CN102023208B - 微珠分析方法和微珠分析器 - Google Patents

Abstract

本发明提供了微珠分析方法和微珠分析器。微珠被形成为柱体形状，其具有彼此面对且大致平行放置的顶表面和底表面、以及从顶表面和底表面延伸的侧表面，微珠承载有形成于顶表面和底表面中的至少一个表面上的识别图案以及固定在微珠的表面上的与分析物质具有亲和性的物质。微珠分析方法包括以下步骤：从包括顶表面和底表面中的没有形成识别图案的区域以及侧表面在内的区域检测由于分析物质和与分析物质具有亲和性的物质的相互作用而从微珠表面发射的荧光。

Description

微珠分析方法和微珠分析器

技术领域

本发明涉及微珠分析方法和微珠分析器。更具体而言，本发明涉及例如通过使用承载有形成于其上的图案的微珠进行的微珠分析，该图案用于各个微珠的图像识别。

背景技术

例如，颗粒载体(通常称作“微珠”)已经用于核苷酸和蛋白质的生化分析。例如，在核苷酸分析中，承载有探测核苷酸链(其具有与靶核苷酸链互补的碱基序列并且被固定在微珠表面上)的微珠用于在靶核苷酸链与探测核苷酸链的相互作用中离析靶核苷酸链。或者，在蛋白质分析中，类似的通过使用具有被固定在微珠表面上的相对于靶蛋白质的抗体的微珠来离析靶蛋白质。

如果预先用荧光物质来标记，则能够光学检测在微珠表面上所捕获和分离的靶核苷酸链或靶蛋白质。此外，测量微珠表面上的荧光强度使得能够定量测定所分离的靶物质。当靶物质是核苷酸链时，如果使用当结合于在靶核苷酸链和检测核苷酸链之间的相互作用中形成的混合链中时发射荧光的嵌入剂，则可以光学检测所分离的靶核苷酸链。

最近，使用上述微珠的生化分析需要在处理能力方面进一步提高，并且开发了各种技术以进一步提高分析的处理速度。

例如，日本专利No.3468750(在下文中，称为专利文献1)公开了“检测样本中的多种分析物的方法，其通过多种分析物的分析反应产物来识别多种分析物，该方法包括：a)使各种类型的荧光颗粒与样本接触，各个荧光颗粒具有不同的荧光信号和不同的分析反应产物，每个分析反应产物与样本中的一个分析物特定地键合，每个荧光颗粒具有至少一个在表面上标记有荧光染料的纳米颗粒；b)将样本加到标记试剂；c)通过检测标记来分析指示分析反应产物与分析物键合的荧光颗粒；同时，d)根据与各个荧光颗粒相关的不同荧光信号的功能，来确定与各个分析物键合的荧光颗粒”(参见其权利要求23)。

根据现有技术，在由Luminex公司提供的“悬浮阵列技术(Suspension Array Technology)”中，通过用在所发射的光的颜色方面有所改变的两种荧光着色剂标记微珠，能够识别多达100种微珠。通过在100种微珠上固定不同的探测核苷酸链或抗体，能够通过“悬浮阵列技术”在一次分析中同时分析100种不同的靶核苷酸链或靶蛋白质。

上述专利文献1还记载了“额外地通过微珠的尺寸和形状来限定荧光颗粒”(参见其权利要求25)，并且公开了能够使用微珠的尺寸和形状作为用于识别微珠的附加参数(例如，参见专利文献1第0037段等)。

相应的，在“Multifunctional encoded Particles for high-throughputbiomolecule analysis”(Science，2007，第315卷，第5817号，第1393-6页(在下文中，称作非专利文献1))中公开了形成使得能够对微珠进行图像识别的点编码的技术。通过上述技术能够制备许多种(多于1,000,000种)微珠。该文献记载了在通过在管道中通过光刻来制备微珠，该微珠承载有形成于微珠的椭圆表面的一半表面上的点代码和固定在另一半表面上的探测核苷酸链(参见非专利文献1的图1)。

发明内容

对于承载有诸如点编码之类的识别图案的微珠，在检测从与作为固定在微珠表面上的标记的靶物质键合或者与结合在靶物质中的嵌入剂键合的荧光物质发射的荧光的过程中，担心识别图案自身会发射荧光。在根据微珠表面上的荧光强度来测量靶物质的量的过程中，上述来自识别图案的荧光成为噪音荧光(导致测量误差的因素)。

此外，因为在各个微珠上形成图案形状不同的多种识别图案，所以每个微珠上所产生的噪音荧光的强度会根据图案形状的差别而发生变化。在这种情况下，需要在校正每个微珠上的噪音荧光的影响之后再计算靶物质的量，这导致分析速度降低。

非专利文献1中所公开的微珠具有两半分开的椭圆表面：用于形成点编码的区域和用于固定探测核苷链的区域。如果能够只从探测核苷链固定区域中检测荧光，则可以使用微珠来检测来自作为标记与靶核苷链键合的荧光物质的荧光，而不受来自识别图案的噪音荧光的影响。但是，该文献没有关于这种可能性的任何描述。

但是，为了制造这种具有分离地形成的点编码形成区域和探测核苷链固定区域的微珠，需要非常复杂的制备步骤。具体而言，需要执行如下步骤：将用于制备点编码形成区域的单体流和用于制备检测核苷链的流体在它们彼此接触的情况下在管道中进行馈送，并且用UV光照射用于点编码形成区域的单体流以进行光刻(参见非专利文献1中的图1)。将点编码形成区域与探测核苷链固定区域分开也引起了增大微珠的整体尺寸的问题。

