CN102030826A

CN102030826A - 一种高亲和力的抗cd20单克隆抗体

Info

Publication number: CN102030826A
Application number: CN2009100579530A
Authority: CN
Inventors: 郭亚军; 李博华; 王皓; 侯盛; 赵磊
Original assignee: ANTIBODIES NATIONAL ENGINEERING RESEARCH CENTER
Current assignee: ANTIBODIES NATIONAL ENGINEERING RESEARCH CENTER; Shanghai National Engineering Research Center of Antibody Medicine Co
Priority date: 2009-09-25
Filing date: 2009-09-25
Publication date: 2011-04-27
Anticipated expiration: 2029-09-25
Also published as: CN102030826B

Abstract

本发明公开了一种具有高亲和力的抗CD20单克隆抗体和其在制备抗肿瘤药物中的用途。所述抗体包括C2B8重链可变区和/或轻链可变区的下述任何一个或多个氨基酸位点上的氨基酸取代。这些突变抗体与Rituximab相比具有更高的亲和力活性，抗体特异性增强，对肿瘤的杀伤效果也显著提高。

Description

一种高亲和力的抗CD20单克隆抗体

技术领域

本发明涉及基因工程产品领域，更具体地，本发明公开了一种具有高亲和力的抗CD20单克隆抗体和其在制备抗肿瘤药物中的用途。

背景技术

恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，在各种疾病所致死亡中高居第二位。非霍奇金淋巴瘤(Non Hodgkin’s lymphoma，NHL)是临床最常见的淋巴***恶性肿瘤，其中B细胞来源的约占85％，好发于青壮年，发病率和病死率呈逐年上升趋势。根据病情特点，NHL可分为低、中、高三度。其中低度和部分中度NHL病程进展缓慢，统称为惰性NHL。它们对首次化疗敏感，但很容易复发或耐药，当再次化疗或放疗时，疗效明显降低，因而被认为是难以治愈的恶性肿瘤。近年来，单克隆抗体及其导向治疗NHL的临床试验研究取得了重大进展，其中被广泛使用且富有成效的是抗CD20的单抗制剂。CD20抗原是一种B细胞分化抗原，仅位于前B细胞和成熟B细胞，它在95％以上的B细胞性淋巴瘤中表达，且表面密度很高，而在造血干细胞、血浆细胞和其他正常组织中不表达。更为重要的是，CD20分子在与单克隆抗体结合后，无显著内化及脱落，故成为治疗B细胞淋巴瘤的理想靶点[Sacchi S，Federico M，Dastoli G，Fiorani C，Vinci G，Clo V，Casolari B.Treatment of B-cell non-Hodgkin’s lymphoma with anti CD 20 monoclonal antibodyRituximab.Crit Rev Oncol Hematol，2001，37(1)：13-25]。

目前采用抗CD20抗体治疗非霍奇金淋巴瘤已取得了较好的疗效。Rituxan(Rituximab，C2B8)为美国基因科技公司研制的以CD20为靶点的单克隆抗体，它是一种人鼠嵌合基因工程抗体，包含了鼠单克隆抗体的可变区基因和人抗体的恒定区基因[Reff ME，Carner K，Chambers KS，Chinn PC，Leonard JE，Raab R，Newman RA，Hanna N，Anderson DR.Depletionof B cells in vivo by a chimeric mouse human monoclonal antibody to CD20.Blood.1994，83(2)：435-45]。Rituxan已于1997年11月获FDA的批准上市，用于复发性或顽固性低度或滤泡性非霍奇金淋巴瘤的临床治疗[Leget GA，Czuczman MS.Use of rituximab，the new FDA-approved antibody.Curr Opin Oncol.1998；10：548-551]。尽管C2B8抗体在临床治疗中已显示出较好的疗效，仍有52％的病人对C2B8治疗不产生反应。因此，寻求更为有效用于治疗B淋巴瘤的CD20抗体药物显得尤为迫切。

