CN102010903A - Il-23在肝癌早期病变诊断中的应用 - Google Patents

Il-23在肝癌早期病变诊断中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种鉴定慢性乙型肝炎病毒感染对象具有发生肝癌倾向的方法，包括在所述对象的生物学样品例如血液样品例如血清或其衍生物中检测IL-23的水平并与对照样品中IL-23的水平比较，其中检测样品中所述IL-23水平升高是所述对象具有发生肝癌倾向的指征。本发明还涉及了检测IL-23的制剂在制备用于鉴定对象具有发生肝癌倾向的组合物中的应用以及用于所述鉴定的试剂盒。

Description

IL-23在肝癌早期病变诊断中的应用
发明领域
本发明涉及肝癌早期病变诊断的新标记物和方法，还涉及用于肝癌早期病变诊断的试剂盒。
发明背景
原发性肝癌是我国发生率最高的恶性肿瘤之一，每年因患肝癌而死亡的人数约占全世界肝癌死亡人数的50％，严重威胁着人民群众的生命健康，给患者家庭及国家造成了沉重的经济负担。在我国，肝癌发生的主要病因是慢性持续性乙型肝炎病毒的感染，表现为血清乙型肝炎病毒表面抗原持续阳性，这部分人群是肝癌发生的危险人群。根据2006年全国流行病学调查结果显示，我国自然人群中乙型肝炎病毒表面抗原调整后阳性率高达7.18％，估计有乙肝病毒表面抗原携带者9400万人。目前，对于临床诊断的肝癌的治疗手段单一受限，患者的死亡率居多种恶性肿瘤的首位。因此，预防慢性持续乙肝病毒感染者进展为肝癌，及早发现肝癌的早期病变，进而采取积极的诊疗措施，可极大提高肝癌患者的生存率。
根据《中国抗癌协会肝癌专业委员会》于2001年9月在广州所制定的“原发性肝癌的临床诊断与分期标准”，(中华肝脏病杂志，2001年12月第9卷第6期第324页)，我国目前最常用的原发性肝癌早期诊断方法是在高危人群中定期进行血清中甲胎蛋白的检测以及影像学的筛查(高危人群：40岁及以上男性，45岁及以上女性的慢性乙肝病毒感染者)。诊断标准为至少具有以下特征之一：(a)AFP≥400μg/L，能排除妊娠、生殖系胚胎源性肿瘤、活动性肝病及转移性肝癌，并能触及肿大、坚硬及有大结节状肿块的肝脏或影像学检查有肝癌特征的占位性病变者；(b)AFP＜400μg/L，能排除妊娠、生殖系胚胎源性肿瘤、活动性肝病及转移性肝癌，并有两种影像学检查有肝癌特征的占位性病变或有两种肝癌标志物(DCP、GGT II、AFU及CA19-9等)阳性及一种影像学检查有肝癌特征的占位性病变者。(c)有肝癌的临床表现并有肯定的肝外转移病灶(包括肉眼可见的血性腹水或在其中发现癌细胞)并能排除转移性肝癌者。而这一诊断的做出往往在肝癌发生之后，病人已经丧失了最佳的治疗时机。此外，流行病学调查显示，在慢性乙肝病毒表面抗原携带者中，每年有1％的人群自然进展为肝癌，终身肝癌的发生率累计约有40％。因此在高危人群中及早发现早期的病变特征，从而采取积极的手段与措施进行干预和治疗，提高患者的生活质量与生存率。需要建立高效便捷易行的方法。
由慢性乙肝进展为肝癌是一个漫长的过程，可长达40-50年，是机体与病毒长期相互作用的结果。因此，临床医生通常针对40岁及以上男性，45岁及以上女性的慢性乙肝病毒感染者这一高危群体，定期检测其血清中甲胎蛋白的水平并附加超声影像学的筛查，以期采用现行的常规手段发现早期肝癌患者。近年来研究发现，在慢性乙肝病毒感染的患者中，病毒感染的肝细胞和识别感染肝细胞的免疫细胞分泌多种不同的细胞因子，在由慢性乙肝病毒感染状态进展为肝癌的病程进展中发挥着重要作用。
白细胞介素23(IL-23)是一个异二聚体造血细胞因子，由p40和p19两个亚基组成，主要由机体活化的巨噬细胞和树突状细胞产生，可促进T细胞的增殖和IFN-γ的产生。IL-23优先刺激机体记忆性T细胞而不是初始型T细胞群。其受体广泛表达于活化T细胞、记忆性T细胞、NK细胞、巨噬细胞和树突状细胞，IL-23作用于这些细胞，诱导IFN-γ等前炎性细胞因子的产生，在炎症性疾病、自身免疫性疾病的发病以及抗肿瘤和抗感染等方面发挥重要作用。
发明概述
在一个方面，本发明提供了一种鉴定慢性乙型肝炎病毒感染对象例如人具有发生肝癌倾向的方法，包括：
