CN101974462A

CN101974462A - 一种防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌及其菌剂制备

Info

Publication number: CN101974462A
Application number: CN 201010515678
Authority: CN
Inventors: 李晶; 姜竹; 王玉霞; 张云湖; 张先成; 赵晓宇; 张淑梅; 孟利强
Original assignee: Institute of Microbiology of Heilongjiang Academy of Sciences
Current assignee: Institute of Microbiology of Heilongjiang Academy of Sciences
Priority date: 2010-10-22
Filing date: 2010-10-22
Publication date: 2011-02-16
Anticipated expiration: 2030-10-22
Also published as: CN101974462B

Abstract

一种防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌及其菌剂制备，它涉及一种枯草芽孢杆菌及其菌剂制备。本发明防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌X1，为芽孢杆菌属(Bacillus)，保藏编号为CGMCC No.4037，保藏日期为2010年7月26日。菌剂是通过活化菌种接种于NYD液体培养基中富集培养得菌数浓度达20～40亿/毫升的菌液即完成。本发明中菌X1是对土传病害具有较高防效的生防菌株；其菌剂防治中草药土传病害人参根腐病和菌核病、平贝菌核病及五味子根腐、茎基腐病等病害的防治达60％～80％，菌剂生防制剂安全，不污染环境，不伤害非靶标生物和诱发病原菌的抗药性。

Description

一种防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌及其菌剂制备

技术领域

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌及其菌剂制备。

背景技术

中药现代化对传统医药发展的八字方针是：“安全、有效、稳定、可控”，衡量人参、平贝、北五味子等中药材质量的标准除中药自身的有效成分外，还包括化学农药和重金属等外来污染物的污染。我国人参中的农残及重金属污染，是造成人参质量下降的重要因素，并成为制约我国人参走向国际的主要障碍。在人参的引种栽培过程中会遭受各种病虫害的危害，目前主要依靠化学农药防治。人参、平贝、北五味子等中药材是人们用来防病、治病、保健的特殊商品，过量施用农药，不但使中药材中农药残留超过国际上或我国规定的允许标准，直接损害人体健康；而且研究表明，某些药用植物施用农药不当，也会使其有效成分含量降低。因此，进行人参、平贝、北五味子等中药材生产无污染新技术的研究，生产无公害、优质的绿色人参，是提高中药材产量和质量的重要环节。

药用植物在生长发育过程中经常会受到有害微生物的侵害，造成植株药用部位的产量降低、品质变坏以致丧失药用价值。人参、平贝、北五味子等均是我国北方地道药材。近年来，由于地道药材在当地经多年栽培，病原菌经多年积累，致使病害严重，尤其表现在土传病害上。如人参立枯病、枯萎病、根腐病、菌核病，平贝菌核病和五味子根腐、茎基腐病等土传病害的发生呈日益严重趋势。通过化学杀菌剂对种子和土壤进行处理，起到了缓解病情和阻止病原菌侵染的作用，但也同时带来以根、根茎、鳞茎等入药的中药材农残超标、土壤环境恶化等问题。因此，将高效安全的生防技术引入对上述几种地道药材土传病害的防治中，将起到标本兼治、抗病增产提质的多重作用，为地道药材的高效优质生产提供保证。

药用植物栽培过程中，常遭受各种病虫害的危害，影响药材的质量和产量，造成重大的经济损失。因此有效控制病虫害的危害，是保证中药材高产优质的关键技术措施。目前由于生产者缺乏有关的技术知识和安全有效的农药产品，因此在发生病虫害时，只能移植农作物上的防治方法，造成农药的滥用、误用，不但病虫害得不到有效控制，病原菌、害虫的抗药性不断增加，而且农药残留超标，严重制约了高产、优质、低残留中药材的生产，影响了我国中药的声誉，降低了国际市场上的竞争力。21世纪倡导的绿色中药材是指无污染、安全、优质的中药材。根据药用植物自身的特点，开展生物防治等无污染新技术、新方法前景广阔。

发明内容

本发明提供了一种防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌及其菌剂制备；目的是为了解决目前采用化学农药防治中药材病害，而诱发病原菌或病虫的抗药性、造成农药残留污染及伤害非靶标生物的问题。

