CN102016002B - 对能够发酵混合底物的生物的选择 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及选择下述生物菌株的方法,所述生物菌株与所述生物的参照菌株相比能够经改进地消耗包含两种或更多种碳源的混合底物,所述方法包括:在存在两种或更多种碳源时培养所述生物的参照菌株的种群,其中所述种群在每种所述碳源上生长的世代数至少是在所述生物最优选的碳源上生长世代数的约50%;并且,选择得到的所述生物的菌株,从而选出与所述生物的参照菌株相比能够经改进地消耗包含两种或更多种碳源的混合底物的生物菌株。本发明还涉及使用这样的方法所选择的生物菌株。使用所述选择方法鉴定的生物的菌株可在使用混合底物的发酵方法中使用。
Description
发明领域
本发明涉及用于选择能够经改进地消耗混合底物的生物菌株的方法。本发明还涉及通过这类方法选择的生物菌株,以及通过所述选择方法鉴定的生物菌株在发酵方法中的用途。
发明背景
木质纤维素原料如玉米秆、废木料、甘蔗渣是巨大但是大多尚未开发的可再生碳源的例子。许多可再生原料中主要的聚合物是纤维素,所述纤维素在水解后产生葡萄糖。然而,取决于讨论的原料,当半纤维素和果胶被水解时释放其它六和五碳源(例如木糖和***糖)的大级分。这使得混合底物发酵成为必需。
混合的糖发酵比标准纯底物方法更加复杂。调节性事件,例如转运竞争或抑制、诱导、阻抑和分解代谢物失活,能够由于两阶段生长和滞后而提高发酵时间,并降低来自第二底物的产物产率。然而并且相反,大部分发酵研究着重于优化来自单一底物的产物形成。
因此需要开发下述方法,所述方法中可以优化来自多种底物的产物形成。加速同时或相继的混合底物利用并产生高产物产率的可能的发酵方法可包括:环境控制(例如pH、培养基组成、底物比例);在大规模发酵前预诱导;代谢诱导物的鉴定和进料;新颖的反应器构型,如两阶段进料分批方法(例如在低浓度诱导物上需氧生长并产生高细胞密度,之后是混合糖的受控进料用于产物形成);和使用特异性适应在混合底物上生长的微生物。
发明内容
本发明基于下述选择方法的开发,所述选择方法使得能够选出下述生 物菌株,其能够在混合底物(即包含两种或更多种碳源的底物)上高效生长,尤其是与参照菌株相比更高效地生长。所述方法可尤其被用于选择能够在这样的底物上经改进地生长的生物菌株,即显示经改进的/更快的这类底物消耗的菌株。也就是说,本发明可被用于选出下述经改进的生物菌株,所述菌株已经能够利用混合底物,但是仅以较低速率利用。
用于进行本发明选择方法的生物的起始菌株在本文中可以被称作例如“起始”菌株、“参照”菌株或“初始”菌株等等。
在所述方法中,针对在混合底物上的生长来选择或构建所述生物的起始(或参照)种群。然后对所述种群进行本发明的选择方法。进行所述选择方法,使得所述生物种群在混合底物中各种碳源上的生长世代数至少是所述生物种群在最优选的碳源上生长的世代数的约50%。
本文所述的选择方法允许鉴定下述酵母菌株,所述酵母菌株在包含葡萄糖、木糖和***糖的混合底物上生长时显示经改进的消耗。
因此根据本发明提供了用于选择下述生物菌株的方法,所述菌株能够在包含两种或更多种碳源的混合底物上比所述生物的参照菌株进行改进/更快的消耗,所述方法包括:
在存在两种或更多种碳源时培养所述生物的参照菌株的种群,其中所述种群在各种所述碳源上的生长世代数至少是在所述生物的参照菌株最优选的碳源上生长世代数的约50%;并
选择得到的所述生物的菌株,
从而选择与所述生物的参照菌株相比能够经改进地消耗包含两种或更多种碳源的混合底物的所述生物的菌株。
本发明还提供了:
-根据前述权利要求中任一项的方法鉴定的生物的菌株;
-能够有至少约0.4g h-1(g干重)-1***糖比消耗速率和至少约0.2gh-1(g干重)-1木糖比消耗速率的酵母菌株,如Saccharomyces cerevisiae菌株;
-能够发酵包含木糖和***糖、并任选地包含葡萄糖的底物,得到至少约0.4g g-1乙醇产率的酵母菌株,如Saccharomyces cerevisiae菌株;
-以登记号CBS 122701保藏于Centraalbureau voor Schimmelcultures的Saccharomyces cerevisiae菌株;
-用于生产发酵产物的方法,所述方法包括用上文所述生物的菌株发酵含有两种或更多种碳源的底物,从而所述细胞将所述碳源转化成所述发酵产物;
-用于生产发酵产物的方法,所述方法包括:
使用根据本发明的方法选择能够消耗包含两种或更多种碳源的混合底物的生物菌株;和
用所述生物菌株发酵用于选择所述生物菌株的、含有两种或更多种碳源的培养基,从而所述生物菌株将所述两种或更多种碳源发酵成所述发酵产物。
附图说明
图1展示了经改造的利用木糖和***糖的S.cerevisiae细胞的选择性恒化器(chemostat)培养期间,CO2生产模式和残余糖浓度。CO2生产模式(实线);木糖(■);***糖(●)。
图2展示了含有30g l-1葡萄糖、15g l-1 D-木糖和15g l-1 L-***糖的混合物的MY中,菌株IMS0003(A)、IMS0007(B)、SBR I(C)的100mL样品和菌株IMS0010(D)的厌氧分批培养。实线,CO2生产模式;葡萄糖(●);木糖(■);***糖(○)。
图3展示了SBR I装置的流程图示。通过用含有20g l-1葡萄糖或20gl-1木糖和20g l-1***糖任一的合成培养基手动或自动化代替约90%的培养基,起始分批培养的新循环。
图4展示了含有20g l-1木糖和20g l-1***糖的MY中重复分批培养(SBR I)的CO2生产模式(实线)。通过在两个时刻——第4批和第6批后用含20g l-1葡萄糖的MY填充反应器来中断所述排空-填充制度(见图4)。对所有批次而言,根据CO2生产(●)计算比生长速率。
图5展示了含20g l-1木糖和20g l-1的MY中SBR第I轮期间重复批次的重叠的CO2生产模式。第2批(灰色实线);第4、8、12批(虚线);第16批(黑色实线)。
图6展示了SBR II设定的流程图示。通过用含有20g l-1葡萄糖、20gl-1木糖和20g 1-1***糖,或20g l-1木糖和20g l-1***糖,或20g l-1***糖任一的合成培养基手动或自动化代替约90%的培养物,起始分批培养的新循环。
图7展示了含20g l-1葡萄糖、20g l-1木糖和20g l-1***糖,或20gl-1木糖和20g l-1***糖,或20g l-1***糖的MY中重复分批培养的单个循环的典型的CO2生产模式。
图8展示了含20g l-1葡萄糖、20g l-1木糖和20g l-1***糖(圆形),或20g l-1木糖和20g l-1***糖(方形),或20g l-1***糖(三角形)的MY中SBR II期间的比生长速率。
图9展示了含20g l-1葡萄糖、20g l-1木糖和20g l-1***糖(A),或20g l-1木糖和20g 1-1***糖(B),或20g l-1***糖(C)的MY中SBR第II轮期间重复批次的重叠的CO2生产模式。批次循环1(灰色实线);批次循环7(虚线);批次循环13(条纹线);批次循环20(黑色实线)。
图10展示了含30g l-1葡萄糖、15g l-1 D-木糖和15g l-1 L-***糖混合物的MY中菌株IMS0010的厌氧分批培养。实线,累积CO2生产;葡萄糖(●);木糖(■);***糖(○);乙醇(▲)。假设生产的乙醇量等于测量的CO2的累积生产减去由于生物量合成而发生的CO2生产和与乙酸形成相关的CO2。
发明详述
在本文件及其权利要求书中,动词“包含”及其连词以其非限制性含义使用,表示该词语之后的项目被包括在内,但是不排除未明确提到的项目。另外,不定冠词“一种”(″a″或″an″)涉及的元素不排除存在多于一种所述元素的可能性,除非上下文清楚地要求存在一种且仅一种所述元素。不定冠词“一种”因此通常表示“至少一种”。
本发明涉及选择能够消耗包含两种或更多种碳源的混合底物的生物菌株的方法。典型地,所述方法被用于鉴定下述生物菌株,所述菌株与应用 所述方法的生物的起始或参照菌株相比显示经改进的混合底物消耗。也就是说,所述方法可被用于改进生物的现存菌株在消耗混合底物能力方面的性能,例如选择在混合底物中显示更快碳源消耗的生物菌株。
典型地,所述方法被用于选择在混合底物上具有经改进的消耗的生物菌株,从而所述菌株显示经改进的发酵特征。因此,根据本发明选择的生物菌株可在所述发酵产物提高的生产力(例如以体积为基础)方面显示经改进的性能。另外或或者,使用本发明方法选择的生物菌株也可显示发酵产物产率的提高(与用于选择所述菌株的菌株相比)。
在本发明的方法中,在存在两种或更多种碳源时培养(也就是选择)生物种群。需要时,所述方法可以用三种、四种、五种或更多碳源进行。
典型地,各种碳源应当是衍生自碳水化合物(多糖)水解的产物,例如衍生自淀粉、纤维素、半纤维素、木质纤维素、果胶或含有这类碳水化合物的材料的水解产物。这类碳源包括寡糖、二糖和单糖。后两者在本文中被称作糖。
本发明中可使用的单糖包括:丙糖,例如醛丙糖如甘油醛,或酮丙糖如二羟基丙酮;丁糖,例如醛丁糖如赤藓糖或苏糖,或酮丁糖如赤藓酮糖;戊糖,例如醛戊糖如***糖、来苏糖、核糖或木糖,或酮戊糖如核酮糖或木酮糖;己糖,例如己醛糖如阿洛糖、阿卓糖、半乳糖、葡萄糖、古洛糖、艾杜糖、甘露糖或塔罗糖,或酮己糖如果糖、阿洛酮糖、山梨糖或塔格糖,或糖酸如半乳糖醛酸;庚糖,例如酮-庚糖如甘露庚酮糖或景天庚酮糖;辛糖,如辛酮糖(octolose)或2-酮-3-脱氧-甘露-辛酸酯/盐;或壬糖如唾液糖(sialose)。
可用于本发明中的二糖包括蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、龙胆二糖、异麦芽糖、曲二糖、昆布二糖、甘露二糖、蜜二糖、黑曲霉糖、芸香糖或木二糖。
本发明可优选地使用两种或更多种单糖的组合,例如两种、三种、四种、五种或更多单糖的组合进行。优选地,所述两种或更多种单糖应当均为己糖,或者是戊糖,或者是这两种单糖的组合。一种优选的糖组合是木糖和***糖的组合,或木糖、***糖和葡萄糖的组合。这些组合代表 了在木质纤维素原料的水解中被释放的主要糖。
生物种群在期望的碳源上的生长对所述种群施加选择压力。因此,可以选择在碳源上具有提高的最大比生长速率(μmax)的种群中的突变体。如果维持所述选择压力,例如通过将分批培养的培养物相继转移至新的批次来维持,则最终具有更高比生长速率的(突变体)细胞会生长远超具有更低比生长速率的所有其它细胞。
培养微生物的方法可例如在分批培养物中,作为具有恒定进料的进料分批发酵或连续发酵而进行。存在一种或多种单糖时的这些操作模式在下文中更详细描述:
在单一碳源(单糖)上的生长
分批培养物中的指数生长
本文中世代的定义是酵母生物量的倍增。生物量的倍增可以通过给定时间由以下等式给出的Cx(生物量浓度)来描述:
