CN102037362A - 用于诊断和治疗肝细胞癌的方法和剂 - Google Patents

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Abstract

本发明关于个体肝细胞癌的诊断方法及治疗方法。本发明还关于PLVAP蛋白的拮抗剂，诸如特异性结合PLVAP蛋白的抗体，以及包含PLVAP蛋白的拮抗剂的组成物及套组。本发明进一步关于特异性结合PLVAP蛋白的人化抗体。

Description

用于诊断和治疗肝细胞癌的方法和剂
相关申请案
本申请案主张2008年3月19日申请的美国临时申请案第61/069,910号的利益。以上申请案的完整教示是以引用方式纳入本文中。
发明背景
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)为最频发的肝脏原发性恶性疾病且为全世界范围内第5位最常见的癌症。HCC还是第4位癌症相关死亡的主要原因(Parkin DM，Bray F，Ferlay J，Pisani P.Estimating the world cancerburden：Globocan 2000.Int J Cancer 2001；94：153-156)。1990年，世界卫生组织(World Health Organization)估计全世界范围内约有430,000例新发肝癌病例且当年有类似人数的患者因此疾病而死亡。
HCC的发病机制与慢性B型肝炎病毒(HBV)及C型肝炎病毒(HCV)感染，以及肝硬化诱导病状有关(Bruix J.等人，J Hepatol 35：421-430，2001；BruixJ.等人，Cancer Cell 5：215-219，2004)。因此，HCC的发病率在诸如中国、香港、台湾、韩国及日本的东亚国家或地区最高，在这些国家或地区HBV及HCV感染最为流行(Bruix J.等人，Cancer Cell 5：215-219，2004；Haskell CM.第46章Liver：Natural History，Diagnosis and Staging，于「Cancer Treatment」第5版，W.B，Saunders Company，Philadelphia，编者：Haskell CM及Berek JS中)。然而，西方国家的HCC发病率在正在稳步递增(Parkin DM.等人，Int J Cancer94；153-156，2001)。过去10年中，在美国，HCC呈现出在所有癌症中发病率增加第二高且死亡率增加最高(Ann Int Med 139：817-823，2003)。因此，在美国及全世界范围内，HCC为死亡率及发病率的主要原因，且由于住院费用及患有HCC的人们失去工作而成为显著的经济负担。
成功控制HCC需要在疾病进展早期正确诊断该疾病。然而，已证明使用目前的技术(诸如成像研究、核心针穿刺活检(needle core biopsy)及/或细针抽吸)来区分小HCC肿瘤与其它恶性或非恶性肝病(包括转移性肿瘤、胆管癌、局灶结节性增生(focal nodular hyperplasia)、发育不良及再生肝结节)具有挑战性(Ferrell LD.等人，Am J Surg Pathol 17：1113-1123，1993；Horigome H.等人，Hepato-Gatroenterology 47：1659-1662，2000；Kalar S.等人，Arch Pathol Lab Med 131：1648-1654，2007；Seki S.等人，Clin Cancer Res 6：3460-3473，2000)。此外，治疗性治疗HCC的尝试大部分未能成功(Bruix J.等人，J Hepatol35：421-430，2001；Bruix J.等人，Cancer Cell 5：215-219，2004；Haskell CM.第46章Liver：Natural History，Diagnosis and Staging，于「Cancer Treatment」第5版，W.B，Saunders Company，Philadelphia，编者：Haskell CM及Berek JS中；Szklaruk J.等人，AJR 180：441-453，2003)。因此，尽管存在现行疗法，但在美国患HCC患者的5年存活率仅为10.5％，其数值仅次于胰腺癌位居第二(ACSCancer Facts & Figures(2007))。因此，急迫地需要鉴别更可靠的标记物来区分HCC与其它肝病理学且促进此疾病的早期侦测。另外，急迫地需要研发新的且更有效的治疗剂来治疗HCC。
发明概要
在一具体实施方式中，本发明涵盖一种治疗有需要的个体(例如，人类)的肝细胞癌(HCC)的方法，其包含向该个体投予治疗有效量的至少一种抑制个体肝脏中HCC肿瘤的形成、生长及/或进展的一或多个的质膜小泡相关蛋白(Plasmalemma Vesicle-Associated Protein，PLVAP)拮抗剂。在一具体实施方式中，PLVAP拮抗剂为特异性结合PLVAP蛋白(例如，人类PLVAP蛋白)的抗体。在一特定具体实施方式中，PLVAP拮抗剂与第二治疗剂(诸如化学治疗剂)组合投予。
在另一具体实施方式中，本发明关于一种治疗有需要的个体的肝细胞癌(HCC)的方法，其包含向该个体投予治疗有效量的特异性结合PLVAP蛋白的抗体及至少一种化学治疗剂。特异性结合PLVAP蛋白的抗体通过动脉内输注(例如，肝动脉输注、经动脉化学栓塞(transarterial chemoembolization))来投予个体且可抑制个体的肝脏中的肿瘤形成、肿瘤生长、肿瘤血管形成或肿瘤进展。在一特定具体实施方式中，将抗体递送至个体肝脏中的HCC肿瘤内或周围的血管的内皮细胞。
在另一具体实施方式中，本发明关于一种诊断个体(例如，人类)的肝细胞癌(HCC)的方法，其包含侦测来自个体的样本中PLVAP基因产物(例如，PLVAP RNA、PLVAP蛋白)的含量且测定样本中PLVAP基因产物的含量相对于对照增加。根据本发明，样本中PLVAP基因产物的含量相对于对照增加表明个体中存在HCC。在一特定具体实施方式中，使用特异性结合PLVAP的抗体来侦测来自个体的样本中PLVAP蛋白的含量。
在另一具体实施方式中，本发明提供一种诊断个体的肝细胞癌(HCC)的方法，其包含侦测来自个体的肝组织样本中PLVAP基因产物的表现。根据本发明，肝组织样本中PLVAP基因产物的表现表明HCC。在一特定具体实施方式中，侦测肝组织样本中血管内皮细胞中PLVAP基因产物的表现。
在另一具体实施方式中，本发明关于一种侦测个体(例如，人类)的HCC的活体内方法，其包含通过动脉内注射或静脉内注射投予经放射性同位素标记的特异性结合PLVAP的抗体，获得个体肝脏的影像并侦测个体肝脏中抗体的累积。根据本发明，侦测到肝脏中抗体的累积表明个体的HCC。
在另一具体实施方式中，本发明提供一种特异性结合哺乳动物(例如，人类)PLVAP蛋白的经分离多肽。在一特定具体实施方式中，该多肽为抗体。在另一具体实施方式中，该抗体为与单株抗体KFCC-GY4或KFCC-GY5竞争结合人类PLVAP蛋白的抗体。
在另一具体实施方式中，本发明涵盖一种医药组成物，其包含至少一种PLVAP拮抗剂及医药学上可接受的载剂。在一具体实施方式中，PLVAP拮抗剂为特异性结合PLVAP蛋白(例如，人类PLVAP蛋白)的抗体。在另一具体实施方式中，该医药组成物进一步包含第二治疗剂，诸如化学治疗剂。
在另一具体实施方式中，本发明关于一种用于诊断个体的HCC的套组。在一具体实施方式中，套组包括至少一种与PLVAP RNA转录物特异性杂交(例如，在高严格度条件下)的核酸探针。在另一具体实施方式中，套组包含特异性结合PLVAP蛋白(例如，人类PLVAP蛋白)的多肽(例如，抗体)。
在另一具体实施方式中，本发明关于一种治疗有需要的个体的肝细胞癌(HCC)的方法，其包含向该个体投予治疗有效量的特异性结合PLVAP的人化抗体。在一特定具体实施方式中，该抗体通过动脉内输注(例如，肝动脉输注、经动脉化学栓塞)来投予个体且可抑制个体的肝脏中的肿瘤形成、肿瘤生长、肿瘤血管形成或肿瘤进展。
在另一具体实施方式中，本发明提供一种人化抗体，其与单株抗体KFCC-GY4或单株抗体KFCC-GY5特异性竞争结合SEQ ID NO：23。
附图简述
图1为描绘鉴别在肿瘤与相邻非肿瘤组织之间展示极端差异性表现的基因的算法的流程图。
图2为描绘如使用Affymetrix基因芯片通过mRNA转录物侧写所测定的配对的HCC(PHCC)与相邻非肿瘤肝组织(PN)样本(n＝18)以及未经配对的HCC样本(n＝82)中的PLVAP基因表现强度的图表。
图3A为描绘如通过Taqman定量性RT-PCR所测定的配对的HCC(PHCC)与相邻非肿瘤肝组织(PN)样本中的相对PLVAP表现量的图表。相对于非肿瘤肝组织，HCC中的PLVAP mRNA含量显著较高。
图3B为描绘如通过微数组分析所测定的18对HCC(PHCC)与相邻非肿瘤肝组织(PN)样本中的PLVAP基因表现强度的图表。除一人外，对于所有经测试个体，来自每一个体的HCC中的PLVAP转录物含量比相邻非肿瘤肝组织中高。
图4A及4B展示用于产生小鼠抗PLVAP多株抗血清的经His标记人类PLVAP51-442蛋白重组融合蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)及推导胺基酸序列(SEQ ID NO：2)。
图5为描绘凝血酶消化以移除His标签之前及之后对重组PLVAP蛋白的侦测的西方墨渍影像。墨渍左侧的箭头指示墨渍上His-PLVAP及PLVAP的位置。墨渍左侧的数字指示分子量标准的位置。
图6A为描绘如通过两步实时定量性RT-PCR所测定在自两个HCC组织样本(样本A(黑色)及样本B(灰色))通过雷射捕捉显微解剖获得的HCC内皮细胞中存在相对大量的PLVAP mRNA的图表。虚线表示来自用于PLVAPmRNA的定量性RT-PCR的相同样本中的β-肌动蛋白mRNA的Taqman定量性RT-PCR信号。结果表明在所解剖内皮细胞中存在易测得的PLVAP mRNA(实线)。
图6B为描绘如通过两步Taqman实时定量性RT-PCR所测定在自两个HCC样本(样本A(黑色)及样本B(灰色))中邻近于HCC组织的非肿瘤肝组织通过雷射捕捉显微解剖获得的细胞中不存在相对大量的PLVAP mRNA的图表。结果表明在所解剖细胞中无可侦测(黑色实线)及几乎无可侦测(灰色实线)PLVAP mRNA。
图6C为描绘如通过两步Taqman实时定量性RT-PCR所测定的自两个HCC组织样本(样本A(黑色)及样本B(灰色))通过雷射捕捉显微解剖获得的HCC肿瘤细胞中的PLVAP mRNA相对量的图表。结果表明由于不可避免的来自附着于所解剖HCC细胞的血管内皮细胞部分的轻微污染，在所解剖HCC细胞中存在极少量PLVAP mRNA(实线)。
图7为描绘如通过ELISA所测定的对抗重组PLVAP51-442蛋白所产生的小鼠抗血清中的抗PLVAP抗体效价的图表。
图8A-8F为展示来自3名患有肝细胞癌的患者的经***固定的配对HCC(图8A、8C、8E)与相邻非肿瘤肝组织(图8B、8D、8F)的切片的影像，这些切片使用抗PLVAP多株抗血清经免疫组织化学方法染色以侦测PLVAP蛋白的定位。图8A、8B；图8C、8D及图8E、8F中展示配对组织。仅在肝细胞癌的毛细管内皮细胞中侦测到PLVAP蛋白，其在HCC影像中显现为褐色染色(箭头)(图8A、8C、8E)。在非肿瘤肝组织中不存在可侦测的HCC(图8B、8D、8F)。
图9A-9F为展示来自另外3名患有肝细胞癌的患者的经***固定的HCC(图9A、9C、9E、9F)及非肿瘤肝组织(图9B、9D)的切片的影像，这些切片使用抗PLVAP多株抗血清经免疫组织化学方法染色以侦测PLVAP蛋白的定位。图9A、9B及图9C、9D展示HCC与相邻非肿瘤肝组织的配对组织样本。仅在肝细胞癌的毛细管内皮细胞中侦测到PLVAP蛋白，其在HCC影像中显现为褐色染色(箭头)(图9A、9C、9E、9F)。在非肿瘤肝组织中不存在可侦测的HCC(图9B、9D)。
图10A-10F为展示来自6名不同患者的经***固定的局灶结节性增生组织的切片的影像，这些切片使用抗PLVAP多株抗血清经免疫组织化学方法染色以侦测PLVAP蛋白的定位。在局灶结节性增生的非肿瘤肝组织的内衬血管窦/毛细管的内皮细胞中未侦测到PLVAP蛋白。在胆管(图10A、10D及10F)及门脉周边血管(图10D及10F)的内皮细胞中注意到一些阳性染色(褐色)，而在肝实质的内皮细胞中并无阳性染色。胆管内皮细胞的阳性染色是由于PLVAP抗血清中的非特异性抗体的结合。
图11A及11B为展示来自两名患有肝血管瘤的患者的经***固定的组织切片的影像，这些切片经抗PLVAP多株抗血清以免疫组织化学方法染色。肝血管瘤的内皮内衬细胞未展示显著的PLVAP蛋白表现。
图12A及12B为展示来自两名患有慢性活性B型肝炎的患者的经***固定的组织切片的影像，这些切片经抗PLVAP多株抗血清以免疫组织化学方法染色。在来自慢性B型肝炎患者的非肿瘤肝组织的内衬血管窦/毛细管的内皮细胞中未侦测到PLVAP蛋白。
图13A-13D为展示来自3名患有慢性活性C型肝炎的不同患者的经***固定的组织切片的影像，这些切片经抗PLVAP多株抗血清以免疫组织化学方法染色。图13B及13D中所示的组织切片来自同一患者。在来自慢性C型肝炎患者的非肿瘤肝组织的内衬血管窦/毛细管的内皮细胞中未侦测到PLVAP蛋白。
图14A-14D为展示来自3名患有转移性肝癌的不同患者的经***固定的组织切片的影像，这些切片经抗PLVAP多株抗血清以免疫组织化学方法染色。这些组织切片来自患有转移性结肠直肠腺癌(图14A)、肝内胆管癌(图14B及14C)或转移性卵巢癌(图14D)的患者。图14B及14C中所示的组织切片来自同一患者。在转移癌组织的内衬血管窦/毛细管的内皮细胞中未侦测到PLVAP蛋白。
图15A展示单株抗体KFCC-GY4的VH域的核苷酸基因(上)(SEQ IDNO：3)及推导胺基酸(中)(SEQ ID NO：4)序列。还指出CDR1(SEQ ID NO：5)、CDR2(SEQ ID NO：6)及CDR3(SEQ ID NO：7)中的胺基酸残基序列(下)。
图15B展示单株抗体KFCC-GY4的VL域的核苷酸基因(上)(SEQ IDNO：8)及推导胺基酸(中)(SEQ ID NO：9)序列。还指出CDR1(SEQ ID NO：10)、CDR2(SEQ ID NO：11)及CDR3(SEQ ID NO：12)中的胺基酸残基序列(下)。
图16A展示单株抗体KFCC-GY5的VH域的核苷酸基因(上)(SEQ IDNO：13)及推导胺基酸(中)(SEQ ID NO：14)序列。还指出CDR1(SEQ IDNO：15)、CDR2(SEQ ID NO：16)及CDR3(SEQ ID NO：17)中的胺基酸残基序列(下)。
图16B展示单株抗体KFCC-GY5的VL域的核苷酸基因(上)(SEQ IDNO：18)及推导胺基酸(中)(SEQ ID NO：19)序列。还指出CDR1(SEQ IDNO：20)、CDR2(SEQ ID NO：21)及CDR3(SEQ ID NO：22)中的胺基酸残基序列(下)。
图17为描绘如通过ELISA所测定的在各种抗体浓度下KFCC-GY4(空心圆圈)及KFCC-GY5(实心圆圈)单株抗体与重组PLVAP蛋白的结合的图。
图18为展示KFCC-GY4及KFCC-GY5单株抗体可侦测5ng重组PLVAP蛋白的免疫墨渍。泳道1：分子量标准；泳道2：含KFCC-GY4单株抗体的免疫墨渍；泳道3：含KFCC-GY5单株抗体的免疫墨渍。
重组PLVAP蛋白的分子量为45kD。
图19A及19C为经库马斯蓝(Coomassie blue)染色的SDS丙烯酰胺凝胶。泳道1：分子量标准；泳道2：使用TX-114自人类脐带血管内皮细胞提取的疏水性膜蛋白，这些内皮细胞在提取前已经VEGF(40ng/ml)刺激72小时。
图19B为免疫墨渍，其中用KFCC-GY4单株抗体探测图19A的泳道2中所示的提取物。泳道1：分子量标准；泳道2：使用TX-114自人类脐带血管内皮细胞提取的疏水性膜蛋白，这些内皮细胞在提取前已经VEGF(40ng/ml)刺激72小时。
图19D为免疫墨渍，其中用KFCC-GY-5单株抗体探测图19C的泳道2中所示的提取物。泳道1：分子量标准；泳道2：使用TX-114自人类脐带血管内皮细胞提取的疏水性膜蛋白，这些内皮细胞在提取前已经VEGF(40ng/ml)刺激72小时。
图20A为描绘人类血管内皮细胞(HUVEC)经对照正常小鼠IgG免疫荧光染色的荧光显微照片。用4′，6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对细胞核进行染色。放大率＝600倍。