最新的实验数据表明，对Rituximab耐受的细胞通常变现为：CD20表达减低；细胞内Bcl-2表达量增高等[Title：Development of Rituximab-Resistant Lymphoma Clones withAltered Cell Signaling and Cross-Resistance to Chemotherapy.Author：Jazirehi，A.R.；Vega，M.I.；Bonavida，B.Source：Cancer Research，2007，67(3)：1270-1281；Title：Acquirement ofRituximab Resistance in Lymphoma Cell Lines Is Associated with Both Global CD20 Gene andProtein Down-Regulaion Regulaed at the Pretranscriptional and Posttranscriptional Levels.Author：Czuczman，M.S.；Olejniczak，S.；Gowda，A.(...)Source：Clinical Cancer Research，2008，14(5)：1561-1570]。而抗体亲和力的提高能够增强抗体的特异性，提高检测灵敏度，增强抗体的功能同时降低抗体的用量。因此，通过在临床上广泛使用具有较好治疗效果的Rituximab的基础上，通过有限的几个突变，显著的提高Rituximab的亲和力，从而提高Rituximab对肿瘤的杀伤效果。

发明内容

本发明的申请人进行了大量的实验，采用基因工程技术构建了多种具有高亲和力的抗CD20单克隆抗体突变体。这些突变抗体与Rituximab相比具有更高的亲和力活性，能够更加有效的识别CD20抗原。高亲和力的抗CD20单克隆抗体突变体可用于制备治疗B细胞淋巴瘤的药物。与Rituximab相比，突变抗体亲和力提高，抗体特异性增强，对肿瘤的杀伤效果也显著提高。

本发明公开了：

1，一种高亲和力的抗CD20单克隆抗体，其特征在于所述抗体包括如SEQ ID NO：5所示的C2B8重链可变区和/或如SEQID NO：6所示的轻链可变区的下述任何一个或多个氨基酸位点上的氨基酸取代，所述位点为重链可变区第57、102位，轻链可变区第93位氨基酸的位置。

2，上述抗CD20单克隆抗体，其特征在于所述一个或多个氨基酸位点上由谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸或苏氨酸取代。

3，上述1或2所述的抗CD20单克隆抗体，其特征在于所述抗体结合CD20的亲和力与Rituximab相比提高至少2倍。

4，上述3所述的抗CD20单克隆抗体，其特征在于所述抗体的重链可变区(VH)的氨基酸序列为SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，或SEQ ID NO：14，轻链可变区(VL)的氨基酸序列为SEQID NO：6或SEQ ID NO：12。

5，上述1或2所述的抗CD20单克隆抗体，其特征在于所述抗体结合CD20的亲和力与Rituximab相比提高至少4倍。

6，上述5所述的抗CD20单克隆抗体，其特征在于所述抗体的重链可变区(VH)的氨基酸序列为SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：14，轻链可变区(VL)的氨基酸序列为SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：12。

7，上述1或2所述的抗CD20单克隆抗体，其特征在于所述抗体结合CD20的亲和力与Rituximab相比提高至少10倍。

8，上述7所述的抗CD20单克隆抗体，其特征在于所述抗体的重链可变区(VH)的氨基酸序列为SEQID NO：14，轻链可变区(VL)的氨基酸序列为SEQ ID NO：6或SEQ IDNO：12。

9，一种制剂，含有上述1至8任一所述的抗CD20单克隆抗体和可药用的载体。

10，上述1至9任一所述的抗CD20单克隆抗体或其制剂在制备抗B细胞淋巴瘤的药物中的用途。

11，上述10的用途，其中B细胞淋巴瘤为非霍奇金淋巴瘤。

12，上述11的用途，其中非霍奇金淋巴瘤为低度和部分中度非霍奇金淋巴瘤。

13，上述10的用途，其中B细胞淋巴瘤为慢性淋巴性白血病。

更具体地，本发明的申请人通过大量实验，首先参照美国专利6,399,061公开的抗CD20单抗资料及序列，构建了抗CD20嵌合抗体C2B8的轻、重链可变区和恒定区基因，然后通过表达、纯化，获得嵌合抗体C2B8。根据图1所示的氨基酸突变位点，采用overlapPCR的方式对嵌合抗体C2B8进行构建，其构建与表达、纯化的方法与未突变的嵌合抗体C2B8相同。所述突变抗体包括重链可变区和/或轻链可变区的下述任何一个或多个氨基酸位点上的氨基酸取代，所述位点为重链可变区第57、102位，轻链可变区第93位氨基酸的位置，取代氨基酸为谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸或苏氨酸。