检测得自所述对象的生物学样品中IL-23的水平，其中检测样品中IL-23水平升高是所述对象具有发生肝癌倾向的指征。
在一个实施方案中，所述生物学样品是血液样品如血清或其衍生物。
在一个实施方案中，所述样品中IL-23的水平通过检测IL-23蛋白或IL-23的mRNA的水平来确定。
在一个实施方案中，使用IL-23特异性抗体或其抗原结合片段检测所述生物学样品中IL-23蛋白的水平。
在一个实施方案中，所述检测样品中IL-23水平升高是检测样品中IL-23水平与对照样品中IL-23水平相比是升高的。
在一个实施方案中，所述检测样品中IL-23水平升高是检测样品中IL-23蛋白水平高于截断值。在一个实施方案中，对象具有发生肝癌倾向的截断值为855pg/ml。
在一个实施方案中，所述检测样品中IL-23蛋白的水平通过检测p19亚基或其同源物来确定。
在另一个方面，本发明提供了一种用于鉴定慢性乙型肝炎病毒感染对象例如人具有发生肝癌倾向的组合物，其中所述组合物包含用于检测所述对象的生物学样品中IL-23水平例如检测IL-23蛋白或IL-23的mRNA的水平的制剂。
在一个实施方案中，所述生物学样品是血液样品例如血清或其衍生物。
在一个实施方案中，使用IL-23特异性抗体或其抗原结合片段检测所述生物学样品中IL-23蛋白的水平。
在一个实施方案中，所述制剂是针对IL-23蛋白的特异性抗体，例如单克隆或多克隆抗体。
在另一个方面，本发明提供了IL-23特异性抗体或其抗原结合片段在制备用于鉴定慢性乙型肝炎病毒感染对象例如人具有发生肝癌倾向的组合物中的应用。
在另一个方面，本发明提供了用于鉴定慢性乙型肝炎病毒感染对象例如人具有发生肝癌倾向的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测所述对象的生物学样品中IL-23水平例如检测IL-23蛋白或IL-23的mRNA的水平的制剂。
在一个实施方案中，所述生物学样品是血液样品例如血清或其衍生物。
在一个实施方案中，所述制剂是针对IL-23蛋白的特异性抗体。在一个实施方案中，所述抗体是单克隆或多克隆抗体。
附图简述
图1：通过受试者操作特征曲线分析评估IL-23对预测肝细胞癌(HCC)的作用。ROC下的面积为0.699(95％CI 0.593/0.791)(图中两条虚线所表示曲线为95％置信区间)。当截断值为855pg/ml时，灵敏性和特异性分别为60.0％和91.1％。
图2：Kaplan-Meier分析用于评估IL-23水平和HCC累积发病率之间的相关性。结果表明具有高IL-23水平的患者中HCC的累积发病率较高。
图3：根据距随访结束时的时间间隔将不同时间点的样品血清分成5组。结果表明在发展为HCC的患者中，在疾病进展早期IL-23浓度较高，然后降低，在对照患者中在随访期间IL-23浓度保持恒定。
发明详细描述
除非特别指出，本文使用的科学和技术术语应具有本领域技术人员通常已知的含义。另外除非特别需要，则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。前述技术和方法通常根据本领域熟知的及在本说明书引用的参考文献所述的常规方法进行。见例如并入作参考的Current Protocols inImmunology.Wiley&Sons，Hoboken，NJ所述。本文引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、文章、教科书等及其中引用的参考文献在此均以其全部援引加入本文。
本发明人于上世纪90年代中后期在我国肝炎肝癌的高发区之一的启东地区建立了一个可长期追踪随访的慢性乙肝携带者队列，定期进行血清甲胎蛋白水平的检测和肝胆脾的超声影像学检查，发现了一些早期肝癌患者。利用这一队列同时研究了在慢性乙肝病毒感染者中机体针对病毒的免疫应答在由慢性乙肝进展为肝癌过程中的作用，以期发现影响肝癌早期病变的血清细胞因子特征。研究结果显示，早在由慢性肝炎进展为采用现行临床常规方法诊断为肝癌的5-8年之前，与持续性慢性乙肝感染者相比，肝癌患者血清中的细胞因子表达谱就已经发生了明显的变化，其中差异最为明显的细胞因子为IL-23。采用酶联免疫布阵法(ELISA Array)的检测结果表明IL-23对于慢性肝炎患者病程进展结局具有较好的指示作用，能有效地对持续性慢性乙肝进展为肝癌的患者进行早期预警诊断。IL-23可作为由持续性慢性乙肝进展为原发性肝癌的早期病变血清标志物。