图20B为描绘人类血管内皮细胞(HUVEC)经针对von Willebrand因子(VWF)的单株抗体免疫荧光染色的荧光显微照片。VWF为人类血管内皮细胞的阳性标记物。用4′，6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对细胞核进行染色。放大率＝600倍。
图20C为描绘人类血管内皮细胞(HUVEC)经针对PLVAP的KFCC-GY4单株抗体免疫荧光染色的荧光显微照片。KFCC-GY4单株抗PLVAP抗体与人类血管内皮细胞阳性反应。用4′，6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对细胞核进行染色。放大率＝600倍。
图20D为描绘人类血管内皮细胞(HUVEC)经针对PLVAP的KFCC-GY5单株抗体免疫荧光染色的荧光显微照片。KFCC-GY5单株抗PLVAP抗体与人类血管内皮细胞阳性反应。用4′，6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对细胞核进行染色。放大率＝600倍。
图21A为包埋于石蜡块中的经***固定的肝细胞瘤组织切片的光学显微照片，该切片经KFCC-GY5单株抗PLVAP抗体染色。在肝细胞瘤的血管内皮细胞中侦测到强PLVAP信号(深灰色染色)。放大率为100倍。
图21B为来自与图21A中所示的样本相同的患者的经***固定的肝细胞瘤组织切片的光学显微照片，该切片经KFCC-GY4单株抗PLVAP抗体染色。在肝细胞瘤的血管内皮细胞中侦测到中等PLVAP信号(浅灰色染色)。放大率为100倍。
图21C为来自与图21A及21B中所示的样本不同的患者的经***固定的肝细胞瘤组织切片的光学显微照片，该切片经KFCC-GY5单株抗PLVAP抗体染色。在血管内皮细胞中侦测到强PLVAP信号(深灰色染色)。放大率为100倍。
图21D为包埋于石蜡块中的来自与图21C中所示的样本相同的患者的经***固定的肝细胞瘤组织切片的光学显微照片，该切片经KFCC-GY4单株抗PLVAP抗体染色。在血管内皮细胞中侦测到中等PLVAP信号(浅灰色染色)，从而表明KFCC-GY4单株抗体与PLVAP抗原的结合比KFCC-GY5抗体弱。放大率为100倍。
图22A-H为来自4名不同的经随机选择的肝细胞瘤患者的肝细胞瘤组织(图22A、22C、22E及22G)及相邻非肿瘤肝组织(图22B、22D、22F及22H)的切片的光学显微照片。这些切片经KFCC-GY5单株抗PLVAP抗体染色。在肝细胞瘤组织的血管内皮细胞中侦测到PLVAP信号(灰色染色)，而在非肿瘤肝组织的血管内皮细胞中未侦测到信号。放大率为100倍。图22A与22B、22C与22D、22E与22F及22G与22H代表四组配对的肝细胞瘤与非肿瘤肝组织。
图23A为描绘经对照小鼠IgG染色的人类血管内皮细胞(HUVEC)的荧光显微照片。用4′，6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对细胞核进行染色。
图23B为描绘经针对PLVAP的KFCC-GY4单株抗体染色的人类血管内皮细胞(HUVEC)的荧光显微照片。KFCC-GY4单株抗PLVAP抗体与人类血管内皮细胞的表面阳性反应。用4′，6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对细胞核进行染色。
图23C为描绘经针对PLVAP的KFCC-GY5单株抗体染色的人类血管内皮细胞(HUVEC)的荧光显微照片。KFCC-GY5单株抗PLVAP抗体与人类血管内皮细胞的表面阳性反应。用4′，6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对细胞核进行染色。
图24展示人类PLVAP蛋白的胺基酸序列(Genbank编号NP_112600；SEQID NO：23)。
图25A及25B展示全长人类PLVAP cDNA的核苷酸序列(Genbank编号NM_031310；SEQ ID NO：24)。
发明详述
定义
如本文中所用，术语「质膜小泡相关蛋白(Plasmalemma Vesicle-Associated Protein)」、「PLVAP」及「PV-1」指天然存在或内源性PLVAP(例如，哺乳动物、人类)蛋白，及具有与天然存在或内源性PLVAP蛋白相同或大体上相同的胺基酸序列的蛋白质(例如，重组蛋白、合成蛋白)。因此，在本文中可互换使用的术语「质膜小泡相关蛋白」、「PLVAP」及「PV-1」包括(例如)通过天然存在于哺乳动物(例如，人类)体内的替代性拼接或其它细胞过程产生的PLVAP蛋白的多态或对偶基因变异体及其它同功异型物。较佳地，PLVAP蛋白为具有SEQ ID NO：23(参见Genbank编号NP_112600及图24)的胺基酸序列的人类蛋白质。
如本文中所定义，「PLVAP拮抗剂(PLVAP antagonist)」为在一具体实施方式中抑制(例如，降低、阻止)PLVAP蛋白的活性；或在另一具体实施方式中抑制(例如，降低、阻止)PLVAP基因及/或基因产物的表现的药剂(例如，抗体、小分子、肽、肽模拟物、核酸)。可由本发明的拮抗剂抑制的PLVAP蛋白的活性包括(但不限于)肝细胞癌肿瘤的形成、生长、血管形成及/或进展。在一特定具体实施方式中，PLVAP拮抗剂特异性结合哺乳动物(例如，人类)PLVAP蛋白且抑制该PLVAP蛋白的活性。
如本文中所用，「特异性结合(specifically binds)」指药剂(例如，抗体)与PLVAP基因产物(例如，RNA、蛋白质)以比PLVAP拮抗剂结合非PLVAP蛋白质的亲和力大至少约5倍，较佳至少约10倍的亲和力(例如，结合亲和力)结合。
如本文中所用，术语「多肽(polypeptide)」指胺基酸的聚合物，且不限长度。因此，「多肽」涵盖蛋白质、肽及寡肽。
如本文中所用，术语「抗体(antibody)」指对标靶、抗原或抗原决定基具有亲和力的多肽，且包括天然存在及经工程化的抗体。术语「抗体」涵盖多株、单株、人类、嵌合、人化、灵长类化、镶饰(veneered)及单链抗体，以及抗体片段(例如，Fv、Fc、Fd、Fab、Fab′、F(ab′)、scFv、scFab、dAb)。(例如参见Harlow等人，Antibodies A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，1988)。
术语「抗体可变区(antibody variable region)」指独立地或在与其它抗体可变区组合时(例如，VH/VL对)，特异性结合抗原决定基的抗体区域(例如，VH、VHH、VL)。
术语「抗原决定基(epitope)」指熟知的由抗体VH/VL对结合的结构单位。抗原决定基定义抗体的最小结合位点且因此代表抗体特异性的标靶。
术语「互补决定区(complementarity determining region)」或「CDR」指来自重链或轻链的抗体可变区的高变区，其含有能够特异性结合抗原标靶(例如，抗原决定基)的胺基酸序列。典型重链或轻链会具有三个CDR(CDR1、CDR2、CDR3)，其负责抗体对特定抗原决定基的特异性。
如本文中所定义，术语「抗原结合片段(antigen binding fragment)」指含有一或多个CDR且本身对抗原决定子具有亲和力的抗体部分。非限制性实例包括Fab片段、F(ab)′2片段、重链-轻链二聚体及单链接构，诸如完整轻链或完整重链。
如本文中所用，术语「特异性(specificity)」指抗体优先结合抗原决定基的能力，且未必意味高亲和力。
术语「亲和力(affinity)」指抗体与抗原决定子之间的结合强度的量度。亲和力取决于多种因素，包括抗体与抗原决定子之间立体化学配合的紧密度，其间接触区域的大小，及带电及疏水性基团的分布。
如本文中所用，术语「亲和力常数(affinity constant)」或「Kd」指用于量测抗体对抗原的亲和力的解离常数。亲和力常数愈低，免疫球蛋白对抗原或抗原决定子的亲和力愈高，且反之亦然。该常数容易由如通过用于抗体反应的标准动力学方法所量测的结合-解离反应的速率常数算得。
如本文中所提及，术语「竞争(competes)」意谓第一多肽(例如，抗体)与标靶抗原的结合受到第二多肽(例如，抗体)结合的抑制。举例而言，结合可因(例如)结合域的物理阻断或结合域的结构或环境改变使得其对标靶的亲和力或结合性降低而受到空间抑制。
如本文中所用，术语「肽(peptide)」指由约2个至约100个胺基酸残基组成的化合物，其中一个胺基酸的胺基经由肽键连接至另一胺基酸的羧基。这些肽的长度典型地小于约100个胺基酸残基且较佳为约10个、约20个、约30个、约40个或约50个残基。
如本文中所用，术语「肽模拟物(peptidomimetic)」指不为肽或蛋白质，但仿真其结构的外表的分子。肽模拟物拮抗剂可通过熟知的化学方法来制备(例如，参见Damewood J.R.「Peptide Mimetic Design with the Aid of Computational Chemistry」于Reviews in Computational Biology，2007，第9卷，第1-80页，John Wiley and Sons，Inc.，New York，1996中；Kazmierski W.K.，「Methods of Molecular Medicine：Peptidomimetic Protocols，」Humana Press，New Jersey，1999)。
术语「肝细胞癌(hepatocellular carcinoma)」、「HCC」及「肝细胞瘤(hepaoma)」在本文中可互换使用，用以指自肝细胞(肝脏的主要细胞类型)产生的癌症。
如本文中所定义，「疗法(therapy)」为向个体(例如，哺乳动物、人类)投予特定治疗剂或预防剂，其对个体产生所需治疗或预防效益。
如本文中所定义，「治疗有效量(therapeutically effective amount)」为在投予条件下足以达成所需治疗或预防作用的量，诸如足以抑制(亦即，降低、预防)患HCC的患者肝脏中的肿瘤形成、肿瘤生长(增殖、尺寸)、肿瘤血管形成及/或肿瘤进展(侵袭、转移)的量。疗法的有效性(例如，缩小/消除肿瘤及/或预防肿瘤生长)可通过任何合适方法(例如，原位免疫组织化学、成像(超音波、CT扫描、MRI、NMR)、3H-胸苷并入)来测定。
如本文中所定义，「治疗摄生法(treatment regimen)」为以特定剂量(例如，含量、量、数量)且按特定时程或以特定时间间隔(例如，数分钟、数天、数周、数月)向哺乳动物个体投予一或多种治疗剂或预防剂的摄生法。
如本文中所用，「个体(subject)」指哺乳动物个体。术语「哺乳动物个体(mammalian subject)」在本文中定义为包括诸如以下动物的哺乳动物：灵长类动物(例如，人类)、母牛、绵羊、山羊、马、犬、猫、兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其它牛科、羊科、马科、犬科、猫科、啮齿动物或鼠类物种。合适个体的实例包括(但不限于)患者HCC或有发展HCC风险的人类患者。发展HCC的高风险群组的实例包括患有慢性肝炎感染(B型肝炎、C型肝炎)的个体及患有肝硬化或相关肝病状的个体。
如本文中所用的术语「预防(prevent、preventing或prevention)」意谓降低个体的HCC肿瘤形成或进展的机率/可能性或风险，延迟个体体内与HCC相关的病状的发病，减轻个体体内HCC相关病状的一或多种症状的严重性，或其任何组合。一般而言，预防性摄生法的个体最可能被归类为「处于风险中(a-risk)」，例如该个体发展HCC的风险高于由相关基线人群所代表的个体的风险。
如本文中所用，术语「治疗(treat、treating或treatment)」意谓抵抗医学病状(例如，与HCC相关的病状)至根据临床可接受的标准使该医学病状得以改良的程度(例如，个体肝脏中HCC肿瘤的数目及/或尺寸降低)。
如本文中所用，术语「低严格度(low stringency)」、「中严格度(medium stringency)」、「高严格度(high stringency)」或「极高严格度条件(very high stringency conditions)」描述核酸杂交及洗涤的条件。执行杂交反应的指南可见于Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中，其全文以引用的方式并入本文中。该参考文献中描述水性及非水性方法且均可使用。本文中所提及的特异性杂交条件如下：(1)低严格度杂交条件为在约45℃下于6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，随后在50℃下(对于低严格度条件可将洗涤温度升至55℃)在0.2X SSC、0.1％SDS中洗涤两次；(2)中严格度杂交条件为在约45℃下于6X SSC中，随后在60℃下在0.2X SSC、0.1％SDS中洗涤一或多次；(3)高严格度杂交条件为在约45℃下于6X SSC中，随后在65℃下在0.2X SSC、0.1％SDS中洗涤一或多次；及较佳(4)极高严格度杂交条件为在65℃下于0.5M磷酸钠、7％SDS中，随后在65℃下在0.2X SSC、1％SDS中洗涤一或多次。极高严格度条件(4)为较佳条件，且除非另有规定，否则应使用这些条件。
除非另有规定，否则本文中所用的所有技术及科学术语具有与一般技术者(例如，细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术及生物化学)通常所了解相同的含义。使用分子、遗传及生物化学方法(一般参见Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.及Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology(1999)第4版，John Wiley & Sons，Inc.，其以引用的方式并入本文中)及化学方法的标准技术。
PLVAP
质膜小泡相关蛋白(PLVAP)，还称为PV1，为一种II型整合膜醣蛋白，其表现限于特定血管内皮细胞(Mol Biol Cell 15：3615-3630(2004))。已证明PLVAP为有孔内皮的小孔及气孔隔膜的关键结构组份(同上)。另外，PLVAP表现为形成内皮小孔隔膜所必需且可能参与调节内皮渗透性及转运(Am J Physiol Heart Circ Physiol 286：H1347-1353，2004)。人类PLVAP基因的基因组结构已有报导(Stan RV，Arden KC，Palade GE.cDNA and protein sequence，genomic organization，and analysis of cis regulatory elements of mouse and human PLVAP genes.Genomics 72；304-313，2001)。
如本文中所述，本发明者已证明在人类HCC患者的肝脏中肝细胞癌组织中的PLVAP基因表现相对于相邻非肿瘤组织显著升高。另外，本发明者已判定PLVAP蛋白主要表现且定位于HCC肿瘤周围或HCC肿瘤内的血管内皮细胞，而不表现或定位于与其它肝病理学相关的细胞。因此，PLVAP代表一种用于诊断及治疗HCC的新颖标靶。
治疗方法
在一方面中，本发明关于一种治疗有需要的个体的肝细胞癌(HCC)的方法，其包含向该个体投予治疗有效量的至少一种PLVAP拮抗剂，其中该PLVAP拮抗剂抑制个体肝脏中HCC肿瘤的形成、生长、血管形成及/或进展的一或多个。在一特定方面中，本发明的PLVAP拮抗剂抑制HCC患者的肝脏中肝细胞周围的血管内皮细胞中的PLVAP蛋白的表现或活性。
在一方面中，向有需要的个体投予治疗有效量的PLVAP拮抗剂以抑制肿瘤生长或杀死肿瘤细胞。举例而言，直接抑制肿瘤生长的药剂(例如，化学治疗剂)熟知地以特定给药时程及含量投予以达成最有效的疗法(例如，最佳杀死肿瘤细胞)。一般而言，在相对较短的治疗期(例如，一至数天)内投予约最大耐受剂量，随后为治疗中断期(off-therapy period)。在一特定实例中，每隔一天以最大耐受剂量150mg/kg投予化学治疗剂环磷酰胺(cyclophosphamide)持续3剂，在第一周期后21天给与第二周期(Browder等人，Can Res 60：1878-1886，2000)。