Cx(t)=Cx(0)*e(μ*t) (等式1)
可以通过代入Cx(t)=2*Cx(0),从所述等式衍生倍增时间(以小时为单位的Td)或传代时间(Tg小时)。
Td=LN(2)/μ (hr)(等式2)
其中μ=以gr生物量/gr生物量/hr或l/hr为单位的比生长速率。
可以通过多种手段测量生物量生长速率:可以使用任何以下方法或合适的替代性方法,通过测定每重量或体积单位培养物的细胞量来分析生物量的提高:
·浊度
·培养物的可见光谱(通常范围:600nm到700nm)光密度
·离心后的沉淀物体积
·在105℃下以恒定重量干燥后的干重含量
·每体积的细胞计数(使用显微镜)
·涂布在固体琼脂培养基上并在平板上从单个细胞生长成菌落后的菌落形成单位(CFU/ml)
或者可以从闭合反应器***中测量的代谢活性来衍生生物量的量,如:
·二氧化碳生产速率(CPR二氧化碳生产速率或CER二氧化碳发展速率,通常表述为mmol CO2/L/hr)
·氧消耗速率(OUR氧摄取速率mmol O2/L.hr)
·底物摄取速率(rs=以g/L.hr为单位的底物摄取速率,葡萄糖、木糖、***糖或铵的摄取速率)
在指数生长实验(无养分限制并且无有毒产物形成)中针对时间绘制Ln(Cx)或LN(CPR),LN(OUR)或LN(rs)时,获得了斜率为比生长速率μ的直线。根据μ和等式2,能够计算出倍增时间,根据生长时间能够计算出倍增量或世代数。
非指数生长
在非指数生长实验中,例如具有恒定进料的进料分批发酵或连续发酵中,通过计算测定世代数:
Mx=Cx*体积(以g/L为单位的生物量浓度*在gr生物量中生产的发酵液升数(等式3),
得到总CFU的gr干重中酵母生物量的总质量(=CFU/ml*产生的培养物的ml数,或OD*vol)。
Mx的两倍增加表示一代。
非指数生长的原则也适用于上述指数生长***。
在混合碳源上的生长
如上文所述针对单一碳源描述和计算世代数量的***也可以应用于混合底物,例如葡萄糖、木糖和***糖的混合物。然而,为了测定各种个体底物上的世代数,必须针对消耗的各种个体糖的总量校正生产的生物量总量的提高。因此在这些实验中,必须扣除对应于消耗的糖的生物量提高。在表2中给出以下述假设为基础的计算***:首先葡萄糖被消耗,其次是木糖,第三是葡萄糖,并且如图2b中所示当进化处于其初始阶段时对于更不发达的情况而言也是如此。
为了始终和精确计算给定底物上的世代数,可通过在生物量提高(dMX/dt=在所述时间间隔中生产的生物量干重的总量)和底物消耗(dMxyl=gr中消耗的木糖总量,dMara=gr中消耗的***糖总量,或dMgluc=gr中消耗的葡萄糖总量)之间制造平衡,来精确测量以非常高频率(例如每小时或每2小时)取样时每个进化实验中消耗的各种个体糖的量。然后应当通过木糖、***糖和葡萄糖的相对消耗,计算Mx的每次倍增时有助于各种个体糖的世代级分,
例如木糖上生物量(Mx)倍增的世代数=与总体糖消耗相比木糖的相对糖消耗,或dMxyl、dMgluc和dMara的总和=dS/dt,或与生物量特异性倍增相同的时间间隔中消耗的糖的总量。
dMxyl/((dMxyl+dMgluc+dMara)。藉此可以精确地测定分批实验中从一种底物到另一种底物的拐点,这在如本实验中所述的混合底物上的SBR设定中是相关的,但是例如在相同糖限制的重复进料分批或连续培养***中的混合糖浓度上的进化中,则并非如此相关。
在本发明的方法中,下述是关键的:生物种群在各种所述碳源上生长的世代数量是在所述生物最优选的碳源上生长世代数量的至少约50%,例如至少约60%,如至少约70%,至少约75%,至少约80%,至少约85%,至少约90%,至少约95%或至少50%,例如至少60%,如至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少100%,至少150%,至少200%,至少250%或至少300%。
也就是说,就各种个体碳源而言对种群施加的选择压力应当至少是就最优选的碳源而言对种群施加的选择压力的约一半。这会促进所有碳源利用的改进。
因此,在混合底物中各种和每种碳源上生长的世代数可以是发生最大数量世代的碳源上生长世代数的至少约50%,至少约60%,至少约70%,至少约75%,至少约80%,至少约85%,至少约90%,至少约95%或至少约98%。
在本发明的方法中,生长的最小世代数典型地发生在所述生物的初始种群最优选的碳源上。然后次最小的生长世代数可发生于次最优选的碳源 上,等等。因此,最大生长世代数会典型地发生在所述生物最不优选的碳源上。
可以进行本发明的方法,使得所述生物在各种碳源上的生长世代数大致相等。也就是说,关于各种和每种碳源,对生物种群施加大致相等的选择压力。
或者可以进行所述方法,使得生物种群在各种碳源上的生长世代数至少约等于在最优选的碳源上的生长世代数。
可以通过在各种或任何碳源中将种群培养更大的世代数,来提高关于各种或任何碳源对生物种群施加的选择压力。
本发明上下文中涉及生长世代数量时,术语“大致等于”或“约等于”等等被理解为表示存在发生最小生长世代数的碳源时,生长世代数至少是存在发生最大生长世代数的碳源时生长世代数的至少约90%,如至少约95%。
例如,在允许偏好木糖超过***糖的能够利用木糖和***糖的酵母菌株如Saccharomyces cerevisiae菌株的情况下,可以进行所述方法,使得在***糖上选择的世代数与木糖上的选择世代数大约相同或更多。
典型地,本发明的方法在相继消耗两种或更多种碳源中各种的生物上进行。
本发明的方法可以以任何合适的方式进行。然而,所述方法可使用相继分批反应器(SBR)方案便利地进行。在这样的方法中,可以将分批培养的培养物相继转移至新的批次。在这样的方法中,可以通过用新鲜培养基重复(例如自动化)代替培养物,在重复的批次中培养细胞。
典型地,用新鲜培养基代替至少约50%,至少约60%,至少约70%,至少约80%或至少约90%的培养物。
如果对生物种群进行这样的技术,其中用于补充培养物的培养基中总是存在所有碳源,则进行的选择会导致最优选或更优选的碳源上更大世代数的生长。
因此,在本发明的方法中,进行进一步的选择,使得额外的生长世代在最优选或更优选的碳源中发生。这确保较不优选的一种或多种碳源中生 长世代数是最优选的碳源中生长世代数的至少约50%。可进行该方案,使得较不优选的一种或多种碳源中的生长世代数至少约等于,或约等于最优选的碳源中的生长世代数。
例如,在两种碳源A和B(其中A比B更加优选)的情况下,可以在存在A和B时(所述选择期间种群在A上会比在B上生长更多世代)、之后在单独的B上进行初始选择(所述选择期间生物种群会在B上生长大量世代)。这使得B上的生长世代数大约匹配或超出A上的生长世代数。
使用三种碳源A、B和C(其中A比B更加优选)时,可以在存在A+B+C、之后B+C、之后C时进行选择。这使得在B和C上的生长世代数大约匹配或超过在A上的生长世代数。
本发明的方法可以在重复的选择循环中进行。因此,上述使用三种碳源的方法可以用多个选择循环、例如A+B+C之后B+C之后C的多个循环来进行。
本发明的方法可以使用从约5个到约50个或更多的上述选择循环、例如从约10个到约30个选择循环、如约20个选择循环来进行。
在本发明的方法中,生物可在各种碳源上经历从约10个到约200个或更多的生长世代,例如在各种碳源上经历至少约20、30、40、50、100、150或200个或更多的生长世代。如上所述使用多个选择循环时,各个循环中生物在各个碳源上的生长世代数可以至少约3、4、5、6、7、8、9或10个或更多。
所述方法典型地使用在大致等浓度的碳源上的选择来进行。也就是说,所有碳源的浓度在彼此的约20%,如约10%,例如约5%之内。
碳源浓度可从约10gl-1到约50gl-1或更多,例如约20gl-1。
本发明中的选择典型地应作为发酵方法进行。这样的发酵方法可以是需氧或厌氧的发酵方法。厌氧发酵方法在本文中被定义为在不存在氧时运行的发酵方法,或者其中基本不消耗氧,优选地消耗少于约5、约2.5或约1mmol/L/h,更优选地消耗0mmol/L/h(即氧消耗不可检出),并且其中有机分子发挥电子供体和电子受体两种用途。在不存在氧时,糖酵解和生物量形成中产生的NADH不能够被氧化磷酸化氧化。为了解决这一问 题,许多微生物使用丙酮酸或其衍生物之一作为电子和氢受体,从而再生NAD+。因此,在这样的方法中,丙酮酸被用作电子(和氢)受体。
或者,根据本发明的方法可以在氧受限的条件下进行。氧受限的条件在本文中可被定义为下述条件,其中溶解的氧浓度和/或氧可利用度过低而不能维持糖代谢的完全呼吸模式,因此导致使用丙酮酸作为额外的电子(和氢)受体。
本发明的方法原则上可以使用可培养的任何生物进行。因此,适用于在本发明方法中选择的生物可以是原核生物,例如细菌,或真核生物例如酵母或丝状真菌。本文中,术语“细胞”或“宿主细胞”可被用于表示适用于本发明方法中的生物。
酵母在本文中被定义为真核微生物,并且包括主要以单细胞形式生长的真菌亚门的所有物种(Alexopoulos,C.J.,1962,In:Introductory Mycology,John Wiley & Sons,Inc.,New York)。
酵母可以通过单细胞原植体(thallus)的出芽生长,或可通过生物的裂变生长。作为本发明细胞的一种优选的酵母可属于Saccharomyces、Kluyveromyces、Candida、Pichia、Schizosaccharomyces、Hansenula、Kloeckera、Schwanniomyces或Yarrowia属。优选地,酵母是能够厌氧发酵的酵母,更优选地是能够厌氧醇发酵的酵母。
丝状真菌在本文中被定义为下述真核微生物,其包括真菌亚门的所有丝状形式。这些真菌的特征是由甲壳质、纤维素和其它复合多糖组成的植物菌丝体。
适合用作本发明细胞的丝状真菌在形态学、生理和遗传上区别于酵母。可有利地使用丝状真菌细胞,因为大部分真菌不需要无菌条件来繁殖,并且对噬菌体感染敏感。丝状真菌的营养生长通过菌丝延长进行,并且大部分丝状真菌的碳代谢是专性需氧的。
适用于本发明方法的优选的丝状真菌可属于Aspergillus、Trichoderma、Humicola、Acremoniurra、Fusarium或Penicillium属。更优选地,丝状真菌细胞可以是Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Penicillium chrysogenum或Rhizopus oryzae细胞。