在一个方面，本发明提供了鉴定慢性乙型肝炎病毒感染对象例如人具有发生肝癌倾向的方法，包括在所述对象的生物学样品中检测IL-23的水平，其中检测样品中所述IL-23水平升高是所述对象具有发生肝癌倾向的指征。
本文所述“肝癌”是指原发性肝细胞癌症。本文所用术语“癌症”通常指任何类型的恶性赘生物，即与未受影响的(健康)野生型对照细胞相比显示或具有发生癌特征倾向的靶细胞的任何形态学和/或生理学改变。这种改变的例子可涉及细胞大小和形状(变大或变小)、细胞增殖(细胞数增加)、细胞分化(生理学状态变化)、凋亡(程序性细胞死亡)或细胞存活。
本文所用术语“具有发生癌症倾向”是指任何处于癌前状态即正常细胞转化为肿瘤细胞过程中的中间状态的指征的细胞表型。换句话说，该术语是指发生癌症的风险的状态。
最常见类型的肝癌是肝细胞癌(HCC)。本文所用术语“肝细胞癌”是指原发的肝脏恶性肿瘤。大多数HCC继发于慢性肝炎病毒感染(乙型肝炎或丙型肝炎)或者肝硬化(酒精中毒是导致肝硬化的最常见因素)。肝细胞癌与任何其它癌症一样，当存在引起细胞高速复制和/或导致细胞避免凋亡的分子机制突变时而发生。特别地，乙型肝炎和/或丙型肝炎的慢性感染通过导致机体自身免疫***反复攻击自身肝细胞(其中一些被病毒感染，其它的仅是旁观者)而可助于肝细胞癌的发生。
在一个实施方案中，所述生物学样品是血液样品如血清或其衍生物。本发明中的生物学样品可以是人或非人类来源的。然而，本发明典型地用人类生物学样品进行。本文所述生物学样品是来自被测对象的任意生物学样品，尤其是包括核酸或者多肽的任意样品。有利地，可以包括下列样品：血液，血清，血浆，血小板，唾液，痰，尿液等等，更一般来说包括核酸或者多肽的任意组织、器官或者有利地生物体液。另外，生物学样品可含有衍生自细胞例如肝细胞的细胞提取物或包括其的细胞群。在本发明的体外方法中用于检测的样品通常应以临床可接受的方式收集，例如以保护核酸或蛋白质的方式收集。在一个实例中，所述样品是源自血液的样品，如血液、血清或者血浆的样品。可以通过任意已知技术如通过采血、通过非侵入性技术从样品采集点或者库等等获取样品。还可以预处理所述样品以增加靶分子的可接近性，如通过裂解(机械、化学、酶裂解等等)、纯化、离心、分离等等。还可以标记所述样品以便于靶分子存在的检测(荧光、放射性、发光、化学、酶标记等等)。在一个实例中，所述生物学样品是全血样品，即还没有经过分离步骤的血液，其任选可以被稀释。
在一个实施方案中，所述样品中IL-23的水平通过检测IL-23蛋白或IL-23的mRNA的水平来确定，例如使用IL-23特异性抗体或其抗原结合片段检测所述生物学样品中IL-23蛋白的水平。
IL-23蛋白由p19和p40两个亚基组成，其中p19(SEQ ID NO：1：MGSRAVMWTAGRAVGGS SAWTCSKCTAWSAHVGHMDRGDTTNDVHCGDGCDGRDNSCRHGYKGSDTGSDSVGHASGSGHHWTSSSWRRKRSAVAVAARVAHGAATS)为特有亚基，而p40(SEQ ID NO：2：MCHVSWSVASVAWKKDVYVVDWYDAGMVVTCDTDGTWTDSSVGSGKTTVKGDAGYTCHKGGVSHSHKKDGWSTDKDKKNKTRCAKNYSGRTCWWTTSTDTSVKSSRGSSDGVTCGAATSARVRGDNKYYSVCDSACAASVMVDAVHKKYNYTSSRDKDKNKKNSRVVSWYDTWSTHSYSTCVVGKSKRKKDRVTDKTSATVCRKNASSVRADRYYSSSWSWASVCS)为与同源物共享的亚基。因此，在一个实施方案中，所述检测IL-23蛋白的水平可以通过检测p19亚基或其同源物的水平来进行，其中检测样品中所述IL-23的水平升高是所述对象具有发生肝癌倾向的指征。
p19亚基的同源物是指包含与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者更高的同源性的氨基酸序列的多肽。