因此，需要如下的的微珠分析方法：其高精度检测来自作为标记与靶物质键合的荧光物质等的荧光，不受来自识别图案的噪音荧光的影响，并且也不需要复杂的制备步骤。

根据本发明的实施例，提供了一种微珠分析方法，其用于被形成为柱体形状的微珠，所述微珠具有彼此面对且大致平行放置的顶表面和底表面、以及从所述顶表面和所述底表面延伸的侧表面，并且所述微珠承载有形成于所述顶表面和所述底表面中的至少一个表面上的识别图案、以及固定在所述微珠的表面上的与分析物质具有亲和性的物质，所述方法从包括所述顶表面和所述底表面中的没有形成识别图案的区域以及所述侧表面在内的区域检测由于所述分析物质和与所述分析物质具有亲和性的所述物质的相互作用而从所述微珠表面发射的荧光。

上述分析方法包括如下步骤：

(1)将所述微珠与所述分析物质混合；

(2)获得包括所述识别图案的所述微珠的透射图像，并且由所述透射图像检测所述识别图案；并且

(3)获得所述微珠的荧光图像，并且由所述荧光图像检测来自包括所述微珠的所述顶表面和所述底表面中的没有形成所述识别图案的区域以及轮廓区域在内的区域的所述荧光。

通过检测来自上述区域的荧光，能够检测排除从识别图案获得的噪音荧光的高强度荧光。

在上述微珠分析方法中，当将所述微珠放置在测量衬底上、并且所述微珠的所述顶表面和所述底表面中的一个表面与所述测量衬底的表面接触时，通过图像获取装置获得所述透射图像和所述荧光图像，所述图像获取装置安装在与所述测量衬底表面面对的位置。

当如上所述排列的微珠被保持在测量衬底上时，通过图像获取装置所获得的透射图像包括可靠的识别图案。

优选的，当将所述微珠放置在表面粗糙化的测量衬底的表面上时，或者当在液体中将所述微珠放置在所述测量衬底的表面上时，获得所述透射图像和所述荧光图像。

通过如上所述将微珠放置在测量衬底上，能够获得没有产生干涉条纹的透射图像和荧光图像。

此外，可以在拍摄所述微珠的所述顶表面和所述底表面中中的一个的图像时，获得所述透射图像，可以在拍摄所述微珠的所述侧表面的图像时，获得所述荧光图像。

根据本发明的另一实施例，还提供了一种微珠分析器，其用于分析微珠，所述微珠在其表面上承载有识别图案，所述微珠分析器包括：图像获取装置，其用于获得所述微珠的透射图像和荧光图像；用于由所述透射图像检测所述识别图案的装置；和用于在所述荧光图像中检测来自没有形成所述微珠的所述识别图案的区域的荧光的装置。

上述微珠分析器还包括：测量衬底，其用于放置所述微珠，其中所述测量衬底的表面和所述图像获取装置被放置为彼此面对，所述测量衬底是表面粗糙化的。

根据本发明的另一实施例，提供了一种微珠分析器，其用于分析被形成为柱体形状的微珠，所述微珠具有彼此面对且大致平行放置的顶表面和底表面、以及从所述顶表面和所述底表面延伸的侧表面，并且所述微珠承载有形成于所述顶表面和所述底表面中的至少一个表面上的识别图案。所述微珠分析器包括：用于透射图像的图像获取装置，其用于获得所述微珠的透射图像；和用于荧光图像的图像获取装置，其用于获得所述微珠的荧光图像。所述用于透射图像的图像获取装置获得所述微珠的所述顶表面和所述底表面中的一个表面的透射图像，所述用于荧光图像的图像获取装置获得所述微珠的所述侧表面的荧光图像。

上述微珠分析器可以包括管道。在这种情况下，所述用于透射图像的图像获取装置和所述用于荧光图像的图像获取装置获得在所述管道中流动的所述微珠的图像。

根据本发明的另一实施例，提供了一种微珠分析器，其用于分析微珠，所述微珠在其表面上承载有识别图案，所述微珠分析器包括：图像获取部分，其获得所述微珠的透射图像和荧光图像；第一部分，其由所述透射图像检测所述识别图案；和第二部分，其在所述荧光图像中检测来自没有形成所述微珠的所述识别图案的区域的荧光。

根据本发明的另一实施例，提供了一种微珠分析器，其用于分析被形成为柱体形状的微珠，所述微珠具有彼此面对且大致平行放置的顶表面和底表面、以及从所述顶表面和所述底表面延伸的侧表面，并且所述微珠承载有形成于其所述顶表面和所述底表面中的至少一个表面上的识别图案。所述微珠分析器包括：用于透射图像的图像获取部分，其获得所述微珠的透射图像；和用于荧光图像的图像获取部分，其获得所述微珠的荧光图像。所述用于透射图像的图像获取部分获得所述微珠的所述顶表面和所述底表面中的一个表面的透射图像，所述用于荧光图像的图像获取部分获得所述微珠的所述侧表面的荧光图像。

在本发明中，“识别图案”是形成于微珠上的特定形状，“识别图案”能够被诸如CCD相机和图像分析软件之类的通用图像识别装置所识别。识别图案是用于区别各个微珠的形状，并且具体形状、尺寸和其他特征不受具体限制。识别图案的典型示例包括所谓的点涂层、条形码等。

在本发明中，“分析物质”包括范围广泛的在使用微珠的生化分析中所分析的化合物，例如核酸、蛋白质和肽。例如，分析物质可以包括诸如类固醇激素和儿茶酚胺之类的体内小分子、诸如微粒体和线粒体之类的细胞内细胞器官、病毒、或者诸如微生物细胞或哺乳动物细胞之类的各种细胞等。

“与分析物质具有亲和性的物质”包括范围广泛的能够与分析物质发生相互作用、并且能与具有亲和性的分析物质键合的化合物，例如核酸、蛋白质、肽、糖链、以及各种合成化合物和天然化合物。

分析物质和与分析物质具有亲和性的物质的组合的示例包括“核酸-核酸”、“蛋白质(或肽)-蛋白质(包括抗体)”、“蛋白质(或肽)-核酸(适体)”和“蛋白质-糖链”。对于“核酸-核酸”的组合，“相互作用”是在具有相互互补的碱基序列的核酸之间形成双链。或者，对于“蛋白质-蛋白质”的组合，例如，“相互作用”是蛋白质-蛋白质键合，例如在受体蛋白质和配体蛋白质之间的键合或者在抗原蛋白质和抗体之间的键合。

