CN101974083A - 抗hsv1病毒感染的人源hirrp蛋白分子 - Google Patents

Abstract

本发明公开了从HSV1病毒感染人肝L02细胞后的差异蛋白表达谱中筛选得到一个新的病毒感染细胞后细胞内表达升高的HIRRP蛋白分子及其制备方法。并将所述的蛋白分子从人肝细胞cDNA文库中成功克隆。另外，本发明首次发现HIRRP蛋白分子具有明确的抗HSV1病毒的生物学功能，而且HIRRP蛋白有效的功能结构域位于该分子的N末端。本发明以上所得研究结果为抗病毒的预防和治疗研究提供了新的思路和靶点。

Description

抗HSV1病毒感染的人源HIRRP蛋白分子

技术领域

本发明属于人类应用基础医学的技术领域，具体地说，本发明涉及一种新的抗病毒蛋白HIRRP基因；更具体地说，本发明涉及抗HSV1病毒感染的人源蛋白分子HIRRP、cDNA全长克隆，以及它在HSV1病毒与细胞相互作用过程中的功能确定。同时，本发明还对该HIRRP蛋白可能的功能结构域进行了界定。

背景技术

疱疹病毒是一类结构极其复杂、感染形式多样并能引起多种临床病理效应的DNA病毒。一直以来对这类DNA病毒在基础医学和临床医学中生物行为的研究都受到人们的普遍关注，具有重要的分子生物学、细胞生物学和临床医学意义。疱疹病毒科(Herpesviridae)病毒颗粒的体积一般中等大小，外覆有包膜，在自然界的分布十分广泛，已经鉴定或部分鉴定的约有100多种。单纯疱疹病毒I型(HSVI)是一种具有较强传染性的病原体，是最早被发现的疱疹病毒，也是目前被研究最为深入的病毒之一。HSVI能感染多种类型细胞，许多研究证据表明，HSVI感染宿主细胞时，只需通过病毒膜蛋白和细胞表面分子的接触，就能导致被感染细胞内某些细胞信号通路的激活和特定转录因子的活化。在HSVI与细胞相互作用的研究中，工作的重点之一是分析差异基因所编码的差异蛋白在病毒感染细胞内所具有的重要意义和特殊功能。与基因相比，蛋白质的结构更复杂、功能更为活跃，更接近生命的本质。病毒感染细胞内出现的差异蛋白分子是HSVI与宿主细胞相互作用过程中特殊功能的执行者。HSVI病毒的入侵改变了宿主细胞的蛋白表达谱，大量蛋白分子相互之间建立新的平衡，而这些蛋白正是被感染细胞内产生一系列细胞效应的分子基础，研究它们以及与之相关的细胞信号通路将有利于认识病毒感染机制。

本发明的前期工作，通过借助比较蛋白质组学的技术平台，将HSVI病毒感染的人正常肝细胞L02和未感染L02细胞分别进行2-DE作蛋白质组图，通过PDQuest软件对蛋白定性、定量分析，再利用MALDI-TOF-MS鉴定差异蛋白。HIRRP蛋白即是经以上2-DE蛋白差异电泳鉴定出的、病毒感染后细胞内表达明显升高的蛋白分子之一，但当下人们对它的认识几乎是“零”，目前还没有任何关于HIRRP蛋白功能的研究工作被报道。HIRRP是蛋白功能未知的新蛋白、是HSVI病毒感染L-02细胞后蛋白表达量明显增加的新蛋白、是在病毒感染状态下被激活并可能与病毒-细胞相互作用有关的新蛋白。对该功能未知的新蛋白分子研究工作的展开，不仅有利于阐明细胞内生物大分子的功能，同时也有助于增强对病毒与宿主细胞间相互作用的理解；不仅可以提升对病毒感染、复制和治病的分子机理的认识，还可以为病毒的预防和治疗提供新的思路和线索。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种新的、病毒感染细胞后细胞内表达升高的人源HIRRP蛋白分子。

本发明的目的之二是提供所述的人源HIRRP蛋白分子的制备方法。

本发明的目的之三是提供一种克隆HIRRP基因并进行HIRRP蛋白的表达和制备抗血清的方法。

本发明的目的之四是揭示所述的人源HIRRP蛋白分子的有效功能结构。

本发明的目的之五是提供所述的人源HIRRP蛋白分子的生物学功能及用途。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

*除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。

A本发明提供了一种新的、病毒感染细胞后细胞内表达升高的HIRRP蛋白分子

本发明所提供的人源HIRRP蛋分子具有序列表中SEQ ID №：1所述的核苷酸序列和序列表中SEQ ID №：2所述的氨基酸序列。

B.本发明提供了所述的人源HIRRP蛋白分子的制备方法，该方法采用下述顺序步骤：

(1)样品制备：HSV1感染24h后分别收集感染后和未感染病毒的L02细胞并按试剂盒操作处理细胞样品(Promega 公司)；

(2)双向电泳(Two dimension Gel Electrophoresis，2-DE)。分别提取细胞总蛋白300μg作为上样量，水化上样缓冲液350μl泡胀IPG胶条。聚焦电泳程序为：50V，主动水化16h；经除盐、升压过程后，10000V聚焦60000伏特小时。聚焦完成后，分别在平衡液中平衡15min。胶条转移至12％S S2PAGE胶上端，进行第二向蛋白质分离。起始时用低电压70V电泳30min，之后升高电压至180V，待溴酚蓝达到底部边缘时停止电泳。电泳完成后，对22DE胶进行银染。采用投射扫描模式进行图像采集，并运用PDQuest专业软件分析蛋白表达差异点；

