CN101991670A - 一种α-葡萄糖甙酶活性抑制剂及在制备糖尿病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种α-葡萄糖甙酶活性抑制剂及在制备糖尿病药物中的应用，该方法以蔷薇科植物仙鹤草为原料，乙醇为提取溶剂，进行热回流，合并醇提液，浓缩，制成浸膏，浸膏用水溶解，按极性大小先后用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇对水溶液进行萃取，挥干乙酸乙酯部位的溶剂得乙酸乙酯部位的浸膏即是仙鹤草提取物，也即本发明的α-葡萄糖甙酶活性抑制剂；仙鹤草提取物与a-葡萄糖甙酶和作为底物的4-硝基酚-a-D-吡喃葡萄糖甙反应，根据添加提取物后葡萄糖量的变化值可推断出提取物具有抑制a-葡萄糖甙酶的活性而降糖作用，添加了该提取物的药物组合物或食品组合物具有降糖作用而可用于防治糖尿病。

Description

一种α-葡萄糖甙酶活性抑制剂及在制备糖尿病药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种α-葡萄糖甙酶活性抑制剂及在制备糖尿病药物中的应用。

背景技术

糖尿病在全世界的发病率有逐年增高的趋势，在发达国家已被列为继心血管疾病及肿瘤之后的第三大疾病，其中2型糖尿病是占了糖尿病患者的90％。目前糖尿病对人类健康危害最大的是在动脉硬化及微血管病变基础上产生的多种慢性并发症，如糖尿病性心脏病、糖尿病性脑血管病、糖尿病性肾病等，已引起全世界医学界的高度重视。

中药与其他降糖药物相比，其优势在于，不仅能降低血糖，还能发挥复方多靶点、多途径的优势对机体进行调整，通过辨证施治，改善患者糖耐量异常、降低血粘度，达到预防大血管及微血管病变，降低糖尿病并发症的效果。

α-葡萄糖甙酶活性抑制剂能抑制肠道内的蔗糖酶等糖水解酶，从而能延缓或减少肠道对糖的摄取，起到防治糖尿病的作用。仙鹤草提取物具抑制α-葡萄糖甙酶活性，起到防治糖尿病尤其是并发症的作用，是一种有广阔应用前景的治疗糖尿病的药物。目前用于临床的α-葡萄糖甙酶抑制剂有三种：阿卡波糖、伏格列波糖，米格列醇。经临床应用，均取得了较好的疗效，但它们种类太少，也都存在这样或那样的副作用，临床上没有更多的选择余地。因此，开发更多，更有效、副作用更少的α-葡萄糖甙酶抑制剂供临床选择使用就显得尤为重要。近年来。从中药中筛选出α-葡萄糖甙酶抑制剂成为国内研究降糖药物的热点之一。

发明内容

本发明目的在于提供来源于植物，通过α-葡萄糖甙酶活性防治糖尿病的药物。

本发明人以蔷薇科(Rosaceae)植物的仙鹤草为原料。

本发明制备仙鹤草提取物，使其与α-葡萄糖甙酶和作为其底物的4-硝基酚-a-D-吡喃葡萄糖甙反应，用紫外-可见分光光度计在400nm处测吸光度的变化值来测定葡萄糖量。对葡萄糖量的测定后发现仙鹤草提取物能显著抑制α-葡萄糖甙酶的活性。仙鹤草提取物能抑制四氧嘧啶糖尿病小鼠和链佐霉素糖尿病小鼠高血糖的上升，有较强的降糖活性。

仙鹤草提取物同时有抑制α-淀粉酶的活性从而起到防治糖尿病的效果。

本发明提供的一种α-葡萄糖甙酶活性抑制剂用以下方法提取获得：首先取干燥的仙鹤草1kg粉碎，过60目筛，称取仙鹤草被中药粉碎机粉碎后过60目筛所得的粉末100g于2000ml圆底烧瓶中，加1000ml的质量浓度为60％的乙醇为提取溶剂，加热至80℃进行热回流，回流提取3次，每次1小时，合并醇提液，浓缩，制成浸膏；浸膏用水溶解，按极性大小先后用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇对水溶液进行萃取，挥干乙酸乙酯部位的溶剂得乙酸乙酯部位的浸膏即是仙鹤草提取物，也即本发明的α-葡萄糖甙酶活性抑制剂。

本发明提供的一种防治糖尿病的医药组合物，其含有所述的α-葡萄糖甙酶活性抑制剂，以及药学上可接受的辅助剂。

本发明提供的一种防治糖尿病的食品组合物，其含有所述的α-葡萄糖甙酶活性抑制剂。

所述的药物制成片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂或乳剂。

本发明的有益效果是：本发明提取物与目前市场上α-葡萄糖甙酶抑制剂降糖药相比具有更强的抑制α-葡萄糖甙酶活性，又同时能抑制α-淀粉酶活性等，各种降糖机理同时协同发挥降糖作用，与目前市场上的降糖药相比，不仅具有较好的降糖效果，还能降低糖尿病性心脏病、糖尿病性肾病等糖尿病并发症的效果。

