CN102021127B - 一株副干酪乳杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)BBE10-215，已于2010年7月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2010169。该菌株具有较高的藻毒素清除效率，将该菌株用于保健食品领域，具有提高人体免疫力、协助营养消化等诸多方面的功效。

Description

一株副干酪乳杆菌及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一株副干酪乳杆菌及其应用方法。

背景技术

国际营养学界给“益生菌”的定义是：指一类有益人类健康的肠道生理细菌，还常被描述为“良性”或“健康”的细菌。它包括保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、双岐杆菌、嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌、发酵乳杆菌等细菌。应用于人体的益生菌产品有益生菌发酵的乳制品、肉制品、果蔬制品等，医药保健行业。乳酸菌是益生菌中的主要一类，具有抗肿瘤、缓解乳糖不耐症、增强免疫力、降低胆固醇、调整肠道菌群等生理作用。乳酸菌主要用于发酵肉制品、发酵水产品等发酵食品的生产中，抑制了腐败菌和致病菌的生长及毒素的产生，使发酵食品的保存期大大延长，有利于储藏和流通，食用安全性更好，营养成分更丰富。

微囊藻毒素(MCs)是由富营养化水体中的铜绿微囊藻、水华鱼腥藻、念珠藻等蓝藻产生的一种环状七肽物质。微囊藻毒素以动物肝脏为作用靶器官，能够特异性地抑制蛋白磷酸酶活性从而诱发癌症等一系列病变。由于毒性强、在食物链中波及范围广以及具有鲜明的地域特征，微囊藻毒素日益成为危害人类健康的重要杀手。目前，干预MCs的手段可分为物理防治、化学防治以及生物防治。其中，微生物处理法中部分益生菌对MCs的干预作用因其安全性(GRAS) 而成为真正能够实现在清除MCs过程中与水源、食品 “零距离”接触的生物防治剂。同时，由于益生菌定殖人体肠道后在抑制有害微生物生长、提高人体免疫力、协助消化和营养吸收等诸多方面发挥的长期功效，使得益生菌作为体内MCs“清道夫”的价值更加突出。

发明内容

本发明提供了一株副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei BBE10-215）。

本发明所提供的副干酪乳杆菌BBE10-215 (Lactobacillus paracasei)，已于2010年7月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2010169，分类学命名为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)；其16SrDNA如核苷酸序列表中SEQ ID NO:1所示，以其16SrDNA全序列为基础的***发育树如说明书附图1所示。

本发明提供了一种所述副干酪乳杆菌的应用，是将培养好的副干酪乳杆菌用于微囊藻毒素的清除。将培养好的副干酪乳杆菌调整菌浓的比例至适宜范围，接种至藻毒素溶液中，室温下静止培养或不定时搅拌使溶液混合均匀。

所述干酪乳杆菌为从泡菜、腊肠等传统发酵食品中筛选，其保藏条件如下：从生长良好的平板上取2-3环益生菌移入MRS培养基中，37℃静置培养20 h，取0.7 mL移入盛有0.3 mL无菌甘油的甘油管中，放-70℃冰箱保存。

所述MRS培养基为：葡萄糖20 g L^-1，蛋白胨10 g L^-1，牛肉膏10 g L^-1，酵母浸出汁5 g L^-1，无水乙酸钠5 g L^-1，磷酸二氢钾2 g L^-1，柠檬酸三铵2 g L^-1，MgSO₄·7H₂O 0.2 g L^-1，MnSO₄·H₂O 0.05 g L^-1，Tween-80 1 mL L^-1，pH 5.5。

所述干酪乳杆菌培养条件为：将甘油管保藏的益生菌接入MRS液体培养基，在37℃静置培养20 h至对数中后期，以2%接种量取-70℃甘油贮存液接种于MRS培养基中，37℃静置培养20 h。

