CN101985612A - 利用生物反应器规模化制备间充质干细胞的方法 - Google Patents

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张宇光
孟恒星
侯士芳
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Abstract

本发明公开了一种利用生物反应器规模化制备间充质干细胞的方法，将间充质干细胞制备成单细胞悬液，于无菌培养袋内接种于微载体上，置于WAVE BioreactorTM生物反应器中扩增，根据所需的细胞数量，可以反复多次消化、传代、添加微载体，直至达到需要的细胞数量，然后将扩增后的间充质干细胞消化收集后冻存或直接应用。本发明可在短时间内获得大量可供临床应用的间充质干细胞，用于实验研究、临床治疗、组织工程等应用。其操作简单，工作强度低，扩增效率高，生产规模可灵活改变。

Description

利用生物反应器规模化制备间充质干细胞的方法
技术领域
本发明涉及一种制备间充质干细胞的方法，尤其是一种利用WAVEBioreactorTM生物反应器规模化制备间充质干细胞的方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是近年来研究的一个热点，间充质干细胞具有多向分化能力，体外扩增能力强，抗原性弱，不涉及伦理道德等问题。
间充质干细胞用于临床、组织工程都需要大量的细胞。临床应用可达108-1010数量级。由于间充质干细胞需要贴壁生长，这种规模的细胞数量在实验室使用培养瓶扩增，不但耗材消耗量大，而且人工的付出也是惊人的。
生物反应器通常用于大规模扩增细胞。但是通常生物反应器用于悬浮细胞的大规模扩增，而且是开放式***，需要很多支持设备，不但操作复杂，还容易导致污染等问题，临床应用存在相当大的风险。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种在短时间内获得大量间充质干细胞的利用WAVE BioreactorTM生物反应器规模化制备间充质干细胞的方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：使用微载体为贴壁细胞在有限的空间内提供大量的生长面积，配合WAVE BioreactorTM生物反应器的应用大规模扩增间充质干细胞。WAVE BioreactorTM生物反应器采用一次性细胞培养袋，封闭式培养***，有效避免了污染等风险，为贴壁细胞大规模扩增进入临床应用提供了良好的技术基础。
所用细胞可来源于不同来源的冻存间充质干细胞或者培养中的间充质干细胞。正在培养中的间充质干细胞可省去复苏及培养一代的步骤，直接进入制备细胞悬液接种于微载体的步骤。
A、将融化后的间充质干细胞接种于培养瓶培养一代后，使用无动物来源的工程化酶消化为单细胞悬液，洗涤去除酶残留，之后接种于已加入处理好的无菌微载体一次性培养袋内；
B、将接种好细胞的一次性培养袋置于WAVE BioreactorTM生物反应器中，4-5天后使用无动物来源的工程化酶消化获取细胞；
C、根据对细胞数量的要求，可将获取的细胞直接冻存及应用，亦可将获得的单细胞悬液接种于更多的微载体上置于更大的培养袋中培养，直至获得足够数量的细胞。
上述方法制备的间充质干细胞可用于实验研究，也可在临床上用于与造血干细胞共移植治疗血液***疾病或其它肿瘤的辅助治疗，直接或经基因修饰后用于治疗脑血管、心血管、外周血管闭塞性疾病或其他存在供血障碍的疾病，还可用于肿瘤性及炎症性疾病抑制血管新生，还可用于组织工程中作为种子细胞。
本发明的有益效果：可在短时间内获得大量可供临床应用的间充质干细胞。其操作简单，工作强度低，扩增效率高，生产规模可灵活改变。
附图说明
图1为采用本发明的方法获得的间充质干细胞。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明，但本发明并不受限于下述实施例。
1、将融化后的间充质干细胞(3*106)接种于3个T75培养瓶培养3-5天，观察细胞融合率达到70-80％后，使用无动物来源的工程化酶消化为单细胞悬液，洗涤去除酶残留，计数，接种于已加入处理好的无菌微载体一次性培养袋内；
2、将接种好细胞的一次性培养袋置于WAVE BioreactorTM生物反应器中，4-5天后使用无动物来源的工程化酶消化获取细胞；
3、计数获取细胞数，根据对细胞数量的要求，可将获取的细胞直接冻存及应用，亦可将获得的单细胞悬液接种于更多的微载体上置于更大的培养袋中培养，直至获得足够数量的细胞(见图1)。扩增倍率1：2-5。
4、间充质干细胞的鉴定。分为免疫表型测定及分化能力测定。
4.1、免疫表型检测CD14，CD31，CD44，CD45，CD105，CD144，VWF，CD29，CD34，CD73，CD90，CD95，CD106，KDR，HLA-DR。使用TrypLETM Select消化体外扩增的第3-4代的间充质干细胞，PBS洗涤2次，分成每管含5×105细胞，第一管加入同型对照抗体(Mouse IgG1 FITC/Mouse IgG1 PE，coulter)20ul，其余管中加入其它相应抗体20ul(或者按使用说明书规定的试剂量加入)，混匀，室温避光静置30分钟，加入PBS(pH7.2-7.4)2ml，混匀，300g离心5分钟，弃上清，加入1％多聚甲醛400ul，混匀，即可上机(流式细胞仪FACSCalibur，BD)检测。细胞免疫表型为：CD73、CD105为阳性，CD31、vWF、KDR、CD34、CD45、CD235a、HLA-DR为阴性。
4.2细胞的成骨及成脂分化潜能及分化后鉴定
消化体外扩增的第3-4代间充质干细胞，以5×103/cm2的密度接种于预先放置无菌消毒盖玻片的6孔板中，制备细胞爬片，每孔加2ml上述分离培养基。在细胞达到60％～70％融合时，更换诱导分化培养基。
4.2.1成骨诱导分化
诱导分化培养基为含有10-7mol/L的***，10mmol/Lβ-磷酸甘油，0.05mmol/L 2-磷酸抗坏血酸和10％FBS的DMEM/F12培养液，每周换液2次，培养21天。取出玻片，PBS洗涤一次，70％酒精固定10分钟，行茜素红及范可萨染色，显微镜下观察。范可萨染色可见黑色矿化物沉积，茜素红染色见细胞浆中有大量的钙沉积。
4.2.2成脂诱导分化
诱导分化培养基为含有10-6mol/L的***，10ug/ml胰岛素，0.5mmol/L异丁基甲基黄嘌吟(IBMX)，200umol/L消炎痛(均为Sigma公司产品)和10％FBS的DMEM/F12培养液，每周换液2次，培养14天。取出玻片，PBS洗涤一次，70％酒精固定10分钟，以油红O染色，镜检。可见油红-O染色呈强阳性。
上述方法制备的间充质干细胞可用于实验研究，也可在临床上用于与造血干细胞共移植治疗血液***疾病或其它肿瘤的辅助治疗，直接或经基因修饰后用于治疗脑血管、心血管、外周血管闭塞性疾病或其他存在供血障碍的疾病，还可用于肿瘤性及炎症性疾病抑制血管新生。还可用于组织工程中作为种子细胞。
综上所述，本发明的内容并不局限在的实施例中，本领域技术人员可以在本发明的技术指导思想之内提出其他实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims (7)