举例而言，可在第一周期中投予治疗有效量的PLVAP拮抗剂(例如，抑制性小分子、中和抗体、抑制性核酸(例如，siRNA、反义核苷酸))，其中以一次时间间隔/给药，或以数次间距相近的时间间隔(数分钟、数小时、数天)投予约最大耐受剂量的拮抗剂，在合适的治疗中断期(例如，一或多周)后投予另一/第二周期。PLVAP拮抗剂的合适给药时程及量可易于由具有一般技术的临床医师判定。如与化学治疗剂相比特定PLVAP拮抗剂的毒性较低可允许投予周期之间的时间较短。当用作(例如，手术、放射疗法、其它基本疗法的)辅助疗法时，治疗有效量的PLVAP拮抗剂较佳按与其它癌症疗法(例如，化学疗法)类似的给药时程，或按由熟习此项技术的临床医师判定为更/最有效抑制(降低、预防)肿瘤生长的给药时程来投予。治疗有效量的抗体PLVAP拮抗剂的治疗摄生法可为(例如)每次治疗每公斤体重约0.01mg至约300mg，且较佳为约0.01mg/kg至约100mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约1mg/kg至约10mg/kg，每1至7天一次历时约4至约6个月的时期。抗肿瘤有效量的小分子PLVAP拮抗剂的治疗摄生法可为(例如)约0.001mg/kg至约100mg/kg、约0.01mg/kg至约100mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.01mg/kg至约1mg/kg，每1至7天一次历时约4至约6个月的时期。
在另一方面中，PLVAP拮抗剂可以节律性给药摄生法投予，藉此相对于最大耐受给药更频繁地投予较低剂量。多种临床前研究已证明节律性摄生法与最大耐受剂量(MTD)对应摄生法相比具有上佳抗肿瘤功效、有效抗血管生成作用及降低的毒性及副作用(例如，骨髓抑制)(Bocci等人，Cancer Res，62：6938-6943，(2002)；Bocci等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，100(22)：12917-12922，(2003)；及Bertolini等人，Cancer Res，63(15)：4342-4346，(2003))。节律性化学疗法似乎可有效克服与化学疗法相关的一些缺点。
PLVAP拮抗剂可作为抗血管生成疗法的部分以节律性给药摄生法投予以抑制(降低、阻止)有需要患者的血管生成。该抗血管生成疗法可通过阻断向肿瘤供给维持肿瘤生长所需的养分且使肿瘤能够转移的新血管的形成来间接影响(抑制、降低)肿瘤生长。以此方式断绝肿瘤的养分及血液供应可最终使肿瘤细胞因坏死及/或细胞调亡而死亡。先前的工作已表明当更频繁地投予较低剂量含量而提供抗血管生成剂的持续血液含量时，涉及阻断血管生成因子(例如，VEGF、bFGF、TGF-α、IL-8、PDGF)或其它信号传输的癌症疗法的临床结果(抑制内皮细胞介导的肿瘤血管生成及肿瘤生长)更为有效(参见Browder等人，Can.Res.60：1878-1886，2000；Folkman J.，Sem.Can.Biol.13：159-167，2003)。抗血管生成治疗摄生法已用于血管生成的靶向抑制剂(凝血栓蛋白-1及血小板生长因子-4(TNP-470))与化学治疗剂环磷酰胺。每隔6天，以低于最大耐受剂量的剂量投予TNP-470且以170mg/kg的剂量投予环磷酰胺(同上)。此治疗摄生法使得肿瘤完全消退(同上)。事实上，抗血管生成治疗在与其它抗癌治疗剂，例如直接抑制肿瘤生长的彼等药剂(例如，化学治疗剂)协同投予时最为有效(同上)。
本文中所述的治疗方法包含将PLVAP拮抗剂投予个体。可将PLVAP拮抗剂以如下方式投予有需要的个体：作为基本疗法(例如，作为疗法或治疗摄生法中的主要治疗剂)；作为辅佐疗法(例如，作为在疗法或治疗摄生法中与另一治疗剂一起使用的治疗剂，其中治疗剂的组合提供所需治疗；「辅佐疗法」还称为「附属疗法」)；与辅佐疗法组合；作为辅助疗法(例如，作为在已给与疗法或治疗摄生法中的主要治疗剂后给与有需要的个体的治疗剂)；或与辅助疗法(例如，化学疗法(例如，他莫昔芬(tamoxifen)、顺铂(cisplatin)、丝裂霉素(mitomycin)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、阿霉素(doxorubicin)、索拉非尼(sorafenib)、奥曲肽(octreotide)、达卡巴嗪(dacarbazine，DTIC)、顺铂(Cis-platinum)、西眯替丁(cimetidine)、环磷酰胺)、放射疗法(例如，质子束疗法)、激素疗法(例如，抗***疗法、雄激素去除疗法(androgen deprivation therapy，ADT)、促黄体素释放激素(LH-RH)促效剂、芳香酶抑制剂(AI，诸如安美达锭(anastrozole)、依西美坦(exemestane)、雷曲唑(letrozole))、***受体调节剂(例如，他莫昔芬、雷洛昔芬(raloxifene)、托瑞米芬(toremifene)))或生物疗法)组合。在癌症治疗摄生法期间还可投予多种其它疗法以减轻疾病作用及/或癌症治疗的副作用，其包括管理以下症状的疗法：疼痛(***、针灸)、胃不适(抗酸剂)、头昏(抗眩晕药物)、恶心(抗恶心药物)、感染(例如，增加红/白血球计数的药物)及其类似症状，所有这些疗法均可易于由熟习此项技术的人来识别。
因此，PLVAP拮抗剂可作为辅助疗法(例如，与另一基本癌症疗法或治疗一起)投予。作为辅助疗法，PLVAP拮抗剂可在如放射及/或手术移除肿瘤的基本疗法之前、之后或并行投予。在一些具体实施方式中，方法包含投予治疗有效量的PLVAP拮抗剂及一或多种其它疗法(例如，辅助疗法、其它靶向疗法)。辅助疗法(例如，化学治疗剂)及/或一或多种其它靶向HCC疗法与PLVAP拮抗剂可以独立调配物的形式或以联合调配物的形式同时(例如，并行地)共投予。或者，这些疗法可以独立组成物的形式在如由熟习此项技术的临床医师所判定(例如，足以允许这些疗法的医药作用重迭的时间)的适当时间范围(例如，诸如1.5至5小时的癌症治疗时段/时间间隔)内相继投予。辅助疗法及/或一或多种其它靶向HCC疗法与PLVAP拮抗剂可以适于达成所需治疗作用(例如，抑制肿瘤生长、抑制血管生成及/或抑制癌症转移)的顺序及时程以单剂或分多剂投予。
可以单剂或分多剂投予一或多种为PLVAP拮抗剂的药剂。合适的给药及投予摄生法可由临床医师判定且取决于所选药剂、医药调配物及投予途径、各种患者因素及其它考虑因素。关于PLVAP拮抗剂与一或多种其它疗法或治疗(辅助、靶向、癌症治疗相关及其类似疗法)一起的投予，典型地以单剂形式(例如，通过注射、输注、经口)投予PLVAP拮抗剂，随后必要时或视病情以特定时间间隔(例如，一或多个小时)重复给药。
PLVAP拮抗剂的投予量(例如，治疗有效量)可由临床医师使用本文中所提供的指南及此项技术中已知的其它方法来判定且取决于数种因素，包括(例如)所选特定药剂、患者的年龄、敏感性、药物耐受性及整体健康状况。举例而言，小分子的合适剂量可为每次治疗每公斤体重约0.001mg至约100mg、约0.01mg至约100mg、约0.01mg至约10mg、约0.01mg至约1mg。抗体的合适剂量可为每次治疗每公斤体重约0.01mg至约300mg，且较佳为每次治疗每公斤体重约0.01mg至约100mg、约0.01mg至约10mg、约1mg至约10mg。在PLVAP拮抗剂为多肽(线性、环状、仿真物)的情况下，较佳剂量会产生约0.1μg/mL至约200μg/mL的肽血浆浓度。判定用于特定药剂、患者及癌症的剂量完全在一般技术者的能力范围内。较佳地，剂量不引起或产生最小不良副作用(例如，免疫原性反应、恶心、头昏、嘈杂(gastric upset)、高血黏度症候群、充血性心脏衰竭、中风、肺水肿)。
投予方法
根据本发明的方法，向哺乳动物个体投予治疗有效量的PLVAP拮抗剂(例如，抗体，诸如经放射性同位素标记的抗体)以治疗HCC。
视药剂及所欲治疗的特定癌症而定，可使用多种投予途径，包括(例如)经口、膳食、局部、经皮、直肠、非经肠(例如，动脉内、静脉内、肌肉内、皮下注射、皮内注射)、静脉内输注及吸入(例如，支气管内、鼻内或经口吸入、鼻内滴剂)投予途径。投予可视病情为局部或全身性投予。较佳投予模式可视所选特定药剂而变化；然而，对于投予本发明的治疗剂(例如，抗体，诸如经放射性同位素标记的抗体)以治疗肝细胞癌而言，动脉内投予(例如，肝动脉输注、经动脉化学栓塞(TACE))通常较佳。
举例而言，(例如)在HCC的常规TACE治疗期间，可使用肝动脉输注将化学治疗剂(例如，PLVAP抗体，诸如经放射性同位素标记的PLVAP抗体)经由肝动脉直接递送至HCC肿瘤(Camma等人，Radiology 224：47-54，2002；Befeler等人，Clinics in Liver Disease 9：287-300，2005；Abou-Alfa JAMA299：1716-1718，2008)。此程序藉助于荧光透视(x射线类型)成像来进行。简言之，将导管***腹股沟中的股动脉中且穿入大动脉。自大动脉，使导管前进至肝动脉或其分枝。当鉴别出供给肝癌的肝动脉分枝后，即可经输注实施化学疗法。经常进行此程序的介入放射医师可判定每一治疗期患者接受的化学疗法的量。一些患者可经历6至12周时间间隔的重复治疗期。在6至12周内重复肝脏的成像研究以评估肿瘤尺寸对治疗的反应。
或者，可使用经动脉化学栓塞(一种类似于动脉内输注的程序)将PLVAP拮抗剂(例如，抗体)投予有需要的个体。在TACE中，将治疗剂的动脉内输注与用特定阻断化合物(诸如凝胶发泡体、油乳液或甚至小金属线圈)阻断(亦即，栓塞)小血管的额外步骤组合。因此，TACE具有使肿瘤暴露于高浓度化学疗法且局部限制药剂以防止或减少其被血流带走的潜在优点。同时，TACE剥夺肿瘤所需的血液供应，此可使得肿瘤细胞损伤或死亡。
对于PLVAP抗体的动脉内投予而言，较佳使用对PLVAP具有高亲和力的抗体(例如，Kd小于10-7M)以便使所输注的抗体会集中于HCC的血管中。预期嵌合及人化抗体分别具有至多4天及至多14-21天的循环半衰期。在一特定具体实施方式中，将具有短循环半衰期(例如，约1天至约5天，例如约1、2、3、4或5天)的高亲和力PLVAP抗体(例如，抗原结合片段、单链抗体)投予患者以降低由其投予所产生的任何毒性及其它不良副作用。在另一具体实施方式中，将具有长循环半衰期(例如，约5天至约24天)的高亲和力PLVAP抗体投予患者以治疗HCC。
在许多情况下，较佳在治疗期内先投予大负荷剂量，随后为定期(例如，每周)维持剂量。还可通过缓释递送***、泵及用于向HCC连续输注的其它已知递送***来递送抗体。给药摄生法可基于特定抗体的药物动力学而改变以提供其所需循环含量。因此，会计算剂量以使所需治疗含量得以维持。
实际剂量及治疗摄生法会由医师考虑癌症性质(原发或转移)、肿瘤数量及尺寸、其它疗法及患者特征来判定。鉴于肝细胞癌危及生命的性质，可使用具有显著副作用的大剂量。
可将基于核酸的PLVAP拮抗剂(例如，siRNA、反义寡核苷酸、天然或合成核酸、核酸类似物)以多种方式引入所关注的哺乳动物个体体内。举例而言，可使核酸在宿主细胞中自表现载体或PCR产物内源性表现或将其封装于合成或经工程化组成物(例如，脂质体、聚合物、奈米颗粒)中，接着可将这些组成物(例如，通过注射、输注)直接引入哺乳动物个体的血流中。还可将抗PLVAP核酸或核酸表现载体(例如，逆转录病毒、腺病毒、腺相关及单纯疱疹病毒载体、经工程化载体、非病毒介导的载体)使用既定基因疗法策略及方案直接引入哺乳动物个体体内(例如，参见Tochilin V.P.Annu Rev BiomedEng8：343-375，2006；Recombinant DNA and Gene Transfer，Office of BiotechnologyActivities，National Institutes of Health Guidelines)。
类似地，在药剂为蛋白质或多肽的情况下，可将药剂经由重组蛋白的活体内表现来投予。活体内表现可根据合适方法通过体细胞表现来实现(例如，参见美国专利第5,399,346号)。此外，还可将编码多肽的核酸并入逆转录病毒、腺病毒或其它合适载体(较佳为复制缺陷型感染性载体)中以供递送，或可将其引入能够表现该多肽的经转染或经转型宿主细胞中以供递送。在后一具体实施方式中，可将细胞以有效表现治疗有效量的多肽的量植入(单独或于障壁装置中)、注入或以其它方式引入。
诊断及预测方法
本发明涵盖诊断及预测方法，其包含评估来自哺乳动物个体(例如，患有肝肿瘤的哺乳动物个体)的样本(例如，肝活检、细针抽吸样本)中PLVAP的表现。对于本发明的诊断方法而言，样本中PLVAP的表现，或相对于合适对照样本中PLVAP的表现增加，表明个体患有HCC，及/或个体为使用PLVAP拮抗剂的抗癌疗法的候选者。
对于本发明的预测方法而言，来自个体的样本中PLVAP的表现，或相对于合适对照样本中PLVAP的表现增加表明不良预后。预后可为患者存活的预后、转移风险的预后及/或复发风险的预后。
用于此等方法的合适样本包括组织样本、生物流体样本、细胞(例如，肿瘤细胞)样本及其类似物。可使用任何自个体采样的方法来获得样本，例如通过抽血、脊髓穿刺、组织涂片或刮片，或组织活检。因此，样本可为活检标本(例如，肿瘤、息肉、肿块(实体、细胞))、抽吸物、涂片或血液样本。样本可为来自具有肿瘤(例如，癌性生长)及/或肿瘤细胞，或疑似具有肿瘤及/或肿瘤细胞的肝脏的组织。举例而言，可在开放式活检中获得肿瘤活检物，开放式活检为一种自标靶区域移除全部(切除活检)或部分(切***检)肿块的程序。或者，可经由经皮活检获得肿瘤样本，经皮活检为一种使用针样仪器经小切口或穿刺(藉助于或不藉助于成像装置)来执行以获得个别细胞或细胞簇(例如，细针抽吸(FNA))或组织核心或片段(穿刺活检)的程序。可以细胞学方法(例如，涂片)、组织学方法(例如，冷冻或石蜡切片)或使用任何其它合适方法(例如，分子诊断方法)来检查活检样本。肿瘤样本还可通过试管内采集来源于个体组织的经培养人类细胞来获得。必要时，可在分析前将肿瘤样本通过在可分析条件下保存样本的蛋白质及/或核酸的合适储存方法，诸如快速冷冻或受控冷冻摄生法来储存。必要时，冷冻可在防冻剂(例如，二甲亚砜(DMSO)、甘油或丙二醇-蔗糖)存在下执行。适当时，出于分析的目的可在储存之前或之后汇集肿瘤样本。肿瘤样本可来自患有肝癌(例如，肝细胞癌)的患者。
可用于评估样本(例如，生物样本)中PLVAP的存在或量的合适检定为熟习此项技术的人所已知。侦测PLVAP蛋白或肽的方法包括免疫及免疫化学方法，如流式细胞术(例如，FACS分析)、酵素结合免疫吸附分析法(ELISA)，包括化学发光检定、放射免疫检定、免疫墨渍法(immunoblot)(例如，西方墨渍法(Western blot))、免疫组织化学(IHC)及其它基于抗体的定量方法(例如，基于
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珠粒的检定)。其它合适方法包括(例如)质谱分析。举例而言，可使用针对PLVAP的抗体使用(例如)免疫组织化学(IHC)来直接地或间接地测定样本中PLVAP的存在及/或表现量。举例而言，可通过合适方法自活检物获取石蜡切片，将其固定至载片且与一或多种抗体组合。在一特定具体实施方式中，在样本中肝细胞周围的血管内皮细胞中侦测到PLVAP蛋白表明HCC。
侦测PLVAP基因表现的方法包括PLVAP核酸扩增及/或可视化。为侦测PLVAP基因表现，可通过此项技术中常规的合适方法(例如，参见Sambrook等人，1989)自个体分离核酸。接着可将经分离核酸扩增(例如，通过聚合酶连锁反应(PCR)(例如，直接PCR、定量实时PCR、逆转录酶PCR)、连接酶链反应、自主序列复制、转录扩增***、Q-β复制酶或其类似方法)且可视化(例如，通过在扩增期间标记核酸、暴露于***化合物/染料、探针)。还可使用核酸探针，例如经标记核酸探针(例如，荧光原位杂交(FISH))直接在取自(例如)肿瘤活检物的组织样本的石蜡切片中，或使用其它合适方法来侦测PLVAP RNA(例如，mRNA)或其表现。还可通过南方墨渍法(Southern blot)或在溶液中(例如，染料、探针)来评估其PLVAP基因表现。此外，可使用基因芯片、微数组、探针(例如，量子点)或其它此类装置(例如，传感器、奈米传感器/侦测器)来侦测PLVAP基因的表现及/或差异性表现。
在一具体实施方式中，可通过侦测来自患者的样本中PLVAP基因产物(例如，PLVAP mRNA、PLVAP蛋白)的表现来诊断肝细胞癌。因此，该方法不需要将来自患者的样本中的PLVAP表现与对照中的PLVAP表现作比较。存在或不存在PLVAP可通过本文中所述的方法或其它合适检定来确定。在另一具体实施方式中，可通过将样本中的PLVAP表现与合适对照的PLVAP表现作比较来测定PLVAP表现的增加。合适对照包括(例如)来自个体的非瘤组织样本、非癌细胞、非转移癌细胞、非恶性(良性)细胞或其类似物，或合适的已知或经确定参考标准。参考标准可为PLVAP蛋白或RNA的表现的典型、正常或经标准化范围或量(例如，表现标准)。因此，该方法不需要评估合适对照中的基因/蛋白质表现。
在另一具体实施方式中，可通过侦测来自患者的样本中的PLVAP基因复本数来诊断肝细胞癌。举例而言，在一些具体实施方式中，大于2的PLVAP基因复本数(例如，基因复本数为3或4)可诊断为患HCC。典型地，正常人类细胞的PLVAP基因复本数会是2。因此，基于PLVAP基因复本数的诊断方法不需要侦测来自患者的对照样本中的PLVAP基因复本数，但可使用对照。合适对照包括(例如)来自个体的非瘤组织样本、非癌细胞、非转移癌细胞、非恶性(良性)细胞或其类似物，或合适的已知或经确定参考标准(例如，PLVAP基因复本数2)。可通过合适技术(诸如荧光原位杂交(FISH))来确定来自患者的样本中的PLVAP基因复本数。