本发明可用于选择能够将生物量(例如植物生物量)发酵成想要的发酵产物(如乙醇)的生物。许多年来,建议引入多种生物用于从作物糖生产生物乙醇。然而在实践中,所有主要的生物乙醇生产方法继续使用Saccharomyces属的酵母作为乙醇生产者。这归因于Saccharomyces物种对工业方法而言的许多有吸引力的特征,即高度酸-、乙醇-和渗透-耐性,厌氧生长的能力,当然还有其较高的醇发酵能力。作为宿主细胞的优选的酵母物种包括S.cerevisiae、S.bulderi、S.barnetti、S.exiguus、S.uvarum、S.diastaticus、K.lactis、K.marxianus或K fragilis。
如上文所公开的,选择用于本发明方法的生物典型地是能够将碳源发酵成想要的产物的生物。
发酵产物可以是乙醇、丁醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、反丁烯二酸、衣康酸、氨基酸、1,3-丙二醇、乙烯、甘油、β-内酰胺抗生素或头孢菌素。
本发明还涉及根据本发明的方法鉴定的,或可根据本发明的方法鉴定的生物菌株。
典型地,所述方法可被用于改进生物的性能,例如其将碳源发酵成想要的产物的能力。
本发明可优先适用于能够表达下述核苷酸序列的真核细胞,所述核苷酸序列赋予细胞使用L-***糖和/或将L-***糖转化成L-核酮糖和/或木酮糖5-磷酸和/或转化成想要的发酵产物如乙醇的能力。这些类型的细胞详细描述于共同未决的国际专利申请PCT/NL2007/000246中。
这类细胞表达编码***糖异构酶的核苷酸序列(araA),编码L-核酮糖激酶的核苷酸序列(araB),和编码L-核酮糖-5-P-4-差向异构酶的核苷酸序列(araD)。
编码araA的核苷酸序列可以编码原核或真核araA,即具有与原核或真核生物中天然存在的araA相同的氨基酸序列的araA。在共同未决的国际专利申请PCT/NL2007/000246中描述了一种具体的araA,其与araB和araD共同表达时赋予宿主细胞使用***糖和/或将***糖转化成L-核酮糖和/或木酮糖5-磷酸和/或想要的发酵产物如乙醇的能力。这不如此之 多地取决于所述araA是真核还是原核起源。相反,这取决于araA的氨基酸序列与国际专利申请PCT/NL2007/000246的SEQ ID NO.1(其为Lactobacillus序列)中公开的特定序列的相关性。
编码araB的核苷酸序列可编码原核或真核araB,即其氨基酸序列与原核或真核生物中天然存在的araB的氨基酸序列相同的araB。在共同未决的国际专利申请PCT/NL2007/000246中描述了一种具体的araB,其与araA和araD共同表达时赋予宿主细胞使用***糖和/或将***糖转化为L-核酮糖和/或木酮糖5-磷酸和/或转化成想要的发酵产物的能力。这不如此之多地取决于所述araB是真核还是原核起源。相反,这取决于araB的氨基酸序列与共同未决的国际专利申请PCT/NL2007/000246的SEQ ID NO.3(其为Lactobacillus序列)中公开的特定序列的相关性。
编码araD的核苷酸序列可编码原核或真核araD,即其氨基酸序列与原核或真核生物中天然存在的araD的氨基酸序列相同的araD。在共同未决的国际专利申请PCT/NL2007/000246中描述了一种具体的araD,其与araA和araB共同表达时赋予宿主细胞使用***糖和/或将***糖转化为L-核酮糖和/或木酮糖5-磷酸和/或转化成想要的发酵产物的能力。这不如此之多地取决于所述araD是真核还是原核起源。相反,这取决于araD的氨基酸序列与共同未决的国际专利申请PCT/NL2007/000246的SEQ ID NO.5(其为Lactobacillus序列)中公开的特定序列的相关性。
密码子偏好指数表示与EP 1 499 708中所述的原核araA、araB和araD基因相比,Lactobacillus plantarum araA、araB和araD更有助于在酵母中表达。
L.plantarum是一种通常被视为安全(Generally Regarded As Safe,GRAS)的生物,其被食品注册机构认为是安全的。因此,一种优选的核苷酸序列编码下述araA、araB或araD,所述araA、araB或araD分别具有与如共同未决的国际专利申请PCT/NL2007/000246中所分别定义的序列SEQ ID NO:1、3或5相关的氨基酸序列。一种优选的核苷酸序列分别编码真菌araA、araB或araD(例如来自Basidiomycete),更优选地编码分别来自厌氧真菌(例如属于Neocallimastix、Caecomyces、Piromyces、 Orpinomyces或Ruminomyces.科的厌氧真菌)的araA、araB或araD。或者,一种优选的核苷酸序列分别编码细菌araA、araB或araD,优选地来自于***,更优选地来自于Lactobacillus属,最优选地来自于Lactobacillus plantarum种。优选地,araA、araB和araD核苷酸序列之一、二或三来源于Lactobacillus属,更优选地来源于Lactobacillus plantarum种。或者,在适用于本发明的细胞中表达的细菌araA可以是Bacillus subtilis araA,并且作为SEQ ID NO:9给出。SEQ ID NO:10代表编码SEQ ID NO:9的核苷酸序列。或者,在本发明细胞中表达的细菌araB和araD可以是如EP 1 499 708中公开的Escherichia coli(E.coli)的araB和araD,并且作为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13给出。SEQ ID NO:12代表编码SEQ ID NO:11的核苷酸序列。SEQ ID NO:14代表编码SEQ IDNO:13的核苷酸序列。
为了提高(细菌)araA、araB和araD酶分别以活性形式在真核宿主细胞如酵母中被表达的可能性,可以改造相应的编码核苷酸序列,以针对所选择的真核宿主细胞优化其密码子使用(Wiedemann and Boles Appl.Environ.Microbiol.2008;0:AEM.02395-07v1-印刷前的电子公开)。编码araA、araB和araD酶(或本发明的其它酶,见下文)的核苷酸序列对所选择的宿主细胞的密码子使用的适应性可以被表述为密码子适应指数(CAI)。密码子适应指数在本文中被定义为基因的密码子使用对于高度表达的基因密码子使用的相对适应性的度量。各个密码子的相对适应性(w)是各个密码子使用的比例与对相同氨基酸而言最大丰度的密码子使用的比例。CAI指数被定义为这些相对适应性值的几何均值。非同义密码子和终止密码子(取决于遗传代码)排除在外。CAI数值范围从0到1,更高的数值表示最大丰度密码子的比例更高(参阅Sharp and Li,1987,Nucleic Acids Research 15:1281-1295;还参阅:Jansen等,2003,Nucleic Acids Res. 31(8):2242-51)。经适应的核苷酸序列优选地具有至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6或0.7的CAI。
编码araA、araB和araD的核苷酸序列的表达赋予细胞使用L-***糖和/或将其转化为L-核酮糖和/或木酮糖5-磷酸的能力。不希望受任何理 论束缚,预期L-***糖被首先转化成L-核酮糖,所述L-核酮糖随后被转化成木酮糖5-磷酸,其为进入戊糖磷酸通路的主要分子。在本发明的上下文中,“使用L-***糖”优选地表示在至少20天期间,存在至少0.5%L-***糖时,在需氧或厌氧条件下培养的经转化细胞在660 nm处测量的光密度(OD660)从约0.5被提高至1.0或更多。更优选地,OD660从0.5被提高至1.5或更多。更优选地,在存在至少1%、至少1.5%、至少2%L-***糖时培养细胞。最优选地,在存在约2%L-***糖时培养细胞。
典型地,在至少20天期间,在存在L-***糖(与先前段中相同的优选的浓度)时,在需氧或厌氧条件下培养的细胞中使用合适测定法检测到可检出量的L-核酮糖时,细胞能够“将L-***糖转化成L-核酮糖”。优选地所述测定法是针对L-核酮糖的HPLC。
典型地,在至少20天期间,在存在L-***糖(与先前段中相同的优选的浓度)时,在需氧或厌氧条件下培养的细胞中使用合适测定法检测到至少2%的木酮糖5-磷酸提高时,细胞能够“将L-***糖转化成木酮糖5-磷酸”。优选地,针对木酮糖5-磷酸的基于HPLC的测定法描述于Zaldivar J.,et al((2002),Appl.Microbiol.Biotechnol.,59:436-442)中。该测定法简要描述于实验部分中。更优选地,所述提高至少为5%、10%、15%、20%、25%或更多。
如前文定义的编码araA、araB和araD的核苷酸序列的表达也可以赋予细胞在至少一个月直至一年期间,在存在L-***糖(与先前段中相同的优选的浓度)时,在需氧或厌氧条件下将L-***糖转化成想要的发酵产物的能力。更优选地,当使用合适的测定法检测到可检出量的想要的发酵产物和在与先前句中给出的条件下培养细胞时,细胞能够将L-***糖转化成想要的发酵产物。进一步更优选地,所述测定法是HPLC。进一步更优选地,所述发酵产物是乙醇。
用如上文所述分别编码araA、araB和araD酶的核苷酸序列转化的细胞优选地是能够主动或被动地将木糖转运进细胞并在细胞中进行木糖异构化的宿主细胞。所述细胞优选地能够进行主动糖酵解。所述细胞还可含有内源戊糖磷酸通路并可含有内源木酮糖激酶活性,从而从木糖异构化而来 的木酮糖也可以被代谢成丙酮酸。
所述细胞还优选地含有用于将丙酮酸转化成想要的发酵产物如乙醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、反丁烯二酸、衣康酸、氨基酸、1,3-丙二醇、乙烯、甘油、丁醇、β-内酰胺抗生素或头孢菌素。可以通过引入如WO2007/041269中公开的丁醇通路的一个或多个基因,使得细胞能够生产丁醇。
用包含如上文定义的编码araA、araB和araD酶的核苷酸序列的核酸构建体转化宿主细胞。这样的宿主细胞可用三种核酸构建体共转化,各种核酸构建体包含编码araA、araB或araD的核苷酸序列。包含araA、araB和/或araD编码序列的核酸构建体能够在宿主细胞中表达araA、araB和/或araD酶。为此可如例如WO 03/0624430中所述构建核酸构建体。宿主细胞可包含单个拷贝,但是优选地包含多个拷贝的各种核酸构建体。核酸构建体可作为附加体维持,并因此包含用于自主复制的序列如ARS序列。合适的附加体核酸构建体可例如基于酵母2μ或pKD1(Fleer等,1991,Biotechnology 9:968-975)质粒。然而,优选地各种核酸构建体以一个或多个拷贝被整合进宿主细胞的基因组中。进入宿主细胞基因组中的整合可通过异常重组而随机发生,但是优选地,如真菌分子遗传学领域所公知的,核酸构建体通过同源重组被整合进宿主细胞的基因组中(参阅例如WO90/14423、EP-A-0 481 008、EP-A-0 635 574和US 6,265,186)。
