CN101979645A - 一种腺苷甲硫氨酸的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种腺苷甲硫氨酸的酶催化制备方法，将腺苷甲硫氨酸合成酶的游离酶固定在固定化载体上，如固定在海藻酸盐上，与底物反应***甲硫氨酸、三磷酸腺苷及其他金属盐离子物质反应，所得反应产物中活性物质(S，S)-腺苷甲硫氨酸含量高，且腺苷甲硫氨酸合成酶经多批次反应后，仍然可保留高活性。

Description

一种腺苷甲硫氨酸的制备方法

技术领域

本发明涉及腺苷甲硫氨酸的酶促合成制备方法，具体涉及用固定化的腺苷甲硫氨酸合成酶催化合成制备腺苷甲硫氨酸，属于生物制药领域。

背景技术

中国是人口大国，同时也是“肝炎大国”。据1992年全国病毒性肝炎流行病学调查，全国约有1.2亿人携带乙型肝炎病毒，丙型肝炎在一般人群中感染率为3.1％。我国现有2000万例慢性乙型肝炎患者，其中部分有可能转化为肝硬化，甚至肝癌。

腺苷甲硫氨酸(SAMe)是人体内一种极为重要的中间代谢产物。它可以通过转硫途径生成体内关键的抗氧化及解毒物质——半胱氨酸，再生成另一种关键的抗氧化和解毒物质——谷胱甘肽，解除肝内的氧化物应激状态，从而达到防治肝病的目的。另外SAMe还可以促进依赖性脂磷脂的合成，降低胆固醇和磷脂的比例，恢复细胞膜的流动性，促进胆汁的主动转运和甘油酸三脂的分泌。因此SAM对肝内胆汁郁积、各种急、慢性肝炎以及脂肪肝、肝硬化等肝脏疾病有很好的疗效。SAMe于20世纪80年代出现在欧洲医药市场上，1999年美国FDA正式批准SAMe上市，使其迅速成为畅销的营养保健品之一，年销售额超过10亿美元。由于其疗机理清楚、效显著、起效快、副作用小，近年来在国内的需求量也越来越大，有广阔的市场前景。

目前，SAMe的生产方法主要有化学合成法、发酵法和酶促转化法3种。

化学合成法采用S一腺苷同型半胱氨酸(S-adenosythomocysteine)和甲基供体(CH₃I)合成，腺苷甲硫氨酸有(R，S)和(S，S)两种构型，只有(S，S)构型才有生物活性，但合成产物中含有大量(R，S)腺昔甲硫氨酸，且难以分离，合成产率也低。

发酵法采用在培养基中添加L-甲硫氨酸，用酵母发酵生产(一)型腺苷甲硫氨酸，是60年代至80年代生产腺普甲硫氨酸的主要方法，但发酵法的缺点是终产物积累量低、原料转化率低、产品生产周期长以及SAM的纯化工艺复杂等，从而导致了腺苷甲硫氨酸的价格居高不下，限制了SAM的广泛生产机应用。

酶促转化法主要利用腺苷甲硫氨酸合成酶催化底物L一甲硫氨酸和ATP生成(一)型腺昔甲硫氨酸。酶作为生物催化剂具有快速、专一的特点，因此酶促转化法生产腺苷甲硫氨酸具有高效、工艺简单、产品生物活性高且无污染的优势。但是，SAMe合成酶在动物、植物和微生物中含量少、酶活低，且分离纯化困难，因此通过酶促转化法生产SAMe受到SAMe合成酶活力的限制，基因工程的发展使获得大量高活性的SAMe合成酶成为可能，利用DNA重组技术构建高效表达SAMe合成酶的基因工程菌，重组菌表达SAMe合成酶活性为野生菌的几十倍到上百倍，经初步分离纯化后的游离酶可用于体外SAMe的合成，但游离酶不稳定，容易失活。