对于本发明，任何合适的真核表达载体都可以使用，这些载体可以为pcDNA3.1(+)，pDR1，pDHFF之一。

本发明的申请人对上述C2B8突变抗体进行了亲和力检测。实验结果表明，申请人构建的C2B8抗体的亲和力与市售的Rituxiamb的亲和力相似。相对于未突变的原本C2B8抗体或市售的Rituxiamb，提高亲和力程度较高的单点突变抗体为：重链可变区第57位谷氨酸或第102位赖氨酸取代的突变抗体(H57DE或H102YK)，亲和力提高了至少4倍左右；重链可变区第102位精氨酸或丝氨酸或苏氨酸取代的突变抗体(H102YR或H102YS或H102YT)，亲和力提高了2倍左右；轻链可变区第93位精氨酸取代的突变抗体(L93NR)，其亲和力也提高了。针对上述重链可变区和/或轻链可变区的突变点进行两点或三点的组合突变，亲和力均提高了10倍以上，最终提高亲和力程度最高的组合突变抗体为：重链可变区第57位谷氨酸、第102位赖氨酸，以及轻链可变区第93位精氨酸三个突变点同时取代的突变抗体(H57DE，H102YK，L93NR)。

以上实验结果说明，高亲和力的C2B8突变抗体，其最佳突变位点为重链可变区第57、102位，轻链可变区第93位氨基酸的位置；取代的氨基酸为谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸或苏氨酸，其中，最佳取代的氨基酸为谷氨酸、赖氨酸或精氨酸。并且，多个单点组合突变抗体的亲和力要高于单点突变抗体。

申请人还针对Rituximab突变体(C2B8突变抗体)的功能进行研究。通过对Rituximab突变体的ADCC功能检测，随着Rituximab突变体亲和力的提高，ADCC功能也显著增强，三点组合突变Rmut8的ADCC杀伤活性显著高于Rituximab。通过对Rituximab突变体凋亡功能检测，结果显示，亲和力的提高不能显著的增加Rituximab突变体的凋亡功能，但是三突变体Rmut8却显示出了较强的凋亡能力；虽然加入不同浓度的caspase(半胱氨酸蛋白酶)抑制剂可以部分的抑制Rmut8引起的凋亡，但是其仍然显示出了较强的促凋亡能力。通过研究高亲和力Rituximab突变体(Rmut8)对Rituximab抵制型细胞的杀伤，结果显示，Rmut8不能提高对Rituximab抵制型细胞的CDC杀伤，但是能够引起较强的ADCC杀伤；Rmut8在Rituximab抵制型细胞株上仍然表现出较强的促凋亡能力。通过高亲和力Rituximab突变体体内小鼠生存实验，结果显示，Rmut8不仅仅在正常的Daudi细胞处理组显示出较强的抗肿瘤效果(P＜0.001)，而且在Rituximab抵制型细胞株(Daudi-R)上，显示出良好的治疗效果(P＜0.01)。

本发明公开上述高亲和力的C2B8突变抗体，可以和药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂，对于本发明公开的上述C2B8突变抗体的水针或冻干制剂，药学上可以接受的辅料包括表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合，其中表面活性剂包括非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或80)；poloxamer(如poloxamer 188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics；MONAQUAT^TM等，其加入量应使C2B8突变抗体颗粒化趋势最小，溶液稳定剂可以为糖类，包括还原性糖和非还原性糖，氨基酸类包括谷氨酸单钠或组氨酸，醇类包括三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其组合，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态，等渗调节剂可以为氯化钠、甘露醇之一，缓冲液可以为TRIS、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一。

上述制剂为包含高亲和力的C2B8突变抗体的组合物，在对包括人在内的动物给药后，抗肿瘤效果明显。具体来讲，对肿瘤的预防和/或治疗有效，可以作为预防和/或***的药物使用。

本发明中C2B8突变抗体及其组合物在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体讲静脉注射的剂量是0.1~3000mg/天。

