CN102027004A - 具有α-淀粉酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有α-淀粉酶活性的分离的多肽，以及编码所述多肽的多核苷酸。本发明亦涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生和使用所述多肽的方法。

Description

具有α-淀粉酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸

涉及序列表

本申请含有计算机可读形式的序列表。其通过提述并入本文。

涉及生物材料保藏物

本申请含有对生物材料的保藏物的涉及，将所述保藏物通过提述并入本文。

发明背景

发明领域

本发明涉及具有α-淀粉酶活性的分离的多肽和编码该多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生和使用所述多肽的方法。

相关技术描述

α-淀粉酶(α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC.3.2.1.1)构成一组酶，其催化淀粉及其他直链和支链1，4-葡糖苷寡糖和多糖的水解。

多年来，α-淀粉酶用于多种不同目的，其中最重要的是淀粉液化(starchliquefaction)、纺织品脱浆(textile desizing)、纸和纸浆工业(paper and pulpindustry)中淀粉的修饰、以及酿酒(brewing)、乙醇产生和焙烤(baking)。

对于将淀粉转化为可溶性淀粉水解物，将淀粉解聚(depolymerize)。常规解聚方法由糊化(gelatinization)步骤和两个连续的方法步骤(即，液化方法和糖化方法)组成。

粒状淀粉(granular starch)由微观颗粒(microscopic granule)组成，其在室温不溶于水。当将含水淀粉浆料(aqueous starch slurry)加热时，所述颗粒溶胀(swell)并最终爆裂(burst)，将淀粉分子分散到溶液中。在该“糊化”方法中，粘度急剧增加。因为在一般的工业方法中固体水平为30-40％，所以必须将淀粉稀化(thin)并“液化”，使其可适于处理。该粘度的降低目前绝大多数是通过酶降解来得到的。在所述液化步骤中，由α-淀粉酶将长链淀粉降解为较小的支链和直链单元(麦芽糊精，maltodextrin)。所述液化方法一般在约105-110℃进行约5-10分钟，然后在约95℃进行约1-2小时。然后将温度降至60℃，添加葡糖淀粉酶(亦称为GA或AMG)或β-淀粉酶，以及，任选地，脱支酶(debranching enzyme)(如异淀粉酶(isoamylase)或支链淀粉酶(pullanase))，而所述糖化方法继续进行约24到72小时。在糖化方法后，糖可通过发酵生物(优选酵母)转化为乙醇。

从上述讨论可知，显然，常规的淀粉转化方法非常耗费能量，这是因为在不同步骤中不同的对温度方面的要求。存在无需糊化淀粉而转化淀粉的方法。上述“生淀粉(raw starch)”方法描述于美国专利号4,591,560、4,727,026和4,009,074，EP专利号0171218以及丹麦专利申请PA200300949。来自Subulispora procurvata具有α-淀粉酶活性的多肽公开于WO 2006/069290的SEQ ID NO：169。

有利的是：提供其他与之前已知的α-淀粉酶具有不同性质的α-淀粉酶，将其用于淀粉转化方法，使得整个方法可以合并为一步。

发明内容

本发明涉及选自下组的具有α-淀粉酶活性的分离的多肽：

(a)一种多肽，其包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少90％同一性的氨基酸序列；

(b)一种由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在至少中等严紧条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ IDNO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

(c)一种由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少90％同一性的核苷酸序列；和

(d)一种变体，其包含取代、缺失和/或***一个或多个(几个)氨基酸的SEQ ID NO：2的成熟多肽。

本发明还涉及编码具有α-淀粉酶活性的多肽的分离的多核苷酸，其选自下组：

(a)一种多核苷酸，其编码包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽；

(b)一种多核苷酸，其在至少中等严紧条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

(c)一种多核苷酸，其包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少90％同一性的核苷酸序列；和

(d)一种多核苷酸，其编码一种变体，该变体包含取代、缺失和/或***一个或多个氨基酸的SEQ ID NO：2的成熟多肽。

本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体、重组宿主细胞，和产生具有α-淀粉酶活性的多肽的方法。

本发明还涉及抑制细胞中多肽表达的方法，包括向所述细胞施用或在所述细胞中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含本发明的多核苷酸的亚序列。本发明还涉及这样的双链抑制性RNA(dsRNA)分子，其中任选地所述dsRNA是siRNA或miRNA分子。

本发明还涉及降解包含淀粉的材料的方法。

本发明还涉及如下的植物，其包含编码上述具有α-淀粉酶活性的多肽的分离的多核苷酸。

本发明还涉及产生上述具有α-淀粉酶的多肽的方法，包括：(a)在有益于下述多肽产生的条件下培养转基因植物或植物细胞，所述转基因植物或植物细胞包含编码上述具有α-淀粉酶活性的多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。

本发明还涉及包含编码蛋白质的基因的核酸构建体，其中所述基因可操作地连接于编码信号肽的核苷酸序列，所述信号肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸1到18或由SEQ ID NO：2的氨基酸1到18组成，其中所述基因对所述核苷酸序列是外源的。

附图简述

图1显示pLIZGaH的限制图谱。

定义

α-淀粉酶活性：在本文中术语“α-淀粉酶活性”定义为1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(EC.3.2.1.1)活性，其催化淀粉以及其他直链和支链1，4-葡糖苷寡糖和多糖的水解。α-淀粉酶活性根据实施例中所述的方法来确定。

本发明的多肽具有SEQ ID NO：2的成熟多肽α-淀粉酶活性的至少20％，优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少100％。

分离的多肽：术语“分离的多肽”用于本文中指从来源分离的多肽。在一个优选的方面，如通过SDS-PAGE测定的，所述多肽为至少1％纯，优选至少5％纯，更优选至少10％纯，更优选至少20％纯，更优选至少40％纯，更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，并且最优选至少90％纯。

基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”在本文表示多肽制备物，所述多肽制备物含有按重量计至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然或重组结合的(associated)其它多肽材料。因此，优选所述基本上纯的多肽按存在于制备物中的全部多肽材料的重量计是至少92％纯，优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，更优选至少98％纯，甚至更优选至少99％纯，最优选至少99.5％纯，并且甚至最优选100％纯。本发明的多肽优选是基本上纯的形式，即所述多肽制备物基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多肽材料。例如，这能够通过如下用公知的重组方法制备多肽或通过经典纯化方法来实现。

成熟多肽：术语“成熟多肽”在本文中定义为以其在翻译和任何翻译后修饰(如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等)之后的最终形式存在的具有α-淀粉酶的多肽。在一个优选的方面，基于SignalP程序所述成熟多肽是SEQ ID NO：2的氨基酸19-615，该程序预测SEQ ID NO：2的氨基酸1-18是信号肽。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”在本文中定义为编码具有α-淀粉酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。在一个优选的方面，基于SignalP程序所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO：1的核苷酸55-1845，该程序预测SEQ ID NO：1的核苷酸1-54编码信号肽。

同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“同一性”来描述。

就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度是使用如EMBOSS程序包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等，2000，Trends in Genetics 16：276-277)(优选版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)来测定的。使用的可选参数是：缺口产生罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性并且是如下计算的：

(相同的残基x100)/(比对的长度-比对中的缺口总数)

就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度使用如EMBOSS程序包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open SoftwareSuite，Rice等，2000，见上)(优选版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上)测定。使用的可选参数是：缺口产生罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性并且是如下计算的：

(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对的长度-比对中的缺口总数)

同源序列：术语“同源序列”在本文中定义为用SEQ ID NO：2的Subulispora菌种α-淀粉酶或其成熟多肽，在tfasty检索(Pearson，W R.，1999，于Bioinformatics Methods and Protocols，S.Misener和S.A.Krawetz编，185-219页)中给出小于0.001的E值(或预期分数)的预测蛋白质。

多肽片段：术语“多肽片段”在本文定义为从SEQ ID NO：2的成熟多肽或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失了一个或多个(几个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有α-淀粉酶活性。在一个优选的方面，片段含有SEQ ID NO：2或其同源序列的至少500个氨基酸残基，更优选至少550个氨基酸残基，并且最优选至少600个氨基酸。

亚序列：术语“亚序列(subsequence)”在本文中定义为从SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的5′和/或3′端缺失了一个或多个(几个)核苷酸的核苷酸序列；或其同源序列；其中所述亚序列编码具有α-淀粉酶活性的多肽片段。在一个优选的方面，亚序列含有SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其同源序列的至少1500个核苷酸，更优选至少1650个核苷酸，并且最优选至少1800个核苷酸。

等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。

分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”用于本文中指从来源分离的多核苷酸。在一个优选的方面，如通过琼脂糖电泳测定的，所述多核苷酸为至少1％纯，优选至少5％纯，更优选至少10％纯，更优选至少20％纯，更优选至少40％纯，更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，并且最优选至少90％纯。

基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”用于本文指多核苷酸制备物，其不含其它外来的或不期望的核苷酸，并且处于适合于在遗传工程蛋白质生产体系中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸含有按重量计至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90％纯，优选至少92％纯，更优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，甚至更优选至少98％纯，最优选至少99％，并且甚至最优选至少99.5％纯的。本发明的多核苷酸优选为基本上纯的形式，即所述多核苷酸制备物基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或它们的任何组合。