因此,适用于本发明选择方法中的细胞可包含含有araA、araB和/或araD编码序列的核酸构建体,并且能够表达araA、araB和/或araD基因产物。在一个进一步更优选的实施方案中,araA、araB和/或araD编码序各自与下述启动子可操作地连接,所述启动子引起相应核苷酸序列在细胞中的足量表达,从而赋予细胞使用L-***糖,和/或将L-***糖转化成L-核酮糖和/或木酮糖5-磷酸的能力。优选地,所述细胞是酵母细胞。因此,在另一方面中,本发明还包括如前文描述的核酸构建体。优选地,核酸构建体包含编码araA、araB和/或araD的核酸序列。编码araA、araB或araD的核酸序列均已在前文中定义。
进一步更优选地,相应核苷酸序列在细胞中的表达赋予所述细胞将L- ***糖转化成下文中定义的想要的发酵产物的能力。在一个进一步更优选的实施方案中,发酵产物是异常。进一步更优选地,细胞是酵母细胞。
在本文中使用时,术语“可操作地连接”是指多核苷酸元件(或编码序列或核酸序列)以功能性相互关系连接。当核酸序列被置于与另一核酸序列的功能性相互关系中时,所述核酸序列是“可操作地连接”的。例如,如果启动子或增强子影响编码序列的转录,则所述启动子或增强子与所述编码序列可操作地连接。可操作地连接表示被连接的核酸序列典型地是紧邻的,并且在需要时接合紧邻并且按照读码框的两个蛋白质编码区域。
在本文中使用时,“启动子”是指下述核酸片段,其发挥控制一个或多个基因转录的功能,相对于基因转录起点的转录方向而言位于上游,并且在结构上通过DNA-依赖性RNA聚合酶、转录起点和本领域技术人员已知的任何其它DNA序列的存在来识别,所述其它DNA序列包括但不限于转录因子接合位点、阻抑蛋白和活化蛋白接合位点,和本领域技术人员已知直接或间接发挥作用来调节所述启动子引起的转录量的任何其它核苷酸序列。“组成型”启动子是在大部分环境和发育条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调节下有活性的启动子。
能够用于实现编码araA、araB和/或araD的核苷酸序列表达的启动子对编码要表达的酶的核苷酸序列而言可以不是天然的,即对与之可操作地连接的核苷酸序列(编码序列)而言异源的启动子。尽管启动子优选地对与之连接的编码序列而言是异源的,但是也优选启动子对宿主细胞而言是同源的,即内源的。优选地,与对编码序列而言天然的启动子相比,(对核苷酸序列而言)异源的启动子能够生产更高稳态水平的包含编码序列的转录本(或者每个单位时间能够生产更多转录本分子,即mRNA分子),优选地在可获得***糖、或***糖和葡萄糖、或木糖和***糖、或木糖和***糖和葡萄糖作为碳源,更优选地作为主要碳源(即多于50%的可获得的碳源由***糖、或***糖和葡萄糖、或木糖和***糖、或木糖和***糖和葡萄糖组成),最优选地作为唯一碳源的条件下。该语境中的合适启动子包括组成型和诱导型天然启动子以及经改造的启动 子。用于本发明中的一种优选的启动子还对代谢产物(葡萄糖)阻抑不敏感和/或会优选地不需要***糖和/或木糖来诱导。
具有这些特征的启动子可以广泛获得并且是本领域技术人员已知的。这类启动子的合适例子包括例如来自糖酵解基因的启动子,如来自酵母或丝状真菌的果糖磷酸激酶(PFK)、丙糖磷酸异构酶(TPI)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD、TDH3或GAPDH)、丙酮酸激酶(PYK)、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子;关于这类启动子的更多细节可在(WO 93/03159)中找到。其它有用的启动子是核糖体蛋白编码基因的启动子,乳糖酶基因启动子(LAC4)、醇脱氢酶启动子(ADH1、ADH4等等)、烯醇化酶启动子(ENO)、葡萄糖-6-磷酸异构酶启动子(PGI1,Hauf等,2000)或己糖(葡萄糖)转运蛋白启动子(HXT7)或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(TDH3)。PGI1启动子的序列在SEQ ID NO:51中给出。HXT7启动子在SEQ ID NO:52中给出。TDH3启动子在SEQ ID NO:49中给出。其它(组成型以及诱导型)启动子和增强子或上游活化序列应当是本领域技术人员已知的。本发明宿主细胞中使用的启动子可以在需要时被修饰,来影响它们的控制特征。
本发明的一种优选的细胞是用L.plantarum的araA、araB和araD基因转化的真核细胞。更优选地,所述真核细胞是酵母细胞,进一步更优选地是用L.plantarum的araA、araB和araD基因转化的S.cerevisiae菌株。最优选地,所述细胞为CBS 120327或CBS 120328,二者均在2006年9月27日保藏于CBS Institute(荷兰)。
用于表示给定(重组)核酸或多肽分子和给定宿主生物或宿主细胞之间相互关系时,术语“同源的”被理解为表示天然情况下所述核酸或多肽分子即由相同物种的宿主细胞或生物生产,优选由相同品种或菌株的宿主细胞或生物生产。如果对宿主细胞是同源的,则编码多肽的核酸序列应典型地与除其天然环境中之外的另一启动子序列可操作地连接,或者可行时与另一分泌信号序列和/或终止子序列可操作地连接。用于表示两条核酸序列的相关性时,术语“同源的”表示一条单链核酸序列可与互补的单链核酸序列杂交。杂交程度可取决于大量因素,包括序列之间的同一性数量和杂交条件,如前文所述温度和盐浓度。优选地,同一性区域大于约5bp, 更优选地,同一性区域大于10bp。
关于核酸(DNA或RNA)或蛋白质使用时,术语“异源的”是指下述核酸或蛋白质,所述核酸或蛋白质不作为其出现的生物、细胞、基因组或DNA或RNA序列的一部分天然存在,或者存在于与其天然存在不同的细胞或基因组或DNA或RNA序列中的一个或多个位置中。异源核酸或蛋白质对引入它的细胞而言不是内源的,而是得自另一细胞或合成生产或重组生产的。通常(尽管并非必须),这类核酸编码不由转录或表达DNA的细胞天然生产的蛋白质。类似地,外源NRA编码通常不在存在所述外源DNA的细胞中正常表达的蛋白质。异源核酸和蛋白质也可以被称作外来核酸或蛋白质。会被本领域技术人员认为对表达它的细胞而言是异源或外来的任何核酸或蛋白质在本文中包括在术语“异源核酸或蛋白质”内。术语“异源的”还适用于核酸或氨基酸序列的非天然组合,即其中组合序列中至少两条对彼此而言是外来的组合。
适用于本发明选择方法的表达araA、araB和araD的细胞能够使用L-***糖和/或将其转化为L-核酮糖,和/或木酮糖5-磷酸和/或如前文定义的想要的发酵产物,并额外地显示使用木糖和/或将木糖转化为木酮糖的能力。木糖成为木酮糖的转化优选地是一步骤异构化步骤(直接将木糖异构化为木酮糖)。这种类型的细胞因此能够使用L-***糖以及木糖。“使用”木糖优选地具有与前文定义的“使用”L-***糖相同的含义。
对木糖异构酶(EC 5.3.1.5)、木酮糖激酶(EC 2.7.1.17)、核酮糖5-磷酸差向异构酶(5.1.3.1)、核酮糖5-磷酸异构酶(EC 5.3.1.6)、转酮酶(EC2.2.1.1)、转醛酶(EC 2.2.1.2)和醛糖还原酶(EC 1.1.1.21)而言,酶定义如WO06/009434中所使用。
优选地,适用于本发明选择方法的表达如前文定义的araA、araB和araD的细胞具有将木糖异构化为木酮糖的能力,如例如WO 03/0624430或WO 06/009434中所述。通过用包含编码木糖异构酶的核苷酸序列的核酸构建体转化宿主细胞,对宿主细胞赋予将木糖异构化为木酮糖的能力。经转化的宿主细胞将木糖异构化为木酮糖的能力是直接将木糖异构化为木酮糖。这被理解为表示木糖在木糖异构酶催化的单个反应中被异构化为木酮 糖,与分别由木糖还原酶和木糖醇脱氢酶催化的、木糖通过木糖醇中间产物成为木酮糖的两步转化相反。
核苷酸序列编码下述木糖异构酶,所述木糖异构酶优选地在本发明的经转化的宿主细胞中以活性形式被表达。因此,宿主细胞中核苷酸序列的表达生产下述木糖异构酶,其比活性在30℃下为每mg蛋白质至少约0.5U木糖异构酶活性,在30℃下每mg优选地至少约1、2、5、10、20、25、30、50、100、200、300或500 U。在经转化的宿主细胞中表达的木糖异构酶的比活性在本文中被定义为宿主细胞无细胞裂解物(例如无酵母细胞裂解物)的每mg蛋白质的木糖异构酶活性单位的量。木糖异构酶活性单位(U)在本文中被定义为在如Kuyper等(2003,FEMS Yeast Res.4,69-78)所述的条件下每分钟生产1nmol木酮糖的量。
优选地,编码木糖异构酶的核苷酸序列在宿主细胞中的表达产生下述木糖异构酶,其对木糖的Km小于50、40、30或25mM,更优选地,对木糖的Km约为20mM或更少。
编码木糖异构酶的核苷酸序列可编码原核或真核木糖异构酶,即其氨基酸序列与原核或真核生物中天然存在的木糖异构酶相同的木糖异构酶。本发明人发现具体木糖异构酶使真核宿主细胞能够将木糖异构化为木酮糖的能力不如此多地取决于所述异构酶是原核或是真核起源。相反,这取决于异构酶的氨基酸序列与Piromyces序列(共同未决的国际专利申请PCT/NL2007/000246中的SEQ ID NO.7)的相关性。令人惊讶的是,真核Piromyces异构酶对原核异构酶的相关性比对其它已知真核异构酶更高。因此,一种优选的核苷酸序列编码具有与上文定义的Piromyces序列相关的氨基酸序列的木糖异构酶。一种优选的核苷酸序列编码真菌木糖异构酶(例如来自Basidiomycete),更优选地编码来自厌氧真菌的木糖异构酶,例如来自属于Neocallimastix、Caecomyces、Piromyces、Orpinomyces或Ruminomyces科的厌氧真菌的木糖异构酶。或者,一种优选的核苷酸序列编码细菌木糖异构酶,优选地革兰氏阴性细菌,更优选地来自Bacteroides纲、或来自Bacteroides属,最优选地来自B.thetaiotaomicron(SEQ ID NO.15)。
为了提高木糖异构酶在真核宿主细胞如酵母中以活性形式被表达的可能性,可以改造编码木糖异构酶的核苷酸序列,以针对前文定义的真核宿主细胞优化其密码子使用。