固定化酶技术是近年来发展起来的一项技术，它是模拟体内酶的作用方式，通过化学或无力的手段，用载体将酶束缚或限制在一定的区域内，使酶分子在此区域进行特有和活跃的催化作用，并可回收及重复使用。常用的固定化方法可分为4类：吸附法、交联法、包埋法、共价结合法。理论上，对于游离的酶，通过固定化处理，可以提高酶在体外的稳定性。但是，不同的酶，由于其结构及性质的差异，固定化所选用的方法及载体的不同，其酶活保留率、稳定性及多次使用的酶活回收率等存在很大差别。

中国专利CN101285085A公开了一种重组微生物全细胞催化合成SAMe和利用固定化细胞催化生产SAMe的方法，但由于微生物细胞膜的通透性屏障，使反应底物和产物都难于自由进入细胞，生物催化效率明显低于酶催化反应体系，且由于细胞中，含有其它很多的一些杂酶会利用反应底物(如ATP)，使得其它反应产物也相应增多，后续的纯化工艺也会更为复杂困难。牛卫宁等(牛卫宁，左晓佳，尚晓娅，等.固定化E.Coli JM109(pBR322-MAT)细胞催化合成S-腺苷甲硫氨酸)利用固定化细胞合成S-腺苷甲硫氨酸，在反应八批次后，固定化细胞的酶活性开始下降较为明显，酶活保存仅为最高酶活性的78％。

发明内容

为解决现有技术中利用SAMe合成酶合成SAMe时，SAMe合成酶体外不稳定、容易失活的问题，本发明的目的在于提供一种应用固定化腺苷甲硫氨酸合成酶酶催化合成(S，S)-腺苷甲硫氨酸的方法，该方法生产效率高，产物得率高，且固定化酶经多次使用后，仍有较高的回收率，酶源更稳定。

本发明对SAMe合成酶的固定化方法，可以采用吸附法、交联法、包埋法、共价结合法、包埋-吸附结合法或包埋-交联结合法中的任意一种，将SAMe合成酶固定在固定化载体上。

本发明中，优选包埋-吸附结合法或包埋-交联结合法。

本发明中，所述的固定化载体，可以是聚乙烯醇、明胶、海藻酸盐、壳聚糖、琼脂、磁性微球中的任意一种，优选为海藻酸盐。

本发明中，通过将游离的腺苷甲硫氨酸合成酶以包埋-交联结合法，固定在载体海藻酸盐(海藻酸钙)上，固定化酶反应10批次以上，其酶活回收率仍可保证在80％以上，且酶催化反应活性高，ATP转化率可一直稳定维持在80％以上。

本发明催化合成腺苷甲硫氨酸的方法，是将固定化酶加入到底物反应体系中：底物反应体系包括原料甲硫氨酸和三磷酸腺苷(ATP)，以及其它金属离子盐如含Mg²⁺、K⁺的盐，在pH为6.0-7.5、温度为35-42度的环境中进行酶促转化反应，得到腺苷甲硫氨酸。

具体地，本发明催化生产腺苷甲硫氨酸的方法包括：

(1)构建含腺苷甲硫氨酸合成酶基因的工程菌细胞；

(2)利用所构建得到的工程菌细胞发酵生产制备腺苷甲硫氨酸合成酶；

(3)腺苷甲硫氨酸合成酶的固定化：用海藻酸盐、壳聚糖或琼胶材料将腺苷甲硫氨酸合成酶发酵液进行包埋，并且用戊二醛、无水丁烯二酸-乙烯交联，冷藏4℃条件下备用；

(4)酶促反应：使用经固定化的腺苷甲硫氨酸合成酶，以甲硫氨酸和三ATP为原料催化合成腺苷甲硫氨酸，

(5)分离：反应结束后，将固定化酶从反应溶液中分离，纯水洗涤固定化酶备用。

本发明中，所构建的工程菌细胞包含来源于大肠杆菌Escherichia coli腺苷甲硫氨酸合成酶的基因；或包含有来源于酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae腺苷甲硫氨酸合成酶2的基因。

