CN101974446A

CN101974446A - 一种产生生物乳化剂和降解烷烃的耐盐红球菌及其在石油污染盐碱土壤生物修复中的应用

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Publication number: CN101974446A
Application number: CN 201010217987
Authority: CN
Inventors: 王君; 范延辉; 姚志刚
Original assignee: Binzhou University
Current assignee: Binzhou University
Priority date: 2010-07-29
Filing date: 2010-07-29
Publication date: 2011-02-16
Anticipated expiration: 2030-07-29
Also published as: CN101974446B

Abstract

本发明属于微生物生物技术和环境生物技术领域，具体地说，它涉及一株耐盐红球菌Rhodococcus sp.JH，一种由该菌发酵产生的生物乳化剂，及其在石油污染盐碱土壤生物修复中的应用。该耐盐红球菌为红球菌(Rhodococcus sp.)JH菌株，于2009年11月04日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No.3388。应用本发明提供的CGMCC No.3388菌在以烃为唯一碳源的无机盐培养基中发酵培养生产的含生物乳化剂的发酵液可直接应用于石油污染的盐碱土壤，提高微生物对石油烃的降解率，以及石油污染盐碱土壤的生物修复中。

Description

一种产生生物乳化剂和降解烷烃的耐盐红球菌及其在石油污染盐碱土壤生物修复中的应用

【技术领域】

本发明属于微生物生物技术和环境生物技术领域，具体地说，它涉及一株耐盐红球菌Rhodococcus sp.JH，一种由该菌发酵产生的生物乳化剂，及其在石油污染盐碱土壤生物修复中的应用。

【背景技术】

随着对石油产品的需求量增加，原油的开采、加工和运输活动日益频繁，这些过程使大量的石油及其加工产品进入土壤，打破了自然界原有的生态平衡，给动植物和人类带来了严重的危害，目前，这已成为世界性的环境问题。现在世界石油总产量每年近3×10¹⁰吨左右，我国当前石油年产量也早已超过1×10⁸吨，而每年新污染土壤达1×10⁵吨之多。黄河三角洲地区拥有丰富的油气资源，是我国第二大石油基地。这里油井分布广泛的同时污染也十分严重，一般井场污染范围在1000-2000m²之间。随着石油的大规模勘探、开发、冶炼、运输和使用，污染、遗漏、井喷、输油管道泄漏等事故频发，造成土壤污染和植被破坏，严重威胁着黄河三角洲地区生态***的安全。近年来，黄河断流影响了黄河三角洲湿地生态***淡水水源的补给，破坏了湿地土壤中水盐的平衡，使土壤含盐量上升，土壤盐碱化现象日益严重。盐渍化土地面积占全区总面积的一半以上，土壤以滨海盐土为主，土壤含盐量高，盐分主要以氯化物为主，占可溶性盐总量的80％以上，土壤表层盐分在0.4-3％范围。深入了解黄河三角洲地区盐渍化条件下石油污染的特点，对该地区进行污染修复，恢复其生态功能迫在眉睫。

微生物降解是修复石油污染土壤的一种有效、经济、环保的方法，是石油烃类有机污染物去除的主要机制。利用微生物降解环境中的污染物具有成本低、效率高、以及不易造成二次污染等优点，所以一直受到广泛关注。然而，在高盐条件下，微生物既要忍受长期的高渗透压胁迫，又要承受短期的渗透冲击。当盐度＞3％时，非嗜盐微生物的代谢会受到抑制，使其生物修复效率明显降低，甚至丧失修复能力。盐度从0.5％升高至2％时，也会严重扰乱非嗜盐微生物的代谢活动。因此，传统的非嗜盐微生物并不适合对污染的高盐环境进行生物修复。

嗜盐微生物可分为嗜盐型和耐盐型。前者是在一定浓度盐中可正常生长，且高浓度盐是生长必需条件的微生物；后者是一类能耐受一定浓度盐溶液，但在无盐条件下也可正常生长的微生物。嗜盐菌种类繁多，它们的分类主要依据三个方面：表型特征、化学分类数据和分子生物学数据。根据表型特征的不同，有嗜盐球菌和嗜盐杆菌。根据16SrRNA/rDNA序列分析并结合其它生物学形状有盐杆菌属(Halebacterium)，盐深红菌属(Halorubrum)，富盐菌属(Haloferax)，盐盒菌属(Haloarcula)，盐球菌属(Halococcus)，嗜盐碱杆菌属(Natronobacterium)，嗜盐碱球菌属(Natronococcus)等菌属。嗜盐微生物一般生活在含10％-20％盐成分的天然盐湖中、晒盐场和腌制海产品等处。由于嗜盐微生物能够在高盐环境中栖息繁殖，因此，利用嗜盐微生物修复污染的天然盐环境或处理排放的高盐度有机污染物废水，不需要通过稀释、反渗透、离子交换、或者电渗透等方法降低待处理样品的盐度，具有操作简单和成本低廉等诸多优点。关于有关高盐环境中能够降解烷烃或原油，同时产生生物表面活性剂的菌株的报道也还很少。但是，上述菌属的应用范围仅限于对石油污染的污水的生物修复，目前，还没有成功实现原油污染的土壤生物修复的先例。