适用于本发明选择方法并用上文所述编码木糖异构酶的核苷酸序列转化的宿主细胞优选地是能够主动或被动将木糖转运进入细胞中的宿主。所述宿主细胞优选地含有活性糖酵解。所述宿主细胞可还含有内源戊糖磷酸通路,并可含有内源木酮糖激酶活性,使得由木糖异构化而来的木酮糖可以被代谢成丙酮酸。宿主还优选地含有用于将丙酮酸转化成期望的发酵产物如乙醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、反丁烯二酸、氨基酸、1,3-丙二醇、乙烯、甘油、丁醇、β-内酰胺抗生素或头孢菌素的酶。一种优选的宿主细胞是天然能够进行醇发酵、优选地进行厌氧醇发酵的宿主细胞。宿主细胞还优选地具有对乙醇的高度耐性、对低pH的高度耐性(即能够在低于约5、约4、约3或约2.5的pH下生长)和对有机酸如乳酸、乙酸或甲酸和/或糖降解产物如糠醛和羟基-甲基糠醛的的高度耐性,和/或对提高的温度的高度耐性。宿主细胞的任何这些特征或活性可以天然存在于宿主细胞中,或可通过遗传修饰被引入或修饰。一种合适的细胞是真核微生物如例如真菌,然而,最适合作为宿主细胞的是酵母或丝状真菌。优选的酵母和丝状真菌已经在本文中定义。
在本文中使用时,表述“宿主细胞”具有与细胞相同的含义。术语“宿主细胞”和“细胞”可以与术语“生物”互换使用。
适用于本发明选择方法中的细胞优选地用包含编码木糖异构酶的核苷酸序列的核酸构建体转化。被优选地使用的核酸构建体与所使用的包含编码araA、araB或araD的核苷酸序列的核酸构建体相同。
如前文定义的适用于本发明选择方法中的,表达araA、araB和araD并且展示将木糖直接异构化为木酮糖的能力的细胞还可包含下述遗传修饰,所述遗传修饰提高戊糖磷酸通路的通量,如WO 06/009434中所述。具体地,遗传修饰导致戊糖磷酸通路非氧化性部分的通量提高。引起戊糖磷酸通路非氧化性部分通量提高的遗传修饰在本文中被理解为表示下述修饰,与除了引起通量提高的遗传修饰之外遗传上相同的菌株中的通量相 比,所述修饰至少将所述通量提高至1.1、1.2、1.5、2.5、5、10或20的倍数。戊糖磷酸通路非氧化部分的通量可以如下测量:在木糖作为唯一碳源时培养经修饰的宿主,测定木糖消耗的比速率,并在产生任何木糖醇时从木糖消耗的比速率中减去木糖醇生产的比速率。然而,戊糖磷酸通路非氧化部分的通量与木糖作为唯一碳源时的生长速率成比例,优选地与木糖作为唯一碳源时的厌氧生长速率成比例。木糖作为唯一碳源时的生长速率(μmax)和戊糖磷酸通路非氧化部分的通量之间存在线性相关。木糖消耗的比速率(Qs)等于生长速率(μ)除以在糖上的生物量产率(Yxs),因为在糖上的生物量产率是恒定的(在给定的一组条件下:厌氧、生长培养基、pH、菌株的遗传背景等;即Qs=μ/Yxs)。因此,戊糖磷酸通路非氧化部分通量的提高可能演绎自这些条件下最大生产速率的提高。在一个优选的实施方案中,所述细胞包含提高戊糖磷酸通路通量的遗传修饰。
可以通过多种方式在宿主细胞中引入提高戊糖磷酸通路通量的遗传修饰。这些方式包括例如,实现木酮糖激酶和/或非还原性部分戊糖磷酸通路的一种或多种酶的更高稳态活性水平,和/或非特异性醛糖还原酶活性的降低的稳态水平。稳态活性水平的这些改变可以通过(自发或化学或辐射诱导的)突变体的选择和/或编码酶的基因或调节这些基因的因子的重组DNA技术(例如通过过表达或失活)来实现。
在用于本发明选择方法中的一种更优选的细胞中,遗传修饰包括(非氧化部分)戊糖磷酸通路的至少一种酶的过表达。优选地,所述酶选自由编码核酮糖-5-磷酸异构酶、核酮糖5-磷酸差向异构酶、转酮酶和转醛酶的酶组成的组,如WO 06/009434中所述。
可以过表达(非氧化性部分)戊糖磷酸通路的酶的多种组合。例如可以被过表达的酶可以至少是酶5-磷酸核酮糖异构酶和5-磷酸核酮糖差向异构酶;或至少是酶5-磷酸核酮糖异构酶和转酮酶;或至少是酶5-磷酸核酮糖异构酶和转醛酶;或至少是酶5-磷酸核酮糖差向异构酶和转酮酶;或至少是酶核酮糖-5-磷酸差向异构酶和转醛酶;或至少是酶转酮酶和转醛酶;或至少是酶5-磷酸核酮糖差向异构酶、转酮酶和转醛酶;或至少是酶5-磷酸核酮糖异构酶、转酮酶和转醛酶;或至少是酶5-磷酸核酮糖异构酶、5- 磷酸核酮糖差向异构酶和转醛酶;或至少是酶5-磷酸核酮糖异构酶、5-磷酸核酮糖差向异构酶和转酮酶。在本发明的一个实施方案中,酶5-磷酸核酮糖异构酶、5-磷酸核酮糖差向异构酶、转酮酶和转醛酶的每一种都在宿主细胞中被过表达。更优选的是下述宿主细胞,其中遗传修饰至少包含酶转酮酶和转醛酶二者的过表达,因为这样的宿主细胞已经能够在木糖上厌氧生长。实际上,在一些条件下我们发现,仅过表达转酮酶和转醛酶的宿主细胞在木糖上已经具有与下述宿主细胞相同的厌氧生长速率,所述宿主细胞过表达所有四种酶,即5-磷酸核酮糖异构酶、5-磷酸核酮糖差向异构酶、转酮酶和转醛酶。另外,过表达酶5-磷酸核酮糖异构酶和核酮糖-5-磷酸差向异构酶二者的宿主细胞是超过下述宿主细胞而被优选的,所述宿主细胞仅过表达异构酶或仅过表达差向异构酶,因为这些酶中仅一种的过表达可产生代谢失衡。
本领域可获得多种用于在适用于本发明选择方法中的细胞中过表达酶的手段。具体地,可以通过提高宿主细胞中编码酶的基因的拷贝数(例如通过在宿主细胞的基因组中整合额外的基因拷贝,通过表达来自附加体多拷贝表达载体的基因,或通过引入包含多拷贝基因的附加体表达载体)来过表达酶。
或者,可以通过使用对编码要过表达的酶的序列而言不是天然的启动子(即对与之可操作地连接的编码序列而言为异源的启动子)来实现适用于本发明方法的宿主细胞中酶的过表达。就此目的而言合适的启动子已经在本文中定义。
用于酶的过表达的编码序列优选地对适用于本发明方法的宿主细胞而言是同源的。然而,可以类似地使用对适用于本发明方法的宿主细胞而言异源的编码序列,如WO 06/009434中所述。
用于在适用于本发明方法的宿主细胞中过表达核酮糖-5-磷酸异构酶的核苷酸序列是编码具有核酮糖-5-磷酸异构酶活性的多肽的核苷酸序列,其中优选地所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO.17至少具有50、60、70、80、90或95%的同一性,或其中所述核苷酸序列能够在中度条件下、优选地在严格条件下与SEQ ID NO.18的核苷酸序列杂交。
用于在适用于本发明方法的宿主细胞中过表达核酮糖-5-磷酸差向异构酶的核苷酸序列是编码具有核酮糖-5-磷酸差向异构酶活性的多肽的核苷酸序列,其中优选地所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO.19至少具有50、60、70、80、90或95%的同一性,或其中所述核苷酸序列能够在中度条件下、优选地在严格条件下与SEQ ID NO.20的核苷酸序列杂交。
用于在适用于本发明方法的宿主细胞中过表达转酮酶的核苷酸序列是编码具有转酮酶活性的多肽的核苷酸序列,其中优选地所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO.21具有至少50、60、70、80、90或95%的同一性,或其中所述核苷酸序列能够在中度条件下、优选地在严格条件下与SEQ ID NO.22的核苷酸序列杂交。
用于在适用于本发明方法的宿主细胞中过表达转醛酶的核苷酸序列是编码具有转醛酶活性的多肽的核苷酸序列,其中优选地所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO.23具有至少50、60、70、80、90或95%的同一性,或其中所述核苷酸序列能够在中度条件下、优选地在严格条件下与SEQ ID NO.24的核苷酸序列杂交。
涉及经遗传修饰的宿主细胞中酶的生产时,酶的过表达表示与相同条件下未经修饰的宿主细胞相比,所述酶以更高水平的酶比活性被生产。通常,这表示与相同条件下未经修饰的宿主细胞相比酶活性蛋白质(或在多亚基酶的情况下多种蛋白质)以更大量被生产,或者以更高的稳态水平被生产。类似地,这通常表示与相同条件下未经修饰的宿主细胞相比,编码酶活性蛋白质的mRNA以更大量被生产,或者也以更高的稳态水平被生产。因此,优选地使用本文所述的适当酶测定法,通过测量宿主细胞中的酶比活性水平,来测定酶的过表达。或者,可以例如使用酶的特异性抗体,通过量化酶蛋白质的比稳态水平,或者通过定量编码所述酶的mRNA的比稳态水平,来间接测定酶的过表达。后者可尤其适用于戊糖磷酸通路,对所述戊糖磷酸通路而言酶测定法不是容易可行的,因为所述酶的底物不可商业获得。优选地,在本发明的宿主细胞中,与除了引起过表达的遗传修饰之外在遗传上相同的菌株相比时,要过表达的酶被过表达至至少1.1、1.2、1.5、2、5、10或20的倍数。应当理解这些过表达水平可适用 于酶活性的稳态水平,酶蛋白质的稳态水平以及编码酶的转录本的稳态水平。
适用于本发明的选择方法,表达araA、araB和araD和展示将木糖直接异构化为木酮糖的能力,并且任选地包含提高如前文定义的戊糖通路通量的遗传修饰的细胞可还包含下述遗传修饰,所述遗传修饰提高特异性木酮糖激酶活性。优选地,所述遗传修饰例如通过编码木酮糖激酶的核苷酸序列的过表达来引起木酮糖激酶的过表达。编码木酮糖激酶的基因对宿主细胞而言可以是内源的,或者可以是对宿主细胞异源的木酮糖激酶。用于在适用于本发明方法的宿主细胞中过表达木酮糖激酶的核苷酸序列是编码具有木酮糖激酶活性的多肽的核苷酸序列,其中优选地所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO.25具有至少50、60、70、80、90或95%的同一性,或其中所述核苷酸序列能够在中度条件下,优选地在严格条件下与SEQ ID NO.26的核苷酸序列杂交。
一种尤其优选的木酮糖激酶是与WO 03/0624430中所述来自Piromyces的木酮糖激酶xylB相关的木酮糖激酶。用于在适用于本发明方法的宿主细胞中过表达木酮糖激酶的一种更优选的核苷酸序列是编码具有木酮糖激酶活性的多肽的核苷酸序列,其中优选地所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO.27具有至少45、50、55、60、65、70、80、90或95%的同一性,或其中所述核苷酸序列能够在中度条件下,优选地在严格条件下与SEQ ID NO.28的核苷酸序列杂交。
在本发明的宿主细胞中,提高特异性木酮糖激酶活性的遗传修饰可以与上文所述提高戊糖磷酸通路通量的任何修饰组合,但是所述组合对本发明而言不是必需的。因此,除了表达本文定义的araA、araB和araD酶之外包含提高特异性木酮糖激酶活性的遗传修饰的本发明宿主细胞明确地包括在本发明内。用于实现和分析本发明宿主细胞中木酮糖激酶过表达的本领域可获得的多种手段与上文针对戊糖磷酸通路的酶所述的相同。优选地,在本发明的宿主细胞中,与除引起过表达的遗传修饰之外在遗传上相同的菌株相比,要过表达的木酮糖激酶被过表达至少1.1、1.2、1.5、2.5、5、10或20的倍数。应当理解这些过表达水平可适用于酶活性的稳态水 平、酶蛋白质的稳态水平以及编码所述酶的转录本的稳态水平。
在又一个优选的实施方案中,
-表达araA、araB和araD,并展示将木糖直接异构化为木酮糖的能力,和任选地
-包含提高戊糖磷酸通路通量的遗传修饰,和/或
