CN101991611A - 活性生物抗菌物及其生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种活性生物抗菌物及其生产方法。所说的活性生物抗菌物，是以蛭弧菌和噬菌体的培养物为主要成份按比例混合制成。主要制备步骤：是先分别获得蛭弧菌培养物和噬菌体培养物，再将它们按1∶1-1∶1000000的比例配制，即蛭弧菌的含量为10-1010/pfu，噬菌体的含量为10-1016/pfu；混合配制，使其悬浮在媒介液或混合在赋形剂中；即得到产品。本发明用于防治人体、动物、植物细菌病，果、蔬、花卉、食品、水产品保质保鲜和清除环境中有害细菌、抑制蓝藻生长具有明显的效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种防治人体、动物、植物细菌病，果、蔬、花卉、食品、水产品保质保鲜和清除环境中有害细菌、抑制蓝藻生长的生物制剂——活性生物抗菌物及其生产方法，属于生物制品及其制造领域。
背景技术
目前国内外用于细菌病的防治药品，主要有抗生素和化学合成抗菌药物。此类药物的使用，一是不断产生抗药菌株，有效用药量逐渐增大，引起对所有抗菌药物都不敏感的“超级细菌”的产生；二是在体内残留，抑制机体正常生长代谢，殃及人体健康；三是污染环境，同样会危害人体健康。因此，研制开发高效无毒的生物防治细菌病的方法和制品引起了人们极大的兴趣和关注，各类生物生态制剂的研究正在崛起，以菌制菌的生物防治方法倍受重视。
60年代发现的蛭弧菌是一类专门以捕食细菌为生的寄生性细菌，具有“寄生”和“溶解(杀灭)”有害细菌的独特的生物学特性，它通常比一般细菌小。蛭弧菌的作用可有选择的吸附到宿主菌细胞上并进入宿主菌细胞内，在其中生长繁殖，最终导致宿主菌细胞裂解。它对许多人体、动物、植物致病菌和环境中的有害细菌都有寄生和裂解的作用，这一独特的生物学特性引起了研究者的高度重视。但长期以来，国内外研究者一直认为蛭弧菌的生长温度为20-30℃，最适生长温度为26.3℃，35℃以上就不能生长繁殖，且只能在活菌上生长。而人体内的正常温度一般为37℃左右，动物体内的正常温度一般为40℃左右。除蛭弧菌对温度特别敏感外，环境中培养的蛭弧菌在体内易失活；又在活菌上培养蛭弧菌的生产过程中，活菌易污染环境，且培养周期长，收获量低，培养物中活菌的残留对环境有害；尤为突出的是，蛭弧菌对宿主裂解范围广、敏感性强，但特异性不及噬菌体。
因此人们利用蛭弧菌防治人体、动物、植物细菌病，果、蔬、花卉、食品、水产品保质保鲜和清除环境中有害细菌、抑制蓝藻生长的开发和应用受到了极大的限制。
噬菌体是20世纪初发现的一类能溶解(杀灭)细菌的细菌病毒。噬菌体对宿主菌细胞有高度的特异性，噬菌体的宿主范围是鉴别菌株的一个有用的特性。噬菌体用于某些细菌病的治疗具有独特的效果，尤其是对耐药菌株引起的疾病。噬菌体是以尾鞘吸附到宿主菌细胞特定的受***点上，收缩头部通过尾针向宿主菌细胞体内注射DNA，并在宿主菌细胞体内复制子代，最终类似蛭弧菌溶解宿主菌细胞的方式，释放子代。噬菌体不能在停止新陈代谢的宿主菌细胞内生长繁殖。噬菌体对宿主菌的敏感性不及蛭弧菌，但噬菌体对相应的宿主菌高度特异。
蛭弧菌培养物和噬菌体培养物联合使用，使得蛭弧菌的敏感性和噬菌体的高度特异性优势互补，有显著的协同作用。完全可以消除使用抗生素和化学合成药物产生抗药性、体内残 留、抑制正常生长代谢、污染环境的弊端。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种以蛭弧菌和噬菌体的混合培养物为主要成分，用于防治人体、动物、植物细菌病，果、蔬、花卉、食品、水产品保质保鲜和清除环境中有害细菌、抑制蓝藻生长的生物制剂——活性生物抗菌物及其生产方法。
实现本发明目的的技术解决方案是：一种活性生物抗菌物，是以蛭弧菌和噬菌体的培养物为主要成份按比例混合制成，其特征在于，蛭弧菌和噬菌体的混合培养物通过以下方法制备：
(1)蛭弧菌培养物的获得：先制得失活的蛭弧菌宿主菌，然后以此失活宿主菌为宿主，用蛭弧菌常规培养法制取蛭弧菌培养物，再选择于自来水双层琼脂平板上噬斑典型的、能裂解有害细菌的、不破坏有益细菌的、在10-43℃环境中能生长的蛭弧菌菌株，然后将上述过程中制得的失活宿主菌和选育出的蛭弧菌悬浮在稀释液中，校正其pH值3.8-10.0，在10-43℃环境中发酵培养，发酵培养物或将发酵培养物冻干后备用。
(2)噬菌体培养物的获得
制取敏感的噬菌体宿主菌悬液，用噬菌体双层琼脂培养法制取噬菌体培养物，再选择于营养肉汤双层琼脂平板上噬斑典型的能裂解有害细菌的烈性噬菌体，挑取透明度好的单噬斑浸泡于营养肉汤中，然后，取上清再制营养肉汤双层琼脂平板，最后将上述过程中制得的噬菌体培养物和敏感的宿主菌悬液悬浮在营养肉汤中，校正其pH值3.8-10.0，在10-43℃环境中发酵培养，发酵培养物经过除菌过滤去除敏感的宿主菌，经检验确定无菌的发酵培养物或将发酵培养物冻干备用。
(3)将上述蛭弧菌发酵培养物或将发酵培养物过滤浓缩冻干粉和经检验确定无菌的噬菌体发酵培养物或将发酵培养物冻干粉按1∶1-1∶1000000的比例配制，即蛭弧菌的含量为10-1010pfu/ml，噬菌体的含量为10-1016pfu/ml；混合配制，使其悬浮在媒介液或混合在赋形剂中；即得到产品。
上述步骤(1)具体可以是：用常规方法制取宿主菌悬液；然后加热，或用氯仿(三氯甲烷)处理，制得失活宿主菌悬液；然后以此失活宿主菌悬液为宿主，用蛭弧菌常规培养法制取其培养物，再选择于自来水双层琼脂平板上噬斑典型的、能裂解相应有害细菌的、不破坏有益细菌的蛭弧菌菌株，然后，再制双层琼脂平板，调高温度培养，选育出在10-43℃环境中能生长的蛭弧菌菌株，最后将上述过程中制得的失活宿主菌悬液和选育出的蛭弧菌按10∶1-105∶1的比例悬浮在稀释液中，校正其pH值为3.8-10.0，在30-43℃环境中发酵培养，发酵培养物或将发酵培养物冻干后备用。
上述步骤(2)具体操作是：用常规方法制取敏感的(相对应的有害细菌)宿主菌悬液，用噬菌体双层琼脂培养法制取其培养物，再选择于营养肉汤双层琼脂平板上噬斑典型的、能裂解相应有害细菌的烈性噬菌体，挑取透明度好的单噬斑浸泡于营养肉汤中，然后，将上述 过程中制得的噬菌体培养物和敏感的(相对应的有害细菌)宿主菌悬液按1∶10-1∶105的比例悬浮在营养肉汤液中，校正其pH值为3.8-10.0，在10-43℃环境中发酵培养，发酵培养物经过除菌过滤去除敏感的(相对应的有害细菌)宿主菌。经检验确定无菌的发酵培养物或将发酵培养物冻干备用。
用本产品防治人、动物体细菌病时，以口服产品给药为主要途径，也可辅以其他给药途经；用于水生动物细菌病防治时，产品直接泼洒到养殖环境水体中的方式，也可辅以口服；用本产品防治植物细菌病时，可以根部包埋，或叶面喷洒；果、蔬、花卉、食品、水产品保质保鲜以叶面喷洒为主要给药途径，也可浸泡；用本产品清除环境中有害细菌和蓝藻类时，可以直接泼洒到环境水体中。
