CN101985610A - 一种伤寒沙门氏菌菌蜕、制备方法及作为递送***的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种伤寒沙门氏菌菌蜕,其制备方法以及其作为递送***的应用。所述菌蜕由裂解基因E裂解伤寒沙门氏菌菌体而成,可以作为递送载体将目的分子递送至靶目标。
Description
技术领域
本发明涉及一种伤寒沙门氏菌菌蜕,其制备方法以及其作为递送***的应用,属于分子生物学和微生物技术领域。
背景技术
细菌菌蜕(Bacterial Ghost,BG)是在革兰氏阴性菌中诱导噬菌体PhiX174的E基因表达,最终使宿主细胞裂解形成的完整的细菌空壳。PhiX174E基因编码一个由91个氨基酸组成的疏水性蛋白质,此蛋白本身没有任何酶活性,但可通过寡聚化起到连接内、外膜的作用。经电子显微照片显示,内外膜在通道处实现融合,并形成一个封闭的周质空间。裂解通道的直径范围介于40nm和200nm之间。裂解通道的大小受细胞个体差异的影响,主要涉及细胞自溶发生的程度,肽聚糖层上筛孔的大小情况以及裂解过程中细胞膜所发生的变化。通道一旦形成,在细胞内高渗透压的驱使下,细胞内的大部分内容物,包括核酸、核糖体及其他组分被排除出来,形成了一个完整的细胞空壳。
细菌菌蜕的制备是通过对裂解基因E的严格表达调控实现的。据研究,PhiX174的裂解基因E可以受控于多个表达***,如热敏的λpL/pR-cI857启动子的转录控制,抑或某些化学诱导性启动子LacPO-LacIq,或tol等表达***。
实验证实E基因除可裂解大肠杆菌外,还可有效裂解胸膜炎肺炎放线杆菌、肺炎克雷伯氏菌、溶血曼海姆菌、巴斯德杆菌、幽门螺杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、爱德华菌、鳗弧菌等。由此推测E裂解体系可介导所有革兰氏阴性菌发生裂解。
由于制备过程较温和且无需变性作用,因此细胞壁在很大程度上被完整保存下来。细菌菌蜕本身可以直接作为一种很好的疫苗,因为其保留了活菌状态下的包膜结构和相关抗原蛋白,如脂多糖、CPG和菌毛等,从而能有效地被抗原递呈细胞(APCs)吞噬、加工和递呈。目前已知菌蜕可通过皮下、静脉、滴鼻等途径免疫小鼠、兔子、猪等动物模型并取得了良好的免疫效果。胸膜肺炎放线菌(A.pleuropneumoniae,APP)菌蜕经肌肉注射免疫猪,诱导了针对APP的保护作用;同时在APP气溶胶感染模型中,APP菌蜕可诱导产生特异性的呼吸道黏膜免疫应答,较全细胞疫苗更为有效、安全。霍乱弧菌菌蜕(V.cholerae Ghost,VCG)经皮下或肌肉注射等方式免疫兔子,可诱导产生针对细胞被膜成分的体液和细胞免疫应答。
此外,细菌菌蜕还是一种极好的递送体系,利用基因工程手段,可以方便地将外来抗原蛋白、核酸或药物等其他成分导入到细菌菌蜕中。外来靶抗原可锚定到外膜(OM)或是内膜(IM),抑或填充于壁膜间隙(PPS)或胞浆周质(CPS)。此重组菌蜕拥有完整、天然的外膜结构,能靶向到抗原递呈细胞,可激发体液和细胞免疫应答,以及黏膜免疫应答。Eko等人首先令沙眼衣原体主要外膜蛋白(OMP)的基因在霍乱弧菌(V.cholerae)内膜中锚定表达,用表达OMP1的霍乱弧菌菌蜕分别鼻内和肌肉注射免疫小鼠,结果诱导黏膜层产生持续的强烈的Th1免疫反应。此疫苗递送***日后开发保护人类免受白粉病菌类的胞内感染带来了希望,现已着手进入临床实验阶段。实验证实,将冷冻干燥的菌蜕直接悬浮在含有质粒的相关缓冲液中,质粒可通过裂解通道进入菌蜕,并与菌蜕内膜发生非特异性结合。实验显示,无论大肠杆菌菌蜕(E.coli Ghost)还是曼海姆菌菌蜕(Mannheimia haemolytica Ghosts),一个菌蜕装载大约4000-6000拷贝的质粒(pEGFP-N1),平均2000拷贝。