CN101988096A - 一种magea3基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种MAGEA3(melanoma-associated antiger 3)黑色素瘤相关抗原基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了一种MAGEA3基因原位杂交检测方法。另外，本发明还提供了试剂盒在制备检测肝癌疾病药物中的应用。本发明优点在于：本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。

Description

一种MAGEA3基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用

【技术领域】

本发明涉及一种试剂盒，具体地说关于一种MAGEA3基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用

【背景技术】

肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，死亡率高，在恶性肿瘤死亡顺位中仅次于胃、食道而居第三位；在部份地区的农村中则占第二位，仅次于胃癌。我国每年死于肝癌约11万人，占全世界肝癌死亡人数的45％。起病常隐匿，多在肝病随访中或体检普查中偶然发现肝癌。此时病人既无症状，体格检查亦缺乏肿瘤本身的体征，此期称之为亚临床期。肝癌一旦出现症状，而来就诊者其病程大多已进入中晚期。

肝癌从癌前变到形成癌症，需要几年时间，如何做到早期检测、诊断、预后的检测及诊治后的复发、转移早期检出是降低发病率和死亡率的关键。

黑素瘤相关抗原(melanoma-associated antiger，MAGE)是一类肿瘤特异性抗原，由位于X染色体的MAGE基因家庭编码。在肝癌组织中，MAGE-1和MAGE-3基因呈特异性高表达，而在肝硬变和正常肝活检组织中不表达，只有个别肝细胞癌癌旁组织标本可表达MAGE-3mRNA，提示这两种的mRNA有可能作为特异性肿瘤标记物，用于检测肝癌细胞血行播散。肝细胞癌患者术后外周血MAGE和(或)MAGE-3mRNA持续阳性或由阴性转为阳性者预后差，监测随访外周血MAGE和(或)MAGE-3mRNA可早期预测转移复发。但也有文献报道，肝细胞癌患者肝癌组织中MAGE-4基因表达的阳性率与肝细胞癌患者TNM分期、肿瘤直径、有无完整包膜、有无门静脉癌栓、生存期等均无关。

随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，至今，我们已有可能在基因水平上做更精确的早期诊断，在癌变前期或癌细胞形成(单克隆时)就能做到早期预测诊断。

原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与细胞化学技术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含有特异序列、经过标记的核酸单链(即探针)，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。

【发明内容】

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种MAGEA3基因的原位杂交检测试剂盒的用途。

本发明的再一的目的是，提供一种MAGEA3基因的原位杂交检测试剂盒。

本发明的另一的目的是，提供一种MAGEA3基因的原位杂交检测方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种MAGEA3基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测肝癌疾病药物中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ IDNO.1所示。MAGEA3基因序列号：NM_0053621753bp，mRNA，染色体Xq28″，cds：210...1154bp。

所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示的RNA序列。

所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

所述的放射性核素选自³H、³⁵S、¹²⁵I或³²P中的一种。

所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。

所述的非放射性标记物优选自地高辛。

所述的试剂盒还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种MAGEA3基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其中所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

一种MAGEA3基因的原位杂交检测方法，该方法包括以下步骤：

a、将试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；

b、检测a步骤得到的杂交复合体。

所述的a步骤中形成杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16-24小时，所述的底物选用血液细胞标本或组织细胞标本。

本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括：

仪器操作：

1).将待测标本放入反应槽中；

2).仪器自动弃去液体，自动加消化液；

3).仪器自动弃去液体，自动后固定；

4).仪器自动弃去液体，自动预杂交(42℃)；

5).仪器自动弃去液体，自动清洗；

6).仪器自动弃去液体，自动杂交(42℃)；

7).仪器自动弃去液体，自动清洗；

8).仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养(室温)；

9).仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；

10).取出封片镜检。

本发明优点在于：

1、本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。

2、本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。

3、本发明的临床意义是更早期跟踪检测肝癌发生动态过程，以及用于肝癌预防医学的检测和筛选工具。本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测癌胚蛋白标志物，以及影像医学检查有显著不同。本发明可以在基因水平上检测MAGEA3异常表达，在影像医学检查及其它检查未发现占位性肝癌病灶之前，癌症生化指标未产生异常之前，亦未形成肿块之前，能及早做到以上基因表达异常的信息采集，给临床肝癌病患一个真正的预后早期诊断。这样才有可能实施肝癌的早期诊断、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底根治肝癌恶疾。