本发明所提供的活性生物抗菌物经中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体研究室测试，对人体致病菌伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌等人体有害细菌的裂解率在75-95.38％以上。南京农业大学、山东农业大学测试，对动物致病菌猪大肠杆菌、鸡白痢杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、耶尔森氏菌、链球菌、假单胞菌、嗜水气单胞菌、副溶血性弧菌，溶藻弧菌、伤口弧菌、鳗弧菌、肠型点状气单胞菌、柱状屈挠杆菌、荧光假单胞菌、和植物致病菌水稻白叶枯病菌、白菜软腐病菌、生姜青枯病菌等动、植物有害细菌的裂解率在92.43％以上。南京农业大学、天津农业大学、江西农业大学、江苏省畜牧局测试，产品用于防治仔猪肠道细菌病的结果显示，预防保护率为87.46-99.33％，降低死亡率99％以上。江苏省农产品质量检验检测中心、南京市科技局农业处、山东省莱芜市农业局科技处测试结果显示，活性生物抗菌物用于黑莓等果蔬食品保质保鲜时，可延长保质保鲜期3-7天；用于辣椒、生姜青枯病的防治，保护率为79.86-94.12％，对植物常见的致病菌，如柄锈菌、假单胞菌、水稻白叶枯病菌、胡萝卜软腐病欧文氏菌、柑桔溃疡病黄单胞菌、白菜软腐病菌等的裂解率为93.76％。
本发明公开的生产活性生物抗菌物的方法，避免了在活菌上培养蛭弧菌所造成的环境污染，而且培养周期短、产量高；特别是使得蛭弧菌、噬菌体对细菌病防治人体、动物、植物细菌病，果、蔬、花卉、食品、水产品保质保鲜和清除环境中有害细菌、抑制蓝藻生长等成为现实。
具体实施方式
本发明中能杀灭有害细菌(是指本领域技术人员所理解的含义)，如沙门氏菌属、弧菌属、志贺氏菌属、大肠埃希氏菌属、耶尔森氏菌属、绿脓假单胞菌属、葡萄球菌属、链球菌属中的大部分致病菌；保护有益细菌(是指本领域技术人员所理解的含义或国家食品药品监督管理部门明文批准的)，如干酪乳杆菌、植物乳杆菌、粪链球菌、乳酸片球菌、枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、乳链球菌、啤酒酵母、产朊假丝酵母、藻泽红假单胞菌、蜡样芽胞杆菌、脆弱拟杆菌等。下述实施例中具体实验筛选得出的菌株，只为说明本发明的方法，不构成对本发明保护范围的限定。
本发明中所说的蛭弧菌和噬菌体，可向菌种保藏机构索取或从环境中分离获得。并分别测定蛭弧菌和噬菌体的裂解范围。选择对常见的沙门氏菌属、弧菌属、志贺氏菌属、大肠埃希氏菌属、耶尔森氏菌属、绿脓假单胞菌属、葡萄球菌属、链球菌属中的大部分有害细菌有裂解(杀灭)作用的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株。
本发明的宿主菌，首先用常规方法获取对蛭弧菌敏感的、不产毒素的非致病菌为宿主菌，如大肠杆菌K12、C600，欧文氏菌，植物乳杆菌等，再用加热或氯仿致死的方法使宿主菌失活。具体做法是(以大肠杆菌C600为例)：向菌种保藏机构索取或从环境中分离得到大肠杆菌(本实验的大肠杆菌C600来源于中国科学院微生物研究所)，将其在营养琼脂上划线分离，培养后，作相应的血清凝集，取凝集反应阳性的单菌落，接种到营养肉汤中，培养后，转种琼脂斜面培养，用灭菌蒸馏水洗脱菌苔，去除培养基中的营养物质，再加入灭菌蒸馏水配制成菌悬液；然后加热灭菌，或者用氯仿(三氯甲烷)处理，即得到失活的大肠杆菌。
其次，以上述失活的大肠杆菌为宿主，首先筛选对有害细菌裂解范围相对较广，又能不破坏有益细菌的蛭弧菌，用蛭弧菌常规培养法获取其培养物后，再对其进行驯化。具体做法是：从菌种保藏机构索取或从环境中分离得到蛭弧菌，并将其和失活的大肠杆菌宿主加入自来水半固体上层琼脂中混合，然后倾倒在自来水双层琼脂平板上，使其凝固，接着培养，选取噬斑典型的蛭弧菌，挑取单噬斑浸泡于灭菌自来水中，然后，取上清再制双层琼脂平板，调高温度培养，并反复数次，直至选育出在10-43℃环境中能生长的蛭弧菌株。
然后，以失活的大肠杆菌为宿主，校正其pH值3.8-10.0，经发酵培养，即得到蛭弧菌培养物，蛭弧菌培养物也可冻干成粉剂。
用噬菌体分离方法获取对有害细菌敏感的噬菌体，具体做法是：向菌种保藏机构索取或从病原体或环境中分离获得致病菌菌株，将其在营养琼脂上划线分离，培养后，作相应的血清凝集，取凝集反应呈阳性的单菌落，接种到营养肉汤中培养，获得致病菌培养物。然后，以致病菌培养物为宿主，筛选对有害细菌裂解性强的噬菌体毒株，用噬菌体常规培养法获取其培养物后，选育出在10-43℃环境中能生长的对对应的致病菌有较强的裂解能力的噬菌体毒株。
然后，以对应的致病菌为宿主，校正其pH值3.8-10.0，经发酵培养，即得到噬菌体培养物，噬菌体培养物也可冻干成粉剂。
最后将得到的蛭弧菌培养物(或冻干培养物)和得到的噬菌体培养物(或冻干培养物)按1∶1-1∶1000000的比例配制，即蛭弧菌的含量为10-1010pfu/ml，噬菌体的含量为10-1016pfu/ml。混合即得到用于防治人体、动物、植物细菌病，果、蔬、花卉、食品、水产品保质保鲜和清除环境中有害细菌、抑制蓝藻生长的生物制剂——活性生物抗菌物。
实施例一：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对不同种属细菌的裂解效果
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；不同种属的细菌菌株由中国药品生物制品检定所提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对24株不同种属细菌敏感的蛭弧菌Bd39、Bd40、Bd59、Bd76、Bd81、Bd94、Bd98、Bd329、Bd334和弧菌噬菌体∮V3、∮M6、∮1a、∮1b，志贺氏菌噬菌体∮P22、∮119X、∮17、∮/F2a，伤寒噬菌体∮Vi、∮S154，致病性大肠杆菌噬菌体∮T2、∮T7，绿脓杆菌噬菌体∮PE5、∮A、∮B。
3、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：
蛭弧菌培养物的制备：参见中华微生物学和免疫学杂志1982，2(1)：12-15。获得的蛭弧菌和失活的大肠杆菌宿主加入自来水半固体上层琼脂中混合，然后倾倒在自来水双层琼脂平板上，使其凝固，接着37℃培养28小时，选取噬斑典型的蛭弧菌，挑取单噬斑浸泡于灭菌自来水中，然后，取上清再制双层琼脂平板，调高温度培养，并反复数次，直至选育出在10-43℃环境中能生长的蛭弧菌株Bd39、Bd40、Bd59、Bd76、Bd81、Bd94、Bd98、Bd329、Bd334。
然后，以失活的大肠杆菌为宿主，校正其pH值至3.8-10.0，经发酵培养，即得到蛭弧菌培养物。
噬菌体培养物的制备：参见Bacteriophages IntersciencePublishers，Inc.，New York USA.或《噬菌体》1975年，司穉东、陈廷祚主译。江苏噬菌体研究室编印。以相应的弧菌，志贺氏菌，伤寒杆菌，致病性大肠杆菌，绿脓杆菌培养物为宿主，筛选对相应弧菌，志贺氏菌，伤寒杆菌，致病性大肠杆菌，绿脓杆菌裂解性强的噬菌体毒株，用噬菌体常规培养法获取其培养物。
最后得到的蛭弧菌培养物，蛭弧菌的含量为103-7pfu/ml；噬菌体培养物，噬菌体的含量为106-13pfu/ml。
4、不同种属细菌培养物的制备：24株不同种属细菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到不同种属细菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌的含量为103-7pfu/ml，噬菌体的含量为106-13pfu/ml混合培养物对24株含量为20-70亿cfu/ml不同菌属中的菌株培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以10-35亿个不同种属细菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48、72小时各观察记录结果1次。同时设以大肠杆菌C600为宿主，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力为对照组。
