/mL，同时分别投喂浓度为101、103、105、107pfu/mL的蛭弧菌蛭质体菌液浸泡后的颗粒饲料(配合饲料1号)；
B1、C1、D1组每5天换水一次，换掉25cm深的水(量)
B2、C2、D2组每10天换水一次，换掉25cm深的水(量)
B3、C3、D3组每15天换水一次，换掉25cm深的水(量)
B4、C4、D4组每20天换水一次，换掉25cm深的水(量)
B5、C5、D5组每25天换水一次，换掉25cm深的水(量)
B6、C6、D6组每30天换水一次，换掉25cm深的水(量)
B1-1、C1-1、D1-1...D6-1换水后加入蛭弧菌蛭质体使水体中菌体浓度为101pfu/mL
B1-2、C1-2、D1-2...D6-2换水后加入蛭弧菌蛭质体使水体中菌体浓度为103pfu/mL
B1-3、C1-3、D1-3...D6-3换水后加入蛭弧菌蛭质体使水体中菌体浓度为105pfu/mL
B1-4、C1-4、D1-4...D6-4换水后加入蛭弧菌蛭质体使水体中菌体浓度为107pfu/mL
斑节对虾实验效果检测
(1)生长指标的测定
每组随机抽取50尾对虾检测生长情况，对虾长度测定采用精度为0.1mm的游标卡尺度量，体重采用电子天平称量。试验生长指标按如下公式计算：
成活率(％)＝Nt/No×100％；
增重率(％)＝(Wt-Wo)/Wo×100％；
体长增长率(％)＝(Lt-Lo)/Lo×100％；
式中No为试验开始时斑节对虾总尾数；Nt为试验结束时斑节对虾总尾数；Wo为试验开始时斑节对虾体重；Wt为试验结束时斑节对虾体重；Lo为试验开始时斑节对虾体长；Lt为试验结束时斑节对虾体长；
试验测得的斑节对虾各项生长指标见表十-表十三：从表中可以看出，与A组相比，B、C、D组的成活率、增重率、体长增长率均有明显提高，B、C、D组成活率的增加值分别≥43.58％、44.58％、48.55％；增重率的增加值分别≥55.54％、80.62％、101.3％；体长增长率增加值分别≥5.04％、4.99％、4.99％。
从表十-表十三可以看出，在对虾高位池养殖过程中，在相同的换水周期下，随着蛭弧菌蛭质体的浓度升高，成活率、增重率、体长增长率都明显升高，且都明显高于工厂生产对照A组，说明采用新型的添加蛭弧菌蛭质体的方法，能明显提高斑节对虾的成活率、增重率、体长增长率，这在实际生产过程中，不仅大大节约了用水量，而且节省了大量的人力，物力资源，节约了养殖成本；从不同换水周期来看，相同浓度下的各组对虾成活率、增重率、体长增长率没有显著的变化。说明新型养殖方法下，5-30天不换水蛭弧菌蛭质体都能催进对虾的生长。就B、C、D三组不同处理方式而言，均提高对虾的养殖成活率、增重率和体长增长率，但同时在水体与饲料中添加蛭弧菌蛭质体菌液效果最佳。
因此，无论在水中添加蛭弧菌蛭质体菌液，使水体蛭弧菌蛭质体菌体浓度为101-107pfu/mL，或者是在饲料中添加浓度为101-107pfu/mL蛭弧菌游泳质体菌液，或是两者兼用，虽长达30天不换水，都会促进斑节对虾的摄食和快速生长，并且同时在水中与饲料中添加菌液的效果最好。
表十斑节对虾生长指标的检测
表十一斑节对虾生长指标的检测
表十二斑节对虾生长指标的检测
表十三斑节对虾生长指标的检测
(2)、免疫指标的检测
用1mL的无菌注射器自对虾心脏抽取血液，每组抽取50尾对虾血液合并置于无菌离心管中4℃静置过夜后，3000r/min离心10min，取上层血清置于-80℃超低温冰箱保存待测。
1、溶菌酶活力测定血清溶菌酶活性通过浊度比色法测定(Ellis A E.Lysozyme assays.[M]//Stolen J S，Fletcher T C，Anderson D P，et al.Techniques in Fish Immunology I.USA：SOS Publications，1990：101-103.)