【附图说明】

图1是本发明实施例中肝癌病人MAGEA3基因表达图片。

图2是本发明实施例中肝硬化病人MAGEA3基因表达图片。

图3是本发明实施例中正常人MAGEA3基因表达图片。

【具体实施方式】

下面结合附图对本发明具体实施方式作详细说明。

实施例1

一种MAGEA3基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物、增效剂，其中，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。杂交探针用地高辛标记。试剂盒中的其它液体和标本组成如下：

消化液         100μl/管   1管/盒    无色透明液体

保护液         100μl/管   1管/盒    无色透明液体

预杂交液       1300μl/管  2管/盒    无色透明液体

正义杂交液     10μl/管    1管/盒    无色透明液体

反义杂交液     10μl/管    1管/盒    无色透明液体

封闭液         1000μl/管  1管/盒    无色透明液体

碱性磷酸酶抗体 1μl/管     1管/盒    无色透明液体

显色剂A        175μl/管   1管/盒    黄色液体

显色剂B        320μl/管   1管/盒    无色透明液体

缓冲液I 10x    90ml/瓶     1瓶/盒    浅黄色或无色透明液体

缓冲液II 10x   80ml/瓶     1瓶/盒    浅黄色或无色透明液体

缓冲液III 10x  20m/瓶      3瓶/盒    浅黄色或无色透明液体

缓冲液IV 10x   90ml/瓶     1瓶/盒    浅黄色或无色透明液体

固定液         90ml/瓶     1瓶/盒    无色透明液体

阳性对照标本   6片/盒

上述试剂成分说明：(所有试剂购自SIGMA)

1、消化液：20mg/ml蛋白酶K，100mg蛋白酶K，加DEPC-H₂O 5ml；

2、保护液：0.2g的glycine加入1ml的1×缓冲液I；

3、预杂交液：1×缓冲液II 7.5ml

50×D 3ml

10mg/ml yest t-RNA 750ul

11mg/ml SALMON TESTES DNA 682ul

0.04M EDTA 3ml

50％ formamide 15ml

4、封闭液：0.03g的bloking(购买自罗氏公司)加入1ml 1×缓冲液III；

5、10x缓冲液I：(PH7.1-7.4)

NaCl 80g

Na₂HPO₄.12H₂O 360g

KCl  2g

KH₂PO₄ 2g

加三蒸水至1l，并高压灭菌；

6、10x缓冲液II：(PH7.0)

NaCl  175.3g

柠檬酸钠 88.2g

HCl 几滴

加三蒸水至1l，并高压灭菌；

7、缓冲液III：(PH7.9)

Tris    121.1g

NaCl  87.66g

HCl  60ml左右

加三蒸水至1l，并高压灭菌；

8、缓冲液IV：

1M Tris-HCl(PH9.5)：Tirs 121.1g加HCl 3ml左右，加水900ml，调PH至9.5，加水至1l，并高压灭菌；

1M NaCl：NaCl 58.44加水至1l，并高压灭菌；

0.5M MgCl₂：101.65g MgCl₂.6H₂O加水至1l，并高压灭菌；

9、固定液：多聚甲醛40g加1×缓冲液I至1l，稍加热(约50-60度)搅拌至溶解；

10、显色剂A：NBT 1g加70％DMF11.44ml；

11、显色剂B：BCIP 1g加100％DMF30ml。

本发明的试剂盒可以多人份使用或一人份使用。

实施例2

一种MAGEA3基因原位杂交检测方法及其试剂盒应用

一、标本处理

1、用10ml的离心管，装4.5ml淋巴细胞分离液，再将3ml抗凝血缓慢加入含有淋巴细胞分离液(血∶淋巴细胞分离液＝1∶1.5)的离心管中，2000r/min离心10min；

2、吸取中间层白细胞至另一离心管中，再在此管中加入约两倍的1×缓冲液I，混匀，1500g/min离心10min；

3、弃上清.沉淀加入约两倍的1×缓冲液I，混匀，1500g/min离心10min；

4、弃上清，并把试管口多余的液体用擦手纸吸去。再将沉淀制成悬液，滴在玻片上推片，自然干燥。(有条件的医院可以用制片机制片。)3ml血，可以做4张片子；

5、用40ml 4％固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用1×缓冲液I洗5min。每缸可以放16片；