5、结果见附表1。
表1.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对不同种属细菌的裂解效果
6、试验结论：
1)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对22株不同种属的致病性细菌都有裂解作用，裂解率为100％；
2)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对2株常用的微生物生态制剂生产用菌株没有裂解作用。
实施例二：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对豚鼠角结膜感染的保护作用
1、菌株来源：中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对福氏志贺氏菌F2 a 301(产毒株)敏感的蛭弧菌Bd98、Bd329和噬菌体∮/F2a。
3、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株，按实施例一的方法进行制备。
4、福氏志贺氏菌培养物的制备：福氏志贺氏菌F2 a301用营养琼脂平板划线分离，37 ℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到福氏志贺氏菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌含量为106pfu、噬菌体含量为108pfu混合培养物和福氏志贺氏菌含量为2.5×106cfu培养物滴入豚鼠眼内，并固定眼睑2分钟。同时设蛭弧菌、噬菌体混合培养物和福氏志贺氏菌培养物对照组。每24小时观察一次。持续5天。
5、结果见表2。
表2.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对豚鼠角结膜感染的保护作用
6、试验结论：
1)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对豚鼠角结膜无刺激作用；
2)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对豚鼠角结膜感染保护率为83.3％。
实施例三：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对伤寒杆菌的裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；伤寒杆菌由江苏省疾病控制中心提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对206株伤寒杆菌敏感的蛭弧菌Bd59、Bd81、Bd98、Bd125、Bd329、Bd334、和伤寒杆菌噬菌体∮/A、∮/D、∮/E、∮/K、∮/M1、∮/36、∮/53、∮/96、∮/Vi。
3、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。蛭弧菌的含量为106pfu/ml，噬菌体的含量每毫升为109pfu/ml。
4、伤寒杆菌培养物的制备：分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到伤寒杆菌培养物。
实验设计：以为106pfu/ml，噬菌体的含量为109pfu/ml混合培养物对206株伤寒杆菌含量为20-30亿cfu培养物的裂解，其中包括标准菌株5株，江苏地方菌株201株(人粪便中分离的199株，污水中分离的2两株)。206株伤寒杆菌中包括已作噬菌体分型为∮/A、∮/D、∮/E、∮/K、∮/M1、∮/36、∮/53、∮/96、∮/Vi的133株及对氨苄青霉素等20种抗菌药物呈不同敏感程度的184株。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20亿cfu伤寒杆菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于25℃培养48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600为对照组， 检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力为。
5、结果见附表3。
表3.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对伤寒杆菌的裂解效果
6、试验结论：
1)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对206株伤寒杆菌中199株有裂解作用，裂解率为96.60％；
2)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对133株不同噬菌体型伤寒杆菌中105株有裂解作用，裂解率为98.10％；
3)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对184株耐药性伤寒杆菌中183株有裂解作用，裂解率为99.50％。
实施例四：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对弧菌的裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；弧菌由中国药品生物制品检定所、江苏省疾病控制中心提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对69株弧菌敏感的蛭弧菌Bd81、Bd98和弧菌噬菌体∮/1b、∮/1c、∮/1d、∮/1j。
3、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为106pfu/ml。
4、弧菌培养物的制备：69株弧菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到弧菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为106pfu/ml混合培养物对69株弧菌含量为20-50亿cfu培养物的裂解(包括霍乱弧菌39株，不凝集弧菌10株，副溶血弧菌20株)。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20-50亿cfu弧菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养，48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600为对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力。
5、结果见附表4。
表4.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对弧菌的裂解效果
6、试验结论：