糖链包括相互键合的单糖链以及用脂类或蛋白质修饰的单糖链，还包括寡糖、糖脂、和糖蛋白质等。核酸包括DNA和RNA，还有通过改变核糖区和磷酸主链区的结构所获得的核酸类似物(例如LNA(锁核酸)和PNA)等。

根据本发明的实施例，提供了高精度检测例如来自作为标记与靶物质键合的荧光物质的荧光的微珠分析方法，该方法不受来自识别图案的噪音荧光的影响，并且不需要复杂的制备步骤。

根据以下对于附图中所示的本发明最佳实施方式的详细描述，本发明的上述及其他目的、特征和优点将变得更加清楚。

附图说明

图1是用于说明在根据本发明的实施例的微珠分析方法中所使用的微珠的示例的示意图，其中图(A)是俯视图，图(B)是侧视图；

图2A至图2C是用于说明形成于微珠的编码区中的识别图案的示意图；

图3A至图3C是用于说明固定在微珠的表面上的探测物质的示意图；

图4A和图4B是说明承载有形成于其上的识别图案的微珠的透射图像和荧光图像的示例的照片(不是绘图)，其中图4A是透射图像，图4B是荧光图像；

图5是用于说明根据本发明的实施例的微珠分析器的示意性结构的示意图(第一示例)；

图6是用于说明根据本发明的实施例的微珠分析器中的测量衬底的结构的示意图；

图7是用于说明荧光检测装置进行荧光检测的区域的示意图；

图8是用于说明根据本发明的实施例的微珠分析器的示意性结构的示意图(第二示例)；并且

图9A和图9B是说明承载有形成于其上的识别图案的微珠的透射图像和荧光图像的其他示例的照片(不是绘图)，其中图9A是透射图像，图9B是荧光图像。

具体实施方式

在下文中，将参考附图描述本发明的实施例。下面所描述的实施例是本发明的典型实施方式，并且应当理解，本发明的范围并非由此限定。将按照下列顺序来描述本发明：

1.微珠

(1)识别图案

(2)探测物质

(3)产生微珠的方法

(i)膜形成步骤

(ii)成形步骤

(iii)分离步骤

(iv)探测物质固定步骤

2.微珠分析方法(第一示例)

(1)微珠分析方法概述

(2)微珠分析器(第一示例)

(3)微珠分析方法的具体过程

(i)反应过程

(ii)保持过程

(iii)检测过程

(a)检测识别图案

(b)检测荧光

3.微珠分析方法(第二示例)

(1)微珠分析器(第二示例)

(2)微珠分析方法的具体过程

(i)管道馈送过程

(ii)检测过程

(a)检测识别图案

(b)检测荧光

1.微珠

(1)识别图案

在根据本发明的实施例的微珠分析方法中，使用承载有形成于微珠上的识别图案和固定在微珠上的与分析物质具有亲和性的物质的微珠。图1示出了根据本发明的实施例在微珠分析方法中所使用的微珠的示例。图1的(A)是示意性俯视图，图1的(B)是示意性侧视图。

在图1中，微珠由附图标记1表示，并且被形成为柱体形状，该柱体形状具有彼此面对且大致平行放置的顶表面11和底表面12、以及从顶表面和底表面延伸的侧表面13。尽管下面将作为示例描述的微珠具有从上方观察均为圆形的顶表面11和底表面12，并且微珠1整体是圆柱形，但是用于本发明的实施例中的微珠在形状上可以是三角棱柱、四角棱柱或其他多角棱柱。但是，为了根据下面描述的方法形成包含识别图案的透射图像，需要将顶表面11和底表面12形成为柱体形状，使得顶表面和底表面彼此相对且大致平行地放置。

微珠1的厚度H和顶表面11(或底表面12)的直径D是任意确定的，但是优选的是，通过使得厚度H小于直径D而使整个微珠1形成为板状形状。

微珠1在顶表面11和底表面12中的至少一个表面上(图1中是顶表面11)具有编码区111，在编码区111上形成用于对各个微珠的图像识别的图案。顶表面11上除了编码区111之外的区域是没有形成识别图案的非编码区112。可以在底表面12上形成编码区111，或者可以在顶表面11和底表面12两者上都形成编码区111。

图2A至图2C是用于说明形成于微珠1的编码区111中的识别图案的示意性俯视图。这里，微珠1被解释为包括分别承载有不同的识别图案的1A、1B和1C这3种微珠的一组微珠。

从微珠的顶表面11穿透到底表面12的多个通孔2形成于图2A到2C中所示的各个微珠1A、1B和1C的编码区111中(参见图中的点状图案阴影圆圈)。在编码区111中可以在五行五列的矩阵中形成最多总共25个通孔2，这些通孔形成了用于识别微珠1的识别图案。对于微珠1A、1B或1C来说，根据在25个位置中形成有通孔2的位置来识别各个微珠1A、1B或1C。

具体来说，对于图2A中所示的微珠1A，在可能的25个位置中的9个位置上形成通孔2。在图中，形成通孔2的位置由点状图案阴影圆圈表示，而没有形成通孔的位置由带黑圈的白点表示。对于图2B中所示的微珠1B，同样在九个位置形成通孔2，但是图案的位置与微珠1A中的图案位置不同。因此，根据所形成的通孔2的位置，能够分别识别微珠1A和微珠1B。

或者，对于图2C中所示的微珠1C，在10个位置形成通孔。因此，根据所形成的通孔2的数量，能够使微珠1C区别于微珠1A或微珠1B。

编码区111中所形成的通孔2的数量在0到25的范围内是任意的，可以在从25个位置中所选出的任意位置处形成通孔。如上所述，通过任意改变通孔2的数量和位置，能够在微珠1的编码区111中形成不同的图案。因为通过图像识别装置来检测图案，所以能够识别高达2的25次幂种微珠。