PLVAP抗体
如本文中所述，结合PLVAP的抗体具有诊断及治疗人类个体的HCC的效用。举例而言，可使用特异性结合PLVAP的抗体通过免疫组织化学染色(IHC)来侦测肝穿刺活检物或针抽吸物标本中肝细胞癌的毛细管内皮细胞上PLVAP的存在。另外，针对PLVAP的抗体(例如，人化抗体、嵌合抗体)可经用于免疫正电子发射断层摄影术(免疫PET)(Clin Cancer Res 12：1958-1960，2006；Clin Cancer Res 12：2133-2140，2006)的适当示踪剂(例如，放射性同位素)标记以测定个体肝脏中的占位病变(space occupying lesion)是否为肝细胞癌。抗PLVAP抗体(例如，人化抗体)还可经用于治疗目的的细胞毒性剂(放射性或非放射性)标记(Weiner LM，Adams GP，Von Mehren M.Therapeutic monoclonal antibodies：General principles.于Cancer：Principles & Practice of Oncology.第6版DeVita VT，Hellman S，Rosenberg SA编，Philadelphia：Lippincott Williams & Wilkins；2001：495-508中；Levinson W，Jawetz E.Medical Microbiology & Immunology.第4版Stamford：Appleton & Lange；1996：307-47；Scheinberg DA，Sgouros G，Junghans RP.Antibody-based immunotherapies for cancer.于Cancer Chemotherapy & Biotherapy：Principles and Practice.第3版Chabner BA，Longo DL编，Philadelphia：Lippincott Williams & Wilkins；2001：850-82中)。
因此，在一具体实施方式中，本发明提供一种结合(例如，特异性结合)PLVAP蛋白(例如，人类PLVAP蛋白(SEQ ID NO：23))的抗体。特异性结合PLVAP蛋白的抗体尤其可为多株、单株、人类、嵌合、人化、灵长类化、镶饰及单链抗体，以及抗体片段(例如，Fv、Fc、Fd、Fab、Fab′、F(ab′)、scFv、scFab、dAb)。(例如参见Harlow等人，Antibodies A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，1988)。特异性结合PLVAP蛋白的抗体可通过熟知的方法或其它合适技术来产生、建构、工程化及/或分离。举例而言，可对抗适当免疫原，诸如重组哺乳动物(例如，人类)PLVAP蛋白(例如，SEQ ID NO：23)或其部分(例如，SEQ ID NO：2)(包括合成分子，例如合成肽)产生对PLVAP蛋白具特异性的抗体。已描述多种此类免疫方法(例如，参见Kohler等人，Nature，256：495-497(1975)及Eur.J.Immunol.6：511-519(1976)；Milstein等人，Nature 266：550-552(1977)；Koprowski等人，美国专利第4,172,124号；Harlow，E.及D.Lane，1988，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY)；Current Protocols In Molecular Biology，第2卷(第27号增刊，94年夏季)，Ausubel，F.M.等人编，(John Wiley & Sons：New York，NY)，第11章，(1991))。还可通过用表现PLVAP的细胞(例如，癌细胞/细胞株)或经工程化以表现PLVAP的细胞(例如，经转染细胞)免疫合适宿主(例如，小鼠)来产生抗体。(例如参见Chuntharapai等人，J.Immunol.，152：1783-1789(1994)；Chuntharapai等人，美国专利第5,440,021号)。
在免疫后的适当时间，例如当抗体效价最高时，可自经免疫动物获得产生抗体的细胞且用以通过标准技术来制备单株抗体，这些技术诸如最初由Kohler及Milstein描述的融合瘤技术(Nature 256：495-497，1975)、人类B细胞融合瘤技术(Kozbor等人，Immunol.Today 4：72，1983)、EBV-融合瘤技术(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，第77-96页，1985)或三体瘤(trioma)技术。产生融合瘤的技术为熟知的(一般参见Current Protocols in Immunology，Coligan等人，(编)John Wiley & Sons，Inc.，New York，NY，1994)。简言之，使永生细胞株(典型地为骨髓瘤)与来自经如上文所述的免疫原免疫的哺乳动物的淋巴细胞(典型地为脾细胞)融合，且筛选所得融合瘤细胞的培养物上清液以鉴别产生结合本文中所述的多肽的单株抗体的融合瘤。
许多用于融合淋巴细胞与永生化细胞株的熟知方案中的任一种均可用于产生针对本发明多肽的单株抗体的目的(例如，参见Current Protocols in Immunology，前述；Galfre等人，Nature，266：55052，1977；R.H.Kenneth，Monoclonal Antibodies：A New Dimension In Biological Analyses，Plenum Publishing Corp.，New York，New York，1980；及Lerner，Yale J.Biol.Med.54：387-402，1981)。此外，一般技术人员应了解存在许多还适用的这些方法的变体。
在制备分泌单株抗体的融合瘤的一替代方法中，可通过用标靶多肽筛选重组合免疫球蛋白文库(例如，抗体噬菌体呈现文库)以藉此分离结合该多肽的免疫球蛋白文库成员来鉴别及分离针对PLVAP蛋白的单株抗体。用于产生及筛选噬菌体呈现文库的套组可购得(例如，Pharmacia重组噬菌体抗体***，目录号27-9400-01；及Stratagene SurfZAPTM噬菌体呈现套组，目录号240612)。另外，特别适用于产生及筛选抗体呈现文库的方法及试剂的实例可见于(例如)美国专利第5,223,409号、PCT公开案第WO 92/18619号、PCT公开案第WO91/17271号、PCT公开案第WO 92/20791号、PCT公开案第WO 92/15679号、PCT公开案第WO 93/01288号、PCT公开案第WO 92/01047号、PCT公开案第WO 92/09690号、PCT公开案第WO 90/02809号；Fuchs等人，Bio/Technology9：1370-1372，1991；Hay等人，Hum.Antibodies Hybridomas 3：81-85，1992；Huse等人，Science 246：1275-1281，1989；及Griffiths等人，EMBO J.12：725-734，1993中。
抗体片段(例如，抗原结合片段)可通过酶促裂解或通过重组技术来产生。举例而言，木瓜蛋白酶或胃蛋白酶裂解分别可产生Fab或F(ab′)2片段。还可使用其它具有必需受质特异性的蛋白酶来产生Fab或F(ab′)2片段。
还可使用已在天然终止位点上游引入一或多个终止密码子的抗体基因产生多种截短形式的抗体。举例而言，编码F(ab′)2重链部分的嵌合基因可经设计而包括编码重链的CH1域及铰链区的DNA序列。
本发明及术语「抗体」还涵盖包含来源于不同物种的部分的单链、人类、嵌合、人化、灵长类化(CDR接枝)或镶饰抗体。此等抗体的各种部分可通过熟知的技术以化学方式接合在一起，或可使用遗传工程化技术以相接蛋白(contiguous protein)的形式制备。举例而言，编码嵌合或人化链的核酸可经表现而产生相接蛋白。例如参见Cabilly等人，美国专利第4,816,567号；Cabilly等人，欧洲专利第0,125,023B1号；Boss等人，美国专利第4,816,397号；Boss等人，欧洲专利第0,120,694B1号；Neuberger，M.S.等人，WO 86/01533；Neuberger，M.S.等人，欧洲专利第0,194,276B1号；Winter，美国专利第5,225,539号；Winter，欧洲专利第0,239,400B1号；Queen等人，欧洲专利第0 451 216 B1号；及Padlan，E.A.等人，EP 0 519 596A1。关于灵长类化抗体，还参见Newman，R.等人，BioTechnology，10：1455-1460(1992)，且关于单链抗体还参见Ladner等人，美国专利第4,946,778号及Bird，R.E.等人，Science，242：423-426(1988)。
在一特定具体实施方式中，本发明关于特异性结合PLVAP(例如，包含SEQ ID NO：23的人类PLVAP蛋白)的嵌合抗体。在一具体实施方式中，本发明的嵌合抗体包含人类IgG4的至少一条重链及至少一条轻链(例如，κ轻链)。
在另一具体实施方式中，本发明关于特异性结合PLVAP(例如，包含SEQID NO：23的人类PLVAP蛋白)的人化抗体。人化抗体可使用合成或重组DNA技术使用标准方法或其它合适技术来产生。还可使用PCR突变诱发方法改变编码人类或人化链的DNA序列(诸如来自预先经人化可变区的DNA模板)来建构编码人化可变区的核酸(例如，cDNA)序列(例如，参见Kamman，M.等人，Nucl.Acids Res.，17：5404(1989)；Sato，K等人，Cancer Research，53：851-856(1993)；Daugherty，B.L.等人，Nucleic Acids Res.，19(9)：2471-2476(1991)；及Lewis，A.P.及J.S.Crowe，Gene，101：297-302(1991))。还可简便地使用此等或其它合适方法产生变异体。在一具体实施方式中，可使经选殖可变区(例如，dAb)突变，且可(例如，自噬菌体文库)选择编码具有所需特异性的变异体的序列(例如，参见Krebber等人，U.S.5,514,548；Hoogenboom等人，WO 93/06213，公开于1993年4月1日)。人化抗体还可由商业来源(例如，包括Antitope Limited(Cambridge，UK))产生及/或自其获得。
可使用产生或分离具有必需特异性的抗体的其它合适方法，包括(例如)自文库(例如，噬菌体呈现文库)选择重组抗体或抗体结合片段(例如，dAb)的方法或依赖于转殖基因动物(例如，小鼠)免疫的方法。能够产生人类抗体谱的转殖基因动物为此项技术中所熟知(例如，
Figure BPA00001256738800251
(Abgenix，Fremont，CA))且可使用合适方法产生(例如，参见Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551-2555(1993)；Jakobovits等人，Nature，362：255-258(1993)；Lonberg等人，美国专利第5,545,806号；Surani等人，美国专利第5,545,807号；Lonberg等人，WO 97/13852)。
抗体产生后，即可容易地使用此项技术中熟知的筛选及分离特异性抗体的方法来鉴别对PLVAP具特异性的抗体。例如参见Paul(编)，Fundamental Immunology，Raven Press，1993；Getzoff等人，Adv.in Immunol.43：1-98，1988；Goding(编)，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press Ltd.，1996；Benjamin等人，Ann.Rev.Immunol.2：67-101，1984。可使用多种检定来侦测特异性结合PLVAP蛋白的抗体。例示性检定详细描述于Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow及Lane(编)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988中。这些检定的代表性实例包括：并行免疫电泳、放射免疫检定、放射免疫沈淀、酵素结合免疫吸附分析法(ELISA)、点渍墨渍或西方墨渍检定、抑制或竞争检定及夹心检定。
在某些具体实施方式中，本发明的抗体对PLVAP具有高结合亲和力。这些抗体较佳会对PLVAP具有以Kd表示至少约10-7M(例如，约0.4×10-7M、约0.6×10-7M或更高，例如至少约10-8M、至少约10-9M或至少约10-10M)的亲和力(例如，结合亲和力)。抗体的结合亲和力可易于由一般技术人员(例如)通过斯卡查德分析(Scatchard analysis)(Scatchard，G.，Ann.NY Acad.Sci.51：660-672，1949)来测定。结合亲和力还可使用可购得的生物感测仪器(BIACORE，Pharmacia Biosensor，Piscataway，N.J.)来测定，其中将蛋白质固定于受体芯片的表面。参见Karlsson，J.Immunol.Methods 145：229-240，1991及Cunningham及Wells，J.Mol.Biol.234：554-563，1993。此***允许测定结合及解离速率(可自其计算结合亲和力)及评估结合的化学计量。
本发明的抗体可包括标记，诸如允许侦测生物样本中的抗体及抗体所结合的蛋白质(例如，PLVAP)的可侦测标记。可侦测标记尤其适用于诊断应用。举例而言，PLVAP抗体可经放射性同位素标记，放射性同位素可由熟习此项技术人员使用γ计数器、闪烁计数器或通过自动放射摄影术或其它合适方法来侦测。对于本发明而言适用的同位素包括(但不限于)：3H、125I、131I、32p、35S、14C、51Cr、36Cl、57Co、58Co、59Fe及75Se。
本发明的抗体还可经荧光化合物(例如，染料)标记。当使经荧光标记的抗体曝露于适当波长的光时，则可因化合物的荧光而侦测到其存在。最常用的荧光标记有异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate)、若丹明(rhodamine)、藻红蛋白(phycoerytherin)、藻青蛋白(phycocyanin)、别藻青蛋白(allophycocyanin)、邻苯二甲醛(o-phthaldehyde)及荧光胺(fluorescamine)。本发明的抗体还可使用荧光发射金属(诸如152Eu)或其它镧系元素来标记。可将此等金属使用诸如二伸乙三胺五乙酸(DTPA)、四氮杂-环十二烷-四乙酸(DOTA)或乙二胺四乙酸(EDTA)的金属螯合基团连接至抗体分子。
还可将本发明的抗体与化学发光化合物偶合。适用化学发光标记化合物的实例为发光胺(luminol)、异发光胺(isoluminol)、芳族吖锭酯、咪唑、吖锭盐及草酸酯。
同样，可使用生物发光化合物来标记本发明的抗体。生物发光为一种可见于生物***中的化学发光类型，其中催化蛋白增加该化学发光反应的效率。生物发光蛋白的存在可通过侦测存在发光来测定。适用于标记抗体的目的的生物发光化合物为虫荧光素(luciferin)、荧光素酶(luciferase)及水母发光蛋白(aequorin)。
侦测经标记抗体可通过闪烁计数器(例如，若可侦测标记为放射性γ发射体)或通过荧光计(例如，若标记为荧光材料)来完成。在酶标记的情况下，侦测可通过使用酶受质的比色法来完成。侦测还可通过相对于类似制备的标准物视觉比较受质的酶促反应程度来完成。
因此，本发明的抗体还可用作组织切片的染色剂。举例而言，可使与PLVAP结合的经标记抗体与组织样本(例如，来自患者的肝组织活检物或细针抽吸物)接触。接着可洗涤此切片且使用适当方法侦测标记。
出于治疗HCC的目的，本发明的PLVAP抗体可包括增强破坏表现PLVAP的细胞(例如，HCC细胞周围的血管内皮细胞)的放射性标记或其它治疗剂。适用于HCC疗法的放射性同位素标记的实例包括(但不限于)125I、131I、90Y、67Cu，217Bi、211At、212pb、47Sc、109pd、111In及118Re。视情况，可使用经中子辐射轰击后发射α及β粒子的标记(诸如硼)作为治疗性PLVAP抗体的标记。