1)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对39株霍乱弧菌中32株有裂解作用，裂解率为82.05％；
2)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对10株不凝集弧菌中8株有裂解作用，裂解率为80.00％；
3)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对20株副溶血弧菌中18株有裂解作用，裂解率为90.00％。
实施例五：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水体中福氏志贺氏菌的清除作用
1、菌株来源：中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对福氏志贺氏菌F2 a 301(产毒株)敏感的蛭弧菌Bd329和噬菌体∮/F2a
3、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。蛭弧菌的含量为106pfu/ml，噬菌体的含量为108pfu/ml。
4、福氏志贺氏菌培养物的制备：福氏志贺氏菌F2 a 301用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中，37℃培养4-6小时，即得到福氏志贺氏菌培养物。
实验设计：于同一水体中，同时加入蛭弧菌的含量为103pfu/ml，噬菌体的含量为104pfu/ml混合培养物和福氏志贺氏菌含量为2500cfu培养物。同时设不加蛭弧菌、噬菌体混合培养物和只加福氏志贺氏菌培养物的对照组。每24小时取水样一次，检测水体中福氏志贺氏菌的数目。持续7天。
5、结果见表5。
表5.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水体中福氏志贺氏菌的清除作用
6、试验结论：
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水体中福氏志贺氏菌的清除率为99.28-99.97％，与对照组比较，经统计学处理(p＜0.01)有非常显著性差异。
实施例六：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中霍乱弧菌的清除作用
1、菌株来源：中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株.和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对霍乱弧菌ElTor18001敏感的蛭弧菌Bd98、Bd329和霍乱弧菌噬菌体∮/1b
3、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备
4、霍乱弧菌培养物的制备：霍乱弧菌Fl Tor18001用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中，37℃培养4-6小时，即得到霍乱弧菌培养物。
实验设计：于同一河水中，同时加入蛭弧菌的含量为102pfu/ml，噬菌体的含量为104pfu/ml混合培养物和霍乱弧菌含量为107cfu培养物/ml。同时设不加蛭弧菌、噬菌体混合培养物，只加霍乱弧菌培养物的对照组。以后定时取水样检测水体中霍乱弧菌的数目。持续13天。
5、结果见表6。
表6.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中霍乱弧菌的清除作用
6、试验结论：
试验组与对照组相比较，蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中霍乱弧菌有明显的清除作用。
实施例七：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中不凝集弧菌的清除作用
1、菌株来源：中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对不凝集弧菌17001敏感的蛭弧菌Bd98和不凝集弧菌噬菌体∮/1i
3、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、不凝集弧菌培养物的制备：不凝集弧菌17001用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到不凝集弧菌培养物。
实验设计：于同一河水中，同时加入蛭弧菌的含量为103pfu/ml，噬菌体的含量为105pfu/ml混合培养物和不凝集弧菌含量为106pfu培养物/ml。同时设不加蛭弧菌、噬菌体混合培养物，只加不凝集弧菌培养物的对照组。以后定时取水样检测水体中不凝集弧菌的数目。持续48天。
5、结果见表7。
表7.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中不凝集弧菌的清除作用
6、试验结论：
试验组与对照组比较，蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中不凝集弧菌有明显的清除作用。
实施例八：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水生动物致病菌裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；水生动物致病菌由中国水产科学院无锡淡水渔业研究中心和上海水产大学提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对11株水生动物致病菌敏感的蛭弧菌Bd59、Bd81、Bd98、Bd296、Bd329和嗜水气单胞菌∮PB31、耶尔森氏菌∮YB1、副溶血性弧菌∮VP3a01、溶藻弧菌∮VB131、荧光假单胞菌∮PS039等噬菌体。
3、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行 制备。
4、水生动物致病菌培养物的制备：11株水生动物致病菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到水生动物致病菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为108pfu/ml混合培养物对11株水生动物致病菌含量为106-12cfu/ml培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20亿cfu水生动物致病菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600为对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力。
5、结果见表8。
表8.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对11株水生动物致病菌的裂解效果
6、试验结论：
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对11株水生动物致病性细菌都有裂解作用，裂解率为100％。据此推测，蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水生动物细菌病的防治具有较大的理论意义和应用价值。