本发明公开的C2B8突变抗体及其组合物还可以和其他的抗肿瘤药联合给药，用于肿瘤的治疗，这些抗肿瘤药包括1、细胞毒类药物(1)作用于DNA化学结构的药物：烷化剂如氮芥类、亚硝尿类、甲基磺酸酯类；铂类化合物如顺铂、卡铂和草酸铂等；丝裂霉素(MMC)；(2)影响核酸合成的药物：二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤(MTX)和Alimta等；胸腺核苷合成酶抑制剂如氟尿嘧啶类(5FU、FT-207、卡培他滨)等；嘌呤核苷合成酶抑制剂如6-巯基嘌呤(6-MP)和6-TG等；核苷酸还原酶抑制剂如羟基脲(HU)等；DNA多聚酶抑制剂如阿糖胞苷(Ara-C)和健择(Gemz)等；(3)作用于核酸转录的药物：选择性作用于DNA模板，抑制DNA依赖RNA聚合酶，从而抑制RNA合成的药物如：放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素等；(4)主要作用于微管蛋白合成的药物：紫杉醇、泰索帝、长春花碱、长春瑞滨、鬼臼硷类、高三尖杉酯碱；(5)其他细胞毒药：门冬酰胺酶主要抑制蛋白质的合成；2、激素类抗***：三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦等；芳香化酶抑制剂：氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、瑞宁德等；抗雄激素：氟它氨RH-LH激动剂/拮抗剂：诺雷德、依那通等；3、生物反应调节剂：主要通过机体免疫功能抑制肿瘤干扰素；白细胞介素-2；胸腺肽类；4、单克隆抗体：Cetuximab(C225)；赫赛汀(Trastuzumab)Bevacizumab(Avastin)；5、其他括一些目前机制不明和有待进一步研究的药物；细胞分化诱导剂如维甲类；细胞凋亡诱导剂。本发明公开的C2B8突变抗体及其组合物可以和上述的抗肿瘤药物之一或其组合联合用药。

本发明所指的B细胞淋巴瘤，包括B细胞慢性淋巴细胞白血病，B细胞原淋巴细胞淋巴瘤，滤泡淋巴瘤，毛细胞白血病，Burkitt淋巴瘤，淋巴浆细胞淋巴瘤等，这里不再一一列举。

本发明所称的抗肿瘤药物，指具有预防和/或***的药物，可以包括伴随肿瘤生长相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，它进一步还包括已存在的肿瘤生长伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还也减少或防止转移。

附图说明

图1.Rituxiamb(又称C2B8抗体)重链和轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。图中第一行序列表示Rituxiamb的重链、轻链的碱基序列，第二行序列表示氨基酸序列。其中有下划线的地方表示构建突变体的突变点。

图2.biacore检测Rituxiamb及C2B8抗体突变体。不同突变体按照相同浓度，等倍比稀释在50μl/min流速和25℃环境下进行检测。图中所示为，不同C2B8抗体突变体在相同浓度下的sensorgram图。WT，表示申请人自行构建的未突变的C2B8抗体。

图3.Rituximab突变体结合饱和曲线。检测¹²⁵碘标记的不同rituximab突变体对Daudi细胞的结合饱和曲线。对不同的抗体突变体按照相同浓度等倍比稀释，37℃孵育2h，通过离心分离，检测结合在细胞上的¹²⁵碘标记的抗体片段。饱和结合实验的数据通过非线性最小二乘法进行拟合并确定结合常数。

图4.Rituximab突变体ADCC功能检测。图中A-D分别显示的是E∶T为50∶1，25∶1，5∶1和1∶1四种比率下，ADCC杀伤作用与不同浓度Rituximab突变体的关系。

图5.Rituimab突变体凋亡功能检测。图5A显示不同条件下的Rituximab突变体的凋亡功能检测结果；图5B-C显示加入不同浓度的caspase抑制剂ZVAD(图5B)和VDVAD(图5C)后，Rituximab突变体的凋亡功能检测结果。

图6.Rituximab突变体对rituximab抵制型细胞株的杀伤情况。图6A显示Daudi或者Daudi-R细胞与不同浓度的抗体(Rituximab或者Rmut8)作用，Rituximab抵制型细胞株的CD20表达下降；图6B显示Raji-R和Daudi-R与10μg/mL的抗体和人补体(1∶10)作用的CDC杀伤情况；图6C显示Raji-R和Daudi-R与10μg/mL的抗体和PBMC(外周血单核细胞)(E∶T＝40∶1)作用的ADCC杀伤结果；图6D显示Rituximab或者Rmut8(10μg/mL)在有二抗交联(20μg/mL的羊抗人κF(ab′)₂的片段)或者无交联的情况下的细胞凋亡情况。

图7.高亲和力Rituximab突变体小鼠生存率实验。每日观察小鼠状况，当出现后肢瘫痪情况时，处死该小鼠。生存曲线做图参照Kaplan-Meier的方法进行，组间比较采用log-rank检验进行分析[Bland JM，Altman DG.Survival probabilities(the Kaplan-Meier method).BMJ.1998；317：1572.]。

具体实施方式

以下实施例仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质拉的方法，将编码蛋白的基因***到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniais，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2^ndedition，Cold spring Harbor Laboratory Press.