本发明中，在酶促反应步骤中，反应底物中进一步还包括金属离子盐，比如含Mg²⁺、K⁺的金属盐，可以是氯化镁、硫酸镁、硼酸钾、硼酸钠等。

本发明中，酶促反应的具体条件为：将浓度为0.3-3.0mg/ml的腺苷甲硫氨酸合成酶，加入到底物反应体系中，底物反应体系为甲硫氨酸20-60mM、三磷酸腺苷7-20mM、以及一定量的Mg²⁺、K⁺的金属盐，反应体系的pH为6.0-7.5，温度为35-42℃。

本发明中，载体固定化酶的加入量，0.3-3.0mg/ml是指将载体固定化酶换算成腺苷甲硫氨酸酶的量。

本发明中，固定在载体上的酶液，是指用构建得到的工程菌细胞发酵生产制备腺苷甲硫氨酸合成酶的粗酶液，也可以是指用构建得到的工程菌细胞发酵生产制备腺苷甲硫氨酸合成酶经精制后的精酶或纯酶液。

本发明中，底物甲硫氨酸可以是D，L-甲流氨酸混合物，也可以是L-甲硫氨酸，当用D，L-甲硫氨酸混合物时，加入的底物甲硫氨酸的量应大于ATP的量。

本发明合成腺苷甲硫氨酸的方法中，进一步地还可以包括在分离出固定化酶后的反应液中，进一步加入一定量的阴离子试剂，以使腺苷甲硫氨酸成盐，提高腺苷甲硫氨酸的稳定性。

所用的阴离子试剂，是指含阴离子的无机酸或有机酸及其盐，如可以是盐酸、硫酸、对甲苯磺酸盐、丁二磺酸盐、牛磺酸盐、多磷酸盐、聚乙烯磺酸盐、聚乙烯磷酸盐、聚对苯乙烯磺酸盐、聚对苯乙烯磷酸盐或8-18个碳原子的脂肪酸酰化牛磺酸盐中的任意一种，也可以是其中的任意两种的混合。

应用本发明用固定化酶，催化生产腺苷甲硫氨酸，得到的腺苷甲硫氨酸产物中，95％以上的为具有生物活性的(S，S)-腺苷甲硫氨酸，并且固定化酶与游离酶相比，具有更好的稳定性，可以回收使用，至少循环使用10次以上，且其活性仍可保留80％以上，解决了游离酶只能使用1次的问题。

附图说明

图1为精制后的酶促反应物(S，S)-腺苷蛋氨酸含量测定高效液相色谱图。

具体是实施例

本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。

主要材料

所用工程菌：重组大肠埃希氏菌(携带腺苷甲硫氨酸合成酶的metK基因)，公司自主构建，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2299，并已在中国专利申请CN101392230A中公开记载。

实施例1利用含腺苷甲硫氨酸合成酶的基因菌种发酵制备腺苷甲硫氨酸合成酶

一、发酵液的配制：

按以下配方分别配制种子培养基、发酵培养基和补料培养基：

(1)种子培养基(LB培养基)(％)：蛋白胨∶酵母粉∶氯化钠＝2∶1∶2

(2)发酵基础培养基(g/100ml培养基)：

葡萄糖：1.47蛋白胨：0.4

酵母粉：0.55磷酸二氢钾：0.4

磷酸氢二钾：0.3磷酸氢二钠：0.35

硫酸铵：0.047硫酸镁：0.05

氯化铵：0.01硫酸亚铁：0.002

氯化钙：0.002硫酸锰：0.0007

200mg/ml氧化四环素：0.0125(V/V)