实施例九：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对嗜水气单胞菌的裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供； 嗜水气单胞菌由江苏省微生物研究所提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对9株嗜水气单胞菌敏感的蛭弧菌Bd81、Bd296和嗜水气单胞菌噬菌体∮PB31。
3、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、嗜水气单胞菌培养物的制备：9株嗜水气单胞菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到嗜水气单胞菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为109pfu/ml混合培养物对9株嗜水气单胞菌含量为106-12cfu/ml培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20亿cfu嗜水气单胞菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力为。
5、结果见表9。
表9.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对嗜水气单胞菌的裂解效果
6、试验结论：
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对9株水生动物致病性细菌嗜水气单胞菌都有裂解作用，裂解率为100％。据此推测，蛭弧菌、噬菌体混合培养物对鱼、虾、贝类水生动物细菌病的防治具有较大的理论意义和应用价值。
实施例十：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对动物致病菌裂解效果测定
1、菌株来源：实验用猪霍乱沙门氏菌C78-2，雏鸡沙门氏菌C79-20，鸡白痢沙门氏菌 C79-13，鸡大肠杆菌C83861，猪大肠杆菌C83907菌株，由中国兽药监察所提供，肠炎沙门氏菌50041由中国药品生物制品检定所提供。蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对6株动物致病菌敏感的蛭弧菌Bd81、Bd98、Bd296、和噬菌体∮P22、∮A、∮1533、∮T7、∮17。
3、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、动物致病菌培养物的制备：猪霍乱沙门氏菌，雏鸡沙门氏菌，鸡白痢沙门氏菌，鸡大肠杆菌，猪大肠杆菌，肠炎沙门氏菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到动物致病菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌含量为103pfu/ml，噬菌体含量为106pfu/ml混合培养物对6株动物致病菌含量为108cfu/ml培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以10亿cfu动物致病菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600为对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力。
5、结果见表10。
表10.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对动物致病菌的裂解效果
6、试验结论：
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对6株动物致病菌都有裂解作用，裂解率为100％。据此推测，蛭弧菌、噬菌体混合培养物对动物细菌病的防治具有较大的应用价值。
实施例十一：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对仔猪黄白痢治疗效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛 选出对猪大肠杆菌敏感的蛭弧菌Bd81、Bd98和猪大肠杆菌噬菌体∮T101。
3、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、实验设计：在南京农业大学江浦实验农场进行。试验随机将已发生黄白痢的30日龄内的仔猪分成两组：一组口服蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为1010pfu/ml混合培养物10ml给药治疗，每天一次，连续3天；另一组是口服庆大霉素100mg给药治疗，每天一次，连续3天。然后每天观察记录仔猪的病程变化情况，连续10天。
5、结果见附表11。
表11.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对仔猪黄白痢的治疗效果
6、试验结论：
1)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对仔猪黄白痢的有治疗效果，治愈率达100％；
2)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对仔猪黄白痢的治疗效果优于庆大霉素，治愈率高于庆大霉素29.42％。
实施例十二：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对仔猪黄白痢防治效果观察
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对朱大肠杆菌敏感的蛭弧菌Bd81、Bd98和猪大肠杆菌噬菌体∮T101。
3、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、实验设计：在江西省南昌市和樟树市进行。试验将2008年南昌市某养猪场和樟树市某养猪场全年繁殖的仔猪常规用蛭弧菌、噬菌体混合培养物预防黄白痢，将已发生黄白痢的仔猪用蛭弧菌、噬菌体混合培养物治疗。
预防试验，自仔猪出生当日采用口腔灌服一次5ml蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为1010pfu/ml混合培养物，十天时加强一次；另一组是口服氧氟沙星50mg给药治疗，十天时加强一次。然后每天观察记录仔猪的黄白痢发生发病情况。连续30天。
治疗试验，试验随机将已发生黄白痢的仔猪分成两组：一组口服蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为1010pfu/ml混合培养物10ml给药治疗，每天一次，连续3天；另一组是口服氧氟沙星200mg给药治疗，每天一次，连续3天。然后每天观察记录仔猪的病程变化情况，连续10天。
5、结果见附表12、13。
表12.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对仔猪黄白痢的预防效果