研究表明,高达96%的大肠杆菌菌蜕成功装载DNA。Paukner S等人证实,装载有pEGFP-N1的大肠杆菌菌蜕可高效地被鼠巨噬细胞(RAW264.7)摄取,转染效率达58%,远高于脂质体或多聚体等非病毒载体。Ebensen T等人发现,装载有pEGFP-N1的曼海姆菌菌蜕不仅能被鼠巨噬细胞摄取,还能高效地被人树突状细胞(DC)摄取,转染效率均接近52%。在此基础上,Kudela P等人证实菌蜕与促成熟介质(maturation mix,MM)的联合不仅能有效提高菌蜕的转染效率达85%,此效率接近腺病毒;还能有效促进DCs成熟。综合看来,无论大肠杆菌菌蜕还是曼海姆菌菌蜕均能有效介导DNA到抗原递送呈细胞(APCs),并且两种菌蜕在介导DNA的转染效率上无明显差异。装载有质粒的重组曼海姆菌菌蜕经皮内或肌肉注射途径免疫小鼠,与裸DNA相比,重组曼海姆菌菌蜕可刺激机体产生更有效的特异性体液和细胞(CD4+和CD8+)免疫反应,并且由Th1/Th2混合型反应转变为Th2型反应占优势。
肠道粘膜免疫在机体的免疫反应中起非常重要的作用,许多疾病的免疫是通过粘膜免疫的途径获得的,而且该免疫途径往往可以通过口服疫苗就可以启动,具有简便易行的优点。上述研究均没有涉及到这方面的研究。目前现有技术中还缺乏菌蜕在肠道粘膜免疫中的应用,也没有能够在肠道粘膜免疫中担当递送载体的菌蜕。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种可以作为递送载体,安全性高,遗传背景清楚的菌蜕,以满足在肠道免疫中能够有效、安全的使用。
本发明的再一个目的是提供所述菌蜕的制备方法。
本发明的又一个目的是提供所述菌蜕作为分子载体的应用。
基于以上目的,本发明首先提供了一种伤寒沙门氏菌菌蜕,所述菌蜕是由裂解基因E在伤寒沙门氏菌中的诱导表达产物导致宿主细胞裂解,而形成的完整细菌空壳。
在一个优选的技术方案中,所述伤寒沙门氏菌为Ty21a。Ty21a是一种活的伤寒Ty21a弱毒菌株,是Germanier于1975年用化学诱变剂亚硝基胍诱变及紫外线照射诱导非定点突变得到的。Ty21a遗传背景清楚,安全性好,是较早获得批准的口服减毒活疫苗,其以自然感染的方式如胃肠道感染进入人体,是肠道免疫的有效细菌载体。
在一个优选的技术方案中,所述基因E是以质粒pMB为载体行使裂解功能的。所述裂解基因E被定向克隆至质粒pMB获得重组质粒pMBE。所述pMB的温控表达***为λpL/pR-cI857控制***。所述pMB质粒是在商业化质粒pBV220(上海闪晶生物科技有限公司)的基础上,在距起始端1300bp处定向***人工合成的幽门螺杆菌的RepA基因(GenBank登录号Z49272.1)构建而成的。
本发明还提供了所述菌蜕的制备方法,所述方法包括以下步骤:
(1)培养所述伤寒沙门氏菌;
(2)将含有裂解基因E的载体电转化入所述伤寒沙门氏菌;
(3)在42℃诱导所述基因E的表达;
(4)收集步骤(3)获得的菌体。
在一个优选的技术方案中,所述伤寒沙门氏菌为Ty21a。
在另一个优选的技术方案中,所述表达质粒为pMBE。本发明采用电转化方法将裂解质粒pMBE(含裂解基因E)导入到人伤寒沙门菌Ty21a疫苗株中。所用的电转化方法采用优化的电转缓冲***(含0.5M山梨醇,0.5M甘露醇,10%葡萄糖的磷酸盐缓冲液)和优化的电转化电压(250-500V)、电容(10-30μF)和电阻(100-300Ω),极大提高了转化效率。而传统化学转化方法不能成功地将重组质粒转化至伤寒杆菌Ty21a。重组Ty21a(pMBE)工程菌经菌落PCR扩增E基因进行鉴定。经鉴定正确的重组Ty21a(pMBE)工程菌在28℃培养至OD600为0.3-0.4时,培养温度迅速升至42℃诱导E基因的表达,实现细菌的裂解。裂解完成后,离心收集菌体,PBS洗涤后冻干保存备用。