附图说明

图1是提取物的剂量对抑制率的影响图。

图2是提取物对温度的稳定性实验图。

图3是提取物对pH的稳定性实验图。

图4是提取物对α-葡萄糖甙酶的抑制动力学实验图。

具体实施方式

以下结合实际情况，对本明的具体实施方式作详细说明：

实施例1

仙鹤草提取物的制备

实施中，以在广州附近采的仙鹤草(由广东中研所蔡岳文教授鉴定为蔷薇科(Rosaceae)植物仙鹤草(Agrimonia pilosa Ledeb.))为例，首先取干燥的仙鹤草1kg粉碎，过60目筛，称取仙鹤草被中药粉碎机粉碎后过60目筛所得的粉末100g于2000ml圆底烧瓶中，加1000ml的质量浓度为60％的乙醇为提取溶剂，加热至80℃进行热回流，回流提取3次，每次1小时，合并醇提液，浓缩，制成浸膏。浸膏用水溶解，按极性大小先后用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇对水溶液进行萃取，挥干乙酸乙酯部位的溶剂得乙酸乙酯部位的浸膏，即是本发明所指的仙鹤草提取物。

本发明中所述的仙鹤草提取物作为一种α-葡萄糖甙酶活性抑制剂能抑制α-葡萄糖甙酶活性达到防治糖尿病的作用。

实施例2

PBS溶液的配制

又称磷酸盐缓冲溶液，一般选择K₂HPO₄和KH₂PO₄配制，因为钠盐溶解的较慢。根据不同pH的溶液，称量不同质量的磷酸盐，也可以用pH计调溶液的pH。PBS一般用作支持电解质。其配置方法如下：采用去离子水、KH₂PO₄和Na₂HPO₄·2H2O配制PBS溶液，按以下步骤进行：(1)配制1/15mol/L KH₂PO₄，即每升水中溶解9.078克KH₂PO₄；(2)配制1/15mol/LNa₂HPO₄·2H₂O，即每升水中溶解11.876克Na₂HPO₄·2H₂O；(3)将18.2％(体积分数)KH₂PO₄溶液和81.8％Na₂HPO₄·2H₂O混合；最终测定PBS液的pH值约为7.4。

实施例3

小肠α-葡萄糖甙酶的提取

雄性大鼠，体重230～280g，左右体重禁食24h，脱颈椎(断头)处死，立即取小肠上段，用预冷的PBS冲洗2次，翻转小肠后再漂洗，将洗净的小肠置于冰台上，用粗卫生纸掖干小肠上的黏液，用载波片轻刮下小肠黏膜，称重，按1∶10比例加入PBS溶液匀浆，于4℃，14000xg离心30min，弃上清，沉淀用预冷的PBS洗两次，均于4℃，14000xg离心30min，最后沉淀按1∶5用PBS稀释后，于4℃，500xg离心10min，上清液供实验用。Bradford法测定蛋白浓度。

实施例4

α-葡萄糖甙酶反应体系的建立

67mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.8)1.7ml，1mg/ml GSH 50μl，20mg/mlα-葡萄糖甙酶提液5μl，37℃水浴反应10min后，加入0.116mol/L PNPG过饱和溶液50μl，37℃水浴反应10min后，加入0.1mol/L碳酸钠溶液10ml终止反应。

实施例5

仙鹤草提取物对α-葡萄糖甙酶活性影响的测定

仙鹤草提取物溶液25μl(终浓度为30μg/ml)加入到标准反应体系(***缓冲液体积相应减少)中，而后先与酶保温10min，再加底物(0.116mol/L PNPG过饱和溶液50μl)反应10min，0.1mol/L碳酸钠溶液10ml终止反应，测定400nm处吸光度。用蒸馏水代替酶和仙鹤草提取物液作空白试验，蒸馏水代替酶液作背景实验，其他步骤及试剂同上。酶抑制率测定公式如下：

式中：A空白为不加样品反应后的吸光度值；A样品为加入样品反应后的吸光度值；A背景为只加样品的吸光度值。

结果见表1：

表1：仙鹤草提取物α-葡萄糖甙酶活性影响的测定

实施例6

仙鹤草提取物对α-淀粉酶活性影响的测定

取适量用0.12mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.10)制备的a-淀粉酶储备液，加入100μl浓度为10g/L的可溶性淀粉，37℃反应5min。反应完成后加入500μl 3，5-DNS(3，5-二硝基水杨酸)，沸水浴10min，取出反应液室温冷却15min，在546nm处测定吸光度值。调整抑制剂溶液及a-淀粉酶溶液的浓度或用量，使A₅₄₆nm的值在0.4～0.7范围内为宜。酶的活性直接由A₅₄₆nm读数表示。待测样品抑制率按以下公式计算：