(3)补料培养基(g/100ml培养基)：

葡萄糖：1.12酵母粉：0.55

硫酸镁：0.035

二、发酵过程：

(1)将含有重组菌的甘油种以1∶100的比例接入一级种子培养基(LB培养基)中，37℃、180rpm摇床培养约8个小时。

(2)将一级种子液以1∶20的比例接入二级种子培养基(LB培养基)中，37℃、180rpm摇床培养约8个小时。

(3)将二级种子液以1∶6接入种子罐，37℃、溶氧40～60、PH7.0。

(4)当种子罐中菌液的OD600＝1.5～2.0时，按1∶10的比例接入发酵罐中发酵，发酵条件为温度37℃、溶氧60～90、PH7.0。

(5)在大罐开始发酵1个小时后开始以流加的方式补料。

(6)发酵的过程中监控发酵液的PH值、OD600、溶氧、浊度等各项参数。

发酵过程如下表所示：

(7)8.5小时后停止发酵。8.5小时后停止发酵，取样用SDS-PAGE聚丙烯酰胺电泳测定其中SAM合成酶的表达量，测定目的酶的表达量占菌体可溶性蛋白的41.4％。

实施例2固定化酶的制备

(一)吸附-包埋法制备固定化酶

1、材料：聚乙烯醇、海藻酸钠、壳聚糖、硼酸、氯化钡、吸附剂(硅藻土、活性炭或三氧化二铝)。

2、固定化液的制备

称取一定量的壳聚糖溶于1％醋酸溶液中，然后加入一定量的硼酸和氯化钡溶解，使最终硼酸浓度为4％、壳聚糖浓度为1.0％、氯化钡浓度为2％，pH值为5.0，备用。

3、酶液的配制

配备一定浓度的pH4.6醋酸-醋酸钠缓冲酶液，0.22μm滤膜过滤备用。

4、固定化酶的制备

配制聚乙烯醇与海藻酸钠浓度比为9∶1的载体溶液，其中聚乙烯醇浓度占8％，取载体溶液总体积20ml。称取0.5g硅藻土，加入适量酶液(酶包埋量40mg)、吸附10min，然后一并加入到聚乙烯醇-海藻酸钠溶液中，混匀，之后，用注射器吸取该混合液滴到硼酸-氯化钡-壳聚糖混合固化液中，固化一定时间，4℃冰箱备用。

包埋-交联法制备固定化酶

1、材料：聚乙烯醇、海藻酸钠、壳聚糖、硼酸、氯化钡、吸附剂(硅藻土、活性炭或三氧化二铝)。

2、固定化酶的制备

(1)聚乙烯醇(PVA)固定化酶：配置10％PVA的水溶液10ml，加入0.02g海藻酸钠充分溶解，然后与一定浓度的粗酶液混合均匀，使用6号针头注射器滴入2％CaCl₂的饱和硼酸溶液，边滴入边搅拌，在4℃冰箱中固定化8h，在10％甲苯的水溶液通透处理1h，清洗后备用。

(2)海藻酸钙(CA)固定化酶：配置2％海藻酸钠的水溶液10ml，然后与一定浓度的粗酶液混合均匀，使用6号针头注射器滴入2％CaCl₂的水溶液，在4℃冰箱中固定化4h，在10％甲苯的水溶液通透处理1h，清洗后备用。

(3)明胶固定化酶：将保温与37℃的10％明胶的水溶液10ml与一定浓度的粗酶液混匀，铺成2mm厚的膜，4℃冷却2h，切成2mm左右的小块，加入0.5％戊二醛的水溶液交联30min，10％甲苯的水溶液通透处理1h，洗涤备用。

实施例3酶促反应

将上述固定化酶按3.0mg/ml(这算成SAM合成酶的量)加入反应体系中，反应体系包括：100mM四硼酸钠+50mM K₂SO₄+40mM MgSO₄+20mM ATP+60mMD，L-Met，35℃、pH为6.5的条件下，反应8小时，将固定化酶与反应液分离，用纯水漂洗固定化酶3-4次，滤干后待下次使用。

实施例4酶促反应

将上述固定化酶按0.3mg/ml(这算成SAM合成酶的量)加入反应体系中，反应体系包括：100mM四硼酸钠+40mM MgCl₂+20mM ATP+20mM L-Met，30℃、pH为7.0的条件下，反应8小时，将固定化酶与反应液分离，用纯水漂洗固定化酶3-4次，滤干后待下次使用。