上述识别图案只是示例。如果在用于本发明的实施例的微珠上所形成的识别图案是已知的图像识别装置可识别的图案，则该图案的形状和尺寸并不受特别限制。

(2)探测物质

将与分析物质具有亲和性的物质固定在微珠1的表面上。图3A至图3C是示出了固定在微珠1的表面上且与分析物质具有亲和性的物质的示意图。在下文中，分析物质将被称为“靶物质”，与分析物质具有亲和性的物质将被称为“探测物质”。

将由附图标记PA所表示的探测物质固定在图3A中所示的微珠1A的表面上。探测物质PA是与靶物质相适配的化合物，例如具有特定碱基序列的核酸、具有特定氨基酸序列的蛋白质或肽、或者糖链。将探测物质PA至少固定在包括编码区111和非编码区112在内的顶表面11上以及微珠1A的侧表面13上，另外还可以将探测物质固定在底表面12上。如果在底表面12上也形成了识别图案，则将探测物质PA固定在底表面12的编码区和非编码区两者上。

当靶物质是核酸时，探测物质PA是具有与靶核苷酸链的碱基序列互补的碱基序列的核苷酸链。通过与探测物质PA杂交(形成双链)，能够以此方式在微珠1A上捕捉和分离样本中的靶核苷酸链。这种情况下，如果探测物质PA具有与靶核苷酸链的碱基序列的至少一部分互补的碱基序列，并且探测物质PA在特定杂交反应条件下能够形成双链，则探测物质PA的碱基数量(长度)是任意的，并且碱基数量不受具体限制。通常，探测物质PA的碱基数量是几个到几打(dozen)个碱基，优选的是约10到30个碱基。

当靶物质是蛋白质时，探测物质PA是肽(例如，蛋白质配体的部分氨基酸序列)、抗体、或者能与靶蛋白质相互作用的物质(例如，受体蛋白质)。在靶蛋白质与探测物质PA的相互作用中，能够以此方式在微珠1A上捕捉和分离样本中的靶蛋白质。

另一方面，将由附图标记PB或PC所表示的探测物质分别固定在图3B或3C中所示的微珠1B或1C的表面上。探测物质PB或PC是与靶物质相适配的化合物，例如具有特定碱基序列的核酸、具有特定氨基酸序列的蛋白质或肽、或者糖链。同样对于微珠1B或1C，将探测物质至少固定在包括编码区111和非编码区112在内的顶表面11上以及侧表面13上。

固定在微珠1A的表面上的探测物质PA和固定在微珠1B和1C的表面上的探测物质PB和PC是与不同的靶物质具有亲和性的物质。因此，能够在微珠1A、1B和1C的表面上分别捕捉和分离不同的靶物质(TA、TB和TC)。在这种情况下，例如，探测物质PA、PB和PC是具有不同序列的核苷酸、蛋白质或者肽，或者是抗原性不同的抗体。

在探测物质PA、PB和PC分别与靶物质TA、TB和TC的相互作用中，保持有捕捉到的靶物质的微珠1A、1B和1C发射荧光。例如，荧光是从作为标记与靶物质键合的荧光物质或者从结合在探测物质和靶物质之间的嵌入剂发射的。根据本发明的实施例的微珠分析方法能够通过同时地检测荧光并通过使用图形识别装置识别形成于各个微珠上的识别图案，来同时分析多种靶物质。

(3)产生微珠的方法

例如，可以按照下列步骤制备根据本发明的实施例的微珠分析方法中所使用的微珠。

(i)膜形成步骤

首先，在衬底上形成薄膜(用于微珠的材料)。例如，供使用的衬底是玻璃衬底或硅衬底。用于衬底的材料不受具体限制，可以使用光刻技术中通常所使用的适当选择的材料。

在衬底上形成聚合物、二氧化硅或金属(铝、铬、金、银等)的薄膜。根据薄膜的材料厚度，可以通过已知的方法形成薄膜，例如使用旋转涂布机或狭缝涂布机的涂覆、或通过喷涂、或通过气相沉积(例如物理气相沉积(PVD)或化学气相沉积(CVD))。根据形成的微珠的所需厚度(在图1中，参见附图标记H)来适当选择薄膜的厚度。

可以优选使用诸如环氧基抗蚀剂(例如SU-8)、聚酰亚胺基抗蚀剂、丙烯酸抗蚀剂、或酚醛基抗蚀剂之类的光刻抗蚀剂作为薄膜材料。通过使用聚合物光刻抗蚀剂薄膜，能够以比二氧化硅薄膜和金属薄膜更低的成本制备微珠，并且获得具有更低比重的微珠。将微珠与包含靶物质的样本混合，并在分析过程中分散在液相中。如果微珠的比重较大，则难以在液相中长时间保持分散状态稳定。

使用SU-8作为聚合物是特别有利的。SU-8是化学放大型环氧基负型光刻抗蚀剂。SU-8是美国IBM研发的作为用于通过组合利用超薄抗蚀剂膜形成技术和光刻技术来形成精细结构的材料。

通过旋转涂布进行膜的形成，可以轻松调整SU-8膜的厚度。此外，SU-8高度透光，并且对各种溶剂、酸和碱以及热具有较高程度的耐受性。因此，通过使用SU-8能够很容易的制备具有各种厚度的微珠。还能够在制备微珠和使用微珠进行分析的步骤中获得稳定的性能。

(ii)成形步骤

随后，通过光刻使所形成的薄膜成形为特定形状。当使用诸如SU-8的抗蚀剂作为微珠材料时，根据需要来加热薄膜以用于固化(预烘焙)。然后通过具有微珠的完整形状和绘制在其上的识别图案的光掩模(在下文中，被简称为“掩模”)使膜曝光。光照射过的衬底被浸入显影液，以去除不需要的区域中的薄膜。再用冲洗液(异丙醇：IPA)冲洗衬底，以完全去除不需要的区域。然后，进行衬底的后烘培，使薄膜上产生的微珠形状保持在衬底上。