实施例1.人抗体轻、重链恒定区基因的克隆

用淋巴细胞分离液(鼎国生物技术发展公司产品)分离健康人淋巴细胞，用Trizol试剂(Invitrogen公司产品)提取总RNA，根据文献(Cloned human and mouse kappaimmunoglobulin constant and J region genes conserve homology in functional segments.HieterPA，Max EE，Seidman JG，Maizel JV Jr，Leder P.Cell.1980Nov；22(1 Pt 1)：197-207.)和文献(The nucleotide sequence of a human immunoglobulin C gamma1 gene.Ellison JW，Berson BJ，Hood LE.Nucleic Acids Res.1982 Jul 10；10(13)：4071-9.)报道的序列分别设计引物采用RT-PCR反应扩增抗体重链和轻链恒定区基因。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体(promega公司)中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID NO 1和SEQID NO 2分别显示了重链恒定区(CH)的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO 3和SEQ IDNO 4分别显示了轻链恒定区(CL)的核苷酸序列和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作pGEM-T/CH和pGEM-T/CL。

实施例2.抗CD20嵌合抗体C2B8的表达载体构建

参照美国专利6,399,061公开的抗CD20单抗资料及序列，委托上海生工生物工程有限公司全基因合成抗CD20单克隆抗体C2B8重链可变区基因(C2B8VH)及轻链可变区基因(C2B8VL)。图1显示了C2B8重链和轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。

以C2B8VH基因和pGEM-T/CH载体为模板通过重叠PCR合成嵌合抗体重链基因，反应条件为：95℃15分钟；94℃50秒，58℃50秒，72℃50秒，30个循环；72℃10分钟。并使此嵌合抗体重链基因的5’端含有限制酶位点HindIII和信号肽基因序列，3’端含有翻译终止密码TAA和限制酶位点EcoR I。信号肽基因序列为：ATGGGATTCAGCAGGATCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGTAACTACAGGTGTCCACTCC。最后琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，回收目的条带并克隆到pGEMT载体中，筛选阳性克隆测序。挑选测序正确的克隆用HindIII和EcoR I酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收嵌合抗体重链片段C2B8VHCH，与用HindIII和EcoR I酶切的质粒pcDNA3.1(+)(美国Invitrogen公司产品)进行连接，构建成嵌合重链真核表达载体pcDNA3.1(+)(C2B8VHCH)。

以C2B8VL基因和pGEM-T/CL载体为模板通过重叠PCR合成嵌合抗体轻链基因，反应条件为：95℃15分钟；94℃50秒，58℃50秒，72℃50秒，30个循环；72℃10分钟，得到PCR产物C2B8VLCL，其5’端含有限制酶位点HindIII和信号肽基因序列，，3’端含有翻译终止密码TAA和限制酶位点EcoR I。信号肽基因序列为ATG GAT TTT CAA GTG CAG ATTTTC AGC TTC CTG CTA ATC AGT GCT TCA GTC ATA ATG TCC AGA GGA。挑选测序正确的克隆用HindIII和EcoR I酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收嵌合抗体轻链片段C2B8VLCL，与用HindIII和EcoR I酶切的质粒pcDNA3.1载体(美国Invitrogen公司产品)进行连接，构建成嵌合轻链真核表达载体pcDNA3.1(C2B8VLCL)。

实施例3.嵌合抗体的稳定表达与纯化

于3.5cm组织培养皿中接种3×10⁵CHO-K1细胞(ATCC CRL-9618)，细胞培养至90％-95％融合时进行转染：取质粒10μg(质粒pcDNA3.1(+)(C2B8VHCH)4μg，质粒pcDNA3.1(C2B8VLCL)6μg)和20μl Lipofectamine2000 Reagent(Invitrogen公司产品)分别溶于500μl无血清DMEM培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成，其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到板中，CO₂孵箱培养4小时后补加2ml含10％血清的DMEM完全培养基，置于CO₂孵箱中继续培养。转染进行24h后细胞换含600μg/ml G418选择培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆：羊抗人IgG(Fc)包被于ELISA板，4℃过夜，用2％BSA-PBS于37℃封闭2h，加入待测的抗性克隆培养上清或标准品(Human myeloma IgG1，κ)，37℃温育2h，加入HRP-羊抗人IgG(κ)进行结合反应，37℃温育1h，加入TMB(四甲基联苯胺)于37℃作用5min，最后用H₂SO₄终止反应，测A₄₅₀值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱(GE公司产品)分离纯化嵌合抗体C2B8。将纯化抗体用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量确定纯化后抗体的浓度。