6、标本可保存在-20℃，或继续做实验。

二、将试剂盒中试剂配制成使用浓度

1、将10×缓冲液I用三蒸水按1∶10稀释成1×缓冲液I；

2、将20×缓冲液II用三蒸水按1∶10稀释成2×缓冲液II；

按1∶100稀释成0.2×缓冲液II；按1∶200稀释成0.1×缓冲液II；

3、将10×缓冲液III用三蒸水按1∶10稀释成1×缓冲液III；

4、10×缓冲液IV用三蒸水按1∶10稀释成×缓冲液IV(取1#，2#，3#各10ml，加水至100ml既可)。

三、实验步骤：

1、取每位待检者标本两张，(另外两张留作复查用)及阳性对照标本两张(每次实验做一对阳性对照)；

2、在玻璃缸里加消化液(消化液100ul加1×缓冲液199.9ml，即为使用浓度)20ml。37℃水浴预热10分钟。放进16张玻片，37℃处理12min，再用1×缓冲液I洗5min；

3、用0.2％的保护液(保护液1ml加1×缓冲液I99ml即为使用浓度)洗10min，三蒸水洗5min，以上过程都在玻璃缸进行。玻片自然干燥；

4、将玻片放入保湿盒内，加预杂交液20ul/片.盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中3h以上；

5、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内，用70％，90％，95％的乙醇各洗2min，自然干燥；

6、将玻片放入保湿盒内，每位病人标本两张，一张加正义杂交液20ul/片，另一张加反义杂交液20ul/片，盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中16-24h；

7、取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内

在42℃恒温水浴箱中用2×缓冲液II洗两次，每次15min

在42℃恒温水浴箱中用0.2×缓冲液II洗一次，每次15min

在42℃恒温水浴箱中用0.1×缓冲液II洗两次，每次15min；

8、用1×缓冲液III洗30s，取出玻片，自然干燥；

9、将玻片放入保湿盒内，加0.5％l封闭液(1ml封闭液加5ml 1×缓冲液III)100ul/片，盖紧保湿盒，在室温下作用30min；

10、取出玻片，用1×缓冲液III洗30s，自然干燥；

11、将玻片放入保湿盒内，加碱性磷酸酶抗体(加入1.8ml 1×缓冲液III)100ul/片，盖紧保湿盒在室温下作用30min；

12、取出玻片，用1×缓冲液III洗3次，每次15min；

13、1×缓冲液IV洗2min，加显色剂(显色剂A73.3ul，显色剂B157.5ul加到30ml 1×缓冲液IV中，混匀)，室温避光12h以上；

14、用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10％的1×缓冲液I混匀)封片镜检。

四、结果判断

在光镜下计数100-300个细胞，计算染上紫色细胞的百分比。

阳性对照标本加反义杂交液的应该80％以上染上紫色。

所有加正义杂交液的阴性内对照应无色。

地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点)，将该杂交探针与人体血液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察mRNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。

本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中的MAGEA3基因表达量，用来确定肝癌是否发生，因为MAGEA3基因在正常人中低表达，如果MAGEA3基因表达高，说明癌症已经发生，从而获得癌症的诊断信息。

本发明实施例采样为：肝癌病人10名，肝硬化病人10名，正常对照组10名。抽所有待检人的外周血3-5毫升(分离白细胞)做原位杂交。结果表示，所有肝癌患者MAGEA3基因有过度表达，细胞染色；肝硬化病人MAGEA3基因不表达；正常对照组MAGEA3基因不表达，细胞无染色。具体结果请见图1是肝癌病人的MAGEA3基因表达图；图2是肝硬化病人MAGEA3表达图；图3是正常人MAGEA3基因表达图片。

实施例3

用MAGEA3基因试剂盒检测肝癌疾病与用IL10基因试剂盒检测肝癌疾病之间平行实验。

为了科学评价上述基因各自在肝癌疾病的特异性、敏感性、准确性。我们用平行试验的方法，同时检测上述基因的mRNA，检测技术采用核酸原位杂交技术，用同一例肝癌疾病患者的外周血，同时检测MAGEA3基因和IL10(白介素10)(IL10基因序列号NM_0005721629bp，mRNA.1q31-q32”，cds：60…596bp)基因的mRNA(进行核酸原位杂交、免疫组化染色、镜下记数、结果报告等均采用实施例1和实施例2的原位杂交技术的相同方法和步骤及试剂)。发现MAGEA3基因在肝癌疾病病人中表达量比IL10基因在同一疾病病人的表达量要高。结果表明，MAGEA3基因对肝癌疾病诊断的特异性、敏感性、准确性比IL10基因更好，原位杂交基因表达图显示，MAGEA3基因的表达量是70％，IL10基因的表达量是50％。本发明的试剂盒作于肝癌疾病诊断的指标有非常重要的临床意义。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110>芮屈生物技术(上海)有限公司