防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌，它为防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌X1，为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，属于芽孢杆菌属(Bacillus)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.4037，保藏日期为2010年7月26日；它为革兰氏阳性菌，杆状，长为1.2μm～1.4μm，宽为0.6μm～0.8μm，芽孢中生，椭圆形，无鞭毛，不产色素；在牛肉膏蛋白胨培养基上形成乳白色菌落，皱褶，边缘不整齐，菌落中心突起呈脊状。

本发明中防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌X1淀粉水解呈阳性、油脂水解呈阴性、明胶水解呈阳性、石蕊牛奶试验呈阳性、尿素水解呈阴性、硫化氢试验呈阴性、吲哚试验呈阳性、甲基红试验呈阴性、伏普试验呈阳性、柠檬酸盐试验呈阳性、过氧化酶试验呈阳性、氧化酶试验呈阴性、能利用葡萄糖和蔗糖产酸不产气、马尿酸盐试验呈阳性、硝酸盐还原试验呈阳性、好养生长、生长pH值为6.0～8.0、生长温度为20～40℃。

本发明中防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌，菌株号为X1，为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，属于芽孢杆菌属(Bacillus)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.4037，保藏日期为2010年7月26日。

制备防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌菌剂的方法按以下步骤进行：一、取-70℃甘油保存的防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌X1的菌液，划线接种于NYDA固体培养基上，30℃恒温箱中培养18～20h，挑取单菌落接种于5ml的NYD液体培养基中，30℃、频率为150r/min条件下震荡培养18～20h，得到活化菌液；二、取0.1ml活化菌液涂布于装NYDA培养基的茄瓶上，在30℃恒温箱中培养18～20h，得活化菌种；三、将活化菌种接种于装有NYD液体培养基的发酵罐中，在发酵温度为25±0.5℃、搅拌速度为160r/min、发酵罐内气压为0.5个大气压的条件下发酵24～48h，得菌数浓度达20～40亿/毫升的菌液，即完成防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌菌剂的制备；其中步骤三中发酵开始时通气量为0.8VVM，发酵开始7h后至发酵结束通气量为1VVM。

本发明防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌X1，是从人参根部土样中分离的对人参根腐病、菌核病、立枯病、枯萎病、平贝菌核病和五味子根腐、茎基腐病等土传病害具有较高防效的生防菌株。

本发明防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌的菌剂，对人参、平贝和五味子等地道药材种子和栽种土壤进行处理，使有益微生物菌群在种子表面、根表和根围土壤中定殖、生长，利用竞争和拮抗作用抑制病原菌的生长和繁殖，控制土传病害的发生和蔓延；同时通过提高根部防御酶活性而增强植株抗性；菌剂生防制剂对人、畜安全，不污染环境，不会伤害非靶标生物，不会诱发病原菌的抗药性；改良中药材品质，防治中草药土传病害如人参根腐病、立枯病、枯萎病和菌核病及平贝菌核病和五味子根腐、茎基腐病等病的防治达60％～80％，提高中药材产量，制剂生产成本低廉，操作简单，易于实施，可批量生产和推广应用，对我省绿色中药材生产和持续农业发展意义重大，具有一定开发应用价值。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌，它为防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌X1，为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，属于芽孢杆菌属(Bacillus)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.4037，保藏日期为2010年7月26日；它为革兰氏阳性菌，杆状，长为1.2μm～1.4μm，宽为0.6μm～0.8μm，芽孢中生，椭圆形，无鞭毛，不产色素；在牛肉膏蛋白胨培养基上形成乳白色菌落，皱褶，边缘不整齐，菌落中心突起呈脊状。

本实施方式中防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌是根据《伯杰细菌鉴定手册》初步判定为芽孢杆菌属，然后经过SHERLOCK微生物***鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus)。

本实施方式中防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌X1是从黑龙江省铁力***鹿鸣农场人参棚土样分离得到的，其分离方法如下：

1、采用稀释平板法分离土壤细菌，分别称取采自黑龙江省铁力***鹿鸣农场人参棚不同区域的人参根部土样10g，放入盛有90mL无菌水的三角瓶中，置于摇床上充分振荡10min，使土壤中的细菌充分分散于稀释液中，制成1∶10浓度的土壤悬浮液；