实施例5酶促反应

将上述固定化酶按2.1mg/ml(这算成SAM合成酶的量)加入反应体系中，反应体系包括：80mM四硼酸钠+40mM K₂SO₄+40mM MgSO₄+30mM ATP+100mMD，L-Met，42℃、pH为6.8的条件下，反应8小时，将固定化酶与反应液分离，用纯水漂洗固定化酶3-4次，滤干后待下次使用。

实施例6酶促反应

在本发明允许的范围内，对固定化酶、ATP、D，L-Met的量进行适当变更，按实施例3的方法，进行酶促反应，合成腺苷甲硫氨酸，本领域的技术人员可以很容易地进行实施。

实施例7SAMe的精制

将实施例5得到的酶促反应液通过安伯来特(amberlite)IRC-76(弱酸性离子交换树脂)的交换柱，使SAMe吸附在树脂上，树脂用0.00005mol/L(0.0001N)硫酸水溶液通过该交换柱，然后再用0.2mol/L(0.4N)硫酸水溶液洗脱SAMe，得到SAMe洗脱液。

再将该洗脱液通过安伯来特XAD-4(合成吸附剂)的交换柱，使杂质吸附在树脂上，得到精制后的含有SAMe的水溶液。

将上述含有SAMe的水溶液通过安伯来特IRA-67(弱碱性离子交换树脂)的交换柱，得到除去了过量硫酸根离子的含有SAMe的液体组合物。

实施例8各种固定化酶方法经过连续批反应后ATP转化率及酶活回收率的比较

按实施例3的条件，对各种固定化酶进行连续批次反应，分别检测器ATP转化率及SAM产量、酶活回收率，结果见表1

ATP转化率：ATP转化率是通过计算反应前后ATP的含量的比值，间接评价腺苷蛋氨酸的产量(理论上认为消耗的ATP全部转化为腺苷蛋氨酸)。ATP含量是通过面积归一法测定。

酶活回收率：每批反应的酶活回收率是通过每批反应后腺苷蛋氨酸的含量与第一批反应结束后腺苷蛋氨酸的含量的比值得出。

表1各种固定化酶批次反应后ATP转化率及酶活回收率比较

由上表可知，海藻酸钙固定化酶可以连续反应16批而酶活回收率仍在80％以上，吸附包埋固定化在连续反应8批次后，其酶活回收率也仍在77％以上。

实施例9实施例7的产物中S，S-腺苷甲硫氨酸含量测定

参照高效液相色谱法(中国药典2005版第二部附录VD)测定产物中S，S-腺苷蛋氨酸与R，S-腺苷蛋氨酸的比例

流动相：甲酸铵溶液(取甲酸铵189.2g，加水700ml溶解，用甲酸调节pH至50.加水稀释至1000ml，摇匀.流速：0.5ml/mim

色谱柱：4.6mm×150mm，C18柱，粒径5um；检测波长为260nm，理论塔板数按(S，S)异构体计算不得低于4000.

测定方法：取样品，用流动相稀释成约含0.12mg/ml的溶液.取此溶液10ul，注入色谱仪.记录色谱图，(S，S)异构体是两峰之中保留时间较短的一个，即为峰1，结果见图1及表2。

表2面积归一化法测定样品中S，S-腺苷甲硫氨酸的含量

从表2中结果可以看出，所得成品腺苷甲硫氨酸中，(S，S)异构体的含量为92.81％。

实施例10SAMe对甲苯磺酸盐的制备

将实施例7所得的SAMe水溶液用硫酸调pH到2.0左右，与相对于SAMe为3倍摩尔的对甲苯磺酸，于室温下剧烈搅拌的同时，将后者加入到前者，可以看到生成乳白色乳浊液，并在几分钟内偏凝结成一团粘稠状物质。简单的倾斜法除去液体，用蒸馏水分两次洗涤沉淀，洗涤时要剧烈搅拌搅动溶液，同样用倾斜法除去洗涤水后，沉淀于真空干燥中进行干燥处理，得到SAMe对甲苯磺酸盐。