受烷烃和原油污染的土壤生物修复是一门新兴的技术，在采用微生物修复石油污染的土壤中面临这样一个难题，即石油难溶于水，生物可利用性低，单纯的石油降解菌难以与之接触从而造成修复率低等问题。有研究表明，表面活性剂可以乳化污染土壤中不溶性有机物，使它们的解吸附增强，水溶性增加。生物乳化剂是一类由生物产生的具有表面活性的化合物，其分子结构由一个疏水部分和一个亲水部分构成，同时具有亲脂和亲水的性质，因此具有减小表面张力、稳定乳化、增加泡沫等作用，另外，生物乳化剂具有与环境的兼容性，即它没有毒性，并可被生物降解，因此它们不会对环境造成不利的影响，利用其能够乳化原油增强油的水溶性的特性，在石油开采、环境治理以及食品饮料、化妆品生产等领域有广阔的应用前景。

为了提高土壤中烷烃降解速度，加入生物表面活性剂，能够增强憎水性化合物的亲水性和生物可利用性，或给土壤提供帮助生物降解的物质，提高土壤微生物的数量，继而提高烷烃的降解速度。生物表面活性剂是微生物在一定条件下培养时，其代谢过程中分泌出的具有一定表面活性的代谢产物，如糖脂、多糖脂、脂肽或中性类脂衍生物等。广义的生物表面活性剂分为生物表面活性和生物乳化剂，前者是一些低分子量的小分子，能明显改变表/界面张力，后者是一些生物大分子，并不能明显降低表/界面张力，但对油/水界面表现出很强的亲和力，因而可使乳状液得以稳定，表现出相当高的表面活性和乳化能力。与化学合成表面活性剂相比，生物表面活性剂具有以下优点：①水溶性好，在油/水界面有高的表面活性；②具有很强的乳化原油的能力；③可生物降解，不对环境造成污染和破坏；④分子结构类型多样，具有特殊的官能团，其中有些基团是化学方法难以合成的；⑤无毒、安全；⑥生产工艺简单，在常温常压下即可发生反应。正因为这些特性，生物表面活性剂尤其适合石油工业和环境工程，如石油的生物降粘、提高原油的采收率、重油污染土壤的生物修复等。

微生物以自己的方式摄取石油烃类然后参与自身代谢，最终生成小分子有机酸。目前所知的微生物细胞对于烷烃的摄取机制有以下几个方面：一是主动运输，这些细胞对烷烃具有很高的亲和力，通过相差和扫描电镜可以观察到不动杆菌可附着于烷烃小液滴的表面，絮凝物的形成也使得细胞可与烷烃保持紧密接触，从而造成一种微生态环境。当然并非依靠烷烃生长的微生物种群都会附着于烃类，有的细胞与烃的接触可能是依靠一种非特异性疏水作用引起的。二是细胞与“拟增溶”的小液滴互相作用：微生物所产生的胞外的生物表面活性剂和生物乳化剂有增加油水界面之间接触面积的作用。

生物乳化剂的研究开始于本世纪六十年代，目前所知多种微生物可产乳化剂，但对乳化剂的结构和理化性质知之甚少；生物乳化剂具有对烃良好的乳化性能和促进烃降解的特性，但是直到现在生物乳化剂的合成机制尚不清楚，尤其是耐盐菌产生的乳化剂还未见报道。生物降解石油作为一种高效率、低成本、无污染的生物治理技术，适应我国的国情，也是增加可利用耕地面积的有效途径。因此有必要进一步研究，这对于生物修复技术的机理具有重要的理论价值和实际应用价值。

本发明主要从能够产生表面活性物质的耐盐解烃菌入手，对菌株的烃降解特性及产生的表面活性剂进行了深入的研究，并用于石油污染盐碱土壤的生物修复技术。

【发明内容】

本发明的目的之一在于针对土壤的石油污染日益严重的问题，提供一种耐盐红球菌(Rhodococcus sp.)JH和并将其用于石油污染土壤的生物治理技术。

本发明的目的之二在于提供一种新型的脂蛋白类的生物乳化剂，以便提高烷烃和原油在乳化性能和溶解度，强化菌株在石油污染土壤中对烷烃和原油的生物降解。

在微生物降解原油的实验中经常会遇到一种现象，就是乳化效果特别好的实验组其油水界面张力并不显著降低。基于此类现象，我们有两个概念必须加以澄清，就是生物表面活性剂和生物乳化剂的区别。在广义上生物乳化剂属于生物表面活性剂，但在狭义上它们是按照各自的功能区分的。生物表面活性剂(如糖脂、磷脂、脂肽、脂肪酸、短肽等)是一些低分子量的小分子，它们能显著降低空气-水或油-水界面的张力，从而有助于油水乳化，但形成的乳状液往往不能稳定存在。生物乳化剂是一些生物大分子，如多糖蛋白、脂多糖、或这些聚合物的混合物等，它们虽不能显著降低表面张力，但对油水界面表现出很强的亲和力，能够吸附在分散的油滴表面，防止油滴凝聚，从而使这种乳状液得以稳定，这种效应使得烷烃呈胶状分散，增加了烷烃与细胞的接触。因此生物乳化剂的主要作用是乳化原油，降低原油粘度，更重要的是可以强化微生物在石油污染土壤修复中的作用。