治疗性抗体还可包括能够选择性杀死表现PLVAP的细胞的细胞毒性剂。举例而言，可使用细菌毒素(诸如白喉毒素(diphtheria toxin))或篦麻毒素(ricin)。用于产生包含白喉毒素的片段A的抗体的方法教示于美国专利第4,675,382号(1987)中。白喉毒素含有两条多肽链。B链使毒素结合至细胞表面上的受体。A链实际进入细胞质且通过使延长因子2(伴随ETP水解使核糖体沿mRNA易位的因子)失活来抑制蛋白质合成。参见Darnell，J.等人，Molecular Cell Biology，Scientific American Books，Inc.，第662页(1986)。或者，可制备包含篦麻毒素(一种毒性凝集素)的抗体。其它合适细胞毒性剂为熟习此项技术的人所已知。
对于活体内侦测而言，可将本发明的PLVAP抗体直接或通过使用中间官能基与放射性核素接合。常用于将放射性同位素(以金属阳离子的形式存在)与抗体结合的中间基团为二伸乙三胺五乙酸(DTPA)或四氮杂-环十二烷-四乙酸(DOTA)。以此方式结合的金属阳离子的典型实例为99Tc、123I、111In、131I、97Ru、67Cu、67Ga及68Ga。
此外，本发明的抗体可经包括顺磁性原子的NMR成像剂标记。使用NMR成像剂允许使用NMR技术活体内诊断患者中HCC的存在及程度。尤其适于以此方式使用的元素为157Gd、55Mn、162Dy、52Cr及56Fe。
在一个具体实施方式中，本发明是关于由融合瘤KFCC-GY4(ATCC编号_______)所制造的PLVAP抗体，该融合瘤已以于_______寄存在美国，维吉尼亚州20108，马纳沙斯，邮政信箱1549，美国菌种保存中心(ATCC)。在另一个具体实施方式中，本发明提供由融合瘤KFCC-GY5(ATCC编号_______)所制造的PLVAP抗体，该融合瘤已于_______寄存在美国，维吉尼亚州20108，马纳沙斯，邮政信箱1549，美国菌种保存中心(ATCC)
在另一个具体实施方式中，本发明是关于融合瘤KFCC-GY4(ATCC编号_______)。在另外的具体实施方式中，本发明提供融合瘤KFCC-GY5(ATCC编号_______)。
PLVAP拮抗剂
本发明的PLVAP拮抗剂可为抑制(例如，降低、阻止)PLVAP基因产物的活性的任何药剂。PLVAP活性包括(但不限于)HCC肿瘤的形成、生长、血管形成或进展。在一特定具体实施方式中，PLVAP拮抗剂通过与PLVAP基因产物(例如PLVAP RNA、PLVAP蛋白)特异性结合来抑制PLVAP基因产物的活性。PLVAP拮抗剂还涵盖抑制(降低、减少、阻止)PLVAP基因或基因产物(例如，PLVAP RNA、PLVAP蛋白)的表现(例如，转录、mRNA加工、转译)的药剂。PLVAP拮抗剂尤其可为抗体、小分子、肽、肽模拟物或核酸。
抗体拮抗剂
本发明的PLVAP拮抗剂可为特异性结合PLVAP蛋白的抗体。这些抗体包括(但不限于)本文中所述的PLVAP特异性抗体中的任一种。
小分子抗体
PLVAP拮抗剂还可为小分子。小分子的实例包括有机化合物、有机金属化合物、无机化合物及有机、有机金属或无机化合物的盐。小分子中的原子典型地经由共价键及/或离子键连接在一起。小有机分子中的原子排列可表现为链(例如，碳-碳链或碳-杂原子链)，或可表现为含有碳原子的环(例如，苯或多环***)或含有碳与杂原子的组合的环(亦即杂环，诸如嘧啶或喹唑啉)。尽管小分子可具有任何分子量，但其通常包括小于约5,000道尔顿(dalton)的分子。举例而言，这些小分子可小于约1000道尔顿，且较佳小于约750道尔顿，或更佳小于约500道尔顿。小分子及其它非肽PLVAP拮抗剂可存在于自然界(例如，鉴别、分离、纯化)及/或合成产生(例如，通过传统的有机合成、生物介导的合成或其组合)。例如参见Ganesan，Drug Discov.Today 7(1)：47-55(2002年1月)；Lou，Drug Discov.Today，6(24)：1288-1294(2001年12月)。天然存在的小分子的实例包括(但不限于)激素、神经递送素、核苷酸、胺基酸、糖、脂质及其衍生物。
肽拮抗剂
本发明的PLVAP拮抗剂还可为与PLVAP蛋白结合的肽。肽可包含任何适合的L-及/或D-胺基酸，例如常见α-胺基酸(例如，丙胺酸、甘胺酸、缬胺酸)、非α-胺基酸(例如，β-丙胺酸、4-胺基丁酸、6-胺基己酸、肌胺酸、斯他胺酸(statine))及不常见胺基酸(例如，瓜胺酸、高瓜胺酸、高丝胺酸、正白胺酸、正缬胺酸、鸟胺酸)。肽上的胺基、羧基及/或其它官能基可为游离的(例如，未经修饰)或经合适保护基保护。适用于胺基及羧基的保护基及适用于添加或移除保护基的方法为此项技术中所已知且揭示于(例如)Green及Wuts，「Protecting Groups in Organic Synthesis」，John Wiley and Sons，1991中。还可使用此项技术中已知的方法将肽的官能基衍生化(例如，烷基化)。
肽PLVAP拮抗剂可视需要包含一或多个修饰(例如，胺基酸连接子、酰化、乙酰化、酰胺化、甲基化、末端修饰子(例如，环化修饰))。肽还可含有化学修饰(例如，N-甲基-α-胺基取代)。另外，肽拮抗剂可为已知及/或天然存在的肽的类似物，例如具有保守胺基酸残基取代的肽类似物。此等修饰可改良肽的各种特性(例如，稳定性、结合)，包括其PLVAP拮抗剂活性。
肽PLVAP拮抗剂可为线性、分枝或环状分子，例如具有包括数个酰胺键的杂原子环结构的肽。在一特定具体实施方式中，肽为环状肽。这些肽可由熟习此项技术人员使用标准技术制得。举例而言，可通过酶促裂解或化学裂解自天然蛋白质衍生或移除肽，或可通过合适方法，例如固相肽合成(例如，梅里菲尔德(Merrifield)型合成)(例如，参见Bodanszky等人，「Peptide Synthesis，」John Wiley & Sons，第2版，1976)来合成肽。作为PLVAP拮抗剂的肽还可(例如)使用重组DNA方法或其它合适方法制得(例如，参见SambrookJ.及RussellD.W.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，2001)。
肽可经合成及组合为包含几种至许多种独立分子种类的文库。这些文库可使用组合化学方法制备，且可使用任何合适方法筛选以测定该文库是否包含具有所需生物活性的肽。接着可将这些肽拮抗剂使用熟习此项技术人员已知的合适方法分离。
肽模拟物拮抗剂
PLVAP拮抗剂还可为肽模拟物。举例而言，可制备具有与肽相同的官能基的多醣。肽模拟物可(例如)通过确立肽药剂在其由标靶分子结合或会与标靶分子结合的环境中的三维结构来设计。肽模拟物包含至少两种组份、结合部分及骨架或支撑结构。
结合部分为会与标靶分子(例如，人类PLVAP)反应或形成复合物(例如，经由疏水性或离子性相互作用)的化学原子或基团。举例而言，肽模拟物中的结合部分可与肽或蛋白质拮抗剂中的结合部分相同。结合部分可为与受体以与肽拮抗剂中的结合部分相同或类似的方式反应的原子或化学基团。举例而言，可使用计算化学来设计结合PLVAP蛋白的肽的肽模拟物。对于肽中的碱性胺基酸而言适用于设计肽模拟物的结合部分的实例包括含氮基团，诸如胺、铵、胍及酰胺或鏻。对于酸性胺基酸而言适用于设计肽模拟物的结合部分的实例包括(例如)羧基、低碳烷基羧酸酯、磺酸、低碳烷基磺酸酯或亚磷酸或其酯。
支撑结构为当与结合部分结合时提供肽模拟物的三维构型的化学实体。支撑结构可为有机或无机结构。有机支撑结构的实例包括多醣、聚合物或有机合成聚合物(诸如聚乙烯醇或聚交酯)的寡聚物。支撑结构较佳地具有与肽骨架或支撑结构大体上相同的大小及尺寸。此可通过计算或量测肽及肽模拟物的原子及键结的大小来测定。在一具体实施方式中，肽键的氮可经氧或硫取代，例如形成聚酯骨架。在另一具体实施方式中，羰基可经磺酰基或亚磺酰基取代，藉此形成聚酰胺(例如，聚磺酰胺)。可制备肽的逆酰胺(reverse amide)(例如，用一或多个-CONH-基团取代-NHCO-基团)。在另一具体实施方式中，肽骨架可经聚硅烷骨架取代。
此等化合物可通过已知方法制造。举例而言，聚酯肽模拟物可通过以下步骤来制备：用羟基取代胺基酸上的相应α-胺基，藉此制备羟基酸且继而将羟基酸酯化，视情况阻断碱性及酸性侧链以使副反应最少。测定适当化学合成途径通常可在确定化学结构后容易地鉴别。
肽仿真物可经合成及组合为包含几种至许多种独立分子种类的文库。这些文库可使用熟知组合化学方法制备，且可经筛选以判定该文库是否包含一或多种具有所需活性的肽模拟物。接着可将这些肽模拟物拮抗剂通过合适方法分离。
核酸拮抗剂
PLVAP拮抗剂还包括抑制PLVAP基因表现的各种核酸(包括核酸分子)(例如，siRNA、反义寡核苷酸、核糖核酸酶)。举例而言，小干扰核糖核酸(siRNA)及类似地在细胞中被加工为短siRNA样分子的短发夹型核糖核酸(shRNA)可阻止PLVAP蛋白的表现(转译)。siRNA分子可为长度通常为约20至约25个核苷酸且经设计以结合特定RNA序列(例如，PLVAP mRNA序列)的聚核苷酸。siRNA以序列特异性方式使基因表现沉默，与标靶RNA(例如，具有互补序列的RNA)结合且使该RNA被核糖核酸内切酶降解。能够抑制PLVAP基因产物的表现的siRNA分子可通过合适方法制得。存在数种可用于设计结合所关注基因序列的siRNA分子的算法(例如，参见Mateeva O.等人，Nucleic Acids Res.35(8)：Epub，2007；Huesken D.等人，Nat.Biotechnol.23：995-1001；Jagla B.等人，RNA 11：864-872，2005；Shabalinea S.A.BMC Bioinformatics 7：65，2005；Vert J.P.等人，BMC Bioinformatics 7：520，2006)。可获得可稳定表现siRNA或shRNA的表现载体。(例如参见Brummelkamp，T.R.，Science 296：550-553，2002；Lee，NS等人，Nature Biotechnol.20：500-505，2002；Miyagishi，M.及Taira，K.Nature Biotechnol.20：497-500，2002；Paddison，P.J.等人，Genes & Dev.16：948-958，2002；Paul，C.P.等人，Nature Biotechnol.20：505-508；2002；Sui，G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(6)：5515-5520，2002；Yu，J-Y等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(9)：6047-6052，2002；Elbashir，SM等人，Nature 411：494-498，2001)。siRNA/shRNA分子的稳定表现有利于治疗癌症，因为其使得分子能够长期表现，从而潜在地降低及/或消除重复治疗的需要。
反义寡核苷酸(例如，DNA、核糖核酸探针(riboprobe))还可用作抑制PLVAP表现的PLVAP拮抗剂。反义寡核苷酸通常为与标靶核酸序列(例如，mRNA)特异性杂交且诱导标靶核酸降解(例如，经由RNase H依赖性机制降解RNA)或空间阻碍拼接或转译机制的进程的短(约13至约25个核苷酸)单链核酸。(例如参见Dias N.及Stein C.A.，Mol.Can.Ther 1：347-355，2002)。存在多种不同类型的可用作PLVAP拮抗剂的反义寡核苷酸，包括甲基膦酸寡核苷酸、硫代磷酸寡核苷酸、核糖2′位处的氢经O-烷基(例如，甲基)置换的寡核苷酸、聚酰胺核酸(PNA)、磷酰二胺酸吗啉代寡聚物(脱氧核糖部分经吗啉环置换)、PN(核糖3′位处的氧经胺基团N3′→P5′置换)及嵌合寡核苷酸(例如，2′-O-甲基-硫代磷酸酯)。可使用预测算法设计对蛋白质具有特异性的反义寡核苷酸。(例如参见Ding，Y.及Lawrence，C.E.，Nucleic Acids Res.，29：1034-1046，2001；Sczakiel，G.，Front.Biosci.，5：D194-D201，2000；Scherr，M.等人，Nucleic Acids Res.，28：2455-2461，2000；Patzel，V.等人，Nucleic Acids Res.，27：4328-4334，1999；Chiang，M.Y.等人，J.Biol.Chem.，266：18162-18171，1991；Stull，R.A.等人，Nucleic Acids Res.，20：3501-3508，1992；Ding，Y.及Lawrence，C.E.，Comput.Chem.，23：387-400，1999；Lloyd，B.H.等人，Nucleic Acids Res.，29：3664-3673，2001；Mir，K.U.及Southern，E.M.，Nat.Biotechnol.，17：788-792，1999；Sohail，M.等人，Nucleic Acids Res.，29：2041-2051，2001；Altman，R.K.等人，J.Comb.Chem.，1：493-508，1999)。反义寡核苷酸可通过合适方法制得，例如使用自动化核酸合成仪(例如，来自Applied Biosystems)的核酸(例如，DNA、RNA、PNA)合成(还参见Martin，P.，Helv.Chim.Acta78：486-504，1995)。还可使反义寡核苷酸稳定表现于含有适当表现载体的细胞中。
反义寡核苷酸可由标靶细胞(例如，肿瘤细胞)经吸附性胞饮过程吸收。因此，在治疗个体(例如，哺乳动物)时，可(例如)通过注射或输注将反义PLVAP寡核苷酸递送至标靶细胞(例如，肿瘤细胞)中。举例而言，可将经纯化的寡核苷酸或siRNA/shRNA单独或以调配物形式使用合适药物递送媒介(例如，脂质体、阳离子聚合物(例如，聚-L-离胺酸、PAMAM树枝状聚合物、聚烷基氰基丙烯酸酯奈米颗粒及聚乙烯亚胺))投予或与合适载体肽(例如，同源转录因子、触足肽(Antennapedia peptide)、HIV-1的Tat蛋白、E5CA肽)偶合。
核糖核酸酶还可用作抑制PLVAP表现的PLVAP拮抗剂。核糖核酸酶为具有酶促活性的RNA分子。一类核糖核酸酶能够重复地将其它独立RNA分子以核苷酸碱基序列特异性方式裂解成两个或两个以上断片。参见Kim等人，Proc Natl Acad Sci USA，84：8788(1987)；Haseloff及Gerlach，Nature，334：585(1988)；及Jefferies等人，Nucleic Acid Res，17：1371(1989)。这些核糖核酸酶典型地具有两个功能域：催化域及引导核糖核酸酶与标靶RNA经由互补碱基配对结合的结合序列。使经特定设计的核糖核酸酶与标靶mRNA结合后，其即酶促裂解标靶mRNA，典型地降低其稳定性及破坏其直接转译经编码蛋白质的能力。在核糖核酸酶裂解其RNA标靶后，其自该标靶RNA释放且随后可结合并裂解另一标靶。亦即，单一核糖核酸酶分子可重复地结合并裂解新标靶。
根据本发明，核糖核酸酶可靶向编码PLVAP的mRNA的任何部分。选择核糖核酸酶标靶序列及设计并制造核糖核酸酶的方法通常为此项技术中所已知。例如参见美国专利第4,987,071号、第5,496,698号、第5,525,468号、第5,631,359号、第5,646,020号、第5,672,511号及第6,140,491号，这些专利各自的全文以引用的方式并入本文中。举例而言，合适核糖核酸酶可以各种构型设计，诸如锤头型基元、发夹型基元、Δ型肝炎病毒基元、I型内含子基元或RNase P RNA基元。例如参见美国专利第4,987,071号、第5,496,698号、第5,525,468号、第5,631,359号、第5,646,020号、第5,672,511号及第6,140,491号；Rossi等人，AIDS Res Human Retroviruses 8：183(1992)；Hampel及Tritz，Biochemistry 28：4929(1989)；Hampel等人，Nucleic Acids Res，18：299(1990)；Perrotta及Been，Biochemistry 31：16(1992)；及Guerrier-Takada等人Cell，35：849(1983)。
核糖核酸酶可通过用于常规RNA合成的相同方法来合成。举例而言，合适方法揭示于Usman等人，J Am Chem Soc，109：7845-7854(1987)及Scaringe等人，Nucleic Acids Res，18：5433-5441(1990)中。经修饰核糖核酸酶可通过揭示于以下文献中的方法来合成：例如美国专利第5,652,094号；国际公开案第WO91/03162号、第WO 92/07065号及第WO 93/15187号；欧洲专利申请案第92110298.4号；Perrault等人，Nature，344：565(1990)；Pieken等人，Science，253：314(1991)；及Usman及Cedergren，Trends Biochem Sci，17：334(1992)。