1.一种利用生物反应器规模化制备间充质干细胞的方法，包括间充质干细胞的接种于微载体上，间充质干细胞在WAVE BioreactorTM生物反应器中的扩增及消化传代，其特征在于，使用一次性无菌培养袋在WAVEBioreactorTM生物反应器中进行间充质干细胞的传代扩增。
2.根据权利要求1所述的利用生物反应器制备间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的一次性培养袋内加入微载体供间充质干细胞生长。
3.根据权利要求2所述的利用生物反应器制备间充质干细胞的方法，其特征在于，微载体的用量随细胞制备数量一次性加入或分数次添加。
4.根据权利要求1所述的利用生物反应器制备间充质干细胞的方法，其特征在于，传代消化所用酶为无动物来源的工程化酶。
5.根据权利要求4所述的利用生物反应器制备间充质干细胞的方法，其特征在于，所述工程化酶为TrypLETM Select。
6.根据权利要求1、2、3、4或5所述的利用生物反应器制备间充质干细胞的方法，包括以下步骤：
A、将融化后的间充质干细胞接种于培养瓶培养一代后，使用无动物来源的工程化酶消化为单细胞悬液，洗涤去除酶残留，之后接种于已加入处理好的无菌微载体一次性培养袋内；
B、将接种好细胞的一次性培养袋置于WAVE BioreactorTM生物反应器中，4-5天后使用无动物来源的工程化酶消化获取细胞；
C、根据对细胞数量的要求，可将获取的细胞直接冻存及应用，亦可将获得的单细胞悬液接种于更多的微载体上置于更大的培养袋中培养，直至获得足够数量的细胞。
7.根据权利要求1、2、3、4或5所述的利用生物反应器制备间充质干细胞的方法，包括以下步骤：
A、将培养中的间充质干细胞接种于已加入处理好的无菌微载体一次性培养袋内；
B、将接种好细胞的一次性培养袋置于WAVE BioreactorTM生物反应器中，4-5天后使用无动物来源的工程化酶消化获取细胞；
C、根据对细胞数量的要求，可将获取的细胞直接冻存及应用，亦可将获得的单细胞悬液接种于更多的微载体上置于更大的培养袋中培养，直至获得足够数量的细胞。
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