本发明提供的红球菌(Rhodococcus sp.)JH菌株，于2009年11月04日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No.3388。

红球菌(Rhodococcus sp.)JH菌株的筛选

取石油污染盐碱土土样1g，无菌接种至100ml无机盐液蜡培养基中(培养基组成：Na₂HPO₄1.5g；KH₂PO₄3.48g；MgSO₄0.7g；(NH₄)₂SO₄4g；酵母粉0.01g；液体石蜡2％(v/w)，蒸馏水1000ml；pH自然；121℃灭菌30min)，37℃摇床往复振荡培养5d。将富集培养液充分混匀，取100μl涂布在1.5％LB固体平板上，37℃恒温培养箱中培养2-3d，观察生长出的菌落。挑取单菌落并用显微镜检验其纯度。将生长的各个菌落，接种至LB培养基中，培养至OD630为0.8左右，作为种子液以10％(v/v)比例接入100ml无机盐液蜡培养基中，37℃摇床往复振荡培养5d。然后以此发酵液作为种子液，接种至新鲜的无机盐液蜡培养基，反复驯化菌种3-4次。

选取对液蜡乳化良好的菌种进行原油降解试验。将菌落接种至液蜡培养基培养3d左右，作为种子以10％(v/v)比例接入到100ml原油培养基中(培养基组成：Na₂HPO₄1.5g；KH₂PO₄3.48g；MgSO₄0.7g；(NH₄)₂SO₄4g；酵母粉0.01g；原油0.5％(w/w)，蒸馏水1000ml；pH自然；121℃灭菌30min)，37℃震荡培养5d后测定原油降解率。油类测定方法采用红外法，即发酵液用100ml四氯化碳萃取，用红外测油仪测定剩余原油的量，降解率(％)＝1-剩余原油的量/加入原油的量×100％；采用高压气相色谱方法检测原油的降解情况。

选取对液蜡乳化良好的菌种发酵液用来测量乳化指数(EI-24)，以筛选能够利用烃产乳化剂的菌株，最终得到一株能够乳化和降解原油，并利用烃类物质产生生物乳化剂的保藏号为CGMCC No.3388的红球菌菌株Rhodococcus sp.JH。

红球菌(Rhodococcus sp.)JH CGMCC No.3388的菌落特征：在LB平板上37℃培养16h以上即形成圆形菌落，菌落大小直径3-5mm，菌落边缘整齐，表面湿润，光滑，桔黄色。

红球菌(Rhodococcus sp.)JH CGMCC No.3388的细胞形态特征：革兰氏染色呈阳性，菌体形态为球状，多呈现双球菌状态；不产芽孢，细胞直径约0.6-1.2μm。

红球菌(Rhodococcus sp.)JH CGMCC No.3388的生理生化特征：生长温度范围15-50℃，NaCl耐受性0-12％；触酶，柠檬酸盐利用，MR实验，V-P实验，吲哚实验均为阳性；纤维素水解，明胶液化，淀粉水解，脲酶实验皆为阴性。能够利用山梨醇、果糖、葡萄糖，不能利用乳糖、蔗糖、木糖醇、麦芽糖发酵产酸。降解烷烃和石油烃，产生生物乳化剂。

红球菌(Rhodococcus sp.)JH CGMCC No.3388的16S rRNA基因序列特征：CGMCCNo.3388接种于LB培养基，37℃摇床培养(130rpm)12h，离心收集菌体，重新悬浮，加溶菌酶和SDS破壁，由酚-氯仿法提取基因组DNA，并采用正相引物27F(5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和反向引物1541R(5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’)，用这对引物对其16S rDNA基因进行PCR扩增，将扩增引物送北京三博公司进行测序。PCR条件为：94℃，10min；94℃，45s，55℃，45s，72℃90s，30个循环；72℃10min，4℃保存。16S rDNA基因序列长度为1479bp，在GenBank中的登录号为*****，与Rhodococcus ruber strain：DSM43338的16S rRNA(登录号为NR_026185)序列相似性为97％，其16S rDNA的序列如序列表1所示。

参照《Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology》Vol.VIII的内容，根据其形态特征和生理生化特征，以及根据其16S rDNA基因序列在GenBank中的搜索结果，经多项分类鉴定JH为一新菌，属于红球菌属(Rhodococcus sp.JH)。