编码序列：术语“编码序列”的意思是直接指定其蛋白产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子如GTG和TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的核苷酸序列。

cDNA：术语“cDNA”在本文中定义为能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。这些步骤包括通过称为剪接的过程去除内含子序列。因而源自mRNA的cDNA没有任何内含子序列。

核酸构建体：术语“核酸构建体”用于本文指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或将所述核酸分子以本来不存在于(nototherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段或所述核酸分子是合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

控制序列(control sequence)：术语“控制序列”在本文定义为包括对编码本发明多肽的多核苷酸表达是必需的所有组分。各个控制序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各个控制序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，控制序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。控制序列可以和目的为引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进控制序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。

可操作地连接：术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型，其中将控制序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得控制序列指导多肽编码序列的表达。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

表达载体：术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。

宿主细胞：如本文中所使用的术语“宿主细胞”包括任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。

修饰：术语“修饰”在本文的意思是，对由SEQ ID NO：2的成熟多肽组成的多肽或其同源序列的任何化学修饰，以及对编码这样的多肽的DNA的遗传操作。所述修饰可以是一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或***，以及一个或多个(几个)氨基酸侧链的置换。

人工变体：术语“人工变体”的意思是具有α-淀粉酶活性的多肽，所述多肽由表达SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的修饰的多核苷酸序列或其同源序列的生物体产生。所述修饰的核苷酸序列通过人为干预(humanintervention)，通过修饰公开于SEQ ID NO：1的多核苷酸序列或其同源序列来获得。

发明详述

具有α-淀粉酶活性的多肽

在第一个方面，本发明涉及包含下述氨基酸序列的分离的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少90％，优选至少93％，更优选至少95％，更优选至少96％，且甚至更优选至少97％、至少98％或至少99％的同一性程度，所述多肽具有α-淀粉酶活性(下文中的“同源多肽”)。在一个优选的方面，所述同源多肽具有氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO：2的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。

本发明的多肽优选包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其等位变体；或它们的具有α-淀粉酶活性的片段。在一个优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在另一优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：2的成熟多肽。在另一优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸19至615，或其等位变体；或它们的具有α-淀粉酶活性的片段。在另一优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸19至615。在另一优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其等位变体，或它们的具有α-淀粉酶活性的片段组成。在另一优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。在另一优选的方面，多肽由SEQID NO：2的成熟多肽组成。在另一优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸19至615或其等位变体，或它们的具有α-淀粉酶活性的片段组成。在另一优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸19至615组成。

在第二个方面，本发明涉及具有α-淀粉酶活性的分离的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选极低严紧条件、更优选低严紧条件、更优选中严紧条件、更优选中-高严紧条件、甚至更优选高严紧条件、和最优选非常高严紧条件下与下列杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的亚序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的全长互补链(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，New York)。SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少100个连续的核苷酸或优选至少200个连续的核苷酸。此外，所述亚序列可编码具有α-淀粉酶活性的多肽片段。在一个优选的方面，所述互补链是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的全长互补链。

SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其亚序列；以及SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其片段，可用于设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码具有α-淀粉酶活性的多肽的DNA。具体而言，可将这些探针用于根据标准的Southern印迹方法与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以鉴定并从其中分离相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少14个，优选至少25个，更优选至少35个，并且最优选至少70个核苷酸。然而，优选所述核酸探针长度上是至少100个核苷酸。例如，所述核酸探针长度上可以是至少200个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少400个核苷酸，或最优选至少500个核苷酸。甚至可以使用更长的探针，例如，长度是优选至少600个核苷酸，更优选至少700个核苷酸，甚至更优选至少800个核苷酸，或最优选至少900个核苷酸的核酸探针。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以探测相应的基因(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。将这些探针涵盖于本发明中。

因而，可从由这些其它菌株制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选DNA，所述DNA与上述探针杂交并且编码具有α-淀粉酶活性的多肽。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术分离来自这些其它菌株的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ ID NO：1或其亚序列同源的克隆或DNA，将所述载体材料优选用在Sounthern印迹中。

就本发明而言，杂交表示核苷酸序列在非常低至非常高的严紧条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列；包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列；其全长互补链；或其亚序列。可使用例如X射线片(X-ray film)检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。

在一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列。在另一优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：1的核苷酸55-1845。在另一优选的方面，核酸探针是编码SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：1。在另一优选的方面，核酸探针是包含在大肠杆菌(E.coli)DSM19686中的质粒pGEM-T中含有的多核苷酸序列，其中所述其多核苷酸序列编码具有α-淀粉酶活性的多肽。在另一优选的方面，核酸探针是包含在大肠杆菌DSM19686中的质粒pGEM-T冲含有的成熟多肽编码区。

对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严紧条件定义为在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200μg/ml已剪切并且变性的鲑精DNA中，并且对于非常低和低严紧性为25％的甲酰胺、对于中和中-高严紧性为35％的甲酰胺、或对于高和非常高严紧性为50％的甲酰胺，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交和杂交最佳12至24小时。

对于长度为至少100个核苷酸的长探针，使用2X SSC、0.2％SDS优选在45℃(非常低严紧性)，更优选在50℃(低严紧性)，更优选在55℃(中严紧性)，更优选在60℃(中-高严紧性)，甚至更优选在65℃(高严紧性)，并且最优选在70℃(非常高严紧性)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将严紧条件定义为在比使用根据Bolton和McCarthy计算法(1962，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 48：1390)计算得出的T_m低大约5℃至大约10℃，在0.9M NaCl，0.09M Tris-HCl pH 7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1X Denhardt’s溶液，1mM焦磷酸钠(sodium pyrophosphate)，1mM磷酸二氢钠(sodium monobasic phosphate)，0.1mM ATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交、杂交和杂交后洗涤最佳12至24小时。

对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将所述载体材料在6X SSC加0.1％SDS中洗涤一次15分钟，并用6X SSC在比计算得出的T_m低5℃至10℃的温度洗涤两次，每次15分钟。

在第三个方面，本发明涉及具有由如下多核苷酸编码的α-淀粉酶活性的分离的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少90％、更优选至少93％，最优选至少95％、并且甚至最优选96％、97％、98％、或99％同一性程度的核苷酸序列或由所述核苷酸序列组成，其编码活性多肽。参见本文多核苷酸部分。

在第四个方面，本发明涉及人工变体，所述人工变体包含取代、缺失和/或***一个或多个(或几个)氨基酸的SEQ ID NO：2的成熟多肽；或其同源序列。优选地，氨基酸改变对性质是较不重要的(of a minor nature)，即保守的氨基酸取代或***，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为1至大约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列(poly-histidine tract)、抗原表位(antigenicepitope)或结合域(binding domain)。

保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，于The Proteins，Academic Press，New York中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

除了20个基本氨基酸，非基本氨基酸(如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后已经过修饰，和/或在它们的侧链具有不同于基本氨基酸的化学结构。非天然氨基酸能够以化学方法合成，并且优选是商业上可得到的，包括六氢吡啶羧酸(pipecolic acid)、噻唑烷羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸。

可供选择的是，氨基酸改变具有这样的性质以使多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸改变可改进多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适pH等。

能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells，1989，Science 244：1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的生物活性(即，α-淀粉酶活性)以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271：4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来测定。参见例如de Vos等，1992，Science 255：306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol.224：899-904；Wlodaver等，1992，FEBSLett.309：59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能够从与多肽的同一性分析来推断，所述多肽与根据本发明的多肽相关。

能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后是有关的筛选方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science 241：53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2152-2156；WO 95/17413；或WO

95/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代、缺失和/或***。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等，1991，Biochem.30：10832-10837；美国专利5,223,409号；WO 92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等，1986，Gene 46：145；Ner等，1988，DNA 7：127)。

诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等，1999，Nature Biotechnology 17：893-896)。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许快速测定感兴趣的多肽中单个氨基酸残基的重要性，并且能够应用于未知结构的多肽。

SEQ ID NO：2的成熟多肽(如SEQ ID NO：2的氨基酸19到615)的氨基酸取代、缺失和/或***的总数是10，优选9，更优选8，更优选7，更优选至多6，更优选5，更优选4，甚至更优选3，最优选2，并且甚至最优选1。

具有α-淀粉酶活性的多肽的来源

本发明的多肽可以获得自任何属的微生物。就本发明而言，用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”，意思是核苷酸序列编码的多肽由所述来源产生，或由其中***了来自所述来源的核苷酸序列的菌株产生。在优选的方面，获得自给定来源的多肽是胞外分泌的。

本发明具有α-淀粉酶活性的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是***多肽如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)多肽，所述多肽具有α-淀粉酶活性；或革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或脲原体属(Ureaplasma)多肽，所述多肽具有α-淀粉酶活性。

在一个优选的方面，所述多肽是具有α-淀粉酶活性的嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bcillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有α-淀粉酶活性的似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、***链球菌(Streptococcus uberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有α-淀粉酶活性的不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)多肽。