然后，通过根据所制备的微珠识别图案的所需形状来设计掩模的形状，能够形成在衬底上具有任意识别图案形状的微珠。通过使用无掩模曝光机可以实现光照射。

如果使用二氧化硅或金属作为微珠材料，则将通常使用的抗蚀剂旋转涂布在薄膜的表面上，并根据需要预烘焙衬底。然后通过与上述相似的掩模使衬底曝光。将曝光的衬底浸入显影液，以去除不需要的区域中的抗蚀剂。再用冲洗液(主要是超纯水)数次冲洗衬底，以去除不需要的区域，并且后烘焙衬底。在通过蚀刻对薄膜进行图案化之后，完全去除抗蚀剂。这样，在衬底上剩余的薄膜上出现微珠形状。

(iii)分离步骤

将成形之后的薄膜从衬底分离。例如，可以通过将衬底浸入碱性或酸性分离溶液，来分离薄膜。或者，可以通过同时进行超声处理和浸没，来加速分离。

分离的微珠具有从薄膜获得的柱体形状，其具有彼此面对且大致平行排列的两个表面。通过调整所形成的膜的厚度，可以任意选择彼此面对且大致平行排列的两个表面之间的距离(即，微珠厚度(参见图1中的附图标记H))。

(iv)探测物质固定步骤

随后，使分离薄膜之后获得的微珠的表面经过官能团修饰，以用于固定探测物质。

例如，修饰的官能团可以是羟基、氨基、羧基、异硫氰酸酯基、环氧基、或顺丁烯二酰亚胺基。在通常的制造DNA和蛋白质芯片中，已经实行官能团修饰来引入连接体，以在衬底表面上固定核苷酸链或肽。在本发明中也可以使用类似的方法。

将作为具体示例来描述用羟基修饰微珠表面。在这种情况下，首先使微珠表面经过氨丙基三乙氧基硅烷处理，可以使微珠修饰，然后将微珠浸入溶有γ-戊内酯的二甲基甲酰胺(DMF)中，以发生反应。或者，通过在使微珠表面经过缩水甘油氧基丙基甲氧基硅烷处理之后，将微珠浸入四甘醇和加入少量浓硫酸的液体混合物中，以发生反应，可以进行修饰。

最后，将探测物质固定在官能团修饰的微珠表面上。例如，当固定核酸或肽作为探测物质时，随着将核苷酸或氨基酸溶液(在下文中，统称为“单体溶液”)逐滴加到微珠表面上，通过逐步合成(step synthesis)可以将探测物质固定在微珠上。

根据所需的核苷酸或氨基酸序列，通过重复地进行将含有相应的基团或氨基酸的单体溶液相继地逐滴加入以在薄膜的将要成为微珠区域的一部分上发生键合反应的合成循环，可以执行核酸或肽的逐步合成。

例如，当固定核酸时，首先通过吸管逐滴加入含有核苷的单体溶液，然后，使5-乙硫基四氮唑溶液通过逐滴加入而发生反应。在冲洗和干燥之后，通过逐滴加入氧化溶液并与氧化溶液反应，使核苷亚磷酸三酯转变成核苷磷酸三酯。冲洗之后，逐滴加入混合乙酸酐/四氢呋喃溶液，以发生反应，将通过官能团修饰所引入的未反应的羟基封端(be capped)。在冲洗和干燥之后，逐滴加入含有二氯乙酸的二氯甲烷溶液，以从微珠连接的核苷5′-羟基中去除双甲氧基三苯甲基保护基。在冲洗和干燥之后，重复(a)核苷键合、(b)冲洗、(c)氧化、(d)冲洗和(e)去除双甲氧基三苯甲基保护基和(f)冲洗的步骤，最后，使核酸基脱保护。以此方式能够固定具有所需碱基序列的核酸。

或者，例如，当固定肽时，通过重复以下步骤来制备肽：在微珠上通过逐滴加入含有使α-氨基和侧链官能团通过缩合而受到适当保护的氨基酸的单体溶液来进行缩合，并最终去除所得到的受保护的肽上的各种保护基。以此方式能够固定具有所需氨基酸序列的肽。

通过在微珠上逐滴加入含有预先制备的核酸或肽的溶液，在所引入的官能团与预先制备的核酸或肽的反应中，可以实现核酸或肽的固定。

通过用吸管或微量分注器点注溶液或者通过喷墨点注，可以实现逐滴加入单体溶液或预先制备的核酸或肽溶液。可以在探测物质固定步骤之后执行上述分离步骤。在这种情况下，在将探测物质固定在成形步骤中形成于衬底上的微珠形成区域中的薄膜的表面上之后，分离薄膜，以产生微珠。

2.微珠分析方法(第一示例)

(1)微珠分析方法概述

在根据本发明的实施例的微珠分析方法中，在上述微珠1的表面上形成识别图案，通过使用固定有探测物质的微珠来检测荧光和识别图案。这样，同时分析多种靶物质。

具体来说，例如，在通过使用微珠1完成单核苷酸多性态(SNP)分析的情况下，假设探测物质PA的碱基序列是与一个SNP相对应的碱基序列，并且探测物质PB和PC的碱基序列是分别与其他SNP相对应的碱基序列。将由微珠1A、1B和1C组成的一组微珠与荧光标记样本核酸混合，以与各个探测物质发生杂交反应。在反应之后，通过测量荧光强度并且检测各个微珠的表面上的识别图案，来确定样本核酸中所含的各个SNP的量。

可以通过使用每个都具有形成于表面上的识别图案和与微珠特定对应的固定探测物质的微珠，在分析中通过检测荧光和识别图案，以此方式能够同时分析多种靶物质。但是，上述***具有问题，即，在从作为标记而与靶物质键合的荧光物质和嵌入剂中检测荧光的过程中，识别图案自身会产生噪音荧光。