红球菌(Rhodococcus sp.)JH CGMCC No.3388可以在营养培养基，如：普通牛肉汁、LB、营养琼脂中生长，也可以在添加葡萄糖或蔗糖的无机盐培养基中生长，也可以以烷烃或原油为碳源生长。菌株在NaCl 0-12％的盐浓度范围内生长。

该菌具有很高的降解石油烃的能力，可降解C12至C32的正构烷烃、芳香烃和原油。用JH生长细胞进行降解实验结果表明，降解0.5％(w/v)的原油，在37℃下，往复摇床130rpm转速培养72h，降解率可达82.5％以上，对不同碳数的烷烃降解率都在65.6％以上，如图1，2所示。

本发明提供的CGMCC No.3388菌能够在0-12％NaCl浓度范围内解烃，在0-5％的范围内降解率基本相同都在70％以上，最高74.5％；NaCl浓度为12％时，原油降解率为45.4％，如图3所示。

本发明提供的CGMCC No.3388菌能在以烃为唯一碳源的无机盐培养基中发酵培养生产生物乳化剂。培养基组成为(g/L)Na₂HPO₄1.5；KH₂PO₄3.48；MgSO₄0.7；(NH₄)₂SO₄4；酵母粉0.01；0^#柴油2％，pH自然。培养条件30℃-37℃，pH 7.2，121℃灭菌30min，在30℃-37℃条件下，130rpm振荡培养72h。经发酵所获得的含生物乳化剂的发酵液效果最好，发酵液中生物乳化剂含量为2.8g/L，菌浓可达6.4×10⁸个/ml。该发酵液对0^#柴油的乳化能力为100％，24h后乳化液稳定，如图4所示。

本发明提供的CGMCC No.3388菌在0-12％的不同NaCl浓度，生产的含生物乳化剂的发酵液对柴油的乳化效果明显。在NaCl浓度为0-5％的范围内，发酵液对柴油的乳化指数均大于90％，随着盐浓度升高，乳化指数降低，在NaCl浓度为10％时，乳化指数为76％，如图5所示。

CGMCC No.3388菌所产生的生物乳化剂做Molish反应判定糖类，用Bradford比色法测定蛋白，油红O染色，实验表明该乳化剂含有蛋白质和脂类，不含糖。

CGMCC No.3388菌所产生的生物乳化剂有明显的乳化能力，根据文献中报道的乳化能力测定方法，以0^#柴油为乳化对象，乳化剂与0^#柴油以7∶3体积比混合，剧烈震荡1min，静置24h，乳化指数(Emusification index，EI-24)用乳化层的高度与测试烃的总高度之比，乘以100％来计算。如果EI-24大于等于50％，则说明乳状液是稳定的。结果表明该乳化剂对二甲苯，甲苯，煤油和原油等都有很好的乳化作用，如表2所示。

CGMCC No.3388菌所产生的生物乳化剂能够明显的促使石油污染盐碱土壤中石油烃的降解。

应用本发明提供的CGMCC No.3388菌在以烃为唯一碳源的无机盐培养基中发酵培养生产的含生物乳化剂的发酵液可直接应用于石油污染的盐碱土壤，提高微生物对石油烃的降解率，以及石油污染盐碱土壤的生物修复中。

具体应用方法为：将发酵液以(100～250)ml.kg^-1干土的投加量喷洒到石油污染的盐碱土壤中，保持土壤湿润，即可完成石油污染的生物降解过程。

本发明的优点和积极效果：

本发明提供的CGMCC No.3388菌能够在高盐含量条件下降解多种烷烃和原油，并可以以烃为碳源产生一种新型生物乳化剂，可以应用在微生物生物修复石油污染盐碱土壤技术中。

该菌株在0-12％NaCl范围内，以烃为碳源和能源生长，能够利用12碳至32碳的正构烷烃，对原油的降解率可达82.5％以上；以烃为碳源在0-12％NaCl范围内进行培养时，可产生一种新型的脂蛋白类的生物乳化剂；该乳化剂对0^#柴油，苯，二甲苯，煤油，原油等具有很好的乳化效果，能够提高烷烃和原油在水中的溶解度，明显促进活性菌株对烷烃和原油的降解。该菌株及其产生的生物乳化剂适用于提高烃摄取效率，在微生物修复石油污染土壤技术中应用。

