CN101983725B

CN101983725B - 一种壳聚糖的病原微生物灭活方法

Info

Publication number: CN101983725B
Application number: CN 201010547705
Authority: CN
Inventors: 张家骊; 夏文水; 李博
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2010-11-17
Filing date: 2010-11-17
Publication date: 2013-06-12
Anticipated expiration: 2030-11-17
Also published as: CN101983725A

Abstract

一种壳聚糖的病原微生物灭活方法，属于生物材料加工技术领域。本发明是采用NaOH溶液对壳聚糖中病原微生物进行初步灭活，然后将壳聚糖干燥，充氮并密封，在-20～30℃条件下进行10～50kGy的γ-射线辐照，将壳聚糖中可能存在的病原微生物灭活，保证壳聚糖作为生物材料的安全性。与现有病原微生物灭活方法相比，本发明具有在保证有效杀灭细菌、病毒等病原微生物的同时，壳聚糖的脱乙酰度、结晶度等质量指标不变，分子量的降低程度显著低于其他灭活方法，在保证有效的杀灭可能污染的病原微生物的同时，维持该生物材料的质量和功能。

Description

一种壳聚糖的病原微生物灭活方法

技术领域

本发明涉及壳聚糖，尤其涉及一种壳聚糖的病原微生物灭活方法，属于生物材料加工技术领域。

背景技术

壳聚糖化学名为聚(1,4)-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖，主要由广泛存在于节肢动物外壳和真菌类细胞壁中提取的甲壳素经脱乙酰化制得，是一种天然氨基多糖。因其具有良好的生物相容性、生物降解性，壳聚糖在生物材料、医药、食品等领域有广泛应用。但壳聚糖来源于动物体，可能被从病毒到细菌等各种病原微生物污染；同时壳聚糖在加工、储藏中也可能因仪器和器皿、试剂、生产环境等因素的影响，受到细菌、病毒等病原微生物的污染。如果这些污染物被传播给人，将会引起严重的健康问题。这些污染物还可能降低甚至破坏所污染的材料。

现有生物材料的细菌灭活方法包括干热、湿热、过滤等；病毒灭活方法包括S/D法（有机溶剂/表面活性剂法）、过滤法、加热法、环氧乙烷等。它们在生物材料灭菌等的应用可参见专利CN1225020A、专利申请200910209501.X等。

但这些方法对壳聚糖病原微生物的灭活有局限性：S/D法仅对包膜病毒有效；加热法对耐热病毒效果差，并且实验发现加热会引起壳聚糖产品的降解：170℃ 2小时干热灭菌后壳聚糖由类白色变为棕色；120℃4小时干热灭菌后壳聚糖变为棕黄色，分子量降低至初始的27.6%；121℃湿热灭菌后壳聚糖由类白色变为黄色，分子量降低至初始的56.8%。烷基化剂可能引起材料的降解等反应。过滤法对高粘度的产品如壳聚糖也不适用。

γ-射线是一种由亚原子粒子相互作用产生的电磁辐射，它对各种微生物均有杀灭作用，包括有包膜和无包膜病毒及所有的基因型物质。与传统的细菌、病毒灭活方法相比较，γ-射线辐照有其独特的优点：1、不使物品升温，适用于忌热物品的消毒，除某些塑料、活细胞及其制剂外，许多医用物品都可用它进行消毒灭菌。2、穿透力强。射线可穿透被照物品的各个部位，一般不受物品包装、形态的限制。3、被照物品不会产生感生放射性，辐照后无残留毒性，方法简便。4、省能，尤其适于大规模工业化处理。由于上述优势，γ-射线辐照在生物材料中对细菌和病毒的灭活应用也越来越多，如专利CN1665388A、CN101757651A、CN1628860A。