实施例4.C2B8抗体突变体的构建及表达

采用overlapPCR的方式进行C2B8抗体突变体的构建，其构建与表达、纯化的方法与C2B8嵌合抗体相同。构建的抗体突变体共10个，分别为Rmut1至Rmut10，突变抗体的重链恒定区(CH)和轻链恒定区(CL)的氨基酸序列分别见SEQ ID NO 2和SEQID NO 4，重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的氨基酸序列分别见SEQ ID NO：5～14。

实施例5.C2B8及突变体的biacore鉴定

将SA芯片(GE公司)在50μl/min的PBS溶液中25℃平衡30min，然后用1M NaCl 50mMNaOH的活化液活化3次，每次1min；将biotin标记的抗原肽(为人CD20分子膜外区的部分片段，制备方法请见Title：Structural Basis for Recognition of CD20 by TherapeuticAntibody Rituximab.Author：Du，J.；Wang，H.；Zhong，C.(...)Source：J Biol Chem，2007，282(20)：15073-15080)稀释成终浓度为1μg/ml，10μl/min的流速包被ΔRu＝1000；然后用PBS缓冲液50μl/min平衡10min。将平衡后的芯片用0.04％的生物素溶液封闭芯片。将抗体等两倍比稀释五个浓度，50μl/min上样75sec，然后用PBS解离10min。图2显示了在相同样品浓度下biacore检测的sensorgram图；具体检测亲和力数值见表1。其中，我们构建的C2B8抗体的亲和力与市售的Rituxiamb的亲和力相似。

相对于未突变的原本C2B8抗体，提高亲和力程度较高的单点突变抗体为：Rmut1和Rmut5，亲和力分别提高了6.08和3.96倍；Rmut2，3，4，亲和力提高了近2倍。最终，亲和力提高最高的为三点组合突变体Rmut8，其亲和力最终提高了15.47倍。

相对于市售的Rituxiamb，提高亲和力程度较高的单点突变抗体为：Rmut1和Rmut5，亲和力分别提高了7.73和5.04倍；Rmut2，3，4，亲和力提高了2倍多。最终，亲和力提高最高的为三点组合突变体Rmut8，其亲和力最终提高了19.68倍。

表1.biacore检测抗体突变体的亲和力

实验误差采用SD表示，通过三次不同的实验确定。WT表示申请人自行构建的未突变的C2B8抗体；Ritu表示市售Rituximab。

实施例6.抗体亲和力检测

所有的抗体突变体的亲和力通过放射性免疫法进行测定【Cragg MS，Morgan SM，ChanHT，Morgan BP，Filatov AV，Johnson PW，French RR，Glennie MJ(2003)Complement-mediatedlysis by anti-CD20 mAb correlates with segregation into lipid rafts.Blood 101(3)：1045-1052】。简要的说，纯化后的rituximab突变体片段，F(ab′)₂，通过碘珠法(iodobead method)进行标记。将标记好¹²⁵碘的抗体片段与Daudi(ATCC CCL-213)细胞孵育2小时，37℃。与细胞结合的和游离的碘标记的抗体通过离心分离，检测结合在细胞上的¹²⁵碘标记的抗体的放射活性(见图3)。抗体突变体亲和力常数通过Hill方程曲线拟合滴定结合曲线求得，(见表2)。申请人自行构建的未突变的C2B8抗体与文献报道的rituximab的亲和力相似【Title：Depletion of B cells in vivo by a chimeric mouse human monoclonal antibody to CD20.Author：Reff，M.E.；Carner，K.；Chambers，K.S.(...)Source：Blood，1994，83(2)：435-445】。其中，单点突变体提高亲和力幅度最大的为Rmut1，其亲和力数值为1.13±0.07nM；两点或三点组合突变体提高亲和力幅度最大的为Rmut8，其亲和力数值为0.27±0.02nM。