图4A和4B示出了承载有形成于其上的识别图案的微珠的透射图像和荧光图像的示例。图4A和图4B各自示出了在将承载有固定探测物质且用荧光物质直接加以标记的微珠1放置在样本支架上使得微珠分散之后从上方拍摄的图像。图4A是透射图像，而图4B是荧光图像。

在图4B所示的荧光图像中可以确认，形成于微珠1上的识别图案发射较强的荧光。注意，可靠地沿着微珠的轮廓(在下面详细描述)检测来自作为标记与探测物质键合的荧光物质的荧光。

在根据微珠表面上的荧光强度测量靶物质的量的过程中，由于识别图案而产生的荧光成为噪音荧光，即，测量误差因素。此外，在每个微珠上形成图案形状不同的识别图案(参见图2A至图2C中的微珠1A、1B和1C)，由于图案形状不同，所以在每个微珠上所产生的噪音荧光的强度可能存在不同。在这种情况下，需要在修正噪音荧光对各个微珠的影响之后再计算靶物质的量，这会导致分析速度降低。

在图4A中所示的透射图像中，可以确认产生了干涉条纹(牛顿环)。当两个元件(在这种情况下是微珠和样本支架)在互相贴到一起时在两者之间形成的间隙(空气层)的厚度等于或小于特定值时，产生上述干涉条纹。由此产生的干涉条纹使得图像识别装置很难在透射图像中检测识别图案，并且引起产生荧光图像的荧光强度的变化。

例如，为了检测来自作为标记与靶物质键合的荧光物质的荧光，同时为了防止由于识别图案而产生的噪音荧光和干涉条纹，根据本发明的实施例的微珠分析方法采用下列步骤。在下文中，以微珠1用作示例，将参考图5和图6来描述根据本发明的实施例的微珠分析方法中的具体步骤，图5和图6示出了在微珠分析方法中所使用的微珠分析器的示意结构的第一示例。

(2)微珠分析器(第一示例)

首先，将描述微珠分析器的示意结构。图5示出了为获取放置在测量衬底31上的微珠1的透射图像所用的光源32，和为获取荧光图像所用的光源33。例如，使用卤素灯或水银灯作为光源32，而例如使用半导体激光器作为光源33。通过透镜34将从光源32施加到微珠1上并且反射、透射的光收集到图像获取装置35中。同样，例如，通过透镜34，将通过来自光源33的激光照射而从例如作为标记与固定在微珠1上的靶物质键合的荧光物质发射的荧光收集到图像获取装置35中。图像获取装置35可以是诸如CCD或CMOS元件之类的面型图像传感器，图像获取装置35获得微珠1的透射图像和荧光图像，并且分别输出到图像识别装置36和荧光检测装置37。分析装置38显示出由图像识别装置36和荧光检测装置37所检测得到的识别图案和荧光强度输出的综合分析结果。尽管图5示出了独立安装的图像识别装置36、荧光检测装置37和分析装置38的结构，但是上述装置也可以例如与通用计算机、程序和显示器结合。

可以使测量衬底31的表面粗糙化，以防止产生干涉条纹(参见图6)。当在测量衬底31与其上支撑的微珠1之间存在厚度等于或小于特定值的间隙(空气层)时，将产生干涉条纹。测量衬底31的表面上形成的不规则结构311通过将微珠1保持在突部上并且维持凹部与微珠1之间的间隙不小于特定值，防止了干涉条纹。通过表面喷砂或在表面上采用防牛顿环膜，可以实现测量衬底31的表面粗糙化处理。例如，通过在衬底上涂布含有分散的无机颜料的涂料溶液以对一个或两个表面进行表面粗糙化所获得的膜可以用作防牛顿环膜。供使用的防牛顿环膜优选是在透光性方面优异的膜，其具有通过涂布含有分散在粘合剂中的玻璃珠或树脂颗粒所制备的不规则表面膜。

(3)微珠分析方法的具体过程

(i)反应过程

首先，将微珠1与含有靶物质的样本混合，使得固定在微珠表面上的探测物质与靶物质之间发生反应，以将靶物质捕捉在微珠表面上。

在用荧光物质标记靶物质之后，或者在荧光嵌入剂被结合在靶物质和探测物质之间的相互作用所形成的复合体中之后而存在荧光嵌入剂的情况下，混合微珠1和样本。

(ii)保持过程

然后，根据需要收集并冲洗微珠1，以去除除了微珠吸附的靶物质之外的物质(污染物)，然后，将微珠1以分散的方式放置在微珠分析器的测量衬底31上(参见图6)。

分散在测量衬底31上的微珠1被保持在测量衬底31上，微珠1以其彼此面对且大致平行放置的两个表面中的一个表面(顶表面11或底表面12)与测量衬底的表面接触的方式排列。通过在该方向上支撑微珠1，能够通过安装成面对测量衬底的图像获取装置35，来获得顶表面11和/或底表面12的编码区上所形成的识别图案的图像。

通过使微珠1的厚度H小于顶表面(或底表面12)的直径D，而使全部的微珠1更接近板状形状，能够将微珠1更可靠地排列在测量衬底31上。

(iii)检测过程

(a)检测识别图案

随后，将来自光源32和33的光施加到被保持在测量衬底31上的微珠1上，并通过图像获取装置35拍摄微珠1的透射图像和荧光图像。

如果微珠1被保持在测量衬底31上，则由于在保持过程中微珠1被排列成其顶表面11或底表面12与测量衬底的表面接触，所以在通过图像获取装置35获得的透射图像中更可靠地包含识别图案。还可以通过在测量衬底31的表面上形成不规则表面311，获得没有干涉条纹的透射图像和没有荧光强度变化的荧光图像。

将通过图像获取装置35所获得的透射图像输出至图像识别装置36。图像识别装置36在透射图像中检测识别图案，并将识别图案作为电子信号输出至分析装置38。可以通过通用图像分析程序或其修改程序来检测识别图案。