两个蛋白质序列的同源性对应于两个蛋白质链中位于相同或类似位置的相同氨基酸的百分比。用BLAST算法利用BLOSUM 62阵列计算同源性百分比，该算法可在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得。在本文中，所述p19亚基的同源物优选是功能性同源物，即其与SEQ ID NO：1具有显著的相似性(例如在氨基酸水平大约50％序列相同性)并且与p40亚基一起组成的多肽。至少大约60％，至少大约70％，至少大约80％、至少大约90％、至少大约95％、或至少大约99％序列相同性的p19亚基的功能性同源物是优选的功能性同源物。
用于检测IL-23蛋白、p19亚基或其同源物、IL-23的mRNA的制剂可以是多肽、核酸、碳水化合物、脂质、小分子量化合物、寡核苷酸、寡肽、RNA干扰(RNAi)、反义RNA、重组蛋白质、抗体、或者其缀合物或融合蛋白。关于RNAi，可见Milhavet O，Gary DS，Mattson MP.(Pharmacol Rev.2003Dec；55(4)：629-48.Review.)，关于反义RNA，可见Opalinska JB，GewirtzAM.(Sci STKE.2003Oct 28；2003(206)：pe47)。
例如，为了确定对象中IL-23蛋白、p19亚基或其同源物的水平，本发明的方法可以使用结合IL-23蛋白或p19亚基的配体测定来自所述对象的生物学样品中IL-23蛋白或p19亚基或其同源物的水平(浓度或绝对量)，在对象的所述生物学样品中IL-23蛋白或p19亚基或其同源物水平升高指示所述对象存在肝癌患病风险。
本文所述配体可以是受体靶向物质、细胞因子、激素、生长因子、受体特异性抗体以及模式识别受体(PRR)配体。在一个实例中，所述配体是抗体(或其抗原结合片段)。可以利用本领域技术人员已知的任意技术揭示或者分析样品中的IL-23蛋白、p19亚基或其同源物，尤其是例如利用特异性配体，如抗体或者片段或者抗体衍生物。优选所述配体是所述蛋白的特异性抗体或者这类抗体的片段(如Fab，Fab′，CDR等等)或者这类抗体的衍生物(诸如单链抗体，ScFv)。通过检测靶和配体的复合物如利用标记的配体、利用第二种标记的检测配体等等可以检测样品中靶蛋白的存在或者量。可以使用公知的免疫技术包括ELISA，RIA等等。
可以通过常规技术尤其是利用包括所述蛋白(或者其免疫原性片段)的免疫原免疫非人动物并回收抗体(多克隆)或者生成细胞(以产生单克隆抗体)产生靶蛋白的特异性抗体。用于制备多克隆或者单克隆抗体、ScFv片段以及人的或者人源化抗体的技术例如在下列文献中描述：Harlow et al.，Antibodies：A Laboratory Manual，CSH Press，1988；Ward et al.，Nature 341(1989)544；Bird et al.，Science 242(1988)423；WO94/02602；US5,223,409；US5,877,293；WO93/01288。
本文所述“抗体”、“抗原结合片段”或“免疫原性部分”均具有本领域技术人员通常已知的含义。例如抗体的“抗原结合片段”是指通过重组DNA技术或者通过酶或化学切割完整的抗体而产生的，包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv和单链抗体(svFc)。抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体及可以是标记的抗体以及所述抗体的片段、变体或衍生物。抗体标记可以是放射性标记、荧光标记、酶标记、化学发光标记或者生物素基团标记。抗体或其片段其制备及使用是熟知的并且公开在例如Harlow，E.and Lane，D.，Antibodies：A LaboratoryManual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1999。