本发明具有α-淀粉酶活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更优选酵母多肽如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)多肽，其具有α-淀粉酶活性；或更优选丝状真菌多肽如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、Chaetomidium、金孢子菌属(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、Coprinopsis、Coptotermes、Corynascus、Cryphonectria、隐球菌属(Cryptococcus)、Diplodia、Exidia、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、Holomastigotoides、腐质霉属(Humicola)、耙菌属(Irpex)、Lentinula、Leptospaeria、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、热子囊菌属/嗜热霉属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、Trichophaea、轮枝孢属(Verticillium)、Volvariella或Xylaria多肽，其具有α-淀粉酶活性。

在一个优选的方面，所述多肽是具有α-淀粉酶活性的卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)多肽。

在另一优选的方面，所述多肽是具有α-淀粉酶活性的解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusariumculmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、Irpexlacteus、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、Thielavia achromatica、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、Thielaviaaustraleinsis、Thielavia fimeti、Thielavia microspora、Thielavia ovispora、Thielavia peruviana、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、毛梭孢壳(Thielaviasetosa)、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)多肽。

在一个更优选的方面，所述多肽是具有α-淀粉酶活性的Subulispora菌种多肽。在一个最优选的方面，所述多肽具有α-淀粉酶活性，例如，包含SEQ ID NO：2的成熟多肽的多肽。

可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而无论它们已知的种名。本领域的技术人员会容易地识别适合的等同物的身份(identity)。

这些种的菌株在许多培养物保藏机构对于公众能够容易地取得，所述保藏机构如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection，Northern Regional Research Center)(NRRL)。

此外，可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物鉴定和获得这些多肽。用于从天然生境(habitat)分离微生物的技术是本领域内公知的。随后可通过相似地筛选这种微生物的基因组或cDNA文库来获得所述多核苷酸。一旦用所述探针检测到编码多肽的多核苷酸序列，就能够使用本领域普通技术人员熟知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook等，1989，见上)。

本发明的多肽还包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中将另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通过将编码另一个多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本发明的核苷酸序列(或其部分)来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使它们在阅读框中，并且使所述融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。

融合多肽还可以包括切割位点。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位点，从融合蛋白释放具有α-淀粉酶活性的多肽。切割位点的实例包括，但不限于，编码二肽Lys-Arg的Kex2位点(Martin等，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3：568-76；Svetina等，2000，J.Biotechnol.76：245-251；Rasmussen-Wilson等，1997，Appl.Environ.Microbiol.63：3488-3493；Ward等，1995，Biotechnology 13：498-503；和Contreras等，1991，Biotechnology 9：378-381)；Ile-(Glu或Asp)-Gly-Arg位点，其在精氨酸残基后通过因子Xa蛋白酶切割(Eaton等，1986，Biochem.25：505-512)；Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位点，其在赖氨酸后通过肠激酶切割(Collins-Racie等，1995，Biotechnology 13：982-987)；His-Tyr-Glu位点或His-Tyr-Asp位点，其通过Genenase I切割(Carter等，1989，Proteins：Structure，Function，and Genetics 6：240-248)；Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser位点，其在Arg后通过凝血酶切割(Stevens，2003，Drug Discovery World 4：35-48)；Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly位点，其在Gln后通过TEV蛋白酶切割(Stevens，2003，见上)；和Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位点，其在Gln后通过遗传工程形式的人鼻病毒3C蛋白酶切割(Stevens，2003，见上)。

多核苷酸

本发明还涉及分离的多核苷酸，其包含编码本发明具有α-淀粉酶活性的多肽的核苷酸序列，或由该核苷酸序列组成。

在一个优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO：1或由SEQ ID NO：1组成。在另一更优选的方面，核苷酸序列包含大肠杆菌DSM19686中所含质粒pGEM-T中含有的序列，或由该序列组成。在另一优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或由SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列组成。在另一优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO：1的核苷酸55-1845或由SEQ ID NO：1的核苷酸55-1845组成。在另一更优选的方面，核苷酸序列包含大肠杆菌DSM19686中所含质粒pGEM-T中含有的成熟多肽编码序列或由该成熟多肽编码序列组成。本发明还包含编码如下多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其成熟多肽，或由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其成熟多肽组成；由于遗传密码的简并性，所述核苷酸序列不同于SEQ ID NO：1或其成熟多肽编码序列。本发明还涉及SEQ ID NO：1的亚序列，所述亚序列编码具有α-淀粉酶活性的SEQ ID NO：2的片段。

本发明还涉及突变的多核苷酸，其在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中包含至少一个突变或由具有至少一个突变的SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列组成，其中突变的核苷酸序列编码SEQ ID NO：2的成熟多肽。

用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域内已知的，且包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特性的克隆DNA片段，从而实现从这种基因组DNA克隆本发明的多核苷酸。参见，例如，Innis等，1990，PCR：A Guide to Methods and Application，Academic Press，New York。可以使用其它核酸扩增方法，如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligated activated transcription；LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。可以从Subulispora的菌株，或另外的或相关的生物体克隆所述多核苷酸，并且因此可以是例如所述核苷酸序列的多肽编码区的等位基因变体或种变体(species variant)。

本发明还涉及分离的多核苷酸，其包含下述核苷酸序列或由其组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有优选至少90％，更优选至少95％，并且甚至最优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性程度，所述多核苷酸编码活性多肽。

修饰编码本发明多肽的核苷酸序列对于合成与所述多肽基本上相似的多肽可为必需的。术语与所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如，比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的人工变体。可以在作为SEQ IDNO：1的成熟多肽编码序列存在的核苷酸序列，例如其亚序列的基础上，和/或通过引入如下核苷酸取代来构建变体序列：所述取代不产生由核苷酸序列编码的多肽的另外的氨基酸序列，但是符合意欲产生酶的宿主生物体的密码子选择；或者所述取代可产生不同的氨基酸序列。关于核苷酸取代的概述，参见，例如，Ford等，1991，Protein Expression and Purification 2：95-107。

对于本领域技术人员显而易见的是，这些取代能够在对于分子功能重要的区域之外进行，并且仍然产生活性多肽。对于由本发明的分离的多核苷酸编码的多肽活性关键的并且因此优选不进行取代的氨基酸残基，可以根据本领域公知的方法，如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(参见，例如，Cunningham和Wells，1989，见上)来鉴定。在后一技术中，将突变引入到分子中的每个荷正电的残基处，并且测试所得突变分子的α-淀粉酶活性，以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。底物-酶相互作用的位点也能够通过分析三维结构测定，通过如核磁共振分析、晶体学或光亲和标记这样的技术来测定(参见，例如，de Vos等，1992，见上；Smith等，1992，见上；Wlodaver等，1992，见上)。

本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸在非常低严紧条件下，优选低严紧条件，更优选中严紧条件，更优选中-高严紧条件，甚至更优选高严紧条件，并且最优选非常高的严紧条件下，与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链，或它们的等位变体和亚序列(Sambrook等，1989，同上)，如本文所定义的。在一个优选的方面，互补链是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的全长互补链。

本发明还涉及通过如下获得的分离的多核苷酸：(a)在非常低、低、中、中-高、高或非常高严紧条件下，将DNA的群体与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(b)分离杂交的多核苷酸，其编码具有α-淀粉酶活性的多肽。在一个优选的方面，所述互补链是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的全长互补链。

核酸构建体

本发明还涉及包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建体，所述分离的多核苷酸与一个或多个(几个)控制序列可操作地连接，所述控制序列在合适的宿主细胞中在与该控制序列相容的条件下指导编码序列的表达。

可以用许多方式操作编码本发明多肽的分离的多核苷酸以供多肽的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸的序列***载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域熟知的。

控制序列可以是适当的启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录控制序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

用于指导本发明的核酸构建体转录，特别是在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：大肠杆菌lac操纵子、天蓝链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 75：3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等，1983，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80：21-25)。另外的启动子在″Useful proteins from recombinant bacteria″于Scientific American，1980，242：74-94中；和在Sambrook等，1989，见上中描述。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、尖镰孢胰蛋白酶-样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞有用的其它启动子由Romanos等，1992，Yeast 8：423-488描述。

控制序列也可以是合适的转录终止子序列，其是由宿主细胞识别以终止转录的序列。所述终止子序列与编码所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶-样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞有用的其它终止子由Romanos等，1992，见上描述。

控制序列还可以是合适的前导序列，其是对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的5’-末端。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列用在本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。

对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

控制序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与核苷酸序列的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为向转录的mRNA添加聚腺苷残基的信号。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本发明中使用。

对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶-样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。

对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 15：5983-5990描述。

控制序列还可以是信号肽编码序列，其编码与多肽的氨基末端相连的氨基酸序列，并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径。核苷酸序列的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，该信号肽编码序列与编码分泌多肽的编码序列区段一起天然地连接在翻译阅读框中。或者，编码序列5’端可含有对于所述编码序列为外源的信号肽编码序列。外源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可以简单地取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径(即，分泌至培养基中)的任何信号肽编码序列可在本发明中使用。

对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57：109-137描述。

对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V和疏棉状腐质霉脂肪酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等，1992，见上描述。

在一个优选的方面，信号肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸1至18或由SEQID NO：2的氨基酸1至18组成。在另一优选的方面，信号肽编码序列包含SEQ ID NO：1的核苷酸1至54或由SEQ ID NO：1的核苷酸1至54组成。