-还包含完全如前文所述提高特异性木酮糖激酶活性的遗传修饰的,
适用于本发明选择方法的细胞可还包含在宿主细胞中降低非特异性醛糖还原酶活性的遗传修饰。优选地,通过降低编码非特异性醛糖还原酶的基因的表达或使其失活的一种或多种遗传修饰,来降低宿主细胞中的非特异性醛糖还原酶活性,如WO 06/009434中所述。优选地,遗传修饰降低或失活宿主细胞中编码非特异性醛糖还原酶的基因的各个内源拷贝的表达。宿主细胞可由于二倍性、多倍性或非整倍性而包含多拷贝的编码非特异性醛糖还原酶的基因,和/或宿主细胞可含有具有醛糖还原酶活性的若干不同的(同工)酶,所述酶的氨基酸序列不同并且各自由不同基因编码。还在这类情况下,优选地编码非特异性醛糖还原酶的每种基因的表达被降低或失活。优选地,通过缺失基因的至少一部分或者通过破坏基因使基因失活,其中在该语境中,术语基因还包括编码序列上游或下游的任何非编码序列,其(部分)缺失或失活导致宿主细胞中非特异性醛糖还原酶活性表达的降低。编码要在本发明宿主细胞中降低其活性的醛糖还原酶的核苷酸序列是编码具有醛糖还原酶活性的多肽的核苷酸序列,其中优选地所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO.29具有至少50、60、70、80、90或95%的同一性,或其中所述核苷酸序列能够在中度条件下、优选地在严格条件下与SEQ ID NO.30的核苷酸序列杂交。
在适用于本发明的细胞中,如本文定义的araA、araB和araD酶的表达与降低非特异性醛糖还原酶活性的遗传修饰组合。导致非特异性醛糖还原酶活性降低的遗传修饰可在上述宿主细胞中与提高戊糖磷酸通路通量的任何修饰和/或提高特异性木酮糖激酶活性的任何修饰组合,但是这些组合对本发明而言不是必需的。因此,表达araA、araB和araD,包含降低非特异性醛糖还原酶活性的其它遗传修饰的宿主细胞明确地包括在本发明 内。
在一个优选的实施方案中,适用于本发明选择方法的细胞是在2006年9月27日保藏于CBS(Centraalbureau voor Schimmelcultures,Uppsalalaan 8,3584 CT Utrecht,荷兰)的CBS 120327,于2006年9月27日保藏于CBS的CBS 120328,于2007年9月20日保藏于CBS的CBS121879,或于2008年3月11日保藏于CBS的CBS 122700。所有这些菌株由Delft University of Technology保藏。前三种菌株描述于共同未决的国际专利申请PCT/NL2007/000246中。后一种菌株详细描述于实施例中。所有被保藏的菌株是被改造使其能够消耗***糖和木糖的Saccharomyces cerevisiae菌株。
所有上述细胞可被用于选择关于木糖和/或***糖利用显示经改进的特性的菌株。
本发明的选择方法可与根据需要继续。所述选择方法优选地进行从约一周到约一年。然而,需要时所述选择方法可以进行更长的时间段。
在选择方法期间,优选地在存在约20g/l L-***糖和/或约20g/l木糖时培养细胞。预期在该选择方法结束时获得的菌株在其使用L-***糖和/或木糖,和/或将L-***糖转化成L-核酮糖和/或木糖5-磷酸和/或想要的发酵产物(如乙醇)的能力方面是经改进的。
在本文上下文中,“经改进的细胞”或“经改进的生物”可表示获得的细胞能够以比其来源细胞更有效的方式使用用来选择它的碳源,如L-***糖和/或木糖。例如,预期获得的细胞生长得更好(在相同条件下比其来源细胞的比生长速率提高至少2%),或更迅速地消耗碳源。优选地,这类提高为至少约4%、6%、8%、10%、15%、20%、25%或更多。比生长速率可以如技术人员所已知的从OD660计算。因此,通过监测OD660,能够推出比生长速率。
在本文上下文中,“经改进的细胞”也可以表示获得的细胞以比其来源细胞更有效的方式将用来选择它的碳源如L-***糖转化成L-核酮糖和/或木酮糖5-磷酸和/或想要的发酵产物如乙醇。例如,预期获得的细胞在相同条件下比其来源细胞生产更大量的转化产物或发酵产物如L-核酮糖和 /或木酮糖5-磷酸和/或想要的发酵产物如乙醇:这些化合物中至少一种的提高至少为2%。优选地,所述提高至少为4%、6%、8%、10%、15%、20%、25%或更多。在本文上下文中,“经改进的细胞”或“经改进的生物”也可以表示获得的细胞以比其来源细胞更有效的方式将木糖转化成木酮糖和/或想要的发酵产物如乙醇。例如,预期获得的细胞/生物生产更大量的木酮糖和/或想要的发酵产物如乙醇:与相同条件下其来源细胞相比,这些化合物中至少一种的提高至少为2%。优选地,所述提高至少为4%、6%、8%、10%、15%、20%、25%或更多。
在使用本发明的方法选择的生物菌株中,至少上述遗传修饰之一、通过选择获得的修饰可赋予经改进到细胞在L-***糖和任选的木糖作为碳源、优选地作为唯一碳源时,并优选地在厌氧条件下生长的能力。优选地,经改进的菌株基本上不生产木糖醇,例如生产的木糖醇低于检测界限或者以摩尔为基础例如少于消耗的碳的5、5、1、0.5或0.3%。
优选地,经改进的菌株具有在L-***糖和任选的木糖作为唯一碳源时,在需氧条件下以至少0.001、0.005、0.01、0.03、0.05、0.1、0.2、0.25或0.3h-1的速率,在厌氧条件下以至少0.001、0.005、0.01、0.03、0.05、0.07、0.08、0.09、0.1、0.12、0.15或0.2h-1的速率生长的能力。优选地,经改进的具有在葡萄糖和L-***糖和任选的木糖(以1∶1的重量比)的混合物作为唯一碳源时,在需氧条件下以至少0.001、0.005、0.01、0.03、0.05、0.1、0.2、0.25或0.3h-1的速率,在厌氧条件下以至少0.001、0.005、0.01、0.03、0.05、0.1、0.12、0.15或0.2h-1的速率生长的能力。
优选地,经改进的菌株具有至少约100、150、200、250、300、346、350、400、500、600、650、700、750、800、900或1000mg/g细胞/h的L-***糖和优选地木糖的比消耗速率。优选地,经修饰的宿主细胞在L-***糖(优选地木糖)上的发酵产物(如乙醇)的产率是宿主细胞在葡萄糖上发酵产物(如乙醇)产率的至少20,25,30,35,40,45,50,55,60,70,80,85,90,95或98%。更优选地,经修饰的宿主细胞在L-***糖(优选木糖)上的发酵产物(如乙醇)的产率等于宿主细胞在葡萄糖上的发酵产物(如乙醇)产率。类似地,经修饰的宿主细胞在L-***糖(优选木 糖)上的生物量产率优选地是宿主细胞在葡萄糖上生物量产率的至少55,60,70,80,85,90,95或98%。更优选地,经修饰的宿主细胞在L-***糖(优选木糖)上的生物量产率等于宿主细胞在葡萄糖上的生物量产率。应当理解在葡萄糖和L-***糖(优选木糖)上产率的比较中,两种产率均在需氧条件下或均在厌氧条件下比较。
使用本发明的选择方法分离了经改进的酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株并在2008年3月11日以登记号CBS 122701保藏于CBS(Centraalbureau voor Schimmelcultures,Uppsalalaan 8,3584 CT Utrecht,荷兰)。保藏者是Delft University of Technology。
在一个优选的实施方案中,根据本发明选择的细胞表达一种或多种下述酶,所述酶赋予细胞生产至少一种选自下组的发酵产物的能力,所述组由乙醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、反丁烯二酸、氨基酸、1,3-丙二醇、乙烯、乙烯、丙三醇、丁醇、β-内酰胺抗生素和头孢菌素组成。在一个更优选的实施方案中,本发明的宿主细胞是用于生产乙醇的宿主细胞。在另一个优选的实施方案中,本发明涉及用于生产除乙醇外的发酵产物的经转化的宿主细胞。这类非乙醇的发酵产物原则上包括可由真核微生物如酵母或丝状真菌生产的任何大宗化学品(bulk chemical)或精细化学品。这类发酵产物包括例如乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、反丁烯二酸、衣康酸、氨基酸、1,3-丙二醇、乙烯、丙三醇、丁醇、β-内酰胺抗生素和头孢菌素。用于生产非乙醇发酵产物的一种优选的本发明宿主细胞是下述宿主细胞,所述宿主细胞含有导致降低的醇脱氢酶活性和/或降低的丙酮酸脱羧酶活性的遗传修饰。
在又一方面中,本发明涉及下述发酵方法,其中使用本发明方法选择的生物菌株被用于发酵包含两种或更多种碳源的混合底物,例如包含L-***糖来源和任选的木糖来源的底物。
优选地,L-***糖来源和木糖来源是L-***糖和木糖。另外,发酵培养基中的碳源还可包含葡萄糖来源。L-***糖、木糖或葡萄糖的来源可以是原样的L-***糖、木糖或葡萄糖,或者可以是包含L-*** 糖、木糖或葡萄糖单元的任何碳水化合物寡聚体或多聚体,如例如木质纤维素、木聚糖、纤维素、淀粉、***糖聚糖等等。为了从这类碳水化合物释放木糖或葡萄糖单元,可以向发酵培养基中添加或者由经修饰的宿主细胞生产适当的糖酶(例如木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶等等)。在后一情况下,经修饰的宿主细胞可以被遗传改造为生产和分泌这类碳水化合物。使用葡萄糖的寡聚体或多聚体来源的一种额外的优点是其例如通过使用限速量的碳水化合物,使得能够在发酵期间维持(更)低的游离葡萄糖浓度。这随即会预防阻抑非葡萄糖的糖(如木糖)代谢和转运所需的***。在一种优选的方法中,经修饰的宿主细胞发酵L-***糖(任选地木糖)以及葡萄糖,优选地同时发酵,在这种情况下优选地使用下述经修饰的宿主细胞,所述宿主细胞对葡萄糖阻抑不敏感从而防止两阶段生长。除了作为碳源的L-***糖、任选地木糖(和葡萄糖)来源以外,发酵培养基还会包含经修饰的宿主细胞生长所需的适当成分。用于微生物(如酵母或丝状真菌)生长的发酵培养基的组成是本领域公知的。
在一个优选的方法中,提供了用于生产选自下组的发酵产物的方法,所述组由乙醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、反丁烯二酸、氨基酸、1,3-丙二醇、乙烯、丙三醇、丁醇、β-内酰胺抗生素和头孢菌素组成,其中所述方法包括步骤:
(a)用使用本发明方法选择的生物菌株发酵含有两种或更多种碳源的培养基,和任选地
(b)回收发酵产物。