本发明还提供了所述菌蜕作为分子递送载体的应用,所述应用包括:
(1)使被递送分子与所述菌蜕相接触,以将所述分子装载于所述菌蜕中;
(2)将装载了被递送分子的菌蜕转导或转染入靶细胞。
在一个优选的技术方案中,所述被递送分子为核酸分子。
在制备的菌蜕中,细菌的内膜和外膜形成一个具有完整细胞膜结构的空腔,所述装载就是将DNA分子导入到这个空腔中。即将冻干的Ty21aBG重悬于含有一定浓度质粒(如绿色荧光蛋白表达质粒,pEGFP-N1)的HBS缓冲液中,然后添加CaCl2至25mM,37℃孵育一定时间,离心收集。
在一个优选的技术方案中,所述靶细胞为包括巨噬细胞在内的抗原递呈细胞。
转染前12h将抗原递呈细胞(APCs),如巨噬细胞RAW264.7以一定浓度接种于6孔板,然后按一定比例加入装载有质粒的Ty21a菌蜕,37℃孵育2h。
本发明利用裂解质粒pMBE成功制备了Ty21a菌蜕,裂解效率高达99%。在此基础上进行Ty21a菌蜕的装载,结果证实经Ty21a菌蜕的递送,真核表达载体可有效装载到Ty21a菌蜕中,每个菌蜕中大约装载2000-5000拷贝的质粒;由于伤寒杆菌Ty21a容易被抗原递呈细胞如巨噬细胞等吞噬,与单独质粒本身相比,大大提高了重组质粒进入到抗原递呈细胞的效率,从而介导真核质粒在细胞内的高效表达。实验证明,以小鼠巨噬细胞RAW264.7为代表的抗原递呈细胞,能有效摄取真核表达质粒,并在细胞内表达。
Ty21a遗传背景清楚,安全性好,Ty21a菌蜕的制备无需剧烈的物理、化学处理,从而有效地保留了其外膜结构,具有天然的佐剂特性,同时,细菌的大部分胞内物质,尤其是核酸被释放,使其安全性大大提高。而传统的灭活方法物理方法(如照射)和化学方法(如***灭活等)在灭活细菌的同时,也破坏了细菌的天然结构和某些抗原,并且菌体内的胞浆成分和核酸成分也被保留,安全性较差。以Ty21a菌蜕作为重组蛋白、核酸或药物等物质的递送体系,具有如下优势:①伤寒沙门氏菌Ty21a为胞内寄生菌,更易被抗原递呈细胞(APCs)摄取,靶向性好;②与大肠杆菌菌蜕相比,由于裂解过程控制合适,本技术所制备的Ty21a菌蜕的胞膜更加完整,适合装载活性物质;③Ty21a菌蜕安全性好。
附图说明
图1表达E基因的重组Ty21a PCR鉴定结果;
图2Ty21a菌蜕的裂解效率;
图3Ty21a菌蜕的扫描电镜和透射电镜结果;
图4荧光显微镜观察绿色荧光蛋白在巨噬细胞RAW264.7中的表达;
图5流式细胞检测绿色荧光蛋白在巨噬细胞RAW264.7中的表达。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改和替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
试验材料
1菌株及质粒
人伤寒Ty21a疫苗株(购自中国药品生物制品检定所)。
2主要试剂和仪器
主要仪器有:
PCR仪(Thermocyler,Biometra),水平电泳仪(北京六一仪器厂),酶联仪(Thermo,Multiskan MK3),高速离心机(HITACHI,CR22GIII),电击仪(BIO-RAD Gene X cell),扫描电子显微镜(HITACHI,S-2400)和透射电子显微镜(PHILIPS,Megaview II),流式细胞仪(BDBioscience)。
主要试剂有:
胰蛋白胨、酵母提取物购自Oxoid公司,质粒提取试剂盒购自TIANGEN公司,引物、限制性内切酶、PCR试剂盒购自TAKARA公司。
实施例1伤寒沙门氏菌Ty21a菌蜕的制备、鉴定
1.1伤寒沙门氏菌Ty21a菌蜕的制备:
应用PCR的方法(正向引物5’-GAATTCGGCATGGTACGCTG-3’,反向引物5’-GGATCCGGCTCACTCCTTCC-3’),从噬菌体PhiX174(购自美国典型培养物中心ATCC13706-B1)获得裂解基因E,然后将裂解基因E定向连接至温控表达质粒pMB中,获得裂解质粒pMBE。采用电转化的方法将裂解质粒pMBE转化到人伤寒沙门菌Ty21a中,所用的电转化方法采用优化的电转缓冲***(含0.5M山梨醇,0.5M甘露醇,10%葡萄糖的磷酸盐缓冲液)和优化的电转化电压(250-500V)、电容(10-30μF)和电阻(100-300Ω)。PCR扩增E基因进行鉴定(见图1,泳道1为分子量对照标记DL2000,泳道2-3为E基因扩增物,泳道4为阳性对照,泳道5为阴性对照)。经鉴定正确的重组Ty21a(pMBE)工程菌在28℃培养至OD600为0.3左右时,培养温度迅速升至42℃诱导裂解。裂解完成后,离心收集菌体,PBS洗涤后冻干保存备用。
试验结果:将转化后的重组Ty21a(pMBE)工程菌经PCR扩增,1%琼脂糖电泳,出现276bp的条带,说明裂解质粒pMBE已成功转入Ty21a菌中。
1。2伤寒沙门氏菌Ty21a菌蜕的鉴定:
通过菌落计数方法测定重组Ty21a(pMBE)工程菌的裂解效率(见图2);通过扫描电镜观察,透射电镜观察等方法对Ty21a菌蜕的形态进行初步鉴定(见图3,A为扫描电镜结果,B为透射电镜结果)。
试验结果:将PCR鉴定正确的重组Ty21a(pMBE)工程菌于28℃200r/min培养至对数生长周期。将培养物分为2组,一组将培养温度迅速升高到42℃诱导E基因表达,另一组于28℃继续培养,不同时间点取样进行菌落计数。结果显示,Ty21a菌(pMBE)在诱导后在4h时裂解最充分,裂解效率达99%以上。
扫描电镜和透射电镜电镜结果显示,绝大多数细菌在诱导后形成菌蜕,呈空泡状结构,并能看到溶菌孔道,直径介于100-200nm之间。菌蜕保留了完整的细菌外膜,但因为胞内物质被释放出去,细菌发生皱缩(参见图3)。
实施例2伤寒沙门氏菌Ty21a菌蜕的装载及体外转染
2.1质粒pEGFP-N1的鉴定和大量提取:
首先对绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-N1(购自CLONTECH公司)进行酶切鉴定;鉴定正确的质粒进行大量提取并浓缩备用。
2.2Ty21a菌蜕的装载:
在制备的菌蜕中,细菌的内膜和外膜形成-个具有完整细胞膜结构的空腔,其装载就是将DNA导入到这个空腔中。
装载过程:将冻干的Ty21a BG重悬于浓度为2-20mg/ml的pEGFP-N1HBS缓冲液中,菌蜕与质粒的比例为10mg菌蜕装载100-500uL上述浓度的质粒,然后再加入终浓度为20-30mM的CaCl2溶液,28-37℃孵育10-20min,离心收集,PBS(PH7.4)洗涤后保存备用。
装载效率:上述装载质粒pEGFP-N1的Ty21a菌蜕中,应用定量PCR检测每个菌蜕大约装载2000-5000拷贝的质粒。
2.3伤寒沙门氏菌Ty21a菌蜕的体外转染
2.3.1小鼠巨噬细胞系RAW264.7的培养:
小鼠巨噬细胞系RAW264.7(购自北京协和医院细胞中心),用含有10%胎牛血清,1%L-谷氨酰胺和1%青链霉素的DMEM培养基(以上试剂均购自GIBCO公司),在37℃,5%CO2的条件下培养。
2.3.2Ty21a菌蜕的体外转染:
转染条件优化过程:转染前12h将细胞(105-106)接种于6孔板,然后按一不同比例(细胞∶菌蜕=1∶100-2000)加入装载有质粒的Ty21a菌蜕、Ty21a菌蜕或质粒。37℃孵育2h。无热源PBS(PH7.4)洗涤2次,去除未吞噬的菌蜕细胞。加入2ml 5%FBS或10%FBS DMEM培养基,37℃孵育。分别于转染后24h、36h和48h收集细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况。确定最佳转染过程。