控制序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前(多)肽通常是无活性的并且能够通过从前多肽催化或自催化切割所述前肽而转化为成熟活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)的基因获得前肽编码区。

当信号肽和前肽序列二者均出现在多肽的氨基末端时，使前肽序列的位置紧接着(next to)多肽氨基末端，并且使信号肽序列的位置紧接着前肽序列的氨基末端。

同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节***的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些***。原核***中的调节***包括lac、tac和trp操纵基因***。在酵母中，可以使用ADH2***或GAL1***。在丝状真菌中，可以使用TAKA α-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核***中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。本文所述的多种核酸和控制序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(几个)方便的限制位点以允许在这些位点***或取代编码多肽的核苷酸序列。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中***包含所述序列的核苷酸序列或核酸构建体来表达本发明的多核苷酸序列。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的表达用控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。

本发明的载体优选地含有一个或多个(或几个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy toauxotrophs)等。

细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等价物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

本发明的载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或允许载体在细胞中独立于基因组自主复制。

为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的核苷酸序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应优选含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，优选400至10,000碱基对，并且最优选800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

为了自主复制，载体可以还包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文定义为能够使质粒或载体体内复制的核苷酸序列。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1，ARS4，ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等，1991，Gene 98：61-67；Cullen等，1987，Nucleic Acids Research 15：9163-9175；WO 00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO 00/24883中的方法完成。

可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸***宿主细胞以增加基因产物的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，从而也含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等，1989，见上)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸，将所述重组宿主细胞有利地用于多肽的重组产生。将包含本发明的多核苷酸的载体引入宿主细胞从而将所述载体作为染色体整合体或作为自复制的染色体外载体保持，如前文所述。术语“宿主细胞”包含亲本细胞的任何子代，其因为在复制过程中发生的突变而与该亲本细胞不同。宿主细胞的选择在很大程度上会依赖于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何***或革兰氏阴性细菌。***包括但不限于，芽孢杆菌属、链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、乳杆菌属、乳球菌属、梭菌属、地芽孢杆菌属和海洋芽孢杆菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于，大肠杆菌、假单胞菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属、螺杆菌属、黄杆菌属、梭杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属和脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞。在本发明的实施中有用的芽孢杆菌属细胞包括但不限于，嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。

在一个优选的方面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在更优选的方面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是克劳氏芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是地衣芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是枯草芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞。在本发明的实施中有用的链球菌属细胞包括但不限于，似马链球菌、酿脓链球菌、***链球菌和马链球菌兽瘟亚种细胞。

在一个优选方面，细菌宿主细胞是似马链球菌细胞。在另一个优选方面，细菌宿主细胞是酿脓链球菌细胞。在另一个优选方面，细菌宿主细胞是***链球菌细胞。在另一个优选方面，细菌宿主细胞是马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞。在本发明的实施中有用的链霉菌属细胞包括但不限于，不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞。

在一个优选的方面，细菌宿主细胞是不产色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是除虫链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是天蓝链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是灰色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是浅青紫链霉菌细胞。

可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young和Spizizen，1961，Journal of Bacteriology 81：823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56：209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology 169：5271-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Hanahan，1983，J.Mol.Biol.166：557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等，1988，Nucleic Acids Res.16：6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：例如原生质体转化和电穿孔(参见，例如，Gong等，2004，Folia Microbiol.(Praha)49：399-405)，接合(参见，例如，Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171：3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.Acad Sci.USA 98：6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：例如电穿孔(参见，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods 64：391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets，2005，Appl.Environ.Microbiol.71：51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(naturalcompetence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immun.32：1295-1297)，原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick，1991，Microbios.68：189-207)，电穿孔(参见，例如，Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.65：3800-3804)或接合(参见，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.45：409-436)。然而，可以使用任何本领域已知的将DNA引入宿主细胞的方法。

宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

在一个优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fungi，第八版，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，见上，171页中所引用)，和所有有丝***孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等，1995，见上)。

在一个更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，会将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，和Davenport，R.R.编，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所述。

在一个甚至更加优选的方面，酵母宿主细胞是假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞。

在一个最优选的方面，酵母宿主细胞是卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母或卵形酵母细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。

在另一个更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等，1995，见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。

在一个甚至更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

在一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另一个最优选方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、Ceriporiopsis subvermispora、嗜角质金孢子菌、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉、Trametes villosa、Trametes versicolor、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁重建的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP 238023和Yelton等，1984，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 81：1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等，1989，Gene 78：147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente，于Abelson，J.N.和Simon，M.I.编，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，Volume 194，182-187页，Academic Press，Inc.，New York；Ito等，1983，Journalof Bacteriology 153：163；和Hinnen等，1978，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 75：1920。

产生方法

本发明还涉及产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一个优选的方面，所述细胞是Subulispora属的。在一个更优选的方面，所述细胞是Subulispora菌种。

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，其包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养如本文所述的重组宿主细胞；和(b)回收所述多肽。

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含突变核苷酸序列，其在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中具有至少一个突变，其中所述突变核苷酸序列编码多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：2的成熟多肽或由SEQ ID NO：2的成熟多肽组成，和(b)回收所述多肽。

在本发明的产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌到培养基中，其能够从细胞裂解物(lysate)回收。

可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶试验(enzyme assay)可用于测定如本文所述的多肽的活性。

所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers，New York，1989)。

植物

本发明还涉及植物，例如，转基因植物、植物部分或植物细胞，其包含分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明α-淀粉酶活性的多肽，从而以可回收的量表达和产生所述多肽。多肽可从植物或植物部分回收。或者，可以将含有该重组多肽的植物或植物部分按原样用于改进食品或饲料的质量，例如，改进营养价值、适口性(palatability)和流变性质(rheological properties)，或用于破坏抗营养因子。

转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(bluegrass)，早熟禾属(Poa))；饲用牧草(forage grass)如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；寒地型牧草(temperate grass)，如Agrostis(翦股颖属)；和谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。

双子叶植物的实例是烟草(tobacco)，豆类(legumes)，如羽扇豆(lupins)，马铃薯，糖甜菜(sugar beet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(family Brassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rape seed)和紧密相关的模型生物体拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

植物部分的实例是茎(stem)、愈伤组织(callus)、叶(leaf)、根(root)、果实(fruit)、种子(seed)和块茎(tuber)，以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮(epidermis)、叶肉(mesophyll)、薄壁组织(parenchyme)、维管组织(vasculartissue)、分生组织(meristem)。具体的植物细胞区室(compartments)，如叶绿体(chloroplast)、质外体(apoplast)、线粒体(mitochondria)、液泡(vacuole)、过氧化物酶体(peroxisome)和细胞质(cytoplasm)也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如为了促进本发明的应用而分离的具体组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和种皮(seed coat)。

同样包含于本发明范围内的还有这些植物、植物部分和植物细胞的子代。

表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞可以依照本领域已知方法构建。简而言之，通过如下方法构建所述植物或植物细胞：将编码本发明多肽的一个或多个(几个)表达构建体并入植物宿主基因组或叶绿体基因组，并且将所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。

表达构建体便利地是包含编码本发明多肽的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该核苷酸序列所需的适当的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含对于鉴定在其中整合了该表达构建体的宿主细胞有用的选择性标记和将该构建体引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依赖于使用的DNA引入方法)。

调节序列的选择，例如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择，举例来说，基于期望何时、何处以及如何表达多肽而确定。例如，编码本发明多肽的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定的组织或植物部分例如种子或叶。调节序列由例如Tague等，1988，Plant Physiology 86：506所述。

对于组成性表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1和稻肌动蛋白1启动子(Franck等，1980，Cell 21：285-294，Christensen等，1992，Plant Mo.Biol.18：675-689；Zhang等，1991，Plant Cell 3：1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如来自贮藏库组织(storage sink tissue)例如种子、马铃薯块茎和果实的启动子(Edwards&Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24：275-303)，或来自代谢库组织(metabolic sink tissue)例如分生组织的启动子(Ito等，1994，Plant Mol.Biol.24：863-878)，种子特异性启动子诸如来自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)启动子(Wu等，1998，Plant andCell Physiology 39：885-889)，来自豆球蛋白(legumin)B4和蚕豆(Vicia faba)的未知种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等，1998，Journal of Plant Physiology152：708-711)、来自种子油体蛋白(oil body protein)的启动子(Chen等，1998，Plantand Cell Physiology 39：935-941)，来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子，或本技术领域公知的任何其它种子特异性的启动子，例如，在WO 91/14772中所描述的。此外，启动子可为叶特异性的启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等，1993，Plant Physiology 102：991-1000)，小球藻病毒(chlorella virus)腺嘌呤甲基转移酶(adenine methyltransferase)基因启动子(Mitra和Higgins，1994，Plant Molecular Biology 26：85-93)，或来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等，1995，Molecular and General Genetics 248：668-674)，或伤口诱导的启动子，如马铃薯pin2启动子(Xu等，1993，Plant Molecular Biology 22：573-588)。同样地，所述启动子可通过非生物的处理诱导，所述非生物的处理诸如温度、干旱或盐度变化，或通过外源施加的激活所述启动子的物质诱导，例如乙醇、***(oestrogens)、植物激素(plant hormones)如乙烯、脱落酸(abscisicacid)和赤霉酸(gibberellic acid)，和重金属。