表2.竞争结合实验检验抗体突变体的亲和力

Rituximab mutants	KD(nM)	Rituximab mutants	KD(nM)
				WT	4.96±0.21	Rmut6	4.48±0.18
Rmut1	1.13±0.07	Rmut7	10.36±0.45
				Rmut5	1.87±0.07	Rmut8	0.27±0.02

WT表示申请人自行构建的未突变的C2B8抗体；实验误差来源于三次独立的实验。

实施例7.Rituximab突变体的ADCC功能检测

Daudi细胞(ATCC CCL-213)在不同抗体浓度下，按照E∶T比50∶1(A)，25∶1(B)，5∶1(C)，1∶1(D)四个比例进行培养(37度，4小时)，然后采用标准的LDH试剂盒(Promega)进行检测ADCC活性。如图4所示，随着Rituximab突变体亲和力的提高，ADCC功能也显著增强。三点组合突变Rmut8的ADCC杀伤活性显著高于Rituximab。

实施例8.Rituximab突变体凋亡功能检测

将Raji细胞(ATCC CCL-86)室温放置15分钟或者采用1.5mM的EGTA(Sigma)预处理，然后分别将细胞等分为3份，均加入10μg/ml的Rituximab抗体及其突变体。一份还加入20μg/ml的羊抗人κF(ab′)₂的片段(Southern Biotechnology)，一份加入20μg/ml的羊抗人κF(ab′)₂的片段和过量的CaCl₂，一份加入正常培养基进行培养。16个小时以后，凋亡的细胞采用Annexin V-Fluos试剂盒(BD公司)进行流式单染。如图5A所示，亲和力的提高不能显著的增加rituximab亲和力突变体的凋亡功能，但是三突变体Rmut8却显示出了较强的凋亡能力。因此，推测其凋亡能力的增加和改变抗体的其他性质有关。加入不同浓度的caspase抑制剂ZVAD(图5B)和VDVAD(图5C)(Sigma公司)，可以部分的抑制Rmut8引起的凋亡，但是其仍然显示出了较强的促凋亡能力。

实施例9.高亲和力Rituximab突变体(Rmut8)对Rituximab抵制型细胞的杀伤

按照文献报道的方法[Czuczman，M.S.and S.Olejniczak，et al.(2008).″Acquirement ofRituximab Resistance in Lymphoma Cell Lines Is Associated with Both Global CD20 Gene andProtein Down-Regulation Regulated at the Pretranscriptional and Posttranscriptional Levels.″Clin Cancer Res.14(5)：1561-1570.；Jazirehi，A.R.and M.I.Vega，et al.(2007).″Developmentof Rituximab-Resistant Lymphoma Clones with Altered Cell Signaling and Cross-Resistance toChemotherapy.″Cancer Res.67(3)：1270-1281.]，申请人自己构建了Rituximab抵制型细胞株Raji-R和Daudi-R。如图6所示，Rituximab抵制型细胞株的CD20表达下降；同时能够显著的抵制Rituximab诱导的CDC，ADCC和凋亡。如图6A所示，分别将2×10⁶个Daudi或者Daudi-R细胞与不同浓度的抗体(Rituximab或者Rmut8)进行冰上孵育1小时，然后采用含1％牛血清的PBS洗涤两次并重悬，最后进行流式检测，结果显示，Rituximab抵制型细胞株的CD20表达下降。如图6B-C所示，将Raji-R和Daudi-R与10μg/mL的抗体和人补体(1∶10)(图6B)或者PBMC(外周血单核细胞)(E∶T＝40∶1)(图6C)进行37度孵箱进行4小时孵育，然后采用标准的LDH试剂盒进行分别检测抗体的CDC和ADCC杀伤，结果显示，Rmut8不能提高对Rituimab抵制型细胞的CDC杀伤，但是能够引起较强的ADCC杀伤。如图6D所示，2×10⁶个细胞采用Rituximab或者Rmut8(10μg/mL)在有二抗交联(20μg/mL的羊抗人κF(ab′)₂的片段)或者无交联的情况下，在37度孵箱培养16个小时后采用FITC标记的annexin V单染检测抗体细胞凋亡情况，结果显示，二抗交联以后，Rmut8在Rituximab抵制型细胞株上仍然表现出较强的促凋亡能力。