通过在液体中将微珠1放置在测量衬底31上的方法，也可以防止产生干涉条纹。当在测量衬底31和被保持在测量衬底31上的微珠1之间存在厚度等于或小于特定值的间隙(空气层)时，产生干涉条纹。因此，如果在液体中将微珠1放置在测量衬底的表面上，则没有在测量衬底31和微珠1之间形成空气层的可能性，因此防止了产生干涉条纹。

具体来说，将悬浮在液体中的微珠1逐滴加到测量衬底上，以将微珠放置在测量衬底上。如果担心逐滴加入的液体由于干燥而消失，可以根据需要再次逐滴加入液体，以将一直被放置在液体中的微珠放置在测量衬底31上。供使用的液体优选的是具有与微珠1具有相同的折射率的液体，并且优选的是反应过程中所使用的缓冲溶液或者具有更高盐浓度的缓冲溶液。

(b)检测荧光

将由图像获取装置35所获得的荧光图像输出到荧光检测装置37中。荧光检测装置37从荧光图像的预定区域中检测荧光，并将转换成电子信号的荧光强度输出至分析装置38。

图7示出了由荧光检测装置37进行检测的荧光检测区域(参见图中的附图标记L)。

如上所述，通过将微珠1布置成以其顶表面11或底表面12与测量衬底的表面接触的方式，微珠1被保持在测量衬底31上。因此，如图所示，通过安装成面对测量衬底表面的图像获取装置35所获得的荧光图像，是从顶表面11或底表面12的方向所拍摄的图像。

在上述荧光图像中，荧光检测装置37检测来自顶表面12或侧表面13中没有承载识别图案的区域的荧光。通过检测来自将形成识别图案的编码区111排除在外的区域中的荧光，能够在没有产生来自编码区111中的识别图案的噪音荧光的情况下检测荧光(参见图4B)。

在荧光图像中，荧光检测装置37还同时检测来自微珠1的轮廓区域的荧光。微珠1的轮廓区域通过聚集来自侧表面13的荧光而发射较强的荧光(参见图4B)。因此，通过同时地检测来自轮廓区域的荧光，能够提高S/N比并使向分析装置38输出的信号放大。

例如，以下面的方式确定用于由荧光检测装置37进行荧光检测的区域L。

首先，随着从荧光图像取出任意色彩序列或者通过由色彩信息进行重新计算，来将荧光图像计算为单色图像并二值化。然后通过使用特定亮度作为阈值，将荧光图像二值化为0或1。随后，计算亮度从0变成1或者从1变成0的点，取得了边界(轮廓)。

然后，参考预先存储的编码区111的尺寸，识别边界中的区域中的非编码区112。并且，界定包括边界在内的轮廓区域，轮廓宽度W延伸到包括非编码区112但是不包括编码区111的区域的宽度，所得到的轮廓区域被界定为荧光检测区域L。

如果荧光检测区域L是不包括编码区111但是包括轮廓区域的区域，则荧光检测区域L不受特别限制，并且如图所示，荧光检测区域可以是包括全部轮廓区域和部分非编码区112的区域、包括全部轮廓区域和全部非编码区112的区域、或者包括部分轮廓区域和部分非编码区112的区域。不仅可以通过上述方法，还可以通过其他适合所使用的微珠的形状(多角棱柱，例如三角棱柱或四角棱柱)的方法来界定荧光检测区域L。

如上所述，在根据本发明的实施例的微珠分析方法中，通过检测来自微珠的非编码区和轮廓区域的荧光，能够检测不具有由编码区中形成的识别图案中所产生的噪音荧光的高强度荧光。因此，通过上述方法，能够在高灵敏度下分析靶物质，并且执行高精度的定量测定。

已经描述了从顶表面11或底表面12的方向上获得荧光图像的情况，但是本发明不限于此。

3.微珠分析方法(第二示例)

(1)微珠分析器(第二示例)

图8示出了用于本发明的实施例的微珠分析器的第二示例。与上述第一示例中的微珠分析器重相同的构件将用相同的附图标记说明。

在第二示例的微珠分析器中，尽管可以如图5和图6所示获得测量衬底31上的微珠1的图像，但是可以如图8所示获得管道61中的微珠1的图像。

管道61不受具体限制，但是优选使用由能够透射可见光和荧光的透明材料(例如，玻璃、石英或透明树脂)通过蚀刻形成的管道61、通过模制形成的管道61、或者透明材料管。管道61的结构和诸如将液体送入管道61的泵的装置不受具体限制，但是优选的是如下面所描述的在管道61中安装用于相对于光源和图像获取装置固定微珠1的方向的装置。

固定装置的示例包括以不允许微珠通过的间隔放置的多个柱子的柱状结构、具有比微珠的厚度H浅且比微珠宽一点的凹坑的凹坑结构、或者与所谓的流式细胞仪相似的结构，其中一个接一个将微珠馈送入管道61中，以排列微珠1。

将来自光源32和33的光施加到管道61中的微珠1上或者施加到测量衬底31上，通过图像获取装置65和66获得透射图像和荧光图像。图像获取装置65和66可以是诸如CCD或CMOS之类的面型图像传感器。与第一示例中的微珠分析器类似，通过透镜63和64收集的光优选用于图像获取。

可以分开安装用于获取透射图像的图像获取装置65和用于获取荧光图像的图像获取装置66。例如，用于透射图像的图像获取装置65面对微珠1的顶表面11或底表面12，图像获取装置65获取从顶表面11或底表面12反射的光，或者通过顶表面11或底表面12透射的光，因而从顶表面11或底表面12获得透射图像。或者，用于荧光图像的图像获取装置66面对微珠1的侧表面13，图像获取装置66获得从侧表面13发射的荧光，并从侧表面13获得荧光图像。

所安装的图像获取装置65和66的位置不受具体限制。例如，如果通过例如由镜面反射可以获得来自顶表面11或底表面12的透射图像和来自侧表面13的荧光图像，则用于透射图像的图像获取装置65可以安装在并不面对顶表面11也不面对底表面12的位置，用于荧光图像的图像获取装置66可以安装在并不面对侧表面13的位置。