启动子增强子元件也可以用于实现本发明多肽在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是内含子，其置于启动子和编码本发明多肽的核苷酸序列之间。例如Xu等，1993，见上，公开了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。

选择性标记基因和表达构建体的任何其它部分可以选自本领域内可用的那些。

将核酸构建体根据本领域已知的常规技术并入植物基因组，所述常规技术包括土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射(microinjection)、粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser等，1990，Science244：1293；Potrykus，1990，Bio/Technology 8：535；Shimamoto等，1989，Nature338：274)。

目前，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移(genetransfer)，是产生转基因双子叶植物的优选方法(为了参考，见Hooykas和Schilperoort，1992，Plant Molecular Biology 19：15-38)，而且它也可以用于转化单子叶植物，虽然对于这些植物常常使用其它的转化方法。目前，产生转基因单子叶植物的优选的方法，是用粒子(用转化DNA涂覆的微观的金或钨粒子)轰击胚愈伤组织(embryonic calli)或发育中的胚(developing embryos)(Christou，1992，Plant Journal 2：275-281；Shimamoto，1994，Current OpinionBiotechnology 5：158-162；Vasil等，1992，Bio/Technology 10：667-674)。转化单子叶植物的可供选择的方法是基于原生质体转化，如由Omirulleh等，1993，Plant Molecular Biology 21：415-428所描述的。

转化之后，根据本领域熟知的方法选择并入了表达构建体的转化体并且再生成为完整植株。通常设计转化方法用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两种独立的T-DNA构建体的共转化或通过特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。

本发明还涉及产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养包含多核苷酸的转基因植物或植物细胞，所述多核苷酸编码本发明具有α-淀粉酶活性的多肽；和(b)回收所述多肽。

组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物。

所述组合物可另外还包括选自下组的酶：真菌α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)，β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)、葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)和支链淀粉酶(E.C.3.2.1.41)。所述葡糖淀粉酶可优选源自曲霉属菌种，如黑曲霉的菌株，或来自踝节菌属菌种的菌株，并且特别是源自Talaromyces leycettanus(如公开于美国专利号Re.32153的葡糖淀粉酶)，杜邦踝节菌(Talaromyces duponti)以及嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)(如公开于美国专利号4,587,215的葡糖淀粉酶)，且更优选源自埃默森踝节菌(Talaromyces emersoni)。最优选地，所述葡糖淀粉酶源自埃默森踝节菌菌株CBS 793.97和/或具有公开于WO 99/28448中SEQ ID NO：7的序列。此外，优选的是具有与前述氨基酸序列有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或甚至至少95％同源性的氨基酸序列的葡糖淀粉酶。商业的踝节菌属葡糖淀粉酶制备物作为Spirizyme Fuel由Novozymes A/S提供。

还优选用于包含本发明多肽和葡糖淀粉酶的组合物的是如下多肽，所述多肽具有葡糖淀粉酶活性，该活性源自栓菌属(Trametes)，优选瓣环栓菌(Trametes cingulata)的菌株。另外，优选的是具有葡糖淀粉酶活性，且与WO2006/069289中SEQ ID NO：2的成熟多肽的氨基酸具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或甚至至少95％同源性的多肽。

还优选用于包含本发明多肽和葡糖淀粉酶的组合物的是如下多肽，所述多肽具有葡糖淀粉酶活性，该活性源自大纹饰孢属(Pachykytospora)，优选纸质大纹饰孢(Pachykytospora papyracea)的菌株，或保藏于DSMZ且给予编号DSM 17105的大肠杆菌菌株。另外，优选的是具有葡糖淀粉酶活性，且与WO2006/069289中SEQ ID NO：5的成熟多肽的氨基酸具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或甚至至少95％同源性的多肽。

上述的组合物可用于液化和/或糖化经糊化的或粒状的淀粉，以及部分糊化的淀粉。部分糊化的淀粉是一定程度上糊化的淀粉，即，其中部分淀粉不可逆地溶胀并糊化，而部分淀粉仍然以颗粒状态存在。

上述的组合物可优选包含以0.01到10AFAU/g DS，优选0.1到5AFAU/gDS，更优选0.5到3AFAU/g DS，且最优选0.3到2AFAU/g DS的量存在的酸性α-淀粉酶。本发明多肽组合物的剂量和使用所述组合物其他条件可基于本领域已知的方法确定。

所述多肽组合物可根据本领域已知方法制备，并可为液体或干组合物的形式。例如，所述多肽组合物可为颗粒(granulate)或微颗粒(microgranulate)的形式。包括在所述组合物中的多肽可根据本领域已知方法来稳定化。

用途

本发明还涉及使用所述具有α-淀粉酶活性的多肽或其组合物的方法。

本发明的多肽或组合物可用于淀粉转化，淀粉到糖的转化和乙醇产生等，例如，液化和/或糖化经糊化的淀粉或粒状淀粉，以及部分糊化的淀粉。部分糊化的淀粉是一定程度上糊化的淀粉，即，其中部分淀粉不可逆地溶胀并糊化，而部分淀粉仍然以颗粒状态存在。其可用于液化淀粉的方法，其中用所述酶在水介质中处理经糊化或粒状的淀粉底物。本发明的多肽或组合物还可以用于糖化经液化的淀粉底物的方法。优选是在发酵方法中使用，其中淀粉底物在本发明的多肽或组合物存在下液化和/或糖化以产生葡萄糖和/或麦芽糖，其适于由发酵生物(优选酵母)转化为发酵产物。上述发酵方法包括产生燃料乙醇或饮用乙醇(可饮用的乙醇)的方法，产生饮料的方法，产生期望的有机化合物(如柠檬酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、葡糖酸钠、葡糖酸钙、葡糖酸钾、葡糖酸δ-内酯或异抗坏血酸钠)；酮；氨基酸(如谷氨酸(单谷氨酸钠))；但还产生更加复杂的化合物，如抗生素(如青霉素，四环素)；酶；维生素(如核黄素、B12、β-胡萝卜素)；激素的方法，上述物质难以利用合成产生。

此外，由于第一方面的多肽的优异水解活性，在糖化步骤中对葡糖淀粉酶的需求大为降低。所述葡糖淀粉酶优选源自曲霉属菌种、踝节菌属菌种、大纹饰孢属菌种或栓菌属菌种内的菌株，更优选源自黑曲霉、埃默森踝节菌、瓣环栓菌或纸质大纹饰孢。

在一个优选实施方案中，本发明多肽用于包含为了产生发酵产物(例如，乙醇)的发酵方法。上述从含淀粉材料通过发酵产生乙醇的方法包括：(i)将所述含淀粉材料用本发明具有α-淀粉酶活性的多肽液化；(ii)糖化所得的经液化的醪液；(iii)在发酵生物存在下发酵在步骤(ii)中得到的材料。任选地，所述方法另外还包括回收乙醇。糖化和发酵可作为同时糖化和发酵方法(SSF方法)进行。

在另一个优选实施方案中，本发明多肽用于包含发酵的方法以从未糊化的(“生的”)淀粉产生发酵产物(例如，乙醇)。上述从未糊化的含淀粉材料通过发酵产生乙醇的方法包括：将所述未糊化的淀粉与本发明具有α-淀粉酶活性的多肽相接触以降解所述未糊化的淀粉；(ii)糖化所得的醪液；(iii)在发酵生物的存在下发酵步骤(ii)中得到的材料。任选地，所述方法另外还包括回收乙醇。糖化和发酵可作为同时糖化和发酵方法(SSF方法)进行。

本发明的多肽或组合物可用于在生产过程中对上浆(sized)织物(fabric)进行脱浆的方法以促进含淀粉浆料(size)的去除，所述浆料在编织(weaving)过程中充当纱线(yarn)上保护性的涂层(coating)。

在脱浆步骤后常常期望包括去矿化(demineralization)步骤以去除金属离子(如Mn²⁺、Fe²⁺/Fe³⁺、Cu²⁺等)，所述离子如果存在于织物上，会在后续方法步骤中导致不均匀的漂白，或甚至在漂白的织物上产生针孔(pin-hole)。去矿化一般通过酸沉淀(acid precipitation)达成，并通常涉及添加酸，如乙酸或硫酸。

在一个优选实施方案中，当使用本发明的多肽进行所述脱浆方法时，无需进行去矿化。织物可在同一个含水处理溶液中同时脱浆和去矿化，或在同一个或两个不同的处理溶液中顺序脱浆和去矿化。在一个优选实施方案中，脱浆和去矿化在同一个处理溶液中同时进行。本发明的方法可使用传统上浆/脱浆装置进行，例如轧染***(pad system)、J型箱(J-box)、喷丝头(jet)、卷染机(jigger)等。一般而言，无需其他的工艺装置。