实验条件下，每mL血清每min吸光值减少0.001为1个酶活性单位(U)。
2、酚氧化酶(PO)活力的测定
酚氧化酶活性测定采用Hernández-López等(Hernández-LópezJ，Gollas-Galvan T.Vargas-Albores F.Activation of the prophenoloxidasesystem of the brown Penaeus californiensis Holmes[J].Comp BiochemPhysiol，1996.113C：61-66.)的方法。以实验条件下，每mL血清每min吸光增加0.001，定义为1个酶活性单位(U)。
3、超氧化物歧化酶(SOD)活力
超氧化物歧化酶(SOD)活力测定采用YI Sun等(A Simple Methodfor Clinical Assay of Superoxide Dismutase[J].Clin.Chem.1988：497-500)的方法。一个酶活力单位定义为：在试验条件下，硝基四氮唑溶液(NBT)被SOD抑制50％所需的酶蛋白量。
斑节对虾各项免疫指标的测定结果见表十四～表十七：
从表中可以看出，与A组相比，B、C、D组的溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力、酚氧化酶活力均有明显提高。B、C、D组溶菌酶活力增加值分别≥11.09U/mL、12.18U/mL、12.8U/mL；超氧化物歧化酶活力增加值分别≥53.58U/mL、79.98U/mL、97.48U/mL；酚氧化酶活力增加值分别≥12.1U/mL、11.8U/mL、12U/mL。
在斑节对虾高位池养殖过程中，在相同的换水周期下，随着蛭弧菌蛭质体的浓度升高，成活率都明显升高，且都明显高于工厂生产对照A组，说明采用新型的添加蛭弧菌蛭质体的方法，能明显提高斑节对的免疫力，增强酶的活力，这在实际生产过程中，不仅节约了养殖成本，而且增强对虾的免疫能力，促进生长；从不同换水周期来看，相同浓度下的各组对虾酶活力没有显著差异，说明新型对虾养殖方法下，5-30天不换水蛭弧菌蛭质体都能提高对虾免疫力。就B、C、D三组不同处理方式而言，均提高免疫力，但同时在水体与饲料中添加蛭弧菌蛭质体菌液效果最佳。
因此，无论在水中添加蛭弧菌蛭质体菌液，使水体蛭弧菌蛭质体菌体浓度为101-107pfu/mL，或者是在饲料中添加浓度为101-107pfu/mL蛭弧菌蛭质体菌液，或是两者兼用，虽长达30天不换水，都能够显著提高斑节对虾的溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力、酚氧化酶活力等免疫指标，在水中和饲料中同时添加，效果更佳。5-30天之间换水，对溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力、酚氧化酶活力均无明显影响。
表十四免疫指标的测定结果
表十五免疫指标的测定结果
表十六免疫指标的测定结果
表十七免疫指标的测定结果
(3)、水质检测
1、氨态氮用次溴酸纳氧化法测定(GB12763.4-91)；
2、亚硝酸盐氮用重氮-偶氮光度法测定(GB12763.4-91)
3、H2S用对二甲氨基苯胺分光光度法测定(GB16489-1996)
经过测定，A组水池中的各项水质测定值均高于试验组B、C、D的。其中，A组氨态氮的检测结果为0.516mg/L，高于B组的0.441-0.466mg/L，C组的0.47-0.502mg/L，D组的0.413-0.451mg/L；A组亚硝酸盐氮检测结果为0.016mg/L，高于B组的0.009-0.01mg/L，C组的0.012-0.014mg/L，D组的0.008-0.009mg/L；A组H2S检测结果为0.21mg/L，高于B组的0.066-0.147mg/L，C组的0.124-0.189mg/L，D组的0.034-0.116mg/L；由以上结果分析可知，应用浓度为101-107pfu/mL蛭弧菌蛭质体可有效改善养殖水体环境，调节水中氨态氮、亚硝酸盐氮、H2S的含量，从而提供有利于斑节对虾生存的水体环境，并且同时在水体和饲料中添加蛭弧菌游泳体的效果最佳。
(4)、细菌数检测：
1、菌落总数用营养琼脂培养基检测(GB4789.2-2010)
2、弧菌总数用TCBS培养基检测(SN/T 0173-2010)
3、pH用PHB-3便携式pH计测定
工厂生产A组的总细菌数和总弧菌数分别高达5.33×103cfu/mL和7.89×102cfu/mL。B、C、D组的总细菌数分别为4.14×102cfu/mL、3.79×102cfu/mL、4.11×102cfu/mL；总弧菌数6.5×10cfu/mL、6.4×10cfu/mL、6.1×10cfu/mL，与A组比明显都降低了1个数量级。说明蛭弧菌蛭质体能有效控制水体的细菌数，并达到改善水质的目的。综合来看，添加蛭弧菌蛭质体，能明显的提高对虾的体质，增强对虾的免疫力，而且能够改善水质，达到节水节能、提高成活率的良好效果。