在藻毒素浓度为1000μg L^-1的条件下， 10⁹ CFU mL^-1的菌体与之共培养24 h后，降解率高达到12%（图2）。在藻毒素浓度为100μg L^-1的条件下，菌浓为10⁹CFU mL^-1的菌体与之共培养24 h后，降解率最高达到76%。在藻毒素起始浓度为500μg L^-1的条件下，菌浓为10⁹ CFU mL^-1的菌体与之共培养24 h后，降解率最高达到39%。

微囊藻毒素的检测采用高效液相的方法：

色谱柱：Agilent  ZORBAX Eclipse XDB-C18 (4.6×150 mm, 5.0 μm) 

流动相：乙腈 ：H₂O (0.05% TFA) = 40：60 （v/v）

进样量：20 μl；流速：1 mL/min；柱温：40℃

检测器：DAD 238 nm；MCs 保留时间：3.48 min

本发明具有藻毒素清除效果好的特点，并且副干酪乳杆菌作为一种益生菌，特别适合应用于食品领域，使藻毒素得到快速、安全和高效地清除。

附图说明

图1：乳杆菌***发育树

具体实施方式

实施例1：副干酪乳杆菌筛选方法

从泡菜、腊肠等传统发酵食品中取一定样品加入到30 mL MRS培养基中富集培养，37℃培养20 h。将培养液梯度稀释，涂布于添加0.02%溴甲酚紫的MRS平板，37℃培养箱中培养48 h。挑取使溴甲酚紫变色圈明显的的单菌落。反复进行平板划线分离，重复三次得到纯化的单菌落，供下一步鉴定用。

鉴定主要通过：1)   菌落特征观察：用肉眼直接观察，挑选菌落直径在1~3 mm之间，圆形***，表面光滑或稍粗糙，乳白、灰白或暗黄色等符合乳酸菌菌落特征的菌株。2)   个体形态观察：用光学显微镜革兰氏染色观察。挑选革兰氏阳性、无芽孢菌株。将满足鉴定条件的菌株挑出甘油管保藏。

以2%接种量取 -70℃甘油贮存液接种于MRS培养基中，37℃静置培养。取37℃静置培养20 h（对数中后期）的发酵液，离心10 min（3200×g，4℃）收集菌体，再用磷酸盐缓冲液（pH 7.0）洗涤离心2次，调整菌浓在10⁹ CFU mL^-1左右。将获得的菌体重悬于含藻毒素（MC-LR）浓度为1000μg L^-1的磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中，置于37℃摇床（150 r min^-1）避光培养。培养24 h后取样，离心10 min（12000×g，4℃），取上清液用HPLC检测MC-LR残存浓度。

通过HPLC检测，筛选到一株具有较强MC-LR清除能力的菌株，通过16SrDNA序列分析（见核苷酸序列表中SEQ ID NO:1所示）可知该菌株为副干酪乳杆菌，于2010年7月7日保藏于菌种保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2010169。

实施例2：

MC-LR初始浓度为100 μg L^-1

以2%接种量取 -70℃甘油贮存液接种于MRS培养基中，37℃静置培养。取37℃静置培养20 h（对数中后期）的发酵液，离心10 min（3200×g，4℃）收集菌体，再用磷酸盐缓冲液（pH 7.0）洗涤离心2次，调整菌浓在10⁹CFU mL^-1左右。将获得的菌体重悬于含MC-LR浓度为100 μg L^-1的磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中，置于37℃摇床（150 r min^-1）避光培养。培养24 h后取样，离心10 min（12000×g，4℃），取上清液用HPLC检测MC-LR残存浓度。计算获得菌株对MC-LR的清除率为76%。