本发明的PLVAP拮抗剂还可为与PLVAP蛋白结合且抑制其活性的核酸分子(例如，寡核苷酸)。合适核酸PLVAP拮抗剂包括能够经由非经典沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对的相互作用以高亲和力及特异性结合所关注的特定分子(例如，人类PLVAP)的适体(Tuerk及Gold，Science 249：505(1990)；Ellington及Szostak，Nature 346：818(1990))。
适体，如通过噬菌体呈现所产生的肽或单株抗体(MAb)，能够特异性结合所选标靶且经由结合阻断其标靶的作用能力。适体可通过试管内选择方法自随机序列寡核苷酸池产生，已对100种以上蛋白质产生适体，这些蛋白质包括生长因子、转录因子、酶、免疫球蛋白及受体。典型适体的大小为10-15kDa(30-45个核苷酸)，以次奈莫耳亲和力结合其标靶，且排斥密切相关的标靶(例如，典型地不会结合来自相同基因家族的其它蛋白质)。一系列结构研究已展示适体能够使用相同类型的结合相互作用(氢键结、静电互补、疏水性接触、空间排阻等)驱动抗体-抗原复合物的亲和力及特异性。
与所关注标靶(例如，人类PLVAP蛋白)结合的适体可使用描述于(例如)美国专利第5,475,096号及美国专利第5,270,163号中的称为「通过指数富集进行配位体的***性演化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)」(SELEX)的标准方法来产生及鉴别。
PLVAP拮抗剂的鉴别
对PLVAP基因产物具有结合特异性的药剂可在化合物及/或文库(例如，化学品、肽、核酸文库)的筛选(例如，高通量筛选)中鉴别。
特异性结合人类PLVAP的抗体可(例如)通过筛选可购得的组合抗体文库(Dyax Corp.，MorphoSys AG)来鉴别。合适组合抗体文库及筛选此等文库的标准方法描述于Hoet等人，Nature Biotechnology 23(3)：344-348(2005)及Rauchenberger等人，J.Biol.Chem.278(40)：38194-38205(2003)中，这些文献的内容以引用的方式并入本文中。这些分子文库或集合还可使用熟知化学方法来制备。
或者，可(例如)通过用PLVAP蛋白、蛋白质片段或肽连同破坏对抗原的耐受性的佐剂免疫小鼠来鉴别特异性结合人类PLVAP的鼠类抗体。可根据所需特异性及活性来筛选此等抗体且接着使用已知技术将其人化以产生适用于治疗人类疾病的药剂。
化合物或小分子可自多种可获得的化合物文库鉴别，这些文库例如来自美国国家癌症研究所的化学品储存库(Chemical Repository of the National Cancer Institute)及分子文库小分子储存库(Molecular Libraries Small Molecules Repository)(PubChem)，以及哈佛大学(Harvard University)的化学与细胞生物学研究所(Institute of Chemistry and Cell Biology at Harvard University)的文库及可自商业来源(例如，Chembridge、Peakdale、CEREP、MayBridge、Bionet)获得的其它文库。这些分子文库或集合还可使用熟知化学方法(诸如熟知组合化学方法)来制备。可筛选文库以鉴别结合且抑制PLVAP的化合物。
经鉴别的化合物可充当使用熟知药物化学方法进一步分化的主导化合物。举例而言，可制备作为主导化合物结构变异体的化合物集合且根据PLVAP结合及/或抑制活性进行筛选。此可使得发展出将化合物结构与生物活性相联系的结构活性关系。具有合适结合及抑制活性的化合物可经进一步研发以供活体内使用。
可进一步评价结合PLVAP的药剂的PLVAP拮抗剂活性。举例而言，可在筛选或结合检定中使用包含PLVAP蛋白的组成物来侦测及/或鉴别结合且拮抗PLVAP蛋白的药剂。适用组成物包括(例如)天然表现PLVAP蛋白的细胞(例如，肝血管内皮细胞)、这些细胞的提取物及重组PLVAP蛋白。
可在(例如)竞争结合检定中鉴别结合PLVAP蛋白的药剂，其中评估测试药剂抑制PLVAP与参考药剂结合的能力。参考药剂可为全长PLVAP蛋白或其部分。参考药剂可经合适标记(例如，放射性同位素、抗原决定基标记、亲和标记(例如，生物素及抗生物素蛋白(avidin)或抗生蛋白链菌素(streptavadin))、自旋标记、酶、荧光基团、化学发光基团、染料、金属(例如，金、银)、磁性珠粒)标记且可测定检定中使PLVAP蛋白饱和所需的经标记参考药剂的量。可使用合适对照(例如，未经标记的药剂、单独标记)来测定PLVAP蛋白与测试药剂之间形成复合物的特异性。
测试药剂抑制参考药剂与PLVAP蛋白之间的复合物形成的能力可根据50％抑制经标记参考药剂的特异性结合所需的测试药剂浓度(IC50值)来测定。特异性结合较佳定义为总结合(例如，复合物中的总标记量)减去非特异性结合。非特异性结合较佳定义为在过量未经标记参考药剂存在下所形成的复合物中仍侦测到的标记的量。适用于该方法的参考药剂包括特异性结合PLVAP的分子及化合物，例如结合PLVAP的抗体。
可通过筛选具有拮抗(降低、阻止、抑制)PLVAP的一或多种活性(诸如肿瘤血管形成)的能力的药剂来鉴别拮抗PLVAP蛋白的药剂。这些活性可由熟习此项技术人员使用任何适当试管内或活体内检定来评估。
医药组成物
本发明的PLVAP拮抗剂可作为医药或生理组成物的部分，例如作为包含PLVAP拮抗剂及医药学上可接受的载剂的医药组成物的部分投予哺乳动物个体。包含PLVAP拮抗剂(例如，特异性结合PLVAP的抗体)的调配物或组成物或包含PLVAP拮抗剂及一或多种其它治疗剂(例如，化学治疗剂，例如阿霉素、5-氟尿嘧啶、他莫昔芬、奥曲肽)的组成物会根据所选投予途径而变化(例如，溶液、乳液或胶囊)。合适医药载剂可含有不与PLVAP拮抗剂相互作用的惰性成份。可使用标准医药调配技术，诸如Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，PA中所述的技术。适用于非经肠投予的医药载剂包括(例如)无菌水、生理食盐水、抑菌生理食盐水(含有约0.9％mg/ml苯甲醇的生理食盐水)、磷酸盐缓冲生理食盐水、汉克氏溶液(Hank’s solution)、林格氏乳酸盐溶液(Ringer’s lactate)及其类似物。调配物还可包括少量增强活性成份的有效性的物质(例如，乳化剂、增溶剂、pH值缓冲剂、润湿剂)。囊封组成物(诸如于硬明胶或环糊精的包衣中)的方法为此项技术中所已知。对于吸入而言，可将药剂溶解及装载于适于投予的分配器(例如，雾化器或喷雾器或加压气溶胶分配器)中。
诊断套组
本发明还提供用于侦测个体中肝细胞癌的存在的诊断套组。这些套组包含至少一种用于侦测样本(例如，来自哺乳动物个体的生物样本)中的PLVAP基因表现的药剂(例如，核酸探针、抗体)。PLVAP基因表现可(例如)通过侦测样本中的PLVAP基因产物(诸如PLVAP mRNA或PLVAP蛋白)来侦测。
因此，在一具体实施方式中，该套组包含至少一种与PLVAP RNA(例如，mRNA、hnRNA)转录物特异性杂交的核酸探针(例如，寡核苷酸探针)。这些探针能够在高严格度条件下与PLVAP RNA杂交。
在另一具体实施方式中，该套组包括能够与样本中的PLVAP基因产物(例如，mRNA、cDNA)特异性杂交的一对寡核苷酸引子。这些引子可用于任何标准核酸扩增程序(例如，聚合酶连锁反应(PCR)，例如RT-PCR、定量实时PCR)中以侦测样本中PLVAP基因产物的含量。
在另一具体实施方式中，本发明的套组包括特异性结合PLVAP蛋白(例如，人类PLVAP蛋白)的抗体。这些抗体包括本文中所述的本发明PLVAP抗体中的任一种。在一具体实施方式中，该抗体包含具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列的VH域及具有SEQ ID NO：9的胺基酸序列的VL域。在另一具体实施方式中，该抗体包含具有SEQ ID NO：14的胺基酸序列的VH域及具有SEQ IDNO：19的胺基酸序列的VL域。
本发明套组中的诊断剂可包括一或多种标记(例如，可侦测标记)。此项技术中已知多种适用于诊断剂的标记且其包括(但不限于)本文中所述标记中的任一种。在一特定具体实施方式中，诊断剂(例如，抗体)包括放射性同位素以使得药剂可用于免疫正电子发射断层摄影术(免疫PET)。
现将通过以下实施例说明本发明，这些实施例不欲任何方式构成限制。
实施例
实施例1：HCC肝组织中的PLVAP表现相对于非HCC肝组织升高
材料及方法：
组织样本
自出于治疗目的自人类患者手术移除的新鲜标本收集HCC及相邻非肿瘤肝脏的组织。此等标本在主治病理医师的直接监督下收集。在辜公亮基金会和信治癌中心医院(Koo Foundation Sun Yat-Sen Cancer Center，KF-SYSCC)的肿瘤库将所收集的组织立即储存于液氮中。可获得来自18名HCC患者的配对组织样本用于研究。此研究获伦理委员会(Institutional Review Board)批准且获得所有患者的书面知情同意书。此研究中的18名HCC患者的临床特征总结于表1中。
表1：自其获得配对的HCC与相邻非肿瘤肝组织样本的18名HCC患者的临床资料。
Figure BPA00001256738800381
Figure BPA00001256738800391
mRNA转录物侧写
使用Trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)自冷冻于液氮中的组织分离总RNA。将所分离的RNA使用RNAEasy Mini套组(Qiagen，Valencia，CA)进一步纯化，且在Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies，Waldbronn，Germany)中使用RNA 6000Nano检定评估其质量。所有用于研究的RNA样本均具有大于5.7(8.2±1.0，平均值±SD)的RNA完整性指数。自8μg总RNA根据Affymetrix方案制备杂交标靶且使其与含有用于大约13,000种人类基因的22,238个探针组的Affymetrix U133A基因芯片杂交。在杂交后，立即使用Affymetrix基因芯片流控台400及EukGE WS2v4方案使经杂交数组经历自动化洗涤及染色。随后，在Affymetrix基因数组扫描仪2500中扫描U133A基因芯片。
微数组数据的存在及不存呼叫的判定
使用Affymetrix微数组分析套件(MAS)5.0软件产生所有18对HCC与相邻非肿瘤肝组织的微数组数据的存在呼叫。存在呼叫判定的所有参数均为默认值。通过MAS 5.0将各探针组判定为「存在」、「不存在」或「边缘」。类似地，使用dChip 2004版软件处理相同微数组数据以判定微数组上各探针组的「存在」、「不存在」或「边缘」状态。
具有极端差异性表现的探针组的鉴别
为鉴别在HCC与相邻非肿瘤肝组织之间具有极端差异性表现的基因，根据以下规则使用用实际撷取与报导语言(Practical Extraction and Report Language，PERL)编写的软件：「肿瘤特异性基因(Tumor-specific gene)」定义为通过MAS 5.0与dChip在HCC中呼叫为「存在」而在相邻非肿瘤肝组织中呼叫为「不存在」或「边缘」的探针组。「非肿瘤肝组织特异性基因(Non-tumorliver tissue-specific gene)」定义为通过MAS 5.0与dChip在HCC中呼叫为「不存在」或「边缘」而在配对相邻非肿瘤肝组织中呼叫为「存在」的探针组。描绘鉴别算法的流程图展示于图1中。
实时定量性逆转录酶聚合酶连锁反应(RT-PC)
使用TaqManTM实时定量性逆转录酶-PCR(qRT-PCR)来定量mRNA。自各样本的8μg总RNA使用1500ng寡聚(dT)引子及600个单位的SuperScriptTM II逆转录酶(来自Invitrogen，Carlsbad，CA)以60μl的最终体积根据制造商说明合成cDNA。对于各RT-PCR反应而言，在25μl的最终体积中遵照制造商说明(ABI及Roche)使用0.5μl cDNA作为模板。使用Applied Biosystems 7900HT实时PCR***进行PCR反应。实验所需的探针及试剂自Applied Biosystems(ABI)(Foster City，CA)获得。用于PLVAP的实时定量性RT-PCR的引子及探针的序列为5’-CCTGCAGGCATCCCTGTA-3’(正向引子)(SEQ ID NO：25)、5’-CGGGCCATCCCTTGGT-3’(反向引子)(SEQ ID NO：26)及5’-CCCCATCCAGTGGCTG-3’(探针)(SEQ ID NO：27)。使用次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酰基核糖基转移酶(HPRT)持家基因(housekeeping gene)作为标准化的内源参考。所有样本均双重复操作，在同一PCR盘上操作同一标靶mRNA及内源参考HPRT mRNA。通过比较性Ct方法根据制造商说明(User Bulletin #2，ABI Prism 7700序列侦测***)计算标靶mRNA的相对量。选择非肿瘤肝样本作为计算的相对校正因子。
结果：
18对HCC与相邻非肿瘤肝组织中的PLVAP基因表现强度展示于图2中。配对的HCC与相邻非肿瘤肝组织的平均基因表现强度分别为759.8±436.5及170.6±53.4(平均值±SD)。两组的间配对t检验的p值为2.8×10-5。此等结果表明PLVAP表现于HCC中而不表现于非肿瘤肝组织中。当82个未经配对的HCC样本展示出810.4±482.0(平均值±SD)的平均表现强度时，该表现强度与来自18个经配对HCC样本的研究结果基本上相同(通过t检验得出p＝0.62)(图2)，进一步证实HCC中PLVAP的此升高表现。
为证实PLVAP显著表现于HCC肝组织中而不表现于非肿瘤肝组织中，对来自18对HCC与相邻非肿瘤肝组织的RNA样本执行实时定量性RT-PCR。相对于非肿瘤肝组织，HCC中的PLVAP mRNA量显著较高(参见图3A及表2)。尽管结果在两组间展示出一些重迭，但除一人外对于所有经测试个体，在同一个体内HCC中的PLVAP转录物比相邻非肿瘤肝组织高(图3B)。此例外可能与组织储存过程中的不均匀RNA降解度有关。
表2：18对HCC与相邻非肿瘤肝组织的PLVAP基因表现强度。
Figure BPA00001256738800411
实施例2：PLVAP由HCC血管内皮细胞特异性表现
材料及方法：
经***(formalin)固定的石蜡包埋组织的雷射捕捉显微解剖(LCM)使用来自Arcturus Bioscience，Inc.(Mountain View，CA)的Arcturus
Figure BPA00001256738800421
IIe***、CapSureTM HS LCM盖片及ParadiseTM试剂***进行来自石蜡块的经***固定的组织的LCM。切离7微米厚的组织切片，将其去石蜡化、再水合、染色及脱水以根据制造商说明进行LCM。使用7.5μm雷射光斑尺寸以50mW功率及1.3ms持续时间将标靶细胞捕捉至CapSureTM HSLCM盖片上。每个盖片捕捉大约5000至6000个细胞。然而，因细胞稀少每个盖片上仅捕捉1000至2000个肝细胞癌血管内皮细胞。
自LCM组织切片提取RNA以供进行定量性RT-PCR
使用ParadiseTM试剂***根据制造商说明处理如上文所述捕捉于CapSureTM HS LCM盖片上的细胞以进行RNA提取、cDNA合成、试管内转录及反义RNA扩增。接着使用所合成的反义RNA作为模板来进行两步TaqMan实时定量性RT-PCR以定量通过LCM所捕捉的细胞中的PLVAP及β-肌动蛋白mRNA。第一步(亦即，逆转录)使用4.5μl反义RNA及TaqMan逆转录试剂(ABI)以10μl的最终体积遵循制造商方案来进行。第二步(亦即，实时PCR)使用2.4μl cDNA模板、引子/探针混合物及来自Applied Biosystems的TaqMan通用PCR母混合物以25μl的最终体积来执行。在Smart Cycler II(Cephid，Inc.，Sunnyvale，CA)中进行实时PCR。将反应最初在50℃下培育2分钟且接着在95℃下培育10分钟。随后，执行45个以下循环：95℃下变性15秒钟及60℃下黏接/延长40秒钟。引子及探针的序列列于表3中。
表3：用于对通过雷射捕捉显微解剖所制备的样本中的PLVAP及β-肌动蛋白含量进行实时定量性RT-PCR的引子及探针序列
Figure BPA00001256738800431
用于重组融合PLVAP51-442蛋白的表现载体的制备