所述发酵方法是用于生产发酵产物如乙醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、反丁烯二酸、氨基酸、1,3-丙二醇、乙烯、丙三醇、丁醇、β-内酰胺抗生素如青霉素G或青霉素V及其发酵衍生物和/或头孢菌素的方法。所述发酵方法可以是需氧或厌氧的发酵方法。厌氧发酵方法在本文中被定义为在不存在氧时进行的发酵方法,或其中基本不消耗氧,优选地消耗少于5、2.5或1mmol/L/h,更优选地消耗0mmol/L/h(即氧消耗不可检出),并且其中有机分子发挥电子供体和电子受体两种作用。在不存在氧时,糖酵解和生物量形成中产生的NADH不能 够被氧化磷酸化氧化。为了解决这一问题,许多微生物使用丙酮酸或其衍生物之一作为电子和氢受体,从而再生NAD+。因此,在一种优选的厌氧发酵方法中,丙酮酸被用作电子(和氢受体),并且被还原成发酵产物如乙醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、反丁烯二酸、氨基酸、1,3-丙二醇、乙烯、丙三醇、丁醇、β-内酰胺抗生素和头孢菌素。在一个优选的实施方案中,发酵方法是厌氧的。厌氧发酵方法是有利的,因为其比需氧方法更便宜:需要更少的特殊设备。另外,预期厌氧方法会比需氧方法得到更高的产物产率。在需氧条件下,生物量产率通常比厌氧条件下更高。因此,在需氧条件下,通常期望的产物产率比厌氧条件下更低。
在另一个优选的实施方案中,发酵方法在氧受限的条件下进行。更优选地,发酵方法是需氧的并处于氧受限的条件下。氧受限的发酵方法是下述方法,其中氧消耗受到从气体到液体的氧转移的限制。氧受限的程度由进入气流的量和组成以及使用的发酵设备的实际混合/物量转移特性决定。在氧受限条件下的一种方法中,氧消耗速率可为至少约5.5、例如至少约6或至少约7mmol/L/h。
发酵方法优选地在对经修饰的宿主细胞而言最适的温度下进行。因此,对大部分酵母或真菌细胞而言,发酵方法在低于42℃、优选地低于38℃的温度下进行。对酵母或丝状真菌宿主细胞而言,发酵方法优选地在低于35、33、30或28℃的温度且高于20、22或25℃的温度下进行。
一种优选的方法是用于生产乙醇的方法,其中所述方法包括步骤:(a)用使用本发明方法选择的生物菌株发酵含有两种或更多种碳源(例如L-***糖和任选地木糖)的培养基,其中所述宿主细胞将所述碳源发酵成乙醇;和任选地,(b)回收乙醇。
所述发酵培养基可还包含也被发酵成乙醇的葡萄糖来源。在一个优选的实施方案中,用于生产乙醇的发酵方法是厌氧的。厌氧已在前文中被定义。在另一个优选的实施方案中,用于生产乙醇的发酵方法是需氧的。在另一个优选的实施方案中,用于生产乙醇的发酵方法处于氧受限的条件下,更优选地是需氧的和处于氧受限的条件下。氧受限的条件已在前文中 定义。
在所述方法中,体积乙醇生产力优选地为至少为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、5.0或10.0g乙醇/升/小时。所述方法中的L-***糖和任选地木糖和/或葡萄糖上的乙醇产率至少为20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、95或98%。乙醇产率在本文中被定义为理论最大产率(对葡萄糖和L-***糖和任选地木糖而言是0.51g乙醇/g葡萄糖或木糖)的百分比,尽管其可以用绝对术语表述。因此,本发明还涉及能够将包含木糖和***糖(和任选地葡萄糖)的底物,得到至少约0.2g g-1、至少约0.3g g-1或至少约0.4g g-1或更多乙醇产率的酵母菌株,如Saccharomyces cerevisiae菌株。
以下实施例描述本发明:
实施例
材料和方法
菌株和维持:该研究中使用的Saccharomyces cerevisiae菌株列于表1中。通过添加30%(v/v)甘油储存来自摇瓶、恒化器或(相继)分批培养的培养物样品,并以2ml的小份试样储存于-80℃下。
培养基和摇瓶培养。于30℃下在含5g l-1(NH4)2SO4、3g l-1 KH2PO4、0.5g l-1 MgSO4.7H2O、0.05ml l-1硅消泡剂和微量元素的合成培养基(MY)中进行摇瓶培养(Verduyn,C.,E.Postma,W.A.Scheffers,and J.P.Van Dijken.1992.Effect of benzoic acid on metabolic fluxes in yeasts:a continuous-culture study on the regulation of respiration and alcoholic fermentation.Yeast 8:501-517)。为了在摇瓶中培养,用2M KOH将培养基的pH调节至6.0,然后灭菌。热灭菌(121℃,20分钟)后,添加过滤灭菌的维生素溶液(Verduyn等,1992,上文)和适当的碳源和能量来源。通过用冷冻菌种培养物接种500-ml摇瓶中100ml含适当糖的培养基并于30℃下在轨道摇床(200rpm)中孵育来制备摇瓶培养物。
通过向MY中添加1.5%琼脂,制备含20g l-1木糖(MYX)或20g l-1***糖(MYA)的固体MY平板。将平板在30℃下孵育,直至观察生长。
恒化器培养。于30℃下在工作体积为1-L的2-L实验室发酵罐(Applikon,Schiedam,荷兰)中进行厌氧恒化器培养。培养在下述合成培养基中进行,所述合成培养基补充有溶于乙醇中的0.01g l-1麦角固醇和0.42g l-1 Tween 80(Andreasen,A.A.and T.J.Stier.1953.Anaerobic nutrition of Saccharomyces cerevisiae.I.Ergosterol requirement for growth in a defined medium.J.Cell Physiol.41:23-36;and Andreasen,A.A.and T.J.Stier.1954.Anaerobic nutrition of Saccharomyces cerevisiae.II.Unsaturated fatty acid requirement for growth in a defined medium.J.Cell Physiol.43:271-281)、硅消泡剂和微量元素(Verduyn等,1992,上文),和20g l-1木糖和***糖作为碳源和能量来源,并通过自动添加2 M KOH维持在pH5.0下。将培养物在800rpm下搅拌,并用0.5 lmin-1的氮气(<10ppm氧)鼓泡。为了最小化氧扩散,用Norprene管道装备发酵罐(Cole Palmer Instrument company,Vernon Hills,USA)。用氧电极监测溶解的氧(Applisens,Schiedam,荷兰)。分批生长完成后,通过以固定的稀释速率对发酵罐添加含20g l-1木糖和***糖的合成培养基来起始恒化器培养。使用由电水平传感器控制的流出物泵将培养物的工作体积保持恒定。
相继分批培养。为了进行厌氧相继分批培养(SBR),使用与恒化器培养相同的发酵罐设置和培养基组成。通过用含有适当碳源和能量来源的合成培养基手动或自动地代替约90%的培养物,来起始分批培养的新循环。使用电水平传感器控制的进料泵,将发酵罐填充至1升的工作体积。耗尽碳源和能量来源后(通过CO2生产峰之后CO2百分比降至低于0.05%来表明),通过用含有适当碳源和能量来源的新鲜合成培养基手动或自动化代替约90%的培养基,来起始新的循环。对每个循环而言,从CO2模式评估最大比生长速率。
分批培养。为了表征选自长期恒化器和相继分批培养物的单个菌落隔离群,使用与恒化器和相继分批培养物相似的发酵罐设置,在含30g l-1葡萄糖,15g l-1 D-木糖和15g l-1 L-***糖的1升合成培养基中进行厌氧分批培养。用于接种分批发酵的培养物在含有补充有20g l-1***糖的MY的摇瓶中培养。
制备单个菌落隔离群培养物。将来自恒化器或相继分批培养(SBR I和II)任一的培养物样品稀释并涂布于含20g l-1 L-***糖的固体MY上,并于30℃下孵育直至出现菌落。将单独的菌落在含20g l-1 L-***糖的固体MY上再划线两次。在含有补充有20g l-1 L-***糖的100mlMY的摇瓶中于30℃下培养单个菌落。通过在平台生长期中添加无菌甘油至30%(v/v)制备冷冻的菌种培养物,并将2ml小份试样储存于-80℃下。
测定生物量干重。在预先称重的滤纸(孔径0.45μm;Gelman laboratory,Ann Arbor,USA)上过滤培养物样品(10.0ml)。过滤发酵液后,用去矿物质水洗涤生物量,在微波炉中于360W下干燥并称重。一式两份的测定变化小于1%。
气体分析。将来自厌氧发酵罐培养的排出气体在冷凝器(2℃)中冷却,并用MD-110-48P-4型Permapure(Permapure,Toms River,USA)干燥。用NGA 2000分析仪(Rosemount Analytical,Orrville,USA测定氧和二氧化碳浓度。如先前所述测定排出气体流速和二氧化碳比生产速率(Van Urk,H.,P.R.Mak,W.A.Scheffers,and J.P.Van Dijken.1988.Metabolic responses of Saccharomyces cerevisiae CB S 8066 and Candida utilis CBS 621upon transition from glucose limitation to glucose excess.Yeast 4:283-291;和Weusthuis,R.A.,W.Visser,J.T.Pronk,W.A.Scheffers,and J.P.Van Dijken.1994.Effects of oxygen limitation on sugar metabolism in yeasts-a continuous-culture study of the Kluyver effect.Microbiology 140:703-715)。计算累积二氧化碳生产时,取出培养物样品引起的体积改变考虑在内。
代谢产物分析。使用装有BioRad HPX 87H柱(BioRad,Hercules,USA)、Waters 2410折光率指数检测器和Waters 2487 UV检测器的Waters Alliance 2690 HPLC(Waters,Milford,USA),通过HPLC分析葡萄糖、木糖、***糖、木糖醇、有机酸、甘油和乙醇。在60℃下用0.5g l-1硫酸以0.6ml min-1的流速洗脱柱。
速率计算。为了计算***糖消耗和乙醇生产的比速率,用Boltzmann S形方程式拟合时间依赖性***糖和乙醇数据。对每个时间点 而言,通过用拟合曲线的导数/斜率除以干重来计算***糖消耗的比速率和乙醇生产的比速率。