表13.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对仔猪黄白痢的治疗效果
6、试验结论：
1)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对仔猪黄白痢有预防保护作用，与氧氟沙星组对比可提高预防保护率为82.63％；
2)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对仔猪黄白痢有治疗效果，治愈率为95.83％，与氧氟沙星组对比可提高治愈率18.91％；；
3)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对仔猪黄白痢的防治效果优于氧氟沙星。
实施例十三：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对畜禽细菌病防治效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对畜禽常见致病菌敏感的蛭弧菌Bd81、Bd98、Bd329、Bd334和猪大肠杆菌∮T101、肠炎沙门氏菌∮/50041噬菌体。
3、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、实验设计：实验由江苏省畜牧局组织在江苏省东台、兴化、江都、高邮、江宁等市、区进行。
预防试验，仔猪出生当日采用口腔灌服一次5ml蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为1010pfu/ml混合培养物，十天时加强一次；雏鸡孵出当日采用饮水口服一次0.5ml蛭弧菌含 量为106pfu/ml，噬菌体含量为1010pfu/ml混合培养物，十天时加强一次；对照组口服抗生素。然后每天观察记录畜禽细菌病发生发病情况。连续30天。
治疗试验，试验1，将已发生黄白痢的畜口服蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为1010pfu/ml混合培养物10-30ml给药治疗，每天一次，连续3天；试验2，将已发生细菌病的禽口服蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为1010pfu/ml混合培养物1.0-3.0ml给药治疗，每天一次，连续3天；同时设口服抗生素给药治疗的对照组。然后每天观察记录1次畜禽的病程变化情况，连续10天。
5、结果见附表14、15。
表14.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对畜禽细菌病的预防效果
表15.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对畜禽细菌病的治疗效果
6、试验结论：
1)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对畜禽细菌病的发生和流行有预防保护作用，保护率分别为82.41％、78.22％；分别高于抗生素12.33％、6.12％。
2)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对畜禽细菌病有治疗效果，治愈率分别为100％、99.33％，分别高于抗生素10.68％、22.23％。
3)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对畜禽细菌病的防治效果优于抗生素。
实施例十四：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对雏鸡白痢病的预防效果
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对鸡白痢杆菌敏感的蛭弧菌Bd76、Bd334和肠炎沙门氏菌∮/50041噬菌体。
3、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、实验设计：实验由辽宁省营口市疾病控制中心组织，在辽宁省营口、盘锦抚顺等市进行。
雏鸡孵出当日采用饮水口服一次0.5ml蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为1010pfu/ml混合培养物，连续7天；对照组口服抗生素和空白对照组。然后每天观察记录鸡白痢病的发生发病情况。
5、结果见表16。
表16.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对雏鸡白痢病的预防效果
6、试验结论：
1)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对雏鸡白痢病的预防保护作用，保护率为87.00％，抗生素71.00％。蛭弧菌、噬菌体混合培养物保护率高于抗生素16.00％。
2)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对雏鸡白痢病的预防保护效果优于抗生素。
实施例十五：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对仔鸡白痢病的防治效果
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对禽常见的鸡白痢杆菌敏感的蛭弧菌Bd76、Bd334和肠炎沙门氏菌∮/50041噬菌体。
3、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、实验设计：实验在南京农业大学进行。试验分两组，每组1日龄45只艾维茵雏鸡45只。试验组，每天饮水口服一次0.5ml蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为1010pfu/ml混合培养物，连续4天；对照组不用任何药物。两组饲养环境、管理条件相同。然后连续30天，每天观察记录细菌病发生发病情况。
5、结果见表17。
表17.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对雏鸡白痢病的预防效果
6、试验结论：
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对雏鸡白痢病有明显的预防保护作用，保护率为100.00％。
实施例十六：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对仔鸡白痢病的防治效果
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对禽常见的鸡白痢杆菌敏感的蛭弧菌Bd76、Bd334、Bd329和肠炎沙门氏菌噬菌体∮/50041、大肠杆菌噬菌体∮/T1。
3、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、实验设计：实验在南京市江宁区某养鸡场进行。试验分两组，每组1日龄红波罗、艾维茵雏鸡14600只。试验组，每天饮水口服一次0.5ml蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为1010pfu/ml混合培养物，连续3天；对照组用其他抗菌药物或不用药物空白对照。各组饲养环境、管理条件相同。然后连续56天，每天观察记录细菌病发生发病情况。