一般情况下，20～50kGy剂量的γ-射线辐照几乎能灭活所有的细菌和病毒。方月娥等报道采用2.5～20kGyγ-射线辐照壳聚糖膜可灭活金葡菌和枯草芽孢杆菌，同时辐照引起了壳聚糖分子量降低，但具体数值未报道。病毒灭活需要的辐照剂量大于灭菌需要的剂量。辐照剂量越大，对生物大分子材料的损伤也越大。Choi等报道壳聚糖溶液2-10kGy辐照后，分子量急剧下降，100kGy以上辐照时溶液变为棕色。Gryczka等报道壳聚糖固体在6.3～300kGy辐照后分子量下降并结晶性发生变化，14.4kGy辐照后分子量即降低至初始分子量的30%，300kGy辐照后分子量仅为初始分子量的2.9%。Kang等报道壳聚糖溶液辐照后结晶度降低。这些分子量、结晶度等的变化会显著影响壳聚糖的质量，限制其作为生物材料的应用。

可见，对壳聚糖进行病原微生物灭活的关键在于彻底进行灭活的同时，尽最大限度地减小对材料的生物活性和结构的影响是非常重要的。因此，寻找一种能灭活所有病毒，同时对壳聚糖质量影响较小，操作方便的方法，将有助于提高壳聚糖产品的安全性，并保证其质量适合作为生物材料使用。

NaOH溶液能够灭活病原微生物，但由于很多生物材料不耐受强碱，其应用很少见。壳聚糖对NaOH稳定，但由于壳聚糖不溶于碱，水相中的NaOH难以灭活包裹在壳聚糖固体颗粒内部的病原微生物，受这样一个两相体系的限制难以完全灭活病原微生物，所以该方法对壳聚糖中病原微生物灭活有很大的局限性。

综上所述，壳聚糖来源于动物体，涉及病毒以及传染性病原体等的风险。现有生物材料的细菌灭活方法不适用于壳聚糖。γ-射线是一种有效灭活壳聚糖中病原微生物的方法，但完全灭活壳聚糖中的病原体需要较高的辐照剂量，高剂量时对壳聚糖的降解较为显著，对其质量有一定影响。NaOH灭活壳聚糖中病原微生物受到两相体系的限制有很大局限性。因此，寻找一种能灭活所有病毒，同时对壳聚糖质量影响较小，操作方便的方法，将有助于提高壳聚糖产品的安全性。

发明内容

本发明是为了克服现有病原微生物灭活技术在壳聚糖的病原微生物灭活中的缺陷而提供的一种在保证有效杀灭可能污染的病原微生物的同时，维持壳聚糖的功能和性质的病原微生物灭活方法。

本发明的目的可通过以下技术方案来实现：

采用NaOH溶液对壳聚糖中病原微生物进行初步灭活，然后将壳聚糖干燥，充氮并密封，控温辐照。

[0013]所述的初步灭菌，采用质量浓度4.0%～40%的NaOH溶液，NaOH溶液与壳聚糖用量质量比为20～50︰1，温度为室温至100℃，初步灭菌至菌落总数小于1000cfu/g；然后过滤，水洗至中性。

所述的干燥是包括但不限于常压干燥、减压干燥、冷冻干燥等方式，使壳聚糖含水量小于10%。

所述的充氮密封是取一定量壳聚糖至适当的容器中，充氮气并立即密封，以降低氧的分压，减少辐照产生的活性氧，减少辐照对壳聚糖的降解。

所述的控温辐照是指密封后的壳聚糖在温度-20～30℃条件下，以10～50kGy的γ-射线辐照。

控温辐照后壳聚糖中的壳聚糖中感染性病毒的残留滴度≤0.5 lg TCID₅₀；菌落数降低至≤10cfu/g。

本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明通过NaOH溶液初步灭活病原微生物，降低壳聚糖的生物负载；然后通过10～50kGy的γ-射线辐照即可实现无菌无病毒，避免了高剂量辐照。因此壳聚糖的脱乙酰度、结晶度等在灭活前后维持不变，分子量降低幅度显著低于其他病原微生物灭活方法；也避免了其他灭活方式引起壳聚糖降解或难以完全灭活等缺点。在保证有效杀灭可能污染的病原微生物的同时，维持壳聚糖的质量和性能，灭活后壳聚糖产品适用于作为生物材料使用。