通过将编码PLVAP的胺基酸残基51至442的PCR片段***
Figure BPA00001256738800432
-TEasy载体(Promega，Inc.，Madison，WI)中来产生质体
Figure BPA00001256738800433
-T Easy-PLVAP51-442。PCR片段自来自OriGene(Rockyille，MD)的PLVAP的cDNA纯通过使用5’-
Figure BPA00001256738800434
AACGTGCACGTGAGCACAGAGTCC-3’(SEQ ID NO：34)及5’-
Figure BPA00001256738800435
TGAGCATATCCCTGCATCCTCC-3’(SEQ ID NO：35)的引子组来扩增。为建构质体pET-15b-PLVAP51-442，自
Figure BPA00001256738800436
-T Easy-PLVAP51-442切离每一各别末端具有NdeI及BamHI识别序列的编码PLVAP的胺基酸残基51至442的cDNA片段且将其***pET-15b(Novagen，Inc.，San Diego，CA)中。通过DNA定序验证上文所述的表现构筑体。
重组融合PLVAP51-442蛋白的表现及纯化
为产生重组经His标记的PLVAP51-442蛋白(SEQ ID NO：2)(图4)，通过将胜任细胞与pET-15b-PLVAP51-442质体DNA一起在冰上培育5分钟，随后在42℃水浴中培育30秒钟且接着再于冰上培育2分钟来转型大肠杆菌(Escherichia coli)(Rosetta-gami2(DE3)pLysS)(Novagen)。在涂铺于选择性培养基上之前，将转型体在37℃下伴随在250rpm下的震荡用SOC培养基(0.5％酵母提取物、2％胰化蛋白、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mMMgSO4、20mM葡萄糖)培育60分钟。在30℃下使用1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导Rosetta-gami2(DE3)pLysS大肠杆菌中经His标记的融合蛋白的表现历时16小时。在诱导之后，通过在补充有8M尿素的平衡缓冲液(50mM磷酸钠、300mM NaCl，pH 7)中超音波处理来使细菌细胞溶解且通过在5,600×g下离心30分钟将其分离为可溶部分与不溶部分。为进一步纯化His-PLVAP51-442蛋白，将可溶部分装载于
Figure BPA00001256738800441
金属亲和树脂(Clontech，Inc.，Palo Alto，CA)上，用平衡缓冲液洗涤且用溶离缓冲液(50mM磷酸钠、300mMNaCl、250mM咪唑，pH 7)溶离。根据制造商说明通过凝血酶裂解(Novagen)来移除经纯化融合蛋白的His标签(参见图5)。通过以PBS进行广泛性透析来回收所得PLVAP51-442蛋白。为验证重组PLVAP蛋白的特性，自Biodesign Insitute(Tempe，AZ)购得少量抗GST-PLVAP331-430融合蛋白的小鼠抗血清。使用此抗体通过西方墨渍分析侦测到无His标签的重组PLVAP51-442蛋白，但其不与针对His标签的抗体反应。此等结果证实重组PLVAP蛋白的特性。
小鼠抗人类PLVAP血清的产生
使用于PBS中的经纯化PLVAP51-442重组蛋白来免疫6周龄的Balb/cByj小鼠。最初用于完全弗氏佐剂(Freund’s adjuvant)(Sigma，Inc.，St Louis，MO)中的总共14μg PLVAP51-442蛋白在多个部位经皮下注射免疫每只小鼠。随后，每两周一次用于不完全弗氏佐剂中的7μg PLVAP51-442重组蛋白加强免疫经历3次。最后一次加强免疫后1周，对小鼠取血以制备抗血清。
酵素结合免疫吸附分析法(ELISA)
试剂及溶液：
1.重组PLVAP蛋白
2.抗小鼠IgG-碱性磷酸酶接合物(目录号AP124A，CHEMICON)
3.涂布缓冲液(0.137M氯化钠、0.01M磷酸氢二钠七水合物、2mM磷酸二氢钾、0.002％(0.3mM)迭氮化钠，pH 7.2-7.4)
4.洗涤缓冲液(0.137M氯化钠、0.01M磷酸氢二钠七水合物、2mM磷酸二氢钾、0.2％吐温20(Tween20)(目录号P1379，SIGMA)，pH 7.2-7.4)
5.阻断缓冲液(0.137M氯化钠、0.01M磷酸氢二钠七水合物、2mM磷酸二氢钾、2％牛血清白蛋白(目录号82-045，PENTEX)、0.05％吐温20(目录号P1379，SIGMA)，pH 7.2-7.4)
6.碳酸盐缓冲液(0.016M碳酸氢钠、0.014M碳酸钠、2mM氯化镁、0.002％(0.3mM)迭氮化钠，pH 9.6)
7.碱性磷酸酶受质：溶解于40ml碳酸盐缓冲液中的一片40mg磷酸酶受质锭剂(目录号P5994，SIGMA)
程序：
使用ELISA测定抗PLVAP血清中的抗体效价。首先，在4℃下用50μl以2.5μg/ml范围内的浓度溶解于含有0.002％迭氮化钠的磷酸盐缓冲生理食盐水(PBS)(亦即，涂布缓冲液)中的PLVAP蛋白涂布96孔ELISA培养盘隔夜。在用200μl洗涤缓冲液(含有0.05％吐温20的PBS)洗涤3次后，在室温下将经涂布培养盘的每一孔用150μl阻断缓冲液(亦即，含有2％牛血清白蛋白的洗涤缓冲液)阻断30分钟。再洗涤3次后，在室温下将各孔用50μl制备于稀释缓冲液中的经稀释抗血清(自1,000倍至128,000倍的连续两倍稀释)培育45分钟。随后，在室温下将各孔用5,000倍稀释度的抗小鼠IgG碱性磷酸酶接合物(Chemico，Inc.，Temecula，CA)培育30分钟。在3次洗涤后，用100μl碱性磷酸酶受质(Sigma，Inc.，St Louis，MO)定量所结合的抗体且在25至40分钟的培育期后使用ELISA培养盘读取器在405nm下执行吸光度量测。
对经***固定的组织中的PLVAP的免疫组织化学(IHC)侦测
自经***固定的组织的石蜡块切离6微米的切片。将切片封固至SuperFrost Plus黏附载玻片(Menzel Glaser GmbH，Braunschweig，Germany)上。接着处理切片以在Benchmark XT自动化染色仪(Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson，AZ)中使用XT-iView-DAB-V.1方案经轻度CCI调节将PLVAP免疫染色30分钟且在37℃下将切片用经400倍稀释的抗人类PLVAP血清培育36分钟。用于侦测小鼠抗人类PLVAP抗体结合的第二抗体及试剂来自Ventana Medical Systems，Inc.(Tucson，AZ)的iViewTMDAB侦测套组。所有试剂及缓冲液均自Ventana Medical Systems购得。
结果：
为判定HCC样本中PLVAP的细胞来源，使用雷射捕捉显微解剖(LCM)将HCC血管内皮细胞、肝细胞癌的肿瘤细胞及非肿瘤肝细胞(包括内衬窦内皮细胞)自样本中解剖出来。由于肝细胞瘤细胞与毛细管内衬内皮细胞之间紧密并列，在解剖期间尽力避免包含毛细管内衬内皮细胞。使用自经解剖细胞提取的RNA进行两步实时定量性RT-PCR以测定PLVAP mRNA的相对量。研究来自两名不同患者的标本。展示于表4及图6A-6C中的结果表明PLVAP由HCC血管内皮细胞表现(图6A)，而在相邻非肿瘤肝组织中未侦测到可侦测的PLVAP转录物(图6B)。
表4：在通过雷射捕捉显微解剖所解剖的细胞中通过Taqman实时定量性RT-PCR测定两个HCC样本中的PLVAP mRNA相对量。
为进一步研究PLVAP表现的组织及疾病特异性，对抗人类PLVAP的细胞外域(胺基酸51至442)产生多株抗体用于免疫组织化学(IHC)研究。如图7中所示，自经重组PLVAP51-442蛋白免疫的Balb/c小鼠获得的抗血清含有高效价的抗PLVAP抗体。
接着使用抗PLVAP抗血清判定来自患有肿细胞癌(n＝7)(图8A-8F及图9A-9F)、局灶结节性增生(n＝4)(图10A-10F)、肝血管瘤(n＝2)(图11A及11B)、慢性活性B型肝炎(n＝2)(图12A及12B)或慢性活性C型肝炎(n＝4)(图13A-13D)及转移癌(n＝4)(亦即，肝内胆管癌、转移性结肠直肠腺癌或转移性卵巢癌)(图14A-14D)的患者的组织切片中PLVAP表现的定位。结果展示仅肝细胞癌的毛细管内皮细胞表现PLVAP蛋白(图8A、8C、8E及图9A、9C、9E、9F)。非肿瘤肝组织(包括肝硬化症肝脏、局灶结节性增生(图10A-10F)及慢性肝炎(图12A及12B，图13A-13D)的肝脏)的内衬血管窦/毛细管的内皮细胞不表现PLVAP蛋白。肝血管瘤的内皮内衬细胞也未展示显著PLVAP表现(图11A及11B)。此等结果证明PLVAP为肝细胞癌而非其它肝病的特异性血管内皮生物标志。因此，PLVAP可用作HCC的诊断标志及治疗标靶。
实施例3：特异性结合PLVAP的小鼠单株抗体的产生及表征
材料及方法
免疫程序
最初用溶解于0.125mL磷酸盐缓冲生理食盐水(PBS)中且在等体积完全弗氏佐剂中乳化的20μg经纯化重组PLVAP蛋白免疫5只6周龄雌性Balb/cByJ小鼠。将PLVAP-佐剂混合物以0.05mL体积注射至小鼠腹侧接近腋窝及腹股沟***的4个独立皮下部位中的每一个以及位于肩胛间的第5个皮下部位。所有小鼠接受每两周一次20μg经腹膜内注射的重组PLVAP蛋白的加强免疫3次。最后一次加强免疫后1周，进行测试取血以量测小鼠是否产生显著高效价的抗PLVAP抗体(大于10,000倍)。使用固相酵素结合免疫吸附分析法(ELISA)以达成此目的。选择产生最高效价的PLVAP抗体的小鼠来制备融合瘤。
鼠类单株抗PLVAP抗体的产生
在产生融合瘤的预定融合实验前3天，给产生最高效价的PLVAP抗体的小鼠静脉内注射20μg重组PLVAP。根据先前所述的方案(参见Current Protocols in Immunology，编者：Coligan JE，Kruisbeek AM，Margulies DH，Shevach EM及Strober W.，John Wiley & Sons，Inc.，New York，2001年出版，第2.5单元Production of Monoclonal Antibodies)稍作修改制备产生抗PLVAP的单株抗体(MAb)的融合瘤。特定言之，使用50％聚乙二醇1540将自经免疫小鼠采集的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞以7.5∶1(脾细胞∶骨髓瘤细胞)的比率融合。将融合产物接种于96孔平底组织培养盘中，且在次日添加次黄嘌呤-胺基喋呤-胸苷(HAT)选择性培养基。7至10天后，通过ELISA针对抗PLVAP抗体的产生筛选生长阳性孔的上清液。扩增最初产生抗PLVAP MAb的融合瘤且再筛选。通过有限稀释法选殖展示持续产生抗体的融合瘤。使用ELISA判定MAb同型。通过蛋白G亲和力管柱层析自腹水或培养基纯化单株抗体(Current Protocols in Immunology，编者：Coligan JE，Kruisbeek AM，Margulies DH，Shevach EM及Strober W.，John Wiley & Sons，Inc.，New York，2001年出版，第2.7单元Purification and Fragmentation of Antibodies)。
ELISA检定
如本文中所述来执行Elisa检定(参见实施例2)。
结合亲和力测定
在ANT Technology Co.，Ltd.(Taipei，Taiwan)使用ANTQ300石英晶体微量天平技术(Lin S.等人，J Immunol Methods 239：121-124(2000))量测KFCC-GY4及KFCC-GY5抗PLVAP单株抗体的结合亲和力。
人类脐血管内皮细胞(HUVEC)的分离及培养
根据Baudin B，Brunee A，Bosselut N及Vaubourdolle M.Nature Protocols2：481-485(2007)中所述的既定方案进行HUVEC的分离及培养。在内皮细胞培养物维持期间，使用溶解于磷酸盐缓冲生理食盐水中的1％明胶(DIFCO，Corp.)替换胶原蛋白溶液来涂布培养盘或盖玻片。
通过含曲拉通(Triton)X-114(TX-114)的缓冲液提取HUVEC的疏水性膜蛋白
将500,000个HUVEC接种于10cm培养皿中历时24小时。接着用人类VEGF以40ng/ml刺激这些细胞再历时72小时。将经培养细胞用5ml磷酸盐缓冲生理食盐水(PBS)洗涤两次。接着通过用含有2mM EDTA的1ml PBS培育自培养皿分离且提起细胞，将其置于离心管中，且通过在300×g下离心5分钟来收集。通过离心产生的离心块中存在大约两百万个细胞。将细胞离心块再悬浮于含有5mM EDTA及0.5％(v/v)曲拉通X-114(TX-114)的200μl冰冷0.05M Tris缓冲液(pH 7.4)中。将所溶解的细胞悬浮液在冰上培育，偶尔轻微涡旋。随后，在4℃下将细胞悬浮液在10,000×g下离心10分钟以移除不可溶细胞碎片。将上清液转移至干净的Microfuge管中且在37℃下培育5分钟。在培育期间，TX-114自水相分离出来。接着在室温下将Microfuge管在1000×g下离心10分钟，以将TX-114离心至管底。移除管顶的水相且将含有疏水性细胞蛋白质的TX-114离心块溶解于2倍SDS丙烯酰胺凝胶样本缓冲液中，最终体积为50μl。使用15μl样本进行SDS丙烯酰胺凝胶电泳。
SDS丙烯酰胺凝胶电泳、西方墨渍制备及免疫墨渍分析
程序与先前Kao KJ，Scornik JC及McQueen CF.Human Immunol27：285-297(1990)所述的程序相同，稍作修改。使用碱性磷酸酶化学发光受质及LAS-4000发光影像分析仪(Fujifilm Corp.)来进行对西方墨渍上抗体结合的侦测。
免疫荧光显微术
材料：
1)第一抗体：
a)正常小鼠IgG(Sigma Corp.，目录号：I-5381)，以1mg/mL溶解于磷酸盐缓冲生理食盐水(PBS)中作为储备溶液，在使用前用PBS-0.5％BSA稀释至5μg/mL的浓度；
b)单株小鼠抗人类von Willebrand因子(vWF)(DakoCytomation Corp.，目录号：M0616)，在使用前用含有0.5％BSA的PBS稀释50倍；
c)经纯化KFCC-GY4及KFCC-GY5抗PLVAP单株抗体，在使用前用含有0.5％BSA的PBS稀释至5μg/ml；
2)第二抗体：FITC接合山羊F(ab′)2抗小鼠IgG(重链及轻链)(Serotec，Corp.，目录号：Star105F)；
3)含DAPI的VectaShield封固介质(Vector Labs，Corp.，目录号：H-1200)；
4)100％甲醇(Merck corp.，目录号：1.06009)；及
5)汉克氏平衡盐溶液(Hank’s Balanced Salt Solution，HBSS)(Gibco，Corp.，目录号：12065-056)，在使用前稀释至1倍。
程序：
为制备用于免疫荧光研究的人类脐带血管内皮细胞，将50,000个细胞置于24孔培养盘的每一孔中，在各孔的底部置放有1.5cm无菌圆形盖玻片。各孔含有0.5ml补充有20％胎牛血清、1％L-麸酰胺酸、1％抗生素/抗真菌溶液、50μg/ml肝素及75μg/ml内皮细胞生长补充剂(Sigma，Corp.E0760)的M199培养基。将各盖玻片用200μl于0.04％乙酸(v/v)中的0.4mg/ml小牛皮胶原蛋白(Sigma Corp.C9791)预涂布隔夜。接着将盖玻片用无菌1倍磷酸盐缓冲生理食盐水(PBS)洗涤，且随后风干以供使用。将细胞培养隔夜且接着再用40ng/ml血管内皮生长因子(VEGF)刺激72小时。使用盖玻片上的细胞进行免疫荧光程序。
为将细胞染色以进行免疫荧光显微术，用0.5ml 1倍HBSS洗涤生长于各孔中的盖玻片上的细胞。接着在0.5ml冰冷甲醇中将细胞固定且增强通透性历时5分钟。将经固定细胞用0.5ml1倍PBS洗涤3次，每次洗涤5分钟。接着在室温下将经固定细胞用含有0.5％BSA的0.5ml1倍PBS阻断1小时。移除含有经固定细胞的盖玻片且将其置于0.2ml经稀释第一抗体溶液之上，该溶液含有5μg/ml正常IgG、KFCC-GY4或KFCC-GY5抗PLVAP单株抗体或抗人类vWF单株抗体的50倍稀释液，其中经固定细胞朝下且接触抗体溶液。在有盖的塑料小容器中将抗体溶液置于一片石蜡上。通过置放一小片用水润湿的滤纸来维持内部湿度。