【附图说明】：

图1是Rhodococcus sp.JH CGMCC No.3388菌株对不同碳数烷烃的降解情况；

图2是Rhodococcus sp.JH CGMCC No.3388菌对原油降解的高压气相色谱图；

图3不同NaCl浓度下Rhodococcus sp.JH CGMCC No.3388对原油的降解率；

图4是Rhodococcus sp.JH CGMCC No.3388菌生产的生物乳化剂的发酵液对柴油的乳化作用；

图5不同NaCl浓度下Rhodococcus sp.JH CGMCC No.3388发酵液对柴油乳化情况；

图6-1不同浓度生物乳化剂对柴油的乳化指数；

图6-2在不同温度下乳状液放置24h后的稳定性；

图6-3生物乳化剂在不同NaCl浓度下对柴油的乳化指数；

图7生物乳化剂发酵液不同投加量的条件下对土壤中石油烃去除率曲线；

图8不同温度条件下对土壤中石油烃去除率曲线；

图9Rhodococcus sp.JH CGMCC No.3388菌对1#试验田生物修复效果。

【具体实施方式】

实施例1：

本发明提供的Rhodococcus sp.JH菌株的分离筛选

取石油污染盐碱土土样1g，无菌接种至100ml无机盐液蜡培养基中(培养基组成：Na₂HPO₄1.5g；KH₂PO₄3.48g；MgSO₄0.7g；(NH₄)₂SO₄4g；酵母粉0.01g；液体石蜡2％(v/w)，蒸馏水1000ml；pH自然；121℃灭菌30min)，37℃摇床往复振荡培养5d。将富集培养液充分混匀，取100μl涂布在1.5％LB固体平板上，37℃恒温培养箱中培养2-3d，观察生长出的菌落。挑取单菌落并用显微镜检验其纯度。将生长的各个菌落，接种至LB培养基中，培养至OD₆₃₀为0.8左右，作为种子液以10％(v/v)比例接入100ml无机盐液蜡培养基中，37℃摇床往复振荡培养5d。然后以此发酵液作为种子液，接种至新鲜的无机盐液蜡培养基，反复驯化菌种3-4次。

选取对液蜡乳化良好的菌种进行原油降解试验。将菌落接种至液蜡培养基培养3d左右，作为种子以10％(v/v)比例接入液接入到100ml原油培养基中(培养基组成：Na₂HPO₄1.5g；KH₂PO₄3.48g；MgSO₄0.7g；(NH₄)₂SO₄4g；酵母粉0.01g；原油0.5％(w/w)，蒸馏水1000ml；pH自然；121℃灭菌30min)，37℃震荡培养5d后测定原油降解率。油类测定方法采用红外法，即发酵液用100ml四氯化碳萃取，用红外测油仪测定剩余原油的量，降解率(％)＝1-剩余原油的量/加入原油的量×100％；采用高压气相色谱方法检测原油的降解情况。

选取对液蜡乳化良好的菌种发酵液用来测量乳化指数(EI-24)，以筛选能够利用烃产乳化剂的菌株，最终得到一株能够乳化和降解原油，并利用烃类物质产生生物乳化剂的保藏号为CGMCC No.3388的红球菌菌株(Rhodococcus sp.)JH。

实施例2：

Rhodococcus sp.JH菌株的16S rRNA基因的PCR扩增和序列测定

Rhodococcus sp.JH CGMCC No.3388接种于LB培养基，37℃摇床培养(130rpm)16小时，离心收集菌体，重新悬浮，加溶菌酶和SDS破壁，由酚-氯仿法提取基因组DNA，并采用正相引物27F(5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和反向引物1541R(5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’)，用这对引物对其16S rRNA基因进行PCR扩增，将扩增引物送上海生工进行测序。PCR条件为：94℃，10min；94℃，45s，55℃，45s，72℃90s，30个循环；72℃10min，4℃保存。16S rRNA基因序列长度为1479bp，在GenBank中的登录号为HM134277，与Rhodococcus ruber strain：DSM43338的16S rRNA(登录号为NR 026185)序列相似性为97％。其16S rRNA的序列如序列表所示。

实施例3：

本发明提供的Rhodococcus sp.JH菌株对烷烃和胜利油田滨南采油厂原油的降解将菌株在LB平板上进行活化，取单菌落接入5ml LB液体培养基中过夜培养，以1％接种量接种至100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养5h至对数生长期，以10％接种量接种至装有100ml含有不同烷烃或原油为碳源的无机盐培养基(培养基组成同实施例1)的锥形瓶中，37℃培养3d，用气相色谱法分析，该菌株对不同碳数烷烃的降解率，用红外测油仪测定原油的降解率并用高压气相色谱法进行残留原油的气相色谱分析，结果如图1和图2所示。该菌株对C12至C32烷烃，降解率均在65.6％以上，对原油的降解率可达82.5％。

实施例4：

本发明提供的Rhodococcus sp.JH菌株在不同盐浓度下对原油的降解情况

在以原油为碳源的无机盐培养基(培养基组成同实施例1)中，添加不同浓度的NaCl，接入Rhodococcus sp.JH菌株，3d后测定用红外测油仪不同浓度下原油降解率(同实施例3)。结果如图3所示。JH菌株在NaCl浓度0-12％的范围内对原油都有不同程度的降解，在0-5％的范围内降解率基本相同都在70％以上，最高74.5％；随着盐浓度的升高降解率逐渐降低，NaCl浓度为12％时，原油降解率为45.4％。实验结果表明，烃降解菌Rhodococcussp.JH CGMCC No.3388菌株对NaCl有很好的耐受性。