<120>一种MAGEA3基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用

<130>/

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1753

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

gagattctcg ccctgagcaa cgagcgacgg cctgacgtcg gcggagggaa gccggcccag   60

gctcggtgag gaggcaaggt tctgagggga caggctgacc tggaggacca gaggcccccg  120

gaggagcact gaaggagaag atctgccagt gggtctccat tgcccagctc ctgcccacac  180

tcccgcctgt tgccctgacc agagtcatca tgcctcttga gcagaggagt cagcactgca  240

agcctgaaga aggccttgag gcccgaggag aggccctggg cctggtgggt gcgcaggctc  300

ctgctactga ggagcaggag gctgcctcct cctcttctac tctagttgaa gtcaccctgg  360

gggaggtgcc tgctgccgag tcaccagatc ctccccagag tcctcaggga gcctccagcc  420

tccccactac catgaactac cctctctgga gccaatccta tgaggactcc agcaaccaag  480

aagaggaggg gccaagcacc ttccctgacc tggagtccga gttccaagca gcactcagta  540

ggaaggtggc cgagttggtt cattttctgc tcctcaagta tcgagccagg gagccggtca  600

caaaggcaga aatgctgggg agtgtcgtcg gaaattggca gtatttcttt cctgtgatct  660

tcagcaaagc ttccagttcc ttgcagctgg tctttggcat cgagctgatg gaagtggacc  720

ccatcggcca cttgtacatc tttgccacct gcctgggcct ctcctacgat ggcctgctgg  780

gtgacaatca gatcatgccc aaggcaggcc tcctgataat cgtcctggcc ataatcgcaa  840

gagagggcga ctgtgcccct gaggagaaaa tctgggagga gctgagtgtg ttagaggtgt     900

ttgaggggag ggaagacagt atcttggggg atcccaagaa gctgctcacc caacatttcg     960

tgcaggaaaa ctacctggag taccggcagg tccccggcag tgatcctgca tgttatgaat    1020

tcctgtgggg tccaagggcc ctcgttgaaa ccagctatgt gaaagtcctg caccatatgg    1080

taaagatcag tggaggacct cacatttcct acccacccct gcatgagtgg gttttgagag    1140

agggggaaga gtgagtctga gcacgagttg cagccagggc cagtgggagg gggtctgggc    1200

cagtgcacct tccggggccg catcccttag tttccactgc ctcctgtgac gtgaggccca    1260

ttcttcactc tttgaagcga gcagtcagca ttcttagtag tgggtttctg ttctgttgga    1320

tgactttgag attattcttt gtttcctgtt ggagttgttc aaatgttcct tttaacggat    1380

ggttgaatga gcgtcagcat ccaggtttat gaatgacagt agtcacacat agtgctgttt    1440

atatagttta ggagtaagag tcttgttttt tactcaaatt gggaaatcca ttccattttg    1500

tgaattgtga cataataata gcagtggtaa aagtatttgc ttaaaattgt gagcgaatta    1560

gcaataacat acatgagata actcaagaaa tcaaaagata gttgattctt gccttgtacc    1620

tcaatctatt ctgtaaaatt aaacaaatat gcaaaccagg atttccttga cttctttgag    1680

aatgcaagcg aaattaaatc tgaataaata attcttcctc ttcaaaaaaa aaaaaaaaaa    1740

aaaaaaaaaa  aaa                                                      1753

Claims (10)

1.一种MAGEA3基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测肝癌疾病药物中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示的RNA序列。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的放射性核素选自³H、³⁵S、¹²⁵I或³²P中的一种。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的非放射性标记物优选自地高辛。

7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的试剂盒还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。

8.一种MAGEA3基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其特征在于，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。

9.一种MAGEA3基因的原位杂交检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

a、将权利要求8所述试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；

b、检测a步骤得到的杂交复合体。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于：a步骤中形成杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16-24小时，所述的底物选用血液细胞标本或组织细胞标本。

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