根据本发明，同时脱浆和去矿化通过将上浆的织物在具有1-5的pH的含水处理溶液中温育来进行，所述含水处理溶液包含α-淀粉酶。在一个优选实施方案中，温育过程中的pH为1-4，特别是pH 2-4的范围。最优的期间取决于加工方案的类型和温度，且可在约15分钟到数日之间变动，例如，48小时。本发明的方法优选在5到90℃范围，特别是20到90℃的温度进行，取决于加工方案。

所述加工方案可为分批的(batch)或连续的(continuous)，其中织物以其展开的宽度(open width)或绳状(rope form)和含水处理蒸汽相接触。

连续操作可使用饱和器(saturator)进行，其中将与织物重量大约相同重量的处理溶液施加于所述织物，然后在加热的堆置室(dwell chamber)中进行化学反应。然后洗涤段(washing section)使得织物可以进行下一个加工步骤。为了保证高白度或良好的润湿性(wettability)以及获得的可染性(dyeability)，所述脱浆酶和其他药剂必需彻底去除。

分批方法可在一个浴(处理溶液)中进行，其中所述织物与，例如大约8-15倍其重量的含水处理溶液相接触。在温育期间后，排干所述含水处理溶液，漂洗所述织物，并起始下一个加工步骤。不连续的PB方法(即，浸轧-堆放回苏方法(pad-batch process)涉及饱和器，其中将与织物重量相同的含水处理溶液施加于所述织物，然后堆置(dwell)一段时间，在CPB方法(即，轧卷冷堆方法(cold pad-batch process))的情况下可为一日或多日。举例而言，CPB方法可在20-40℃进行8-24小时或更长，其pH在1-5的范围，优选在约1-4，特别是2-4的pH。此外，PB方法可在40-90℃进行1-6小时，其pH在1-5的范围，优选pH在约1和4之间，特别是2和4之间的pH。

在一些方面，本发明的多肽还可以用于焙烤、洗涤剂以及纸浆和纸的产生。

信号肽

本发明还涉及核酸构建体，所述核酸构建体包含编码蛋白质的基因，其中所述基因与一个或两个或多个编码信号肽的第一核苷酸序列可操作地连接，所述信号肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸1到18，或者由SEQ ID NO：2的氨基酸1至18组成，其中所述基因对于第一或第二核苷酸序列是外源的。

在一个优选的方面，所述第一核苷酸序列包含SEQ ID NO：1的核苷酸1-54或由SEQ ID NO：1的核苷酸1-54组成。

本发明还涉及包含上述核苷酸构建体的重组表达载体和重组宿主细胞。

本发明还涉及产生蛋白质的方法，包括(a)在适合于产生所述蛋白质的条件下培养这样的重组宿主细胞；和(b)回收所述蛋白质。

所述蛋白质对于宿主细胞可以是天然的或异源的。术语“蛋白质”在本文的意思不是指特定长度的编码产物，并因此包括肽、寡肽和蛋白质。术语“蛋白质”还包括组合以形成编码产物的两个或更多个多肽。所述蛋白质还包括杂合多肽，其包含从至少两个不同的蛋白质获得的部分或完全多肽序列的组合，其中一个或多个(几个)对于宿主细胞可以是异源或天然的。蛋白质进一步包括上述蛋白质和杂合蛋白质天然存在的等位基因变异和工程的变异。

蛋白质优选是激素或其变体、酶、受体或其部分、抗体或其部分，或报告蛋白(reporter)。在更优选的方面，所述蛋白质是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶(lyase)、异构酶或连接酶。在更加优选的方面，所述蛋白质是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、另外的脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。

基因可以获得自任何原核、真核或其它来源。

通过以下实施例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。

实施例

用作缓冲液和底物的化学品是至少试剂级的商业产品。

方法

葡糖淀粉酶活性(AGU)

葡糖淀粉酶活性可以淀粉葡糖苷酶单位(AmyloGlucosidase Unit，AGU)测定。AGU定义为在如下的标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量：37℃，pH 4.3，底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间5分钟。

可以使用自动分析仪***。向葡萄糖脱氢酶试剂加入变旋酶，从而将任何存在的α-D-葡萄糖转变为β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶在上述反应中特异性地与β-D-葡萄糖反应，形成NADH，使用光度计在340nm测定NADH作为原始葡萄糖浓度的量度。

AMG温育：
		底物：	麦芽糖23.2mM
缓冲液：	乙酸盐0.1M
		pH：	4.30±0.05
温育温度：	37℃±1
		反应时间：	5分钟
酶工作范围：	0.5-4.0AGU/mL

显色反应：
		GlucDH：	430U/L
变旋酶：	9U/L
		NAD：	0.21mM
缓冲液：	磷酸盐0.12M；0.15M NaCl
		pH：	7.60±0.05
温育温度：	37℃±1
		反应时间：	5分钟
波长：	340nm

脱浆(Tegawa方法)

淀粉上浆残余物(starch size residue)通过用肉眼(visually)将碘染色的织物样品(fabric swatch)与标准组照片相比较来确定，所述照片为1-9的标度(scale)，其中1为深蓝，而9无染色。

碘染色溶液通过将10g KI溶解于10ml水，添加0.632g I₂和去离子水中的200ml乙醇以得到总共1L溶液来制备。切取织物样品，并将其浸于所述碘溶液60秒，并在去离子水中漂洗约5秒。在挤出所述样品中过量的水之后，所述织物样品由至少两个职业人士评级(rate)。给出平均值。方法和标准的标度可自Verband TEGEWA，Karlstrasse 21，Frankfurt a.M.，Germany获的。

金属离子的检测

样品上Fe和Mn的浓度通过Inductively Coupled Plasma Atomic EmissionSpectroscopy(电感耦合等离子体-原子发射光谱法)(ICP-AES)(PerkinElmer，USA)来确定。结果为4次测定的平均值。

实施例1：产生从Subulispora菌株克隆的本发明的α-淀粉酶

材料和方法

材料：

聚合酶链式反应(PCR)的寡核苷酸引物由Shanghai Sangon BiologicalEngineering&Technology and Service Co.Ltd定制。RNeasy Mini Kit和DNeasyPlant Mini Kit购自Qiagen Company。pGEM-T Vector System I和Wizard PlusMinipreps DNA Purification System购自Promega公司。3’Rapid Amplifiction ofcDNA End System，Platinum Taq HIFI Taq DNA聚合酶和大肠杆菌DH10B感受态细胞购自Invitrogen Company。DNA Walking SpeedUp Kit购自Seegene。DNA标记：100bp DNA阶梯(DNA ladder)购自New England Biolab。

真菌菌株：

Subulispora菌种自中国分离。

发酵和菌丝体收获：

使用在PDA平板上具有完全生长的真菌培养物的4-6个琼脂糖块状物来接种一个含FG4培养基(按重量计1.5％麦芽糖，3％大豆粉(soy meal)，0.5％细菌用蛋白胨(Bacto Peptone)，0.2％PLURONIC L61)的摇瓶，并以160rpm在室温温育96小时。菌丝体通过用微孔布(miracloth)过滤并挤干来收获。将其迅速在液N₂中冷冻并储藏于-80℃。

基因克隆：

1.引物设计

基于已知淀粉酶序列的保守区设计了两个简并引物。

AmyD1：   5’-g(gc)n tac ca(tc)ggn tac tgg-3’(SEQ ID NO：3)

AmyD2.5R：5’-gtc gtg gtt ctc ga(tg)(ag)aa-3’(SEQ ID NO：4)

2.基因组DNA和总RNA制备物以及cDNA合成

通过使用DNeasy Plant Mini Kit提取基因组DNA。通过使用The RNeasyMini Kit分离总RNA。通过依照3’Rapid Amplifiction ofcDNAEnd System(3’RACE)的指示合成cDNA。

3.PCR扩增

3.1部分基因克隆

PCR通过使用AmyD1和AmyD2.5R作为引物对以及所述基因组DNA作为模板进行。具体步骤为：

10x PCR缓冲液     5μl

25mM MgCl₂        2μl

10mM dNTP         1μl

100uM AmyD1       1μl

100uMAmyD2.5R     1μl

基因组DNA         2μl

Taq Hifi          0.5μl

H2O               37.5μl

PCR程序：94℃2分钟；30循环的94℃40秒，50℃40秒和72℃1分钟，最终延伸在72℃10分钟。

从凝胶回收了～800碱基对的特异扩增物，并对其进行直接测序。确证其为淀粉酶。基于该部分序列，设计了新引物以供5’端克隆：

Amy-SPR15′-TGGAGGTCAAGTTGCTGTAGTC-3′(SEQ ID NO：5)

Amy-SPR25′-GCAACTGTAGACGATTCGGACTGTA-3′(SEQ ID NO：6)

3.25’端克隆

对于5’端克隆，用DNA Waking SpeedUp试剂盒进行DW-ACP(DNAWalking-Annealing Control Primer(DNA步移-退火控制引物))PCR。第一PCR用引物对Amy-SPR1与4DW-ACP引物：DW-ACP1、2、3、4(由DNAWaking SpeedUp试剂盒提供)分别进行。使用基因组DNA作为模板。

DW-ACP1：5’-ACP-AGGTC-3’

DW-ACP2：5’-ACP-TGGTC-3’

DW-ACP3：5’-ACP-GGGTC-3’