2、待土壤悬浮液沉淀后，用无菌的移液管吸取1mL上清液，移入盛有9mL无菌水的试管中，充分震荡摇匀，制成1∶100的土壤悬浮液；以此类推，制成浓度分别为10^-3、10^-4、10^-5倍稀释悬液，选择10^-3、10^-4、10^-5三个浓度的稀释液各100μL，涂布于NYDA固体培养基中，每个浓度作3个，然后倒置于37℃恒温培养箱中培养18h；统计每个平板上长出的菌落数；挑取单菌落，在NYDA固体培养基上反复划线纯化，直至得到纯系菌株为止；将纯系菌株单菌落接种于NYD液体培养基中，37℃温箱中培养18～20h，取菌液700μl加入到Eppendorf管中，然后加入50％甘油300μl，混匀后置于-70℃冰箱中冷冻保存。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌X1淀粉水解呈阳性、油脂水解呈阴性、明胶水解呈阳性、石蕊牛奶试验呈阳性、尿素水解呈阴性、硫化氢试验呈阴性、吲哚试验呈阳性、甲基红试验呈阴性、伏普试验呈阳性、柠檬酸盐试验呈阳性、过氧化酶试验呈阳性、氧化酶试验呈阴性、能利用葡萄糖和蔗糖产酸不产气、马尿酸盐试验呈阳性、硝酸盐还原试验呈阳性、好养生长、生长pH值为6.0～8.0、生长温度为20～40℃。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌的菌剂制备方法按以下步骤进行：一、取-70℃甘油保存的防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌X1的菌液，划线接种于NYDA固体培养基上，30℃恒温箱中培养18～20h，挑取单菌落接种于5ml的NYD液体培养基中，30℃、频率为150r/min条件下震荡培养18～20h，得到活化菌液；二、取0.1ml活化菌液涂布于装NYDA培养基的茄瓶上，在30℃恒温箱中培养18～20h，得活化菌种；三、将活化菌种接种于装有NYD液体培养基的发酵罐中，在发酵温度为25±0.5℃、搅拌速度为160r/min、发酵罐内气压为0.5个大气压的条件下发酵24～48h，得菌数浓度达20～40亿/毫升的菌液，即完成防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌菌剂的制备；其中步骤三中发酵开始时通气量为0.8VVM，发酵开始7h后至发酵结束通气量为1VVM。

本实施方式制备所得防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌菌剂加水稀释50倍用于人参浸种、灌根或喷洒；对其进行防治人参土传病害人参根腐病和菌核病的防治实验如下：

1、供试病原菌剂：尖孢镰刀菌和菌核病病原菌，在麦粒培养基上培养，待菌丝长满后，磨碎待用；

2、化学药剂供试药剂：50％多菌灵可湿性粉剂，南京诺华化工有限公司；

3、方法

3.1人参种子筛选，筛选均匀饱满的人参种子；

3.2接种病原菌制备

将磨碎的病原菌用细沙按1∶5比例稀释后使用，除空白对照组每盆均匀撒上一层病菌后放上人参种子，再撒一层土覆盖。

3.3实验设计：共做7个处理，种子处理后点播到整好的畦面上，穴距为10cm×10cm，每穴2粒，覆土浇足水，作好标记，每一处理3m²，重复3次；

处理1：空白对照组，直接人参种子，不接种病原菌；

处理2：病原菌对照，直接播种人参种子，接种尖孢镰刀菌；

处理3：化学药剂对照，播种用的人参种子，接种尖孢镰刀菌；

处理4：播种防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌菌剂浸泡过的人参种子，接种尖孢镰刀菌；

处理5：病原菌对照，直接播种人参种子，接种菌核菌；

处理6：播种防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌菌剂浸泡过的人参种子，接种菌核菌；

处理7：化学药剂对照，播种用的人参种子，接种菌核菌；

4、防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌菌剂使用方法

1)浸种：用芽孢杆菌X1菌剂50倍稀释液各浸30分钟，阴干后播种；

2)灌根：苗期和移栽期，用芽孢杆菌X1菌剂50倍稀释液各灌根一次，每株用量100毫升；

3)喷洒：芽孢杆菌X1菌剂50倍稀释液在苗期和始花期各喷洒一次；

5、试验调查：

20天左右观察出苗，记录出苗率；人参出苗后每5天调查一次根腐病、菌核病发病情况，计算发病率，实验结果如表1所示，可见，本实施中所得防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌菌剂对人参根腐病和菌核病的防治达76.2％和87.3％。