同时，由实验数据可知无论在水中添加蛭弧菌蛭质体菌液，使水体蛭弧菌蛭质体菌体浓度为101-107pfu/mL，或者是在饲料中添加浓度为101-107pfu/mL蛭弧菌蛭质体菌液，或是两者兼用，虽长达30天不换水，但也可促进斑节对虾成活，增强免疫力，提高养殖期抗病能力，并且在水体和饲料中同时添加蛭弧菌蛭质体菌液效果最好。
(5)感染实验
感染试验于预先消毒的盛有5L砂滤海水(盐度10‰)的水池中进行。从实验A组、B1-1、B1-2...D6-3、D6-4共73组中每个组随机取对虾50只，规格体长20～25cm。向各组水体中添加副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，购于美国典型物种保藏中心AmericanType Culture Collection，ATCC 17802)使水体中副溶血弧菌浓度达到108cfu/mL；A组为该实验的对照组。实验期间正常投饵，连续充气培养。人工感染后，连续观察7天，最终计算成活率，采用相对存活率(Relative Percentage Survival，RPS)计算式：
RPS(％)＝(1-免疫组死亡率/对照组死亡率)×100％
表十八攻毒感染实验相对存活率
感染实验的结果显示，A组的相对存活率(Relative PercentSurvival，RPS)为0，与A组相比，B、C、D组的相对存活率均有明显提高，B、C、D组相对存活率的增加值分别≥93.2％、86.6％、100％。
从表可以看出，在对虾感染实验过程中，在相同的换水周期下，随着蛭弧菌蛭质体的浓度升高，相对存活率逐渐升高，且都明显高于工厂生产对照A组，说明采用新型的添加蛭弧菌蛭质体的方法，能明显提高斑节对虾的相对存活率，即提高对虾免疫抵抗力；从不同换水周期来看，相同浓度下的各组对虾相对存活率没有显著的变化。说明新型养殖方法下，5-30天不换水蛭弧菌蛭质体都能增强对虾的生免疫能力。就B、C、D三组不同处理方式而言，均提高对虾的相对存活率，但同时在水体与饲料中添加蛭弧菌蛭质体菌液效果最佳。
因此，无论在水中添加蛭弧菌蛭质体菌液，使水体蛭弧菌蛭质体菌液浓度为101-107pfu/mL，或者是在饲料中添加浓度为101-107pfu/mL蛭弧菌蛭质体菌液，或是两者兼用，虽长达30天不换水，都会提高斑节对虾免疫抵抗力，并且同时在水中与饲料中添加菌液的效果最好。从而进一步表明蛭弧菌蛭质体具有潜在的疫苗作用，能够刺激对虾产生免疫应答反应，抵御副溶血弧菌的侵害，有助于提高对虾的成活率。
由此可见，无论是普通养殖还是高位池养殖，在水中添加蛭弧菌蛭质体菌液，使水体蛭弧菌蛭质体菌体浓度为101-107pfu/mL，或者是将饲料用101-107pfu/mL蛭弧菌蛭质体菌液浸泡，都能够达到提高虾的免疫力、促进摄食和快速生长的目的，并且能够降解氨氮、增加溶氧浓度、裂解水中的治病菌，同时具有对副溶血弧菌强效的免疫抵抗力，从而达到改善水质的效果，节约地下水资源，保护环境，节省成本，提高经济效益，促进养殖业的快速发展。在水中和饲料同时使用，效果更佳。
Claims (2)
1.蛭弧菌蛭质体菌液在斑节对虾养殖中的应用，其特征在于：是将饲料在蛭弧菌蛭质体菌液中浸泡15-45min，其中蛭弧菌蛭质体菌液中蛭弧菌蛭质体的浓度为101-107 pfu/mL；和/或在水体中添加蛭弧菌蛭质体菌液，使水体中蛭弧菌蛭质体浓度为101～107pfu/mL；
所述蛭弧菌为蛭弧菌（Bdellovibrio sp.）BDFM05，于2009年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 209172。
2.根据权利要求1所述蛭弧菌蛭质体菌液在斑节对虾养殖中的应用，其特征在于：所述蛭弧菌蛭质体菌液的制备方法为：
接种宿主于营养肉汤液体培养基中，在35℃和200rpm摇床培养12h，培养液经4℃，5000～8000rpm离心10～20min后，沉淀加入至DNB液体培养基中，接入蛭弧菌BDFM05，在温度25～35℃下，以150～300 rpm摇床培养36～48h，得到含蛭弧菌蛭质体和蛭弧菌游泳体的培养液，培养液在4℃温度下以6000～8000rpm离心15～20min后，去除含蛭弧菌游泳体的上清，得到的沉淀即为蛭弧菌蛭质体；将蛭弧菌蛭质体用DNB液体培养基、水、生理盐水或0.2mol／L pH值为7.2～7.6的磷酸盐缓冲液悬浮，得到浓度为1011~1012pfu/mL的蛭弧菌蛭质体菌液；所述宿主为副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus），购于美国典型物种保藏中心(American Type Culture Collection)，ATCC 17802。
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