将在下面通过使用在第二示例中的微珠分析器来描述分析方法的具体过程。

(2)微珠分析方法的具体过程(第二示例)

例如，通过与“2.微珠分析方法(第一示例)”中的“(1)反应过程”相似的方法将靶物质键合到微珠1，并且微珠1用于检测操作。

(i)管道馈送过程

将微珠1以悬浮在液体中的状态被馈送通过管道61，使得微珠1经过由图像获取装置65和66获得微珠1的图像的位置。虽然液体优选具有与微珠1相同的折射率，但是该液体优选是不改变靶物质的性质或不会分解靶物质且适合保持靶物质的液体，例如，在捕捉靶物质时所使用的缓冲溶液或者具有更盐浓度的缓冲溶液。此外，最好不要将诸如空气之类的气泡引入管道61中。

(ii)检测过程

(a)检测识别图案

将来自光源32和33的光施加在管道61中经过成像位置的微珠1上，通过图像获取装置65和66获得透射图像和荧光图像。如果用于透射图像的图像获取装置65直接或通过光学装置(例如透镜63或反射镜)面对形成识别图案的区域，则所获得的透射图像可靠地包括识别图案。

与第一示例中的微珠分析器的情况一样，将所获得的透射图像输出至图像识别装置36，分析装置38检测识别图案。

(b)检测荧光

用于荧光图像的图像获取装置66直接或通过光学装置(例如透镜64或反射镜)面对微珠1的侧表面13，但是并不面对顶表面11或底表面12。因为用于荧光的图像获取装置66并不面对承载有所形成的识别图案的表面，不检测来自识别图案的荧光，所以能够在没有噪音荧光的情况下检测荧光。

图9A和9B是从侧表面13拍摄的微珠1的荧光图像，图9A是用互补靶物质(完全匹配)获得的图像，而图9B是用非互补靶物质(失配)获得的图像。

因为在微珠1的轮廓区域(即，微珠1的侧表面)中收集来自荧光物质的荧光，并且该荧光是高强度发射的，所以如图9A和9B所示，来自侧表面13的荧光图像在完全匹配的情况和失配的情况之间存在明显不同。因此，通过从侧表面13拍摄荧光图像，能够提高S/N比，并增强从荧光检测装置37向分析装置38输出的信号。

为了高精度检测识别图案，最好使得用于透射图像的图像获取装置65的光轴垂直于顶表面11或底表面12，并从垂直于顶表面11或底表面12的方向获得透射图像，并且，为了提高S/N比，最好使得用于荧光图像的图像获取装置66的光轴垂直于侧表面13，并从垂直于侧表面13的方向获得荧光图像。例如，图像获取装置65或66的光轴是组成光接收单元的透镜的光轴。

如上所述，具有更高S/N比的根据本发明的实施例的微珠分析器和微珠分析方法能够以高灵敏度来评测荧光。此外，因为如果从微珠1的侧表面13获得荧光图像，则不需要在顶表面11或底表面12上形成非编码区112，所以能够减小微珠1的尺寸并提高处理能力(每单位时间的处理容量)。

根据本发明的实施例的微珠分析方法能够高精度地检测例如来自作为标记与靶物质键合的荧光物质的荧光，而不受来自识别图案的噪音荧光的影响，该微珠分析方法能够有助于进一步提高通过使用微珠进行的各种生化分析的处理能力和处理速度。

本申请包含与2009年9月15日递交于日本特许厅的日本在先专利申请JP 2009-213360和2010年6月30日递交于日本特许厅的日本在先专利申请JP 2010-148819中所公开内容相关的主题，上述申请的全部内容通过引用结合于此。

本领域技术人员应当理解，在所附权利要求书的范围或其等价范围内，可以根据设计需求和其他因素进行各种修改、组合、重组和变更。

Claims (4)

1.一种微珠分析方法，其用于被形成为柱体形状的微珠，所述微珠具有彼此面对且平行放置的顶表面和底表面、以及从所述顶表面和所述底表面延伸的侧表面，并且所述微珠承载有形成于所述顶表面和所述底表面中的至少一个表面上的识别图案、以及固定在所述微珠的表面上的与分析物质具有亲和性的物质，所述方法包括如下步骤：

从包括所述顶表面和所述底表面中的没有形成识别图案的区域以及所述侧表面在内的区域检测由于所述分析物质和与所述分析物质具有亲和性的所述物质的相互作用而从所述微珠表面发射的荧光，

其中，所述方法还包括下列步骤：

将所述微珠与所述分析物质混合；

获得包括所述识别图案的所述微珠的透射图像，并且由所述透射图像检测所述识别图案；并且

获得所述微珠的荧光图像，并且由所述荧光图像检测来自包括所述微珠的所述顶表面和所述底表面中的没有形成所述识别图案的区域以及轮廓区域在内的区域的所述荧光，

其中，当将所述微珠放置在表面粗糙化的测量衬底的表面上或者当在液体中将所述微珠放置在所述测量衬底的表面上、并且所述微珠的所述顶表面和所述底表面中的一个表面与所述测量衬底的表面接触时，通过图像获取装置获得所述透射图像和所述荧光图像，所述图像获取装置安装在与所述测量衬底表面面对的位置。

2.根据权利要求1所述的微珠分析方法，

其中，当拍摄所述微珠的所述顶表面和所述底表面中的一个的图像时，获得了所述透射图像，当拍摄所述微珠的所述侧表面的图像时，获得了所述荧光图像。

3.一种微珠分析器，其用于分析微珠，所述微珠在其表面上承载有识别图案，所述微珠分析器包括：图像获取装置，其用于获得所述微珠的透射图像和荧光图像；

用于由所述透射图像检测所述识别图案的装置；和

用于在所述荧光图像中检测来自没有形成所述微珠的所述识别图案的区域的荧光的装置。

4.根据权利要求3所述的微珠分析器，还包括

测量衬底，其用于放置所述微珠，

其中所述测量衬底的表面和所述图像获取装置被放置为彼此面对，所述测量衬底是表面粗糙化的。