表1

采用上述方法对人参立枯病、枯萎病、平贝菌核病和五味子根腐、茎基腐病进行实验，结果为本实施中所得防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌菌剂对人参立枯病、枯萎病、平贝菌核病和五味子根腐、茎基腐病的防治达60％～80％。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三不同的是步骤一中NYDA固体培养基由5g的酵母膏、8g的牛肉膏、10g的葡萄糖和15g的琼脂粉加入蒸馏水并定容至1000mL组成。其它步骤及参数与具体实施方式三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是步骤一中NYD液体培养基由5g的酵母膏、8g的牛肉膏和10g的葡萄糖加入蒸馏水并定容至1000mL组成。其它步骤及参数与具体实施方式四相同。

具体实施方式六：本实施方式防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌的菌剂制备方法按以下步骤进行：一、取-70℃甘油保存的防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌X1的菌液，划线接种于NYDA固体培养基上，30℃恒温箱中培养18～20h，挑取单菌落接种于5ml的NYD液体培养基中，30℃、频率为150r/min条件下震荡培养18～20h，得到活化菌液；二、取0.1ml活化菌液涂布于装NYDA培养基的茄瓶上，在30℃恒温箱中培养18～20h，得活化菌种；三、将活化菌种接种于装有10～15L NYD液体培养基的发酵罐中，在发酵温度为25±0.5℃、搅拌速度为160r/min、发酵罐内气压为0.5个大气压的条件下发酵24～48h，得菌数浓度达20～40亿/毫升的菌液，即完成防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌菌剂的制备；其中步骤三中活化菌种的接种量为发酵罐内NYD液体培养基体积的1％；步骤三中发酵开始时通气量为0.8VVM，发酵开始7h后至发酵结束通气量为1VVM。

Claims

1.一种防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌，其特征在于它为防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌X1，为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，属于芽孢杆菌属(Bacillus)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.4037，保藏日期为2010年7月26日；它为革兰氏阳性菌，杆状，长为1.2μm～1.4μm，宽为0.6μm～0.8μm，芽孢中生，椭圆形，无鞭毛，不产色素；在牛肉膏蛋白胨培养基上形成乳白色菌落，皱褶，边缘不整齐，菌落中心突起呈脊状。

2.根据权利要求1所述的防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌，其特征在于防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌X1淀粉水解呈阳性、油脂水解呈阴性、明胶水解呈阳性、石蕊牛奶试验呈阳性、尿素水解呈阴性、硫化氢试验呈阴性、吲哚试验呈阳性、甲基红试验呈阴性、伏普试验呈阳性、柠檬酸盐试验呈阳性、过氧化酶试验呈阳性、氧化酶试验呈阴性、能利用葡萄糖和蔗糖产酸不产气、马尿酸盐试验呈阳性、硝酸盐还原试验呈阳性、好养生长、生长pH值为6.0～8.0、生长温度为20～40℃。

3.如权利要求1中所述防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌的菌剂制备方法，其特征在于防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌的菌剂制备方法按以下步骤进行：一、取-70℃甘油保存的防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌X1的菌液，划线接种于NYDA固体培养基上，30℃恒温箱中培养18～20h，挑取单菌落接种于5ml的NYD液体培养基中，30℃、频率为150r/min条件下震荡培养18～20h，得到活化菌液；二、取0.1ml活化菌液涂布于装NYDA培养基的茄瓶上，在30℃恒温箱中培养18～20h，得活化菌种；三、将活化菌种接种于装有NYD液体培养基的发酵罐中，在发酵温度为25±0.5℃、搅拌速度为160r/min、发酵罐内气压为0.5个大气压的条件下发酵24～48h，得菌数浓度达20～40亿/毫升的菌液，即完成防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌菌剂的制备；其中步骤三中发酵开始时通气量为0.8VVM，发酵开始7h后至发酵结束通气量为1VVM。

4.根据权利要求3所述防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌的菌剂制备方法，其特征在于步骤一中NYDA固体培养基由5g的酵母膏、8g的牛肉膏、10g的葡萄糖和15g的琼脂粉加入蒸馏水并定容至1000mL组成。

5.根据权利要求3所述防治中草药土传病害的枯草芽孢杆菌的菌剂制备方法，其特征在于步骤一中NYD液体培养基由5g的酵母膏、8g的牛肉膏和10g的葡萄糖加入蒸馏水并定容至1000mL组成。