A_酶为a-淀粉酶在A₅₄₆nm的读数，A_样为待测样品在A₅₄₆nm的读数

表2：仙鹤草提取物α-淀粉酶活性影响的测定

实施例7

仙鹤草提取物对四氧嘧啶糖尿病小白鼠血糖的影响

取小白鼠35只分正常对照组10只和造模组25只，禁食不禁水24h，造模组腹腔注射四氧嘧啶水溶液200mg/kg，正常对照组腹腔注射等体积生理盐水，正常喂食，给水5d后，禁食(不禁水)2h，眼眶取血约0.2ml，按邻甲苯胺法测定血糖。血糖值＞10.0mmol/L的小白鼠可视为造模成功。取造模成功的四氧嘧啶糖尿小白鼠20只，随机分成2组，每组10只，分为模型组、仙鹤草提取物服用组。正常对照组和模型组灌胃蒸馏水，仙鹤草提取物服用组给予仙鹤草提取物，每天1次，给药剂量均为0.2ml/10g，连续7d，正常喂食、给水。末次给药后禁食(不禁水)2h，眼眶取血约0.2ml，测定血糖。血糖降值见下表，由表中数值可以看出，仙鹤草提取物对四氧嘧啶糖尿病小白鼠血糖的影响显著，有较强的降糖活性。

表3糖尿病鼠血糖影响

实施例8

仙鹤草提取物剂量对α-葡萄糖甙酶活性的影响

分别移取不同体积浓度为1mg/ml的仙鹤草浸物溶液，测定其对α-葡萄糖甙酶的抑制活性。

如图1所示，随着提取物溶液的剂量(1mg/ml)的提高，抑制率逐渐上升，当当加入60μl此时，最高抑制率可达68.2％。

实施例9

仙鹤草提取物对温度的稳定性试验

先将浓度为1mg/ml的仙鹤草浸物溶液分别于0、20、40、60、80、100℃保温30分钟，迅速冷却至室温，然后取60μl体积测定其对α-葡萄糖甙酶的抑制活性。

如图2所示，仙鹤草提取物对α-葡萄糖甙酶的抑制率不随温度(在0～100℃范围内)的变化而发生明显的改变

实施例10

仙鹤草提取物对pH的稳定性试验

先将仙鹤草提取物用pH值为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0的缓冲液配成浓度为1mg/ml的溶液放置10分钟后取60μl不同pH的抑制剂溶液测定其对α-葡萄糖甙酶的抑制活性。

如图3所示，在pH值6～11的条件下活性较高，当pH值<6和pH值>11时，抑制率明显下降。

实施例11

仙鹤草提取物的酶促动力学实验

将5只试管编号，依次加入一定量磷酸缓冲液(pH 6.8)，再各加入20μl0.5mg/ml还原型谷胱甘肽，10μl 0.0167U/ml α-葡萄糖甙酶，一定量抑制剂溶液(1mg/ml)，37℃保温10min后，依次加入4、8、12、16、20μl的PNPG底物，继续保温10min，测定400nm处的吸光值。每管应满足体系总体积为1ml。按Lineweaver--Burk作图法，确定没食子酸的抑制类型和抑制常数，求出Km(米氏常数Km值等于酶促反应速度为最大速度一半时的底物浓度)和Ki(抑制解离常数Ki值等于其抑制50％时的抑制剂浓度)。

如图4所示，添加仙鹤草提取物与不加仙鹤草提取物在纵轴上交于一点，由此可推断仙鹤草提取物抑制α-葡萄糖甙酶活性的类型属于竞争性抑制类型。可求出抑制解离常数Ki＝96.8μg/ml。

Claims (4)

1.一种α-葡萄糖甙酶活性抑制剂，其特征在于该抑制剂用以下方法提取获得：首先取干燥的仙鹤草1kg粉碎，过60目筛，称取中药粉碎机粉碎仙鹤草过60目筛所得粉末100g于2000ml圆底烧瓶中，加1000ml的质量浓度为60％的乙醇为提取溶剂，加热至80℃进行热回流，回流提取3次，每次1小时，合并醇提液，浓缩，制成浸膏；浸膏用水溶解，按极性大小先后用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇对水溶液进行萃取，挥干乙酸乙酯部位的溶剂得乙酸乙酯部位的浸膏即是仙鹤草提取物，也即本发明的α-葡萄糖甙酶活性抑制剂。

2.一种防治糖尿病的医药组合物，其含有权利要求1所述的α-葡萄糖甙酶活性抑制剂，以及药学上可接受的辅助剂。

3.一种防治糖尿病的食品组合物，其含有权利要求1所述的α-葡萄糖甙酶活性抑制剂。

4.根据权利要求2所述的药物，其特征在于所述的药物制成片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂或乳剂。

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