实施例3：

MC-LR初始浓度为500 μg L^-1

以2%接种量取 -70℃甘油贮存液接种于MRS培养基中，37℃静置培养。取37℃静置培养20 h（对数中后期）的发酵液，离心10 min（3200×g，4℃）收集菌体，再用磷酸盐缓冲液（pH 7.0）洗涤离心2次，调整菌浓在10⁹ CFU mL^-1左右。将获得的菌体重悬于含MC-LR浓度为500μg L^-1的磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中，置于37℃摇床（150 r min^-1）避光培养。培养24 h后取样，离心10 min（12000×g，4℃），取上清液用HPLC检测MC-LR残存浓度。计算获得菌株对MC-LR的清除率为39%。

实施例4：

MC-LR初始浓度为1000 μg L^-1

以2%接种量取 -70℃甘油贮存液接种于MRS培养基中，37℃静置培养。取37℃静置培养20 h（对数中后期）的发酵液，离心10 min（3200×g，4℃）收集菌体，再用磷酸盐缓冲液（pH 7.0）洗涤离心2次，调整菌浓在10⁹ CFU mL^-1左右。将获得的菌体重悬于含MC-LR浓度为1000μg L^-1的磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中，置于37℃摇床（150 r min^-1）避光培养。培养24 h后取样，离心10 min（12000×g，4℃），取上清液用HPLC检测MC-LR残存浓度。计算获得菌株对MC-LR的清除率为12%。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

核苷酸序列表

<110>  江南大学

<120>  一株副干酪乳杆菌及其应用

<160>  1     

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  1462

<212>  DNA

<213>  Lactobacillus paracasei BBE10-215

<400>  1

gtgctataca tgcagtcgaa cgagttctcg ttgatgatcg gtgcttgcac cgagattcaa      60

catggaacga gtggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgccctta agtgggggat     120

aacatttgga aacagatgct aataccgcat agatccaaga accgcatggt tcttggctga     180

aagatggcgt aagctatcgc ttttggatgg acccgcggcg tattagctag ttggtgaggt     240

aatggctcac caaggcgatg atacgtagcc gaactgagag gttgatcggc cacattggga     300

ctgagacacg gcccaaactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcca caatggacgc     360

aagtctgatg gagcaacgcc gcgtgagtga agaaggcttt cgggtcgtaa aactctgttg     420

ttggagaaga atggtcggca gagtaactgt tgtcggcgtg acggtatcca accagaaagc     480

cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tatccggatt     540

tattgggcgt aaagcgagcg caggcggttt tttaagtctg atgtgaaagc cctcggctta     600

accgaggaag cgcatcggaa actgggaaac ttgagtgcag aagaggacag tggaactcca     660

tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg cggctgtctg     720

gtctgtaact gacgctgagg ctcgaaagca tgggtagcga acaggattag ataccctggt     780

agtccatgcc gtaaacgatg aatgctaggt gttggagggt ttccgccctt cagtgccgca     840

gctaacgcat taagcattcc gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac tcaaaggaat     900

tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc     960

ttaccaggtc ttgacatctt ttgatcacct gagagatcag gtttcccctt cgggggcaaa    1020

atgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc    1080

aacgagcgca acccttatga ctagttgcca gcatttagtt gggcactcta gtaagactgc    1140

cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg    1200

gctacacacg tgctacaatg gatggtacaa cgagttgcga gaccgcgagg tcaagctaat    1260

ctcttaaagc cattctcagt tcggactgta ggctgcaact cgcctacacg aagtcggaat    1320

cgctagtaat cgcggatcag cacgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg    1380

cccgtcacac catgagagtt tgtaacaccc gaagccggtg gcgtaaccct ttagggagcg    1440

agccgtctaa gggacaaaag gt                                             1462

Claims (4)

1.一株副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）BBE10-215，保藏编号CCTCC NO：M 2010169。

2.一种培养权利要求1所述副干酪乳杆菌的方法，是在MRS培养基中静置培养副干酪乳杆菌。

3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于pH 为5.5；培养温度为37℃。

4.权利要求1所述副干酪乳杆菌的应用，是将培养好的副干酪乳杆菌用于清除水体中的微囊藻毒素。

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