3、结果见表18。
表18.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对雏鸡白痢病的预防效果
6、试验结论：
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对雏鸡白痢病有明显的预防作用，与对照组比较保护率为79.34％。
实施例十七：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对仔猪黄白痢治疗效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对猪大肠杆菌敏感的蛭弧菌Bd81、Bd98和猪大肠杆菌噬菌体∮T101。
3、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、实验设计：在南京市江宁区宝华山生猪养猪农场进行。试验用约克杂交良种20日龄内的仔猪233头，试验分成四组：一组口服蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为1010pfu/ml混合培养物5ml，每天一次，连续3天；另两组口服庆大霉素、氯霉素100mg，每天一次，连续3天。同时设不用任何药物的空白对照组。然后每天观察记录仔猪的病程变化情况，连续30天。
5、结果见表19。
表19.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对仔猪黄白痢的预防效果
6、试验结论：
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对仔猪黄白痢有预防效果，保护率达82.11％，保护率高于庆大霉素59.77％、氯霉素71.05％。
实施例十八：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对植物致病菌裂解效果
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。实验用植物致病菌菌株由江苏省农产品质量检验测试中心提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对9株植物致病菌敏感的蛭弧菌Bd81、Bd296、Bd334和噬菌体∮PE5、∮1537、∮119X、∮T7、∮1214。
3、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、植物致病菌培养物的制备：植物致病菌梨火疫病菌EA137、白菜软腐病菌EC153、放 线植物肥大病菌Tr1、菜豆假单胞菌ATCC11355、茄科假单胞菌PS138、番茄溃疡病棒状杆菌CM9、烟草假单胞菌NRRLB877、绿脓杆菌2019、青棵病菌S173分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到植物致病菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为1010pfu/ml混合培养物对9株植物致病菌含量为108cfu/ml培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以30亿cfu植物致病菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600为对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力。
5、结果见表20。
表20.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对植物致病菌的裂解效果
6、试验结论：
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对9株植物致病菌都有裂解作用，裂解率为100％。据此推测，蛭弧菌、噬菌体混合培养物对植物细菌病的防治具有较大的应用价值。
实施例十九：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对黑莓防腐作用的观察
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对植物致病菌敏感的蛭弧菌Bd81、Bd296、Bd334和噬菌体∮PE5、∮1537、∮119X、∮T7、∮1214。
3、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、实验设计：在江苏省句容县黑莓种植基地进行试验。试验分两组：一组是在黑莓采摘前24小时用喷雾法将蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为1010pfu/ml混合培养物均匀喷洒在成熟的拟采摘的黑莓表面，以果实为主。24小时后采摘，采摘后常规保存；二组是在黑莓采摘后当即用喷雾法将以蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为1010pfu/ml混合培养物均匀喷洒在已采摘的黑莓表面，然后常规保存。两组都设不用蛭弧菌、噬菌体混合培养物的空白对照。
5、结果见表21。
表21.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对黑莓防腐作用的观察
6、试验结论：
1)、在黑莓采摘前24小时用喷雾法将蛭弧菌、噬菌体混合培养物均匀喷洒在成熟的拟采摘的黑莓表面，可延长黑莓保质保质保鲜3-4天；
2)、在黑莓采摘后当即用喷雾法将蛭弧菌、噬菌体混合培养物均匀喷洒在已采摘的黑莓表面，可延长黑莓保质保质保鲜1-2天。
实施例二十：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对生姜和青椒青枯病的防治作用
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对植物致病菌敏感的蛭弧菌Bd81、Bd296和噬菌体∮PE5、∮1537、∮119X。
3、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、实验设计：在山东省莱芜市绿色家园蔬菜公司进行试验。试验分两组：一组是选择刚出苗的青椒和生姜各500棵，用蛭弧菌含量为108pfu/ml，噬菌体含量为1010pfu/ml混合培养物10ml浇灌幼苗根部，20天后重复一次，然后连续50天观察记录生长情况；二组是选择已 经发病或有发病苗头的青椒和生姜各50棵，用蛭弧菌含量为每毫升106pfu，噬菌体含量每毫升为1010pfu混合培养物20ml浇灌根部，每天1次连续3天。两组都在相同环境中选同样数量的青椒和生姜幼苗，或发病的青椒和生姜不用蛭弧菌、噬菌体混合培养物的空白对照。
5、结果见表22、23。
表22.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对青椒、生姜青枯预防的效果
表23.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对青椒、生姜青枯治疗的效果
6、试验结论：
1)、用蛭弧菌、噬菌体混合培养物浇灌幼苗根部，对青椒青枯病有预防作用，保护率为82.35％；