DW-ACP4：5’-ACP-CGGTC-3’

PCR程序为：1循环的94℃5分钟，42℃1分钟，72℃3分钟；35循环的94℃40秒，50℃40秒和72℃3分钟；最终延伸在72℃7分钟。

巢式PCR(nested PCR)用引物对Amy-SPR2和通用引物(5’-TCA CAGAAG TAT GCC AAG CGA-3’，由DNA Waking SpeedUp试剂盒提供)，以及用上面得到的100x稀释的第一PCR溶液作为模板。PCR程序为94℃3分钟，10循环的94℃40秒，65℃40秒(每循环降低1℃)和72℃1分钟；29循环的94℃40秒，55℃40秒和72℃1分钟；最终延伸在72℃10分钟。

通过用Amy-SPR2和通用引物作为引物对和第一PCR溶液(通过DW-ACP1和Amy3161SPR1得到)作为模板，从所述嵌套式PCR获得～800碱基对的特异性片段。其鉴定为淀粉酶的5’端。然后对于全长克隆设计5’端引物：

Amy-FLF2：5′-ATGCGGGCGAACGGCATTTTA-3′(SEQ ID NO：7)

3.3从cDNA的全长克隆

最后，通过PCR用Amy-FLF2和AUAP(由3’Rapid Amplifiction of cDNAEnd System提供)通过使用HIFI Taq DNA聚合酶克隆全长基因。详细步骤为：

10x PCR缓冲液    5μl

25mM MgCl₂       2μl

10mM dNTP        1μl

10uM Amy3161FLF2 1μl

10uM AUAP        1μl

第一链cDNA       2μl

Taq Hifi         0.5μl

H₂O              37.5μl

PCR程序为：94℃3分钟；10循环的94℃40秒，60℃40秒，其中每循环降低1℃，68℃2分钟；25循环的94℃40秒，50℃40秒，72℃2分钟；最终延伸在72℃10分钟。扩增了2kb的特异片段。其鉴定为淀粉酶。

将获得的PCR片段克隆入pGEM-T载体，并转化入大肠杆菌DH10B。阳性克隆通过测序确证，并在2007年9月19日作为DSMZ19686保藏于DSMZ(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(德意志微生物和细胞培养物保藏中心)，Mascheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig，Germany)。cDNA克隆的序列分析显示所述序列包含SEQ ID NO：1中1845个核苷酸的编码区。该基因推导的氨基酸序列与其推定的18个氨基酸的信号肽显示于SEQ ID NO：2。

实施例2：本发明α-淀粉酶的表达

使用保藏的菌株DSM19686中的质粒作为模板，Amy-IF_N-Bam和Amy-IF_C-Eco作为引物运行标准PCR反应：

Amy-IF_N-Bam：

ATTATTCGAAGGATCCACCATGCGGGCGAACGGCAT(SEQ ID NO：8)

Amy-IF_C-Eco：

GATGGTGATGGAATTCCGTCTGCCACGTGTCAGACACG(SEQ ID NO：9)

上面得到的PCR片段用BamHI和EcoRI消化，并连接至用相同限制性酶消化的表达质粒pLIZGaH中(图1)。所得的质粒命名为pLIZGaH-AMY。

将所述质粒使用标准技术(参照WO 2004/069872)转化入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(一种商业上可得到的酵母细胞)。就淀粉酶表达使用蓝色底物AZCL-HE-直链淀粉(Megazyme)通过微滴定平板测定法(microtiter plateassay)筛选所得的转化体。吸光度通过BioRad Microplate Reader(微板阅读器)在595nm处测定。对于检查纯化的淀粉酶纯度并确定其分子量，对酶试样施以Invitrogen SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。选取同时给出最高OD595和最强条带的转化体以供进一步发酵和后续的淀粉酶纯化。

实施例3：本发明α-淀粉酶的纯化

将来自实施例2的培养物上清的pH用NaOH调整为7.3，然后通过0.45um过滤器过滤。将溶液上样至用含0.3M NaCl，pH7.3的20mM Tris-HCl平衡的30ml Ni-Sepharose High Performance柱(GE Healthcare)上。用线性咪唑梯度(0-500mM)洗脱蛋白质。分析来自柱的级分的淀粉酶活性。

通过SDS-PAGE检查具有淀粉酶活性的级分，并汇集纯级分。SDS-PAGE显示分子量为约60kDa。

实施例4：本发明α-淀粉酶的表征

通过下述方法表征如在实施例中纯化的SEQ ID NO：2的α-淀粉酶：

确定α-淀粉酶活性

当根据本发明使用时，任何酸性α-淀粉酶的活性可以AFAU(AcidFungal Alpha-amylase Units)测定，其相对于酶标样确定。1AFAU定义为在下面提及的标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。

酸性α-淀粉酶(即，酸稳定的α-淀粉酶)，一种内切α-淀粉酶(1，4-α-葡聚糖-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)，在淀粉分子的内部区域中水解α-1，4-糖苷键形成不同链长的糊精和寡糖。与碘形成的颜色的强度与淀粉浓度成正比。α-淀粉酶活性使用反向比色法(reverse colorimetry)作为在特定分析条件下淀粉浓度的减少来确定。

反应条件：将10μl标样或酶试样，70ul H₂O，以及80μl淀粉工作溶液(终浓度为0.35g/L淀粉，50mM乙酸缓冲液，pH5.0，0.1M NaCl，3mM CaCl₃)混合，并在37℃振荡反应2分钟。添加40μl碘工作溶液(最终碘浓度为0.04g/L)并在37℃反应1分钟。读取OD590(在读数前，振荡10秒)。

FUNGAMYL^TM(可自Novozymes A/S获取)用作标样。本发明SEQ IDNO：2的α-淀粉酶活性为6264AFAU/g。

AZCL-HE-直链淀粉测定法

在反应前，将5微升酶试样和pH7的120微升1％AZCL-HE-直链淀粉((Megazyme International Ireland Ltd.)在微滴定板上混合，并置于冰上。所述测定法通过将所述微滴定板转移至Eppendorf热混合器来起始，所述热混合器设定为50℃的分析温度。然后将70微升上清转移至新微滴定板中。读取OD595作为淀粉酶活性的量度。所有的反应重复两次进行，并在该分析法中包括了缓冲液盲对照(blind)(代替酶)。

pH曲线(profile)

在反应前，将来自实施例3的5微升酶试样和120微升在用HCl或NaOH调整至pH值3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的B&R缓冲液(Britton-Robinson缓冲液：0.1M硼酸，0.1M乙酸，和0.1M磷酸)中的1％AZCL-HE-直链淀粉在微滴定板中混合，并置于冰上。所述测定法通过将所述微滴定板转移至Eppendorf热混合器来起始，所述热混合器设定为50℃的分析温度。然后将70微升上清转移至新微滴定板中。读取OD595作为淀粉酶活性的量度。所有的反应重复两次进行，并在该分析法中包括了缓冲液盲对照(代替酶)。

所述酶看来在pH 3-5的广泛pH范围内具有活性。最适pH为约4。

pH稳定性

将来自实施例3的30μl酶添加至270μl在pH 4的缓冲液(100mM乙酸钠)中，在40℃温育0、10、30、60和120分钟，在每个时间点移取50μl进行反应。在40℃将所述酶添加至在pH4.5的120μl含0.2％AZCL-HE-直链淀粉的缓冲液中20分钟，移取70μl进行OD595分析。添加20％乙醇以测试pH稳定性。

所述酶在酸性条件下看来是稳定的。甚至在pH 4，40℃温育30分钟后，其仍然具有约60％残余活性。

温度曲线

在pH 7将50μl酶添加至100μl缓冲液(100mM Tris-HCl)，并添加20μl2％AZCL-HE-直链淀粉，在20、30、40、50、60、70和80℃温育20分钟。然后将试样在冰中储藏10分钟。移取70μl上清进行OD595分析。

所述酶在20-50℃的宽广温度范围具有活性，并在看来具有约40℃的最适温度。

温度稳定性

将50μl在60℃温育0、5、10、30、60和120分钟，在每个时间点移取5μl并置于冰上。然后在40℃添加120μl pH4.5的0.2％AZCL-HE-直链淀粉20分钟，移取70μl进行OD595分析。然而，所述酶在该条件下并不稳定。

实施例5：生淀粉的同时糖化和发酵(SSF)

以如下条件在实验室进行酵母的再水化(rehydration)：向5.5g干酵母Ethanol Red^TM(可自Fermentis，Marcq-en-Barceul cedex，France获取)添加100ml自来水。随后将酵母溶液以100rpm搅拌，并在水浴中在37℃温育30分钟。酵母准备就绪待用于SSF的后续步骤。

生淀粉(粒状淀粉)同时糖化和发酵(SSF)测试通过微尺度发酵在厌氧条件下评估。将410g平均颗粒大小约0.5mm的磨碎的黄色马齿型玉米(dent corn)(可得自POET，SD，USA)添加至584g自来水中。向混合物补充6.0ml的1g/L青霉素和1g尿素。将浆料的pH调整至4.5。干固体(DS)水平确定为约35％w/w。将大约5g这种浆料添加至10ml试管。根据表1，将每个试管配以合适量的本发明的α-淀粉酶和葡糖淀粉酶(AMG)，然后每5g浆料添加约10微升酵母溶液。实际酶剂量基于每个试管中玉米浆料的准确重量。将试管在32℃温育。每种处理运行六次重复的发酵。在48小时和70小时将发酵试管用手涡旋振荡。在48小时和70小时时间点取三个试管用HPLC进行分析。