实施例5：

本发明提供的Rhodococcus sp.JH菌株产生生物乳化剂的条件

通过优化培养基组分、培养条件(通氧量，发酵周期等)，等试验获得该Rhodococcus sp.JH菌株产生生物乳化剂的最佳培养基为g/L：Na₂HPO₄1.5g；KH₂PO₄3.48g；MgSO₄0.7g；(NH₄)₂SO₄4g；酵母粉0.01g；0^#柴油2％(v/w)，蒸馏水1000ml；pH自然；121℃灭菌30min，最佳培养条件为：初始pH 7.2，37℃，130rpm培养72h。该培养条件下，加入的液蜡能够完全乳化，通过测量对柴油的乳化指数(EI-24)可达100％，如图4所示，并可稳定7d以上。该乳化剂对二甲苯，甲苯，煤油和原油等也都有很好的乳化作用，如表2所示。

表2

实施例6：

本发明提供的Rhodococcus sp.JH菌株在不同盐浓度下产生物乳化剂情况

Rhodococcus sp.JH菌株在产生生物乳化剂的培养基中(同实施例5)培养发酵，在培养基中添加不同浓度的NaCl(0-12％)，37℃，130rpm培养72h。发酵结束后，用发酵液测定对柴油的乳化能力，结果如图5所示。在NaCl浓度为0-5％的范围内，发酵液对柴油的乳化指数均大于90％，随着盐浓度升高，乳化指数降低，在NaCl浓度为10％时，乳化指数为76％。实验结果表明，Rhodococcus sp.JH菌株在不同0-12％范围的盐浓度下可产生生物乳化剂，其发酵液对柴油有很好的乳化效果。

实施例7：

本发明提供的Rhodococcus sp.JH菌株所产生的生物乳化剂的分离提取

Rhodococcus sp.JH菌株在产生生物乳化剂的培养基和条件下(同实施例5)培养发酵，发酵液用滤纸过滤，滤液在8000rpm 4℃离心除去菌体后，加入3倍体积冰冷丙酮或者工业酒精，用玻璃棒搅拌均匀，置于4℃过夜，离心得沉淀，将沉淀透析后冷冻干燥，得乳化活性物质，该物质溶于双蒸水后对柴油的乳化能力为100％。在光学显微镜下观察乳化液滴的大小，随即测量20个液滴，计算乳化液滴的平均大小，如表3所示，提取的乳化活性物质对柴油作用后，产生的乳化液滴约为发酵液作用的1/4。

表3

实施例8：

本发明提供的Rhodococcus sp.JH菌株所产生的生物乳化剂的理化性质Rhodococcus sp.JH菌株产生物乳化剂(同实施例6)，将该乳化剂溶于双蒸水中测试不同浓度该乳化剂对柴油的乳化，以及该乳化剂在不同NaCl浓度和pH下对柴油的乳化能力以及对柴油形成的乳状液在不同温度下的稳定性，结果如图6-1至图6-3所示。当乳化剂浓度为0.8g/L时，对柴油的乳化能力可达100％(图6-1)；在不同pH条件下，该乳化剂对柴油的乳化能力均为100％；形成的乳状液在不同温度下测试稳定性，发现在100℃水浴中过夜，仍保持有65.3％的乳化层(图6-2)；该乳化剂可耐受的NaCl浓度为25％(图6-3)，更适合于高盐浓度土壤的生物修复。将该乳化活性物质溶于双蒸水中，置于121℃高压作用30min后，对柴油仍有100％的乳化活性。

实施例9：

本发明提供的Rhodococcus sp.JH菌株所产生的生物乳化剂的定性反应

Rhodococcus sp.JH菌株产生的生物乳化剂(同实施例6)进行Molish反应判定糖类，用Bradford比色法测定蛋白和油红O染色，实验表明该乳化剂含有蛋白质和脂类，不含糖类。

实施例10：

本发明提供的Rhodococcus sp.JH菌株在室内模拟不同生物乳化剂投放量对石油污染土壤的修复作用

供试土壤样品是未受石油污染的农田盐碱土，掺杂原油为胜利油田原油。供试土样去除石块、杂草研磨后过2mm筛，置入烧杯中向其中添加采自胜利油田的原油充分搅拌，于阴暗处晾干后进一步研磨过2mm筛，使土壤和原油混合均匀，其中油含量约为2g/kg。

将Rhodococcus sp.JH菌株在最适条件下发酵产生生物乳化剂(同实施例5)，将发酵液以不同量投放到供试土壤中去，投加量分别为100、150、200和250ml.kg^-1干土，其中生物乳化剂含量分别为12.6、18.9、25.2、31.5mg.kg^-1干土。设两组对照，第一组将斜面上生长的JH菌刮入无菌水中制成菌悬液投放至测试土壤中；第二组以不加任何菌和发酵液的土壤为对照。所有土样均采用每天翻耕1次，每天加水20ml以保持土壤水分。间隔一段时间采样，采用红外测油仪测定土壤中石油含量，即称取土样5g置于125ml磨口三角瓶中，再加入20ml CCl₄，振荡片刻，放置过夜，将上清液经无水硫酸钠过滤到50ml容量瓶中，随后再加入10ml CCL₄在60℃水浴上加热30min，上清液经过漏斗(漏斗放入滤纸，上层添加10g无水硫酸钠)过滤到容量瓶中，再用10ml CCl₄清洗三角瓶和滤斗上的无水硫酸钠，最后将容量瓶用CCl₄定容至50ml，用红外仪测定石油烃含量，计算烃去除率。结果如图7所示，降解8d后，测试土壤含油量发现烃去除率分别为12.3％、26.9％、41.8％和56.8％，对照一组烃去除率为4.5％，不加菌液的对照几乎没有降解。降解后期添加生物乳化剂发酵液的供试土壤及对照一组中烃降解率都有明显提高。