具体实施方式

实施例1

取壳聚糖样品1份，依次加入约10⁷cfu/g短小芽孢杆菌孢子（Spores of Bacillus pumilus），约10⁷cfu/g枯草芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus subtilis)和约10⁶TCID₅₀/g的猪细小病毒（PPV），1g/瓶分装。加入4.0%NaOH溶液，NaOH溶液用量与壳聚糖比为20︰1，80℃保温，使灭菌至菌落总数小于1000cfu/g。过滤，水洗至中性，安瓿瓶分装，冷冻干燥，干燥后水分含量9.6%。充氮气，立即密封。-20℃进行50kGyγ-射线辐照。辐照后采用Reed-muench TCID₅₀法测定病毒滴度降低（total reduction factor, TRF）情况，并测定菌落数降低的情况。

实验结果表明：4.0%NaOH溶液80℃初步灭活后50kGy γ-射线辐照，PPV的残留滴度≤0.5 lg TCID₅₀，菌落数降低至≤10cfu/g。同时灭活前后壳聚糖结晶度分别为36.4%、36.7%、脱乙酰度均为84.2%，分子量降低为初始分子量的76.6%。

实施例2

壳聚糖的准备同实施例1。

用NaOH溶液质量浓度为15%，NaOH溶液与壳聚糖用量比为30︰1，60℃灭菌至菌落总数小于1000cfu/g。过滤，水洗至中性。减压干燥至水分含量8.8 %。安瓿瓶分装，充氮气，密封。室温进行总剂量25kGyγ-射线辐照，辐照后PPV的残留滴度≤0.5 lg TCID₅₀，菌落数降低至≤10cfu/g。辐照前后壳聚糖结晶度分别为36.4、36.7%，脱乙酰度分别为84.2%和84.6%，分子量降低为初始分子量的77.8 %。

实施例3

壳聚糖的准备同实施例1。

用NaOH溶液质量浓度为40%，NaOH溶液与壳聚糖用量比为50︰1，温度为室温，灭菌至菌落总数小于1000cfu/g。过滤，水洗至中性。减压干燥，干燥后水分含量8.9 %。安瓿瓶分装，充氮气，密封。30℃进行总剂量10kGy γ-射线辐照，辐照后PPV的残留滴度≤0.5 lg TCID₅₀，菌落数降低至≤10cfu/g。辐照前后壳聚糖结晶度分别为36.4、36.2%，脱乙酰度分别为84.2%和85.0%，分子量降低为初始分子量的80.1%。

实施例4

壳聚糖的准备同实施例1。

用NaOH溶液质量浓度为30%，NaOH溶液与壳聚糖用量比为40︰1，温度为100℃，灭菌至菌落总数小于1000cfu/g。过滤，水洗至中性。常压干燥，干燥后水分含量9.2 %。安瓿瓶分装，充氮气，密封。-10℃进行总剂量30kGy γ-射线辐照，辐照后PPV的残留滴度≤0.5 lg TCID₅₀，菌落数降低至≤10cfu/g。辐照前后壳聚糖结晶度分别为36.5、36.3%，脱乙酰度分别为84.1%和84.7%，分子量降低为初始分子量的78.2%。

Claims

1.一种壳聚糖的病原微生物灭活方法，其特征在于采用NaOH溶液对壳聚糖中病原微生物进行初步灭活，然后将壳聚糖干燥，充氮并密封，控温辐照；步骤为：

（1）采用NaOH溶液对壳聚糖中病原微生物进行初步灭活：所述的NaOH溶液质量浓度为4.0%～40%，NaOH溶液与壳聚糖质量比为20～50︰1，温度为室温至100℃，初步灭活至菌落总数小于1000cfu/g；然后过滤，水洗至中性；

（2）所述的干燥：采用常压干燥、减压干燥、或冷冻干燥，使壳聚糖含水量小于10%；

（3）所述的充氮密封：取一定量壳聚糖至适当的容器中，充氮气并立即密封，以降低氧的分压，减少辐照产生的活性氧，减少辐照对壳聚糖的降解；

（4）所述的控温辐照：密封后的壳聚糖在温度-20～30℃条件下，以10～50kGy的γ-射线辐照；

经控温辐照后，壳聚糖中感染性病毒的残留滴度≤0.5 lg TCID₅₀；菌落数降低至≤10cfu/g。