标准转染过程:转染前12h将生长状态良好的小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞(105-106)接种于6孔板,然后以按不同比例(细胞∶菌蜕=1∶100-2000)加入装载有质粒的Ty21a菌蜕,同时设立空菌蜕和质粒pEGFP-N1对照。37℃孵育2h,无热源PBS(PH7.4)洗涤2次,去除未吞噬的菌蜕细胞。加入2ml含5-10%FBS的DMEM培养基,37℃继续孵育,在转染后不同时间24h、36h和48h收集细胞,分别用荧光显微镜和流式细胞观察绿色荧光蛋白表达情况,图4和图5分别为转染后48小时荧光显微镜(图4)和流式细胞(图5)观察结果。
实验结果:将绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-N1装载至制备好的Ty21a菌蜕,并转染至小鼠巨噬细胞系RAW264.7中,应用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,结果如图4所示,A为RAW264.7阴性对照,未观察到荧光蛋白的表达,B为含有转化了质粒pEGFP-N1的Ty21a菌蜕的RAW264.7细胞,可观察到荧光蛋白的表达。流式细胞检测结果也证实了绿色荧光蛋白的表达,结果如图5所示。两种方法的结果表明,装载pEGFP-N1质粒的Ty21a菌蜕在RAW264.7中得到了有效表达。
Claims (10)
1.一种人伤寒沙门氏菌菌蜕,所述菌蜕是通过温控诱导裂解基因E在人伤寒沙门氏菌中表达从而导致细菌裂解,而形成的完整的细菌空壳。
2.根据权利要求1所述的菌蜕,其特征在于,所述人伤寒沙门氏菌为Ty21a。
3.根据权利要求2所述的菌蜕,其特征在于,所述基因E是以质粒pMB为载体行使裂解功能的。
4.一种制备人伤寒沙门氏菌菌蜕的方法,所述方法包括以下步骤:
(1)培养所述伤寒沙门氏菌;
(2)将含有裂解基因E的重组质粒pMBE以电转化方法转化入所述伤寒沙门氏菌,获得稳定转化pMBE的重组人伤寒沙门氏菌;
(3)在28℃培养上述转化pMBE的重组人伤寒沙门氏菌,在42℃诱导所述基因E的表达;
(4)在诱导表达后2-4小时收集步骤(3)获得的菌蜕。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述人伤寒沙门氏菌为Ty21a。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述电转化方法的缓冲***为含0.5M山梨醇,0.5M甘露醇,10%葡萄糖的磷酸盐缓冲液。
7.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述电转化方法的电转化电压为250-500V、电容10-30μF,电阻100-300Ω。
8.根据权利要求1-3中任一所述的菌蜕作为分子递送载体的应用,所述应用包括:
(1)将被递送分子装载于所述菌蜕中;
(2)将装载了被递送分子的菌蜕转导或转染入靶细胞。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述被递送分子为核酸分子。
10.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述靶细胞为包括巨噬细胞在内的抗原递呈细胞。
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