本领域已知许多针对IL-23蛋白、p19亚基或其同源物的特异性抗体，例如Anti-Human IL-23(p 19)Monoclonal antibody，Clone hlt2736(Biolegend)、Anti-Human IL-23p 19，Clone eBio473P 19(eBioscience)和Anti-Human IL-23p 19Functional Grade Purified，Clone HNU2319(eBioscience)。
还可以利用质谱分析相关领域的技术人员已知的技术检测蛋白质表达和/或结构的变化，这类技术一般来说被分到蛋白质组分析名下，以便检测患者血液中的特异性特征序列。
或者，本发明的方法可以使用检测IL-23的mRNA的变化的任何检测方法来测定所述生物学样品中IL-23的mRNA的水平，其中所述生物学样品中IL-23的mRNA的水平升高指示所述患者具有肝癌患病风险。上述检测方法包括能够检测样品中核酸的各种技术，如Northern印迹，选择性杂交，使用包被寡核苷酸探针的基材例如核酸分子阵列、DNA芯片等，通过例如RT-PCR、定量PCR或者连接PCR的核酸扩增等等。这些方法可以包括使用能够选择性或者特异性检测样品中核酸靶的核酸探针或者引物。例如，本领域技术人员已知并且可以参考标准条件(Sambrook，Fritsch，Maniatis(1989)Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press)进行杂交，例如可以在高、中或者低严格性条件下进行杂交。或者，本领域技术人员可以利用已知的各种方法进行扩增，如PCR、LCR、转录介导的扩增(TMA)、链置换扩增(SDA)、NASBA、等位基因特异性寡核苷酸(ASO)的使用、等位基因特异性扩增、Southern印迹、单链构像分析(SSCA)、原位杂交(例如FISH)、凝胶迁移、异源双链分析等等。
本文所述“水平升高”是指通过检测上述生物学样品获得的值与参照值例如在未患肝癌的慢性乙肝感染者或者正常人中观察到的中间值或者平均值、或者与基于实验证据和/或现有技术数据针对慢性乙型肝炎病毒感染对象例如人具有发生肝癌倾向的截断值相比是升高的。
在一个实施方案中，所述检测样品中IL-23水平升高是检测样品中IL-23水平与对照样品中IL-23水平相比是升高的。
本文所用术语“对照样品”典型地是指来自具有慢性乙型肝炎病毒感染但无肝癌病变特征的对象的生物学样品。靶的水平的确定典型地遵循本领域熟知的已建立的标准程序(参见例如Current Protocols in Immunology.Wiley&Sons，Hoboken，NJ；Current Protocols in Molecular Biology.Wiley&Sons，Hoboken，NJ)。确定可以在蛋白质水平或RNA水平进行，例如使用酶联免疫分析或Western印迹方法进行蛋白水平检测，或者RNA特异性探针进行Northern印迹分析，或者在逆转录(及克隆)RNA后通过定量PCR或实时PCR技术在DNA水平进行。
所获得的一或多种待测样品和一或多种对照样品的水平之间的差异可以归一化至进一步的对照核酸例如管家基因的水平，管家基因的水平已知不根据细胞的疾病状态而不同。举例的管家基因包括β-肌动蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和核糖体蛋白P1等。
但是，代替在任何实验中确定一或多种对照样品的水平，也可以基于实验证据和/或现有技术数据定义针对特定疾病表型(即疾病状态)的一或多个截断值。
在本文中，截断值是指ROC曲线各点中阳性似然比(为真阳性率与假阳性率之比)与阴性似然比(为假阴性率与真阴性率之比)比值最大的点。
因此，在一个实施方案中，所述检测样品中IL-23水平升高是检测样品中IL-23蛋白水平高于截断值。在本发明一个优选的实施方案中，所述截断值为855pg/ml。
在本发明中，术语“鉴定具有发生肝细胞癌症的倾向”也包括预测和可能性分析(“诊断”意义上)。本文公开的组合物和方法意在临床应用，以决定治疗形式，包括治疗性或预防性干预，诊断标准如疾病阶段，和疾病监控和疾病监视。根据本发明，可提供用于检查对象状态的中间结果。这种中间结果可与额外信息组合以帮助医生、护士或其它从业人员诊断出该对象患有该疾病或者具有患有该疾病的风险。