碳回收。碳回收被计算为形成的产物中的碳除以消耗的糖碳总量,并且基于48%的生物量碳含量。为了校正发酵期间的乙醇蒸发,假定生产的乙醇量等于测量的累积CO2生产减去由于生物量合成而发生的CO2生产(每克生物量5.85mmol CO2(Verduyn等,1990,上文))和与乙酸形成相关的CO2。
速率计算。为了计算***糖和木糖消耗的比速率,用S型方程式拟合时间依赖性***糖和木糖数据:
其中:
A1=初始值(左侧水平渐近线)
A2=最终值(右侧水平渐近线)
x0=中心(拐点)
τ=宽度(对应于y轴中最显著改变的x改变)
B和C=使τ时间相关的参数。
对每个时间点而言,通过用拟合曲线的导数/斜率除以干重来计算糖消耗的比速率。
实施例1
通过恒化器培养进行选择
在共同未决的国际专利申请号PCT/NL2007/000246中,在含木糖的固体MY上培养并随后在补充有20g l-1***糖的MY中摇瓶培养后,分离了发酵木糖和***糖的S.cerevisiae菌株IMS0003(CBS 121879)。通过在含20g l-1***糖的MY中培养48小时,从该摇瓶培养物的冷冻菌种制备100mL摇瓶培养物,并用于接种含有900mL具有20g l-1木糖和20gl-1***糖的MY的厌氧发酵罐。完成分批阶段后,通过以0.03 h-1的固定稀释速率向发酵罐添加含有20g l-1木糖和20g l-1***糖的合成培养 基,来起始恒化器培养。在恒化器培养期间,从培养物中取出样品并测定生物量干重、木糖和***糖浓度。最初木糖和***糖浓度从190到约250小时分别稳定在69和26mmol l-1(见图1)。250和600小时的培养之间,连续培养物中剩余木糖浓度从69mmol l-1降至约8.5mmol l-1,而***糖浓度的降低仅较小,并且保持在17和19mmol l-1之间的水平上。结果表明对恒化器培养物的木糖的亲和力(定义为μmax/Ks)提高,并且对***糖的亲和力未显著改变。
通过进行含有30g l-1葡萄糖、15g l-1木糖和15g l-1***糖混合物的厌氧分批发酵,针对木糖和***糖的共消耗测试来自恒化器的单菌落隔离群。图2B展示了来自恒化器培养物的单菌落隔离群之一(菌株IMS0007)在这类分批发酵期间的CO2生产模式和木糖与***糖消耗。选择性恒化器培养导致葡萄糖/木糖/***糖混合物的总发酵时间从约70小时(菌株IMS0003,见图2A)被降至约55小时。这些结果主要表明经改进的木糖消耗,剩余的挑战是经改进的木糖与***糖的共消耗。
IMS0007已在2008年3月11日以登记号CBS 122700被保藏于CBS(Centraalbureau voor Schimmelcultures,Uppsalalaan 8,3584 CT Utrecht,荷兰)。保藏者为Delft University of Technology。
实施例2
通过相继分批培养进行选择
为了获得与菌株IMS0007相比具有进一步改进的木糖和***糖共消耗的S.cerevisiae菌株,使用来自恒化器选择培养的样品接种厌氧SBR发酵罐。该***可被用于选择具有递增的最大比生长速率(μmax)的突变体。通过将分批生长培养物相继转移至新的批次,最终具有最高比生长速率的(突变体)细胞会生长远超(overgrow)具有更低比生长速率的细胞。在最初的SBR轮(SBR I)中,通过用含有20g l-1木糖和20g l-1***糖的合成培养基重复自动化替换约90%的培养物,在重复的批次中培养细胞(图3)。通过用100ml来自上述恒化器选择培养物的培养物样品接种含1升该培养基的厌氧SBR,起始第一批次。使用自动化填充和排空 (fill-and-empty)制度,用含20g l-1木糖和20g l-1***糖的MY在重复批次中培养细胞。为了选择具有木糖与***糖厌氧共消耗的组成型表型的细胞,通过在两个时刻——第4批和第6批后用含20g l-1葡萄糖的MY填充反应器来中断所述制度(见图4)。对每个循环而言,根据CO2模式评估最大比生长速率(见图4)。在补充有木糖和***糖的培养基上进行16个循环后,厌氧比生长速率从0.08提高至0.13h-1。二氧化碳生产模式和演绎的比生长速率显示在相继批次运行的过程期间,木糖-***糖混合物上分批培养的第一阶段逐渐加速。上清液样品中糖的分析显示观察到的加速是递增的木糖消耗速率的结果(数据未展示)。然而,SBR选择期间***糖消耗速率降低,导致两个二氧化碳生产峰所代表的木糖和***糖消耗分离,而不是经改进的木糖与***糖的共消耗。重复批次的CO2生产模式的重叠清楚地显示从单个CO2生产峰转换为两阶段CO2生产模式(见图5)。
为了用发酵木糖和***糖的菌株IMS0007比较发酵特征,在第13批期间从SBR培养物取出100mL样品,并用于接种含有MY的厌氧分批发酵罐,所述MY补充有30g l-1葡萄糖、15g l-1 D-木糖和15g l-1 L-***糖。该厌氧分批发酵的CO2生产模式和糖消耗曲线(见图2C)显示与含有相同糖混合物的MY培养基中培养的菌株IMS0007相比,木糖消耗加速并且***糖消耗被延迟(图2B)。
SBR期间观察到的从木糖和***糖的共消耗到的转换可能归因于下述事实:细胞对木糖具有超过***糖的偏好,因此,在两种糖的混合物中,与***糖相比细胞在木糖上生长了更多的世代(见表2,3.2代比0.9代)。为了提高对***糖消耗的选择压力,应当提高在***糖上生长的细胞的世代数。为此,开始新一轮SBR(SBR II)。在SBR II中,通过用含有20g l-1葡萄糖、20g l-1木糖和20g l-1***糖,或20g l-1木糖和20g l-1***糖,或20g l-1***糖任一的合成培养基重复自动化代替约90%的培养物,在重复批次中培养细胞(见图6)。表2表明在该设定中,木糖和***糖上的世代数量在相同范围内,这应当导致两种糖利用的改进(4.2代比4.6代)。
这些3批次培养的单个循环导致如图7中所示典型的CO2生产模式。以该特定顺序将循环重复20次。
在SBR II运行期间,葡萄糖/木糖/***糖批次的比生长速率从0.19提高至约0.23 h-1(图8)。在葡萄糖消耗阶段中测定这些批次期间的生长速率。木糖/***糖批次中的比生长速率也提高了。然而,***糖批次期间的生长速率未改变。
根据单独批次的CO2生产模式(图9)可以推论出,与SBR I相反,在SBR II期间同时利用木糖和***糖的能力被保留。另外,CO2生产峰尾端的形状显示木糖/***糖和***糖批次期间提高的对***糖的亲和力。另外,SBR运行期间所有三种批次中糖的总发酵时间降低。
针对共消耗木糖和***糖的能力测试在约3000小时的培养后来自SBR II的单菌落隔离群。为此,在含有30g l-1葡萄糖、15g l-1 D-木糖和15g l-1 L-***糖的混合物的MY中厌氧培养用***糖培养的再划线的单菌落。图2D中展示了单菌落隔离群之一(菌株IMS0010)的这类分批发酵期间的CO2生产模式和木糖与***糖消耗。与先前选择的菌株IMS0003和IMS0007相比,SBR选择将葡萄糖/木糖/***糖混合物的总发酵时间大幅降低至约40小时。根据菌株IMS0010与IMS0007的糖消耗模式的比较可以推论出,SBR II选择期间***糖利用尤其被加速,而木糖消耗则未显著改变。
IMS0010已于2008年3月11日以登记号CBS 122701被保藏于CBS(Centraalbureau voor Schimmelcultures,Uppsalalaan 8,3584 CT Utrecht,荷兰)。保藏者是Delft University of Technology。
实施例3
菌株IMS0010的表征
在含有30g l-1葡萄糖、15g l-1 D-木糖和15g l-1 L-***糖的混合物的MY中厌氧培养菌株IMS0010。图10展示了这样的分批发酵期间的累积CO2生产模式、乙醇生产和木糖和***糖消耗。在该实验中,153mmol l-1葡萄糖(27.6g l-1)、98mmol l-1木糖(14.9g l-1)和107mmol l-1*** 糖(16.0 gl-1)在约40小时内被完全消耗。在该实验中观察到的最大比消耗速率对***糖而言为0.49g h-1(g干重)-1,对木糖而言为0.21g h-1(g干重)-1。根据累积的CO2生产估计生产了551mmol l-1的乙醇(25 g l-1),对应于0.43g g-1总糖的总体乙醇产率。与先前选择的菌株IMS0003和IMS0007相比,SBR选择将葡萄糖/木糖/***糖混合物的总发酵时间大幅降低至约40小时。从菌株IMS0010与IMS0007的糖消耗模式的比较可以推断出,在SBR II中选择期间***糖利用尤其被加速,而木糖消耗则未显著改变。
据我们所知,之前从未描述过通过在各种糖上进行等量的SBR培养来促进糖混合物中相继被利用的糖的共消耗的上述策略。结果是我们获得了具有更高的比生长速率、改进的亲和力的细胞,和总体发酵时间的减少。
表1
表2
比较在含有不同碳源(混合物)和能量来源的合成培养基中厌氧分批发酵中培养的酵母细胞的生物量形成。在该表中假设:(i)葡萄糖是最优选的糖,木糖是第二优选的糖,***糖是最不优选的糖;(ii)在糖的混合物中,糖被相继消耗;(iii)生物产率是0.08g g-1糖。
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(PCT Rule 13bis)
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Claims (8)
1.以登记号CBS122701保藏于Centraalbureau voor Schimmelcultures的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株。
2.用于生产发酵产物的方法,所述方法包括用根据权利要求1的酵母菌株发酵含有两种或更多种碳源的底物,从而所述细胞将所述碳源转化成所述发酵产物。
3.根据权利要求2的方法,其中所述底物包含木糖和***糖,并任选地包含葡萄糖。
4.根据权利要求2或3的方法,所述方法包括回收所述发酵产物。
5.根据权利要求2到3中任一项的方法,其中所述发酵产物是乙醇、丁醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、反丁烯二酸、衣康酸、氨基酸、1,3-丙二醇、乙烯、甘油、丁醇、β-内酰胺抗生素或头孢菌素。
6.根据权利要求2到3中任一项的方法,其中所述方法是厌氧的。
7.根据权利要求2到3中任一项的方法,其中所述方法是需氧的。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述方法在氧受限的条件下进行。
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