2)、用蛭弧菌、噬菌体混合培养物浇灌幼苗根部，对青椒生姜病有预防作用，保护率为73.68％；。
3)、用蛭弧菌、噬菌体混合培养物浇灌幼苗根部，治疗对青椒青枯病的治愈率为85.71％(24/28)；
4)、用蛭弧菌、噬菌体混合培养物浇灌幼苗根部，治疗对生姜青枯病的治愈率为77.27％(17/22)。
实施例二十一：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中大肠菌群清除作用观察
1、菌株来源：中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛 选出对大肠菌群敏感的蛭弧菌Bd98、Bd59、Bd329和大肠杆菌噬菌体∮/T1、∮/T2、∮/T7。
3、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、实验设计：在自然河水中，加入蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为106pfu/ml混合培养物。同时设不加蛭弧菌、噬菌体混合培养物对照组。以后定时取水样检测水体中大肠菌群的变化。持续33天。
5、结果见表24。
表24.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中大肠菌群的影响
6、试验结论：
试验组与对照组比较，统计学处理(P＜0.01)有显著性差异，从而证明蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中大肠菌群有清除作用。
实施例二十二：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中细菌总数清除作用观察
1、菌株来源：中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对河水中常见的致病菌敏感的蛭弧菌Bd59、Bd81、Bd98、Bd329和弧菌噬菌体∮V3、∮M6，志贺氏菌噬菌体∮P22，伤寒噬菌体∮Vi、∮S154，致病性大肠杆菌噬菌体∮T2、∮T7，绿脓杆菌噬菌体∮PE5。
3、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、实验设计：在自然河水中，加入蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为105pfu/ml混合培养物。同时设不加蛭弧菌、噬菌体混合培养物对照组。以后定时取水样检测水体中细菌总数的变化。持续30天。
5、结果见表25。
表25.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中细菌总数的
6、试验结论：
试验组与对照组比较，蛭弧菌、噬菌体混合培养物的河水中细菌总数减少的幅度高于对照组39-55倍。
实施例二十三：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻控制作用的观察
1、菌株来源：中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对植物致病菌敏感的蛭弧菌Bd59、Bd296和噬菌体∮53K、∮S157。
3、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、实验设计：在江苏省射阳县发阳农场水产(斑点叉尾鮰鱼)养殖基地进行试验。试验选择蓝藻污染较重的斑点叉尾鮰养殖鱼塘10个，每个塘的面积为150m×300m，水深约1.2m。试验组每10天泼洒1次蛭弧菌(含量为108/pfu)、噬菌体(含量为1010/pfu)混合培养物 300ml/亩/米。连续3次。然后连续90天观察记录蓝藻生长情况；选择相同环境中蓝藻污染较重的斑点叉尾鮰养殖鱼塘5个，不用蛭弧菌、噬菌体混合培养物而用生石灰的对照组。
5、结果见表26。
表26.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻控制效果的观察
6、试验结论：
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻的蔓延有非常明显的控制效果。
Claims (2)
1.一种活性生物抗菌物，其特征在于，是以蛭弧菌和噬菌体的培养物为主要成份按比例混合制成，其特征在于，蛭弧菌和噬菌体的混合培养物通过以下方法制备：
（1）蛭弧菌培养物的获得：先制得失活的蛭弧菌宿主菌，然后以此失活宿主菌为宿主，用蛭弧菌常规培养法制取蛭弧菌培养物，再选择于自来水双层琼脂平板上噬斑典型的、能裂解有害细菌、不破坏有益细菌的、在10-43℃环境中能生长的蛭弧菌菌株，最后将上述过程中制得的失活宿主菌和选育出的蛭弧菌按10：1-10000：1的比例悬浮在发酵培养液中，校正其pH值3.8-10.0，经发酵培养，发酵培养物或将发酵培养物冻干后备用；
（2）噬菌体培养物的获得：制取敏感的噬菌体宿主菌悬液，用噬菌体双层琼脂培养法制取噬菌体培养物，再选择于营养肉汤双层琼脂平板上噬斑典型的能裂解有害细菌的烈性噬菌体，挑取透明度好的单噬斑浸泡于营养肉汤中，然后，取上清再制营养肉汤双层琼脂平板，最后将上述过程中制得的噬菌体培养物和敏感的宿主菌悬液按1：10-1：108的比例悬浮在发酵培养液中，校正其pH值3.8-10.0，经发酵培养，发酵培养物经过除菌过滤去除敏感的宿主菌；经检验确定无菌的发酵培养物或将发酵培养物冻干备用；
（3）将上述蛭弧菌发酵培养物或将发酵培养物过滤浓缩冻干粉和经检验确定已经无菌的除菌过滤后的噬菌体发酵培养物或将发酵培养物冻干粉按1：1-1：1000000的比例配制，即蛭弧菌的含量为每毫升10-1010pfu，噬菌体的含量每毫升为10-1016pfu；混合配制，使其悬浮在媒介液或混合在赋形剂中；即得到产品。
2.一种制备权利要求1所述活性生物抗菌物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）蛭弧菌培养物的获得：先制得失活的蛭弧菌宿主菌，然后以此失活宿主菌为宿主，用蛭弧菌常规培养法制取蛭弧菌培养物，再选择于自来水双层琼脂平板上噬斑典型的、能裂解有害细菌、不破坏有益细菌的、在10-43℃环境中能生长的蛭弧菌菌株，最后将上述过程中制得的失活宿主菌和选育出的蛭弧菌按10：1-10000：1的比例悬浮在的发酵培养液中，校正其pH值，经发酵培养，发酵培养物或将发酵培养物冻干后备用；
（2）噬菌体培养物的获得
制取敏感的噬菌体宿主菌悬液，用噬菌体双层琼脂培养法制取噬菌体培养物，再选择于营养肉汤双层琼脂平板上噬斑典型的能裂解有害细菌的烈性噬菌体，挑取透明度好的单噬斑浸泡于营养肉汤中，然后，取上清再制营养肉汤双层琼脂平板，最后将上述过程中制得的噬菌体培养物和敏感的宿主菌悬液按1：10-1：108的比例悬浮在发酵培养液中，校正其pH值，经发酵培养，发酵培养物经过除菌过滤去除敏感的宿主菌；经检验确定无菌的发酵培养物或将发酵培养物冻干备用；
（3）将上述蛭弧菌发酵培养物或将发酵培养物冻干粉和经检验确定无菌的噬菌体发酵培养物或将发酵培养物冻干粉按1：1-1：1000000的比例配制，即蛭弧菌的含量为每毫升10-1010pfu，噬菌体的含量每毫升为10-1016pfu；混合配制，使其悬浮在媒介液或混合在赋形剂中；即得到产品。
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