本文所用术语“多肽”，“肽”和“蛋白质”可互换使用，指氨基酸残基的聚合物，其包含经肽键结合的9个或更多个氨基酸。聚合物可以是线性的，分枝的或环状的，可包含天然存在的和/或氨基酸类似物，它可被非氨基酸间断。通常，若氨基酸聚合物是长的(例如超过50个氨基酸残基)，其优选称为多肽或蛋白质，但是若其是50个氨基酸长或更短，优选称为“肽”。在本文中，术语“核酸”，“核酸分子”，“多核苷酸”和“核苷酸序列”可互换使用，定义任何长度的多聚物，如聚脱氧核糖核苷酸(DNA)(例如cDNA，基因组DNA，质粒，载体，病毒基因组，分离的DNA，探针，引物和其任何混合物)或聚核糖核苷酸(RNA)分子(例如mRNA，反义RNA)或混合的聚核糖-聚脱氧核糖核苷酸。它们包含单链或双链，线性或圆形，天然或合成的多核苷酸。此外，多核苷酸可包括非-天然存在的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物和可被非核苷酸组分间断。如果存在，在聚合之前或之后可进行核苷酸修饰。
在另一个方面，本发明还提供了特异性检测IL-23蛋白或IL-23的mRNA的制剂在制备用于鉴定慢性乙型肝炎病毒感染对象例如人具有发生肝癌倾向的组合物中的应用。在一个实例中，所述制剂是IL-23蛋白的配体。本文所述配体可以是受体靶向物质、细胞因子、激素、生长因子、受体特异性抗体以及模式识别受体(PRR)配体。在一个实施方案中，所述配体是抗体(或其抗原结合片段)。在一个实施方案中，所述对象是人。在配体是抗体的实例中，所述抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体及可以是标记的抗体以及所述抗体的片段、变体或衍生物，或者所述抗原结合片段是Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv和单链抗体(svFc)。
在另一个方面，本发明还提供了用于鉴定慢性乙型肝炎病毒感染对象例如人具有发生肝癌倾向的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测来自所述对象的生物学样品、例如血液样品或其衍生物中IL-23蛋白或IL-23的mRNA的水平的制剂。所述试剂盒包括可以用于实施本发明所述方法的任意物质。在一个实例中，本发明的试剂盒包括特异性针对IL-23蛋白或免疫原性片段的抗体。
实施例
本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。
实施例1：
自1996年至1999年在江苏省启东招募在2年内至少2次测试为HBsAg阳性的慢性乙肝病毒(HBV)持续感染的患者。排除丙肝病毒或HIV共感染以及其他伴随性慢性肝病的人群。在基线进行B超检测以排除肝硬化和HCC的存在，在随访过程中，无人接受过抗病毒治疗。研究方案获得中国医学科学院和启东肝癌防治研究所癌症研究所/医院伦理委员会(EthicsCommittee of Cancer Institute/Hospital，Chinese Academy of Medical Sciencesand Qidong Liver Cancer Institute)批准(批准号：#09-59/354)。进展为HCC的所有患者根据2001年《中国抗癌协会肝癌专业委员会》所制定的“原发性肝癌的临床诊断与分期标准”进行诊断，具有至少一个下列标准：(a)AFP≥400μg/L，能排除妊娠、生殖系胚胎源性肿瘤、活动性肝病及转移性肝癌，并能触及肿大、坚硬及有大结节状肿块的肝脏或影像学检查有肝癌特征的占位性病变者；(b)AFP＜400μg/L能排除妊娠、生殖系胚胎源性肿瘤、活动性肝病及转移性肝癌，并有两种影像学检查有肝癌特征的占位性病变或有两种肝癌标志物(DCP、GGT II、AFU及CA19-9等)阳性及一种影像学检查有肝癌特征的占位性病变者。(c)有肝癌的临床表现并有肯定的肝外转移病灶(包括肉眼可见的血性腹水或在其中发现癌细胞)并能排除转移性肝癌者。