实施例10.高亲和力Rituximab突变体体内小鼠生存实验

将3.5×10⁶的Daudi和Daudi-R细胞尾静脉注射SCID小鼠5天后，进行100μg的抗体治疗，然后观察小鼠的生存时间。每日观察小鼠状况，当出现后肢瘫痪情况时，处死该小鼠。生存曲线做图参照Kaplan-Meier的方法进行，组间比较采用log-rank检验进行分析[Bland JM，Altman DG.Survival probabilities(the Kaplan-Meier method).BMJ.1998；317：1572.]。如图7所示，Rmut8不仅仅在正常的Daudi细胞处理组显示出较强的抗肿瘤效果(P＜0.001)(图7A)，而且在Rituximab抵制型细胞株(Daudi-R)上，显示出良好的治疗效果(P＜0.01)(图7B)。

序列表

<110>上海抗体药物国家工程研究中心有限公司

<120>一种高亲和力的抗CD20单克隆抗体

<160>14

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>990

<212>DNA

<213>人抗体重链恒定区(CH)的核苷酸序列

<400>1

gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggaaga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc tcccggtaaa 990

<210>2

<211>330

<212>PRT

<213>人抗体重链恒定区(CH)的氨基酸序列

<400>2

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr ValAsp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210>3

<211>321

<212>DNA

<213>人抗体轻链恒定区(CL)的核苷酸序列

<400>3

cgtactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60

ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120

tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180

agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240

aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300

agcttcaaca ggggagagtg t 321

<210>4

<211>107

<212>PRT

<213>人抗体轻链恒定区(CL)的氨基酸序列

<400>4

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210>5

<211>121

<212>PRT

<213>C2B8重链可变区氨基酸序列

<400>5

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210>6

<211>106

<212>PRT

<213>C2B8轻链可变区氨基酸序列

<400>6

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210>7

<211>121

<212>PRT

<213>Rmut1重链可变区氨基酸序列

<400>7

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Glu Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210>8

<211>121

<212>PRT

<213>Rmut2重链可变区氨基酸序列

<400>8

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Arg Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210>9

<211>121

<212>PRT

<213>Rmut3重链可变区氨基酸序列

<400>9

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Ser Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210>10

<211>121

<212>PRT

<213>Rmut4重链可变区氨基酸序列

<400>10

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Thr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210>11

<211>121

<212>PRT

<213>Rmut5重链可变区氨基酸序列

<400>11

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Lys Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210>12

<211>106

<212>PRT

<213>Rmut6轻链可变区氨基酸序列

<400>12

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Arg Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210>13

<211>106

<212>PRT

<213>Rmut7轻链可变区氨基酸序列

<400>13

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Lys Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210>14

<211>121

<212>PRT

<213>Rmut8重链可变区氨基酸序列

<400>14

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Glu Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Lys Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala

115 120

Claims

1.一种高亲和力的抗CD20单克隆抗体，其特征在于所述抗体包括如SEQ ID NO：5所示的C2B8重链可变区和/或如SEQ ID NO：6所示的轻链可变区的下述任何一个或多个氨基酸位点上的氨基酸取代，所述位点为重链可变区第57、102位，轻链可变区第93位氨基酸的位置。

2.权利要求1所述抗CD20单克隆抗体，其特征在于所述一个或多个氨基酸位点上由谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸或苏氨酸取代。

3.权利要求1或2所述的抗CD20单克隆抗体，其特征在于所述抗体结合CD20的亲和力与Rituximab相比提高至少2倍。

4.权利要求3所述的抗CD20单克隆抗体，其特征在于所述抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：14，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：12。

5.权利要求1或2所述的抗CD20单克隆抗体，其特征在于所述抗体结合CD20的亲和力与Rituximab相比提高至少4倍。

6.权利要求5所述的抗CD20单克隆抗体，其特征在于所述抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：14，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：12。

7.权利要求1或2所述的抗CD20单克隆抗体，其特征在于所述抗体结合CD20的亲和力与Rituximab相比提高至少10倍。

8.权利要求7所述的抗CD20单克隆抗体，其特征在于所述抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：14，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：12。

9.一种制剂，含有上述1至8任一所述的抗CD20单克隆抗体和可药用的载体。

10.权利要求1至9任一所述的抗CD20单克隆抗体或其制剂在制备抗B细胞淋巴瘤的药物中的用途。

11.权利要求10的用途，其中B细胞淋巴瘤为非霍奇金淋巴瘤。

12.权利要求11的用途，其中非霍奇金淋巴瘤为低度和部分中度非霍奇金淋巴瘤。

13.权利要求10的用途，其中B细胞淋巴瘤为慢性淋巴性白血病。