在37℃下于潮湿容器中培育1小时后，移除盖玻片且将盖玻片上的细胞用0.5ml PBS洗涤3次，每次5分钟。接着在37℃下如针对使用第一抗体溶液培育所述将经固定细胞用0.2ml经200倍稀释的FITC接合山羊F(ab′)2抗小鼠IgG第二抗体培育50分钟。随后，如上文所述将细胞用PBS洗涤3次。使用VectaShield抗褪色溶液将经染色细胞封固于载玻片上。自盖玻片边缘移除过量的封固介质且用指甲油密封边缘。使用荧光显微术检查经染色细胞。
结果
用重组人类PLVAP蛋白免疫Balb/cByJ小鼠使得产生出产生识别人类PLVAP蛋白的单株抗体(mAb)的融合瘤。选择两种融合瘤作进一步研究。将由此等融合瘤产生的抗体命名为KFCC-GY4及KFCC-GY5。单株抗体KFCC-GY4及KFCC-GY5的VH及VL域及此等域的CDR的序列分别展示于图15A及15B及图16A及16B中。
在ELISA(图17)及免疫墨渍(图18C及18D)检定中KFCC-GY4与KFCC-GY5单株抗体均结合重组PLVAP蛋白。
此等抗体还在免疫墨渍检定中与来自人类脐带血管内皮细胞的提取物中的PLVAP蛋白特异性反应(图19B及19D)。另外，免疫荧光染色实验展示KFCC-GY4及KFCC-GY5单株抗体与表现PLVAP的人类血管内皮细胞结合(图20C及20D)。
使用ANTQ300石英晶体微量天平(Lin等人，J.Immunol.Methods239：121-124，2000)测定单株抗体与重组PLVAP蛋白的结合亲和力(Kd)为0.41×10-7 M(KFCC-GY5mAb)及0.6×10-7 M(KFCC-GY4mAb)。
使用KFCC-GY4或KFCC-GY5单株抗PLVAP抗体对来自两名不同肝细胞瘤患者的肝脏的肝细胞瘤切片执行的免疫组织化学实验展示KFCC-GY5单株抗体(图21A、C)在血管内皮细胞中产生比KFCC-GY4单株抗体(图21B、D)强的信号。
使用KFCC-GY4单株抗PLVAP抗体对来自4名不同的经随机选择的肝细胞瘤患者的样本执行来自同一患者的肝脏的相邻肝细胞瘤及非肿瘤肝组织切片的免疫组织化学实验。在肝细胞瘤组织(图22A、22C、22E及22G)的血管内皮细胞中侦测到PLVAP表现，而在相邻非肿瘤肝组织(图22B、22D、22F及22H)中未侦测到PLVAP表现。
实施例4：PLVAP蛋白在血管内皮细胞的表面上表现
材料及方法
免疫荧光显微术
试剂：
用于以下程序的试剂如实施例3中所述，修改如下：
·1倍HBSS洗涤缓冲液含有0.1％迭氮化钠，其用于防止结合至细胞表面的抗体的胞饮作用；
·在含0.1％迭氮化钠的1倍HBSS洗涤缓冲液中稀释KFCC-GY4及KFCC-GY5单株抗PLVAP抗体。
程序：
如实施例3中所述执行人类脐带血管内皮细胞(HUVEC)的免疫荧光染色，其中例外为不用甲醇将细胞固定及增强通透性。而是，在用抗PLVAP单株抗体培育后，洗涤细胞且在室温下用4％聚甲醛固定10分钟。在此培育后，将细胞洗涤3次，接着用FITC接合山羊F(ab′)2抗小鼠IgG培育。再洗涤3次后，如实施例3中所述处理细胞以进行免疫荧光显微术。
结果
使用上文所述的方法，仅可侦测到表现于细胞表面上的PLVAP蛋白。此等实验的结果揭示KFCC-GY4与KFCC-GY5抗PLVAP单株抗体均结合至HCC血管内皮细胞的表面(图23B、23C)，从而表明PLVAP蛋白表现于此等细胞的表面上。此等研究结果表明以高亲和力特异性结合PLVAP的抗体在注射至肝细胞癌肿瘤的血管中后会能够结合至HCC血管内皮细胞的表面。
  申请人或代理人档案号4261.1001002   国际申请号
关于微生物或其他生物材料保藏的说明
(细则13之二)
Figure BPA00001256738800531
PCT/RO/134表(1998年7月，2004年1月再版)
关于微生物或其他生物材料保藏的说明
(附加页)
补充说明(接上页)
关于该主题PCT申请在澳大利亚的指定，并根据澳大利亚专利法3.25(3)的规定，申请人由此通知：对于在本发明中不享有权益且被指定为需要样品提供的收件人，保藏在美国菌种保存中心(编号为N/A)的生物材料样品的提供仅会在专利授权之前，或该申请失效、被驳回或撤回之前受到影响。
关于该主题PCT申请在加拿大的指定，申请人由此通知国际局：申请人希望直到加拿大专利已经基于本申请被授权，或者本申请已经被驳回、被放弃并不再恢复或者被撤回为止，专利官员仅授权将所述保藏在美国菌种保存中心(编号为N/A)且在本申请中被引用的生物材料样品提供给该官员指定的独立专家。
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Claims (80)

1.一种在需要其的个体中治疗肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的方法，其包括将治疗有效量的至少一种PLVAP拮抗剂投予该个体，其中该PLVAP拮抗剂抑制选自由该个体的肝脏中的肿瘤形成、肿瘤生长、肿瘤血管形成及肿瘤进展所组成的群组的活性。
2.如权利要求1的方法，其中该PLVAP拮抗剂为特异性结合PLVAP的抗体。
3.如权利要求2的方法，其中该抗体选自由单株抗体、多株抗体、嵌合抗体、人化抗体、人类抗体及抗原结合片段所组成的群组。
4.如权利要求2的方法，其中该抗体与放射性同位素或细胞毒性剂接合。
5.如权利要求1的方法，其中该PLVAP拮抗剂是动脉内投予。
6.如权利要求5的方法，其中该PLVAP拮抗剂通过选自由肝动脉输注及经动脉化学栓塞(transarterial chemoembolization，TACE)所组成的群组的程序动脉内投予该个体。
7.如权利要求1的方法，其中该PLVAP拮抗剂与化学治疗剂组合投予。
8.如权利要求7的方法，其中该化学治疗剂选自由阿霉素(doxorubicin)、顺铂(cisplatin)、丝裂霉素(mitomycin)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、他莫昔芬(tamoxifen)、索拉非尼(sorafenib)及奥曲肽(octreotide)所组成的群组。
9.如权利要求1的方法，其中该个体为人类。
10.一种在需要其的个体中治疗肝细胞癌(HCC)的方法，其包括将以下投予该个体：
1)治疗有效量的抗体，其特异性结合包含SEQ ID NO：23的PLVAP蛋白，且抑制选自由个体的肝脏中的肿瘤形成、肿瘤生长、肿瘤血管形成及肿瘤进展所组成的群组的活性，其中该抗体通过动脉内输注投予该个体；与
2)至少一种化学治疗剂，
藉此在该个体中治疗HCC。
11.如权利要求10的方法，其中该抗体选自由单株抗体、多株抗体、嵌合抗体、人化抗体、人类抗体及抗原结合片段所组成的群组。
12.如权利要求10的方法，其中该抗体与放射性同位素、细胞毒性剂或其组合接合。
13.如权利要求10的方法，其中该动脉内输注选自由肝动脉输注及经动脉化学栓塞(TACE)所组成的群组。
14.如权利要求10的方法，其中该抗体被递送至在该个体的肝脏中的HCC肿瘤内或周围的血管的内皮细胞。
15.如权利要求10的方法，其中该化学治疗剂是动脉内投予。
16.如权利要求10的方法，其中该化学治疗剂选自由阿霉素、顺铂、丝裂霉素、5-氟尿嘧啶、他莫昔芬、索拉非尼及奥曲肽所组成的群组。
17.如权利要求10的方法，其中该个体为人类。
18.一种诊断个体中的肝细胞癌(HCC)的方法，其包括：
1)侦测来自该个体的样本中PLVAP基因产物的含量；及
2)测定该样本中的PLVAP基因产物的含量相对于对照增加，其中该样本中的PLVAP基因产物的含量相对于该对照增加表明该个体中的HCC，
藉此诊断该个体中的HCC。
19.如权利要求18的方法，其中该PLVAP基因产物选自由PLVAP RNA及PLVAP蛋白所组成的群组。
20.如权利要求18的方法，其中该样本中的PLVAP基因产物的含量使用选自由定量性逆转录酶聚合酶连锁反应(RT-PCR)、原位杂交(ISH)、酵素结合免疫吸附分析法(ELISA)及免疫组织化学染色(IHC)所组成的群组的检定来侦测。
21.如权利要求20的方法，其中该样本中的PLVAP基因产物的含量使用酵素结合免疫吸附分析法(ELISA)或免疫组织化学染色(IHC)来测定。
22.如权利要求21的方法，其中该ELISA或IHC使用特异性结合PLVAP的抗体来执行。
23.如权利要求18的方法，其中该样本为肝组织样本。
24.如权利要求23的方法，其中该肝组织样本选自由活检样本及细针抽吸样本所组成的群组。
25.如权利要求18的方法，其中该对照选自由参考标准、来自同一个体的正常肝样本中的该PLVAP基因产物的含量、及来自另一个体的正常肝样本中的该PLVAP基因产物的含量所组成的群组。
26.如权利要求18的方法，其中该个体为人类。
27.一种诊断个体中的肝细胞癌(HCC)的方法，其包含侦测来自该个体的肝组织样本中的PLVAP基因产物的表现，藉此诊断该个体中的HCC。
28.如权利要求27的方法，其中该PLVAP基因产物的表现是在该肝组织样本中的血管内皮细胞中侦测。
29.如权利要求28的方法，其中这些血管内皮细胞邻近于该肝组织样本中的肝细胞。
30.如权利要求27的方法，其中该PLVAP基因产物选自由PLVAP RNA及PLVAP蛋白所组成的群组。
31.如权利要求27的方法，其中该样本中的PLVAP基因产物的含量使用选自由定量性逆转录酶聚合酶连锁反应(RT-PCR)、原位杂交(ISH)、酵素结合免疫吸附分析法(ELISA)及免疫组织化学染色(IHC)所组成的群组的检定来侦测。
32.如权利要求27的方法，其中该肝组织样本选自由活检样本及细针抽吸样本所组成的群组。
33.如权利要求27的方法，其中该个体为人类。
34.一种侦测个体中的肝细胞癌(HCC)的活体内方法，其包括
1)通过动脉内注射将特异性结合PLVAP的抗体投予该个体，其中该抗体包含放射性同位素，
2)获得该个体的肝脏的影像；并
3)侦测该个体的肝脏中该抗体的累积，
藉此侦测该个体中的HCC。
35.如权利要求34的方法，其中该抗体包含具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列的VH域及具有SEQ ID NO：9的胺基酸序列的VL域。
36.如权利要求34的方法，其中该抗体包含具有SEQ ID NO：14的胺基酸序列的VH域及具有SEQ ID NO：19的胺基酸序列的VL域。
37.如权利要求34的方法，其中该个体为人类。
38.一种经分离多肽，其特异性结合SEQ ID NO：23，其包含选自由以下所组成的群组的抗体可变域：
1)包含以下的抗体可变域：
a)由SEQ ID NO：5组成的CDR1；
b)由SEQ ID NO：6组成的CDR2；及
c)由SEQ ID NO：7组成的CDR3；
2)包含以下的抗体可变域：
d)由SEQ ID NO：10组成的CDR1；
f)由SEQ ID NO：11组成的CDR2；及
g)由SEQ ID NO：12组成的CDR3；
及
3)其组合。
39.如权利要求38的经分离多肽，其中该多肽为抗体。
40.如权利要求39的经分离多肽，其中该抗体以约0.6×10-7M的结合亲和力结合SEQ ID NO：23。
41.如权利要求39的经分离多肽，其中该抗体选自由单株抗体、多株抗体、嵌合抗体、人化抗体、人类抗体及抗原结合片段所组成的群组。
42.如权利要求39的经分离多肽，其中该抗体包含具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列的VH域。
43.如权利要求39的经分离多肽，其中该抗体包含具有SEQ ID NO：9的胺基酸序列的VL域。
44.如权利要求38的经分离多肽，其中该多肽包含标记。
45.如权利要求44的经分离多肽，其中该标记选自由放射性同位素及细胞毒性剂所组成的群组。
46.一种经分离多肽，其特异性结合SEQ ID NO：23，其包含至少一个选自由以下所组成的群组的抗体可变域：
1)包含以下的抗体可变域：
a)由SEQ ID NO：15组成的CDR1；
b)由SEQ ID NO：16组成的CDR2；及
c)由SEQ ID NO：17组成的CDR3；
2)包含以下的抗体可变域：
d)由SEQ ID NO：20组成的CDR1；
f)由SEQ ID NO：21组成的CDR2；及
g)由SEQ ID NO：22组成的CDR3；
及
3)其组合。
47.如权利要求46的经分离多肽，其中该多肽为抗体。
48.如权利要求47的经分离多肽，其中该抗体以约0.4×10-7M的结合亲和力结合SEQ ID NO：23。
49.如权利要求47的经分离多肽，其中该抗体选自由单株抗体、多株抗体、嵌合抗体、人化抗体、人类抗体及抗原结合片段所组成的群组。
50.如权利要求47的经分离多肽，其中该抗体包含具有SEQ ID NO：14的胺基酸序列的VH域。
51.如权利要求47的经分离多肽，其中该抗体包含具有SEQ ID NO：19的胺基酸序列的VL域。
52.如权利要求46的经分离多肽，其中该多肽包含标记。
53.如权利要求52的经分离多肽，其中该标记选自由放射性同位素及细胞毒性剂所组成的群组。
54.一种用于治疗哺乳动物个体中的肝细胞癌的医药组成物，其包含至少一种PLVAP拮抗剂及医药学上可接受的载剂。
55.如权利要求54的组成物，其中该PLVAP拮抗剂为特异性结合PLVAP的抗体。
56.如权利要求55的组成物，其中该抗体选自由单株抗体、多株抗体、嵌合抗体、人化抗体、人类抗体及抗原结合片段所组成的群组。
57.如权利要求55的组成物，其中该抗体与放射性同位素或细胞毒性剂接合。
58.如权利要求54的组成物，其进一步包含至少一种化学治疗剂。
59.如权利要求58的组成物，其中该化学治疗剂选自由阿霉素、顺铂、丝裂霉素、5-氟尿嘧啶、他莫昔芬、索拉非尼及奥曲肽所组成的群组。
60.一种用于侦测哺乳动物个体中的肝细胞癌的诊断套组，其包含在高严格度条件下与PLVAP RNA转录物特异性杂交的核酸探针。
61.如权利要求60项的套组，其中该核酸探针包含标记。
62.一种用于侦测哺乳动物个体中的肝细胞癌的诊断套组，其包含特异性结合SEQ ID NO：23的抗体。
63.如权利要求62项的套组，其中该抗体包含标记。
64.一种经分离抗体，其与单株抗体KFCC-GY4特异性竞争结合SEQ IDNO：23。
65.一种经分离抗体，其与单株抗体KFCC-GY5特异性竞争结合SEQ IDNO：23。
66.一种在需要其的个体中治疗肝细胞癌(HCC)的方法，其包括将治疗有效量的特异性结合PLVAP的人化抗体或其片段投予该个体，其中该人化抗体动脉内投予该个体，且其中该人化抗体抑制选自由该个体的肝脏中的肿瘤形成、肿瘤生长、肿瘤血管形成及肿瘤进展所组成的群组的活性。
67.如权利要求66的方法，其中该人化抗体与放射性同位素或细胞毒性剂接合。
68.如权利要求66的方法，其中该人化抗体通过选自由肝动脉输注及经动脉化学栓塞(TACE)所组成的群组的程序动脉内投予该个体。
69.如权利要求66的方法，其进一步包含投予至少一种化学治疗剂。
70.如权利要求69的方法，其中该化学治疗剂选自由阿霉素、顺铂、丝裂霉素、5-氟尿嘧啶、他莫昔芬、索拉非尼及奥曲肽所组成的群组。
71.如权利要求66的方法，其中该个体为人类。
72.如权利要求66的方法，其中该人化抗体与单株抗体KFCC-GY4或单株抗体KFCC-GY5特异性竞争结合SEQ ID NO：23。
73.一种人化抗体，其与单株抗体KFCC-GY4或单株抗体KFCC-GY5特异性竞争结合SEQ ID NO：23。
74.如权利要求73项的人化抗体，其中该人化抗体与放射性同位素或细胞毒性剂接合。
75.一种人化抗体，其特异性结合SEQ ID NO：23，其包含选自由以下所组成的群组的抗体可变域：
1)包含以下的抗体可变域：
a)由SEQ ID NO：5组成的CDR1；
b)由SEQ ID NO：6组成的CDR2；及
c)由SEQ ID NO：7组成的CDR3；
2)包含以下的抗体可变域：
d)由SEQ ID NO：10组成的CDR1；
f)由SEQ ID NO：11组成的CDR2；及
g)由SEQ ID NO：12组成的CDR3；
及
3)其组合。
76.如权利要求75项的人化抗体，其中该人化抗体包含标记。
77.如权利要求76项的人化抗体，其中该标记选自由放射性同位素及细胞毒性剂所组成的群组。
78.一种人化抗体，其特异性结合SEQ ID NO：23，其包含至少一个选自由以下所组成的群组的抗体可变域：
1)包含以下的抗体可变域：
a)由SEQ ID NO：15组成的CDR1；
b)由SEQ ID NO：16组成的CDR2；及
c)由SEQ ID NO：17组成的CDR3；
2)包含以下的抗体可变域：
d)由SEQ ID NO：20组成的CDR1；
f)由SEQ ID NO：21组成的CDR2；及
g)由SEQ ID NO：22组成的CDR3；
及
3)其组合。
79.如权利要求78项的人化抗体，其中该人化抗体包含标记。
80.如权利要求79项的人化抗体，其中该标记选自由放射性同位素及细胞毒性剂所组成的群组。
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