患者每24-36个月进行随访。每次随访期间，进行肝功、AFP、乙肝病毒s抗原(HBsAg)、乙肝病毒e抗原(HBeAg)检测。每次随访保存血清样品用于进一步分析，同时进行B超检测。临床肝硬化定义为肝硬化和脾功能亢进迹象特征。发生HCC前随访时间定义为首次血清收集时间和诊断出HCC之间的时间间隔。当随访在2009年6月结束时每名患者被访问3-4次。
实施例2：实验及统计方法
使用Quansys(Quansys Biosciences，Logan，Utah)的Human 9-plex分析试剂盒检测人血清细胞因子水平，所述试剂盒含有下述9种细胞因子：IL-1α，IL-1β，IL-6，IL-8，IL-10，IL-17，IL-23，IFNγ和TNFα。根据生产商手册的指导进行检测分析，该分析具有高灵敏性和广泛的动力学范围(IL-1α：0.87-450pg/ml；IL-1β：3.24-1400pg/ml IL-6：3.81-475pg/ml；IL-8：0.21-125pg/ml，；IL-10：0.22-190pg/ml；IL-17：1.63-450pg/ml；IL-23：18.64-8000pg/ml，TNFα：0.73-350pg/ml；IFNγ：0.25-100pg/ml，通过软件计算超出所述动力学范围的细胞因子浓度)。每个样品重复检测两次，使用平均值进行数据分析。为了评估储存时间长短是否影响细胞因子稳定性，在同一人的系列血样中检测了与肝功能无关的人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)。结果表明，ECP浓度不随储存时间的长短而发生改变，因此认为本实验所检测的炎症性细胞因子在合适的储存条件下也是稳定的。
分析数据时，连续变量以中间值和四分位数间距表示。通过卡方检测比较分类变量。通过Mann-Whitney U检验比较发展为HCC的患者和保持慢性乙型肝炎病毒感染的对照人群之间的细胞因子水平。无HCC的随访时间通过Kaplan-Meier分析评估。多重逻辑回归模型用于调整与HCC发生相关的潜在因素。通过受试者特性曲线分析评估细胞因子水平在预测HCC发生中的作用。所有统计学测试均为双尾。p＜0.05认为具有统计学显著性。
实施例3：实验结果
至2009年6月，45名患者发展为HCC，45名年龄和和性别相匹配的对照患者被配对。发展为HCC的患者中随访时间中位数(四分位数间距)为108(84，132)个月，对照组中为144(132，144)个月(p＜0.0001)。我们还比较了两组之间的一些特征(表I)。发展为HCC的患者的中位年龄为45(39，52)岁，而对照组为44(41，53)岁(p＝0.79)。因为男性比女性更倾向于发展HCC，因此在所述群中仅有3名女性患者。发展为HCC的28(62％)名患者饮酒，对照组中29(64％)名患者饮酒。他们具有相似的酒精摄入量(p＝0.72)。此外，两组之间吸烟状况和家族病史也无差异。
表I-有和无HCC的慢性乙肝患者的基线特征
Figure BSA00000251213100121
我们检测了9种炎症性细胞因子谱。发展为HCC的患者和对照患者的细胞因子表达谱示于表III。根据该表，我们可以发现IL-23(一种在连接先天免疫应答和适应性免疫应答中发挥重要作用的重要细胞因子)基线水平在发展为HCC的病例患者和对照患者之间具有显著差异。在病例患者中，IL-23(pg/ml)的中位值(四分位数间距)为1315pg/ml(137-3816)，明显高于对照患者(四分位数间距)的227.9pg/ml(84.69-453.2)(p＝0.0014)。
受试者特性曲线也用于确定IL-23在未来HCC发展中的预测作用。ROC曲线下的面积为0.699(95％CI 0.593/0.791)(图1)。当选择ROC曲线各点中阳性似然比/阴性似然比最大处时，IL-23浓度截断值为855pg/ml。我们将发展为HCC的45名病例患者和45名对照患者根据其基线IL-23浓度分为两组：高IL-23组(＞855pg/ml)和低IL-23组(≤855pg/ml)。在病例组中，27(60.0％)名患者具有高IL-23浓度，在对照组中，仅有4名患者具有高IL-23浓度(p＜0.001)，预测HCC发展的灵敏性为60.0％，特异性为91.1％，阳性预测值为87.09％，阴性预测值为69.49％。
表II-与对照组相比，病例组中IL-23异常表达的比例显著增加