实施例11：

本发明提供的Rhodococcus sp.JH菌株在室内模拟不同温度下石油污染土壤的修复作用

将Rhodococcus sp.JH菌株在最适条件下发酵产生生物乳化剂，将发酵液以250m1.kg^-1干土的投放量投放到供试土壤中去(同实施例10)，分别在20℃和30℃下作用。土样采用每天翻耕1次，每天加水20mL以保持土壤水分。间隔一段时间采样，测定土壤中石油含量，计算烃去除率。结果如图8所示。降解8d后，30℃条件下石油污染土壤中烃去除率为60.2％，20℃条件下为43.7％。随着时间延长，在两个温度下烃去除率都有增加。

实施例12：

本发明提供的Rhodococcus sp.JH菌株所产生的生物乳化剂对1#试验田石油污染土壤的生物修复能力

将Rhodococcus sp.JH菌株在产生物乳化剂的最适培养基和发酵条件下(同实施例5)培养发酵，将发酵液以250m1.kg^-1干土的投加量喷洒到石油污染的1#试验田中，时间为6-8月份(平均温度约28℃，雨水充足)。试验田中每周翻耕1次，间隔一段时间采样，测定土壤中石油含量，计算烃去除率。结果如图9所示。经过65d的试验，发现1#试验田中烃去除率可达71.8％，石油污染得到了有效的修复，而在不添加任何菌剂的对照田中，由于土著微生物的降解作用，石油污染物也有一定的减少(最高12.2％)，但是远远低于1#试验田。

实施例13：

本发明提供的Rhodococcus sp.JH菌株所产生的生物乳化剂对2#试验田石油污染土壤的生物修复能力

将Rhodococcus sp.JH菌株在产生物乳化剂的最适培养基和发酵条件下(同实施例5)培养发酵，将发酵液以250ml.kg^-1干土的投加量喷洒到石油污染的1#试验田中，时间为6-8月份(平均温度约28℃，雨水充足)。试验田中每周翻耕1次，间隔一段时间采样，测定土壤中石油含量，计算烃去除率。经过60d的试验，2#试验田中烃去除率也可达70％以上，石油污染得到了有效的修复。