HPLC试样的准备由下述步骤构成：通过在各5g试样中添加50微升40％H₂SO₄立即停止反应，以3000rpm在室温离心5分钟，然后通过0.45微米滤器过滤。在分析前将试样储藏于4℃。将与RI检测器偶联的Agilent^TM 1100HPLC用于确定乙醇和糖的浓度。分离柱为来自BioRad^TM的AminexHPX-87H离子排阻柱(300mm x 7.8mm)。分析使用5mM H₂SO₄作为流动相以0.6/分钟的流速进行，并将分离柱保持在65℃，将RI检测器保持在55℃。

产生的乙醇量示于下面的表1。无论时间和葡糖淀粉酶如何，显然本发明中的α-淀粉酶提高(boost)了在SSF中来自生淀粉的乙醇得率。举例而言，在对来自磨碎的玉米的生淀粉进行70小时的SSF之后，当本发明的α-淀粉酶与瓣环栓菌AMG(AMG1)一同添加时，产生了约151.9g/l乙醇(即，19.25％v/v乙醇)，与之相比，未添加α-淀粉酶时仅得到118.3g/l乙醇。

表1：在一步生淀粉到乙醇的SSF方法中的乙醇得率

注释：AMG1^*为源自以WO2006/069289的SEQ ID NO：2公开的瓣环栓菌的葡糖淀粉酶

AMG2^**为源自黑曲霉(SWISSPROT P04064，Carlsberg Res.Commun.48：529-544(1983))的葡糖淀粉酶。

AMG3^***为源自以WO09928448的SEQ ID NO：7公开的埃默森踝节菌的葡糖淀粉酶。

α-淀粉酶是本发明SEQ ID NO：2的α-淀粉酶。

实施例6：轧卷冷堆同时脱浆和去矿化

材料：

织物

-428R针织棉(Test fabrics，Inc.)

化学品

-表面活性剂：Leophen M(BASF)

缓冲液

1.草酸缓冲液(pH 2.5)：将2.7g二水合草酸溶解于800ml去离子水。将pH用2N NaOH调整至2.50。用去离子水注至1L。

2.50mM乙酸(盐)缓冲液(pH5.0)：将2.87g乙酸钠和0.9g乙酸溶解于1L去离子水。

将来自Test Fabrics的428R针织棉织物(woven cotton fabric)切为15cm*25cm。将100ml pH2.5的草酸缓冲液添加入烧杯，添加Leophen M至浓度为1g/L。将本发明SEQ ID NO：2的α-淀粉酶储液添加于浸渍溶液至219AFAU/L，并混匀。将一片织物样品用镊子固定，并将所述样品蘸于浸渍浴中60秒，并用轧染机(padder)(Mathis Inc，U.S.A.)轧染。检查湿吸浆率(wetpick-up)达到100％。将所述样品置于两层塑料袋间，将空气挤压排除，并将袋子置于室温。18小时后，将试样从塑料袋中移除。用镊子固定样品，并将其蘸入90℃的水浴30秒，并用轧染器挤压。重复蘸-挤(dipping and squeezing)两次。将织物在冷的自来水中漂洗至少60秒，并用手将水挤除(squeeze off)。然后将所述织物风干，并测定织物上的TEGEWA和金属离子。对照试样通过遵循同样步骤，但是从浸渍溶液中去除淀粉酶来进行。结果在表2中给出。添加本发明SEQ ID NO：2的α-淀粉酶促进了淀粉的去除，其由TEGEWA评级的证实。在脱浆处理后，发现Fe和Mn的含量从13ppm和4.5ppm分别降至1.9ppm和1.4ppm。有报道高于10ppm的铁浓度对漂白是有害的。在酸性pH下脱浆能够在一个单独的步骤中去除淀粉浆料和重金属，由此改善了方法的效率，并极大地节约了水电费(utility)。

表2：在pH 2.5用α-淀粉酶对针织棉织物进行脱浆和去矿化

	TEGEWA	Fe，ppm	Mn，ppm
				未经处理的织物	1.0	13	4.5
经缓冲液处理的织物	1.0	1.9	1.4
				经酶处理的织物	2.8	无法检出	无法检出

实施例7：用α-淀粉酶进行浸轧-堆放回苏脱浆

将与实施例6相同的织物用于在60℃进行脱浆。将100ml pH5的乙酸缓冲液添加至烧杯中，添加Leophen M至浓度1g/L。将本发明SEQ ID NO：2的α-淀粉酶储液添加于浸渍溶液至219AFAU/L，并混匀。将样品用所述浸渍溶液轧染至100％湿吸浆率，然后在60℃温育4小时，并遵循与实施例6相同的方法进行漂洗。经酶处理的织物的4.5的TEGEWA评分清楚地表明淀粉的去除，而经缓冲液处理的织物的分数仅为1.0。

生物材料的保藏

依据布达佩斯条约的条款，下述的生物材料已经保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，DSM)，Mascheroder Weg 1B，D-38124Braunschweig，Gcrmany，并给予下述的登录号：

保藏物    登录号    保藏日期

大肠杆菌  DSM19686  2007年9月19日

所述菌株于下述条件下保藏：确保在本专利申请未决期间，由外国专利法律决定授权的人能够获得所述培养物。所述保藏物为所保藏菌株的基本上纯的培养物。在提交了题述申请的对应申请或其后续申请(progeny)的国家中，依据该外国专利法律的要求，可以获得所述保藏物。然而，应当理解，保藏物的可获得性并不构成对实施题述发明的许可，实施题述发明是对政府行为所授予的专利权的侵犯。

在本文中描述和要求保护的发明在范围上并不受本文公开的特定方面所限，这是因为这些方面的意图为说明本发明的数个方面。任何等价的方面应认为在本发明的范围内。事实上，除本文中显示和描述的那些之外，数种对本发明的修改从前述的描述而言对本领域技术人员将显而易见。上述修改亦意欲落入所附权利要求的范围内。在出现冲突的情况下，以包括定义在内的本公开为准。

Claims (19)

1.一种具有α-淀粉酶活性的分离的多肽，选自下组：

(a)一种多肽，其包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少90％，优选95％同一性的氨基酸序列；

(b)一种由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在至少中等严紧条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ IDNO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

(c)一种由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少90％，优选95％同一性的核苷酸序列；和

(d)一种变体，其包含取代、缺失和/或***一个或数个氨基酸的SEQ IDNO：2的成熟多肽。

2.权利要求1的多肽，包含SEQ ID NO：2的19-615位氨基酸的成熟多肽，或由SEQ ID NO：2的19-615位氨基酸的成熟多肽组成。

3.一种分离的多核苷酸，包含编码权利要求1或2的多肽的核苷酸序列。

4.一种核酸构建体，包含权利要求3的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个调控序列，所述调控序列在表达宿主中指导所述多肽的产生。

5.一种重组表达载体，包含权利要求4的核酸构建体。

6.一种重组宿主细胞，包含权利要求4的核酸构建体或权利要求5的载体。

7.一种产生权利要求1或2的多肽的方法，包括：

(a)在有益于所述多肽产生的条件下培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码所述多肽的核苷酸序列；和

(b)回收所述多肽。

8.权利要求1或2的多肽在淀粉液化和/或淀粉糖化中的用途。

9.一种糖化淀粉的方法，包括用权利要求1或2的多肽处理淀粉。

10.权利要求9的方法，还包括将淀粉转化为含有葡萄糖和/或麦芽糖的糖浆。

11.权利要求9或10的方法，其中所述淀粉是糊化的或粒状的淀粉。

12.权利要求9-11任一项所述的方法，其中将所述经糖化的淀粉与发酵生物相接触以产生发酵产物。

13.一种从含淀粉的材料通过发酵产生乙醇的方法，所述方法包括：

(a)用葡糖淀粉酶和权利要求1或2的多肽糖化所述淀粉；

(b)在发酵生物存在下发酵步骤(a)中得到的材料以产生乙醇；

(c)任选地，回收乙醇。

14.权利要求13的方法，其中所述淀粉是糊化的或粒状的淀粉。

15.权利要求14的方法，其中所述糖化和发酵作为同时糖化和发酵方法进行。

16.一种组合物，包括权利要求1或2的多肽和葡糖淀粉酶。

17.权利要求16的组合物，其中所述葡糖淀粉酶源自曲霉属菌种、大纹饰孢属菌种、踝节菌属菌种或栓菌属菌种的菌株。

18.一种在生产织物的过程中对含有淀粉或淀粉衍生物的经浆化的织物进行脱浆的方法，包括将所述经浆化的织物在具有1-5的pH的含水处理溶液中温育，所述溶液包含权利要求1或2的多肽。

19.权利要求18的方法，其中所述方法在5-90℃，特别是20-90℃的温度进行。

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