Figure BSA00000251213100132
(1)灵敏性，即病人中得出阳性检测的样本占病人总数的百分比TP/(TP+FN)；
(2)特异性，即对照组中得出阴性检测的样本占对照组总数的百分比TN/(FP+TN)；
(3)阳性预测值，即得出阳性检测的样本总数中，病人样本占阳性检测样本总数的百分比TP/(TP+FP)；
(4)阴性预测值，即得出阴性检测的样本总数中，对照样本占阴性检测样本总数的百分比TN/(FN+TN)。
Kaplan-Meier分析结果显示所述研究中高基线IL-23浓度和HCC的累积发病率是显著相关的。144个月中HCC累积发病率自低IL-23浓度患者中的25.42％增加至高IL-23浓度患者中的78.71％(p＜0.001)。逻辑回归检验结果表示高IL-23浓度(＞855pg/ml)是HCC发展的危险因子(对于包括年龄、性别、饮酒、吸烟和家族史在内的潜在干扰因素进行调整后OR＝14.0295％CI 4.289/45.871p＜0.001)。在最后的随访中，发展为HCC的病例患者中的IL-23水平与对照患者无显著差异(p＝0.599)。我们还检测了HCC诊断前IL-23浓度相对于时间的改变。在研究结束前，我们将样品分为5个时间段。在对照患者中，在随访期间IL-23浓度保持恒定。在发展为HCC的患者中，在疾病进展早期IL-23浓度较高。然后浓度降低，随访结束前0-24个月发展为HCC的患者和对照患者之间无差异(图3)。
除了IL-23，在病例患者和对照患者之间其他8种细胞因子谱在基线水平无显著差异。
Figure BSA00000251213100151
Figure ISA00000251213300011

Claims (15)

1.一种鉴定慢性乙型肝炎病毒感染对象例如人具有发生肝癌倾向的方法，包括：
检测得自所述对象的生物学样品中IL-23的水平，
其中检测样品中IL-23水平升高是所述对象具有发生肝癌倾向的指征。
2.权利要求1的方法，其中所述生物学样品是血液样品如血清或其衍生物。
3.权利要求1或2的方法，其中所述样品中IL-23的水平通过检测IL-23蛋白或IL-23的mRNA的水平来确定。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中检测所述样品中IL-23蛋白的水平。
5.权利要求4的方法，其中通过使用IL-23特异性抗体或其抗原结合片段检测所述生物学样品中IL-23蛋白的水平。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中检测样品中IL-23水平升高是检测样品中IL-23水平与对照样品中IL-23水平相比是升高的。
7.权利要求4或5的方法，其中检测样品中IL-23水平升高是检测样品中IL-23蛋白水平高于截断值，例如高于855pg/ml。
8.权利要求4或5的方法，其中样品中IL-23蛋白的水平通过检测p19亚基或其同源物来确定。
9.IL-23特异性抗体或其抗原结合片段在制备用于鉴定慢性乙型肝炎病毒感染对象例如人具有发生肝癌倾向的组合物中的应用。
10.一种用于鉴定慢性乙型肝炎病毒感染对象例如人具有发生肝癌倾向的组合物，其中所述组合物包含用于检测所述对象的生物学样品中IL-23水平例如检测IL-23蛋白、或IL-23的mRNA的水平的制剂。
11.权利要求10的组合物，其中所述生物学样品是血液样品例如血清或其衍生物。
12.权利要求10的组合物，其中所述制剂是针对IL-23蛋白的特异性抗体，例如单克隆或多克隆抗体。
13.用于鉴定慢性乙型肝炎病毒感染对象例如人具有发生肝癌倾向的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测所述对象的生物学样品中IL-23水平例如检测IL-23蛋白、或IL-23的mRNA的水平的制剂。
14.权利要求13的试剂盒，其中所述生物学样品是血液样品例如血清或其衍生物。
15.权利要求13或14的试剂盒，其中所述制剂是针对IL-23蛋白的特异性抗体，例如单克隆或多克隆抗体。
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