序列表1

滨州学院

一种产生乳化剂和降解烷烃的耐盐菌JH及用途

1479bp

Rhodococcus sp.JH CGMCC No.3388 16s rRNA gene sequence

1 GACGAACGCT GGCGGCGTGC TTAACACATG CAAGTCGAAC GATGAAGCCC AGCTTGCTGG

61 GTGGATTAGT GGCGAACGGG TGAGTAACAC GTGGGTGATC TGCCCTGCAC TTCGGGATAA

121 GCCTGGGAAA CTGGGTCTAA TACCGGATAG GACCTCGGGA TGCATGTTCC GGGGTGGAAA

181 GGTTTTCCGG TGCAGGATGG GCCCGCGGCC TATCAGCTTG TTGGTGGGGT AACGGCCCAC

241 CAAGGCGACG ACGGGTAGCC GGCCTGAGAG GGCGACCGGC CACACTGGGA CTGATACACG

301 GCCCAGACTC CTACGGGAGG CCGCAGTGGG GAATATTGCA CAATGGGCGC AAGCCTGATG

361 TACCGACGCC GCGTGAGGGA TGACGGCCTT CGGGTTGTAA ACCTTTTTCA CTACCGACCA

421 AGCGCAAGTG ACGGTAGGTA CAGAAGAAGC AGCGGCCAGT TCCGTATCGG CAGCCGCGGT

481 AATACGTAGG GTGCGAGCGT TGTCCAGCCA TACTGGGTGT AAAGAGCTCG TAGACGGTTT

541 GTCGCGTCGT CTGTGAAAAT CCGCAGCTCA ACTGAGGGCT TGCAGGCGAT ACGGGCAGAC

601 TTGAGTACTG CAGGGGAGAC TGGAATTCCT GGTGTAGCGG TGAAATGCGC AGATATGAGG

661 AGGAACACCG GTGGCGAAGG CGGGTCTCTG GGCAGTAACT GACGATGAGG AGCGAAAGCG

721 TGGGTAGCGA ACAGGATTAG ATACCCTGGT AGTGCACGCC GTAAACGGTG GGCGCTAGGT

781 GTGGGTTTCC TTACACGGGA TCCGTGCCGT AGCTAACGCA TTAACCGCCC CGCCTGGGGA

841 GTACGGCTGC AAGGCTAAAA CTCAAAGGAA TTCACGGGGG CCCGCACAAG CGGCGGAGCA

901 TGTGGATTAA TTCGATGCAA CGCGAAGAAC CTTACCTGGG TTTGACATAC ACCGGACCGC

961 CCCAGAGATG GGGTTTCCCT TGTGGTCGGT GTACAGGTGG TGCATGGCCG TCGTCAGCTC

1021 GTGTCGTGAG ATGTTGGGTT AAGTCTCGCA ACGAGCGCAA CCCTTGTCCT GTGTTGCCAG

1081 CACGTAATGG TGGGGACTCG CAGGAGACTG CCGGGGTCAA CTCGGAGGAA GGTGGGGACG

1141 ACGTCAAGTC ATCATGCCCC TTATGTCCAG GGCTTCACAC ATGCTACAAT GGCCGGTACA

1201 GAGGGCTGGG ATACCGCGAG GTGGAGCGAA TCCCTTAAAG CCGGTCTCAG TTCGGATCGG

1261 GGTCTGCAAC TCGACCCCGT GAAGTTGGAG TCGCTAGTAA TCGCAGATCA GCAACGCTGC

1321 GGTGAATACG TTCCCGGGCC TTGTACACAC CGCCCGTCAC GTCATGAAAG TCGGTAACAC

1381 CTGAAGCCGG TGGTCTAACC CCTCGTGGGA GGGAGCCGCC GAAGGTGGGA TCGGCGATTG

1441 GGACGAAGTC GTAACAAGGT AGCCGTACCG GAAGGTGCG

Claims

1.一种产生生物乳化剂和降解烷烃的耐盐红球菌，其特征在于：该耐盐红球菌为红球菌(Rhodococcus sp.)JH菌株，于2009年11月04日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No.3388。

2.如权利要求1所述的一种耐盐红球菌，其特征在于：所述的红球菌Rhodococcus sp.JH CGMCC No.3388菌株，其16S rRNA的核苷酸序列如序列表1所示。

3.如权利要求1所述的红球菌(Rhodococcus sp.)JH CGMCC No.3388菌株，其菌落特征，在LB平板上37℃培养16h以上即形成圆形菌落，菌落大小直径3-5mm，菌落边缘整齐，表面湿润，光滑，桔黄色，显微镜下观察其菌体形态为球状，多呈现双球菌状态；革兰氏染色呈阳性；不产芽孢，细胞直径约0.6-1.2μm，生长温度范围15-50℃，NaCl耐受性0-12％，pH生长范围5-9，触酶，柠檬酸盐利用，MR实验，V-P实验，吲哚实验均为阳性；纤维素水解，明胶液化，淀粉水解，脲酶实验皆为阴性，能够利用山梨醇、果糖、葡萄糖，不能利用乳糖、蔗糖、木糖醇、麦芽糖发酵产酸。

4.如权利要求1所述的耐盐红球菌，其特征在于：该菌种可以在营养培养基：普通牛肉汁、LB、营养琼脂中生长；也可以在添加葡萄糖或蔗糖的无机盐培养基中生长；也可以以烷烃或原油为碳源培养生长。

5.如权利要求1或4所述的耐盐红球菌，其特征在于：该菌种可以在NaCl在质量百分比浓度为0-12％的盐浓度范围内生长。

6.如权利要求1所述的耐盐红球菌在石油污染盐碱土壤生物修复中的应用，其特征在于：应用本菌种在以烃为唯一碳源的无机盐培养基中发酵培养生产的含生物乳化剂的发酵液，可直接应用于石油污染的盐碱土壤中，强化石油污染土壤中烷烃和原油的生物降解，实现石油污染的盐碱土壤的生物修复。

7.如权利要求6所述的耐盐红球菌在石油污染盐碱土壤生物修复中的应用，其特征在于：所说的无机盐培养基组成为(g/L)Na₂HPO₄1.5、KH₂PO₄3.48、MgSO₄0.7、(NH₄)₂SO₄4、酵母粉0.01、0^#柴油2％。

8.如权利要求6所述的耐盐红球菌在石油污染盐碱土壤生物修复中的应用，其特征在于：所说的发酵培养含生物乳化剂的发酵液的条件为：温度30℃-37℃，pH 7.2，在30℃-37℃条件下，130rpm振荡培养72h。

9.如权利要求6所述的耐盐红球菌在石油污染盐碱土壤生物修复中的应用，其特征在于：所说的发酵液中生物乳化剂含量为2.8g/L，菌株浓度达6.4×10⁸个/ml。

10.具体应用方法为：将发酵液以(100～250)ml.kg^-1干土的投加量，喷洒到石油污染的盐碱土壤中，保持土壤湿润，即可完成石油污染的生物降解过程。