实施例11SAMe丁二磺酸盐的制备

将实施例7所得的SAMe水溶液用硫酸调pH到2.5左右，与相对于SAMe为3倍摩尔的丁二磺酸钠，于室温下剧烈搅拌的同时，将后者加入到前者，可以看到生成乳白色乳浊液，并在几分钟内偏凝结成一团粘稠状物质。简单的倾斜法除去液体，用蒸馏水分两次洗涤沉淀，洗涤时要剧烈搅拌搅动溶液，同样用倾斜法除去洗涤水后，沉淀于真空干燥中进行干燥处理，得到SAMe丁二磺酸盐。

实施例12SAMe聚苯乙烯磺酸盐的制备

将实施例7所得的SAMe水溶液用硫酸调pH到3.0左右，与相对于SAMe为3倍摩尔的聚苯乙烯磺酸钠，于室温下剧烈搅拌的同时，将后者加入到前者，可以看到生成乳白色乳浊液，并在几分钟内偏凝结成一团粘稠状物质。简单的倾斜法除去液体，用蒸馏水分两次洗涤沉淀，洗涤时要剧烈搅拌搅动溶液，同样用倾斜法除去洗涤水后，沉淀于真空干燥中进行干燥处理，得到SAMe聚苯乙烯磺酸盐。

Claims (10)

1.一种酶催化合成腺苷甲硫氨酸的方法，包括将腺苷甲硫氨酸合成酶加入到反应底物体系甲硫氨酸和三磷酸腺苷中，催化得到腺苷甲硫氨酸，其特征在于，所述的腺苷甲硫氨酸合成酶是预先固定在固定化载体上。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述的固定化载体为聚乙烯醇、明胶、海藻酸盐或壳聚糖中的任意一种。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是所述的腺苷甲硫氨酸固定到载体上是采用包埋-吸附结合法或包埋-交联结合法。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述方法具体包括如下步骤：

(1)构建含腺苷甲硫氨酸合成酶基因的工程菌细胞；

(2)利用所构建得到的工程菌细胞发酵生产制备腺苷甲硫氨酸合成酶；

(3)腺苷甲硫氨酸合成酶的固定化：用海藻酸盐、明胶或聚乙烯醇材料将腺苷甲硫氨酸合成酶发酵液进行固定化处理，冷藏于4℃条件下备用；

(4)酶促反应：将固定化酶加入到反应底物甲硫氨酸和三磷酸腺苷反应体系中进行反应，催化反应得到腺苷甲硫氨酸；

(5)分离：反应结束后，将固定化酶从反应溶液中分离，纯水洗涤固定化酶备用。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征是所述的酶促反应步骤中，底物反应体系中还包括金属离子盐。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征是所述的金属离子盐为金属Mg²⁺和/或K⁺盐。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征是所述的酶促反应具体条件为：将浓度为0.3-3.0mg/ml的腺苷甲硫氨酸合成酶，加入到底物反应体系中，底物反应体系为甲硫氨酸20-60mM、三磷酸腺苷7-20mM，以及镁离子和钾离子盐，反应体系的pH为6.0-7.5，温度为30-42℃。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征是，酶促催化反应后，所得的腺苷甲硫氨酸中，(s，s)-腺苷甲硫氨酸的重量百分含量不低于90％。

9.根据权利要求4所述的方法，进一步的步骤包括向所得酶促反应液中加入阴离子试剂，形成腺苷甲硫氨酸盐。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征是所述的阴离子试剂是对甲苯磺酸盐、丁二磺酸盐、牛磺酸盐、多磷酸盐、聚乙烯磺酸盐、聚乙烯磷酸盐、聚对苯乙烯磺酸盐、聚对苯乙烯磷酸盐或8-18个碳原子的脂肪酸酰化牛磺酸盐中的任意一种。

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