(3)生物质谱分析：完成蛋白点的切取和质谱鉴定，MALDI-TOF-MS质谱鉴定由上海基康生物公司完成。所得蛋白点的肽指纹图谱PMF与Matrixscience数据库进行比对，由Mascot软件完成检索；

(4)HIRRP分子即为HSV1感染后细胞内表达升高的差异蛋白。

C.本发明提供了一种克隆HIRRP基因并进行HIRRP蛋白的表达和制备了抗血清的方法，该法采用以下步骤：

(1)HSV1病毒感染人L02细胞后提取细胞总RNA，并逆转为cDNA，操作步骤详见试剂盒说明。以TAKARA公司高保真酶PCR扩增目的基因hirrp，得到长度为630bp的扩增产物。

(2)以特异性上下游引物扩增HIRRP全长分子，并成功构建原核表达载体pGEX-HIRRP，通过在大肠杆菌BL21(DE3)中经过IPTG诱导表达，得到了HIRRP的全长表达蛋白。进一步分离菌体中上清和包涵体显示，HIRRP在包涵体中的表达含量非常高。经切胶纯化后，得到纯度较高的HIRRP包涵体蛋白；用于免疫小鼠制备HIRRP小鼠抗血清。

(3)特异性HIRRP抗血清的检测：提取转染pcDNA3-HIRRP质粒的Vero细胞蛋白，HIRRP小鼠抗血清能够特异性识别23KD的蛋白条带；而对于仅转染pcDNA3空质粒的细胞样品，未能检测出HIRRP蛋白条带。

D.本发明首次揭示了HIRRP分子的功能结构域位于N末端，其采用下述步骤：

在HSV1病毒整体水平对HIRRP蛋白的功能域进行了检测。实验分别以pcDNA3、pcDNA3-HIRRP-N和pcDNA3-HIRRP-C三种质粒分别转染Vero细胞，转染后24h，接种HSVI(MOI＝01)，病毒感染后24h、36h和48h收取样品通过PFU法检测HSVI病毒滴度。噬斑形成单位实验操作见下。

E.本发明提供了所述的人源HIRRP蛋白分子的生物学功能及用途。

本发明揭示了所述的HIRRP蛋白分子对HSV1病毒具有抑制功能，其通过以下实验步骤从不同水平验证：

(1)氯霉素乙酰转移酶CAT报告基因分析法在转录水发现：HIRRP对病毒重要基因启动子的转录活性具有抑制效应；

当6孔板中的Vero细胞长至60％--70％汇合时，以Lipofectamine 2000分别转染CAT报告基因表达质粒(pCAT-α4、pCAT-TK、pCAT-gC enhancer)与不同剂量的pcDNA3-HIRRP。另设仅转染pcDNA3及CAT报告基因表达质粒作为本底对照，同时每孔转染等量的pSV-β-Galactosidase作为内对照控制转染效率不同所产生的误差。转染40h后进行CAT活性分析及β-gal活性测定。将本底对照的CAT活性值视为100，分别得到各实验组的CAT相对活性值。将本底对照的β-gal活性值视为100，分别得到各实验组的β-gal相对活性值；

(2)实时定量PCR法检测：高表达的HIRRP分子能抑制HSV1病毒三期基因mRNA的表达；

6孔板中的L02细胞长至80％--90％汇合时，以MOI＝01接种HSVI病毒，于病毒接种后的0h，1h、2h、4h、6h，8h、10h、12h，24h，36h收样。按总RNA提取试剂盒操作说明提取各个样品不同时间点的总RNA。依照逆转录试剂盒操作说明，每个样品逆转2ugRNA为cDNA，于-20℃冰箱冻存。每个时间点均设未感染HSVI的细胞样品作为对照。以cDNA为模板，分别以ICP0、TK、gC、gB及内参β-actin的上、下游引物扩增目的基因。使用Real MasterMix(sybrgreen)PCR体系进行扩增，扩增参数：95℃，3min；95℃，10sec；56℃，10sec；68℃，40sec；35cycles。溶解曲线条件为：95℃，15sec；60℃，1min；95℃，15sec；最后数据用lg2^-ΔΔCT进行相对定量处理。

(3)噬斑形成单位PFU法证实：高表的HIRRP分子对HSV1能在活病毒整体水平产生抑制作用，表现为HSV1病毒滴度的下降，噬斑形成单位数降低；反之，HIRRP分子的Knock down则可以逆转HIRRP分子对HSV1病毒的抑制效应，表现为病毒滴度的升高。

6孔板中的Vero细胞长至60％-70％合时，将4μg pcDNA3和4μg pcDNA3-HIRRP质粒分别转染Vero细胞，培养24h后，HSV-1以MOI＝0.01感染Vero细胞，分别在感染后的12h、24h、36h、48h以严格无菌操作条件下收取病毒样品(连同细胞和培养液)，用于噬斑形成单位试验。所收取的病毒样品应避免反复冻融。

本发明技术方案的提出是基于以下思路：

1当前比较蛋白质组学已被广泛运用于肿瘤、病原菌，以及化学、物理、生物因素干预细胞生命活动等研究领域。其目的在于寻找差异蛋白，通过比较不同空间、不同时间蛋白质组的整体动态变化，获得不同蛋白质组之间蛋白表达数量、表达水平和修饰状态的差异信息，进而发现与病变相关的特异蛋白质。这些特异蛋白质不仅为研究疾病发病机制提供线索，而且可以作为疾病诊断的生物标志物。大量研究证明，病毒感染宿主细胞能影响细胞蛋白的合成过程，很多蛋白不仅出现量的变化，其修饰状态和功能定位都有异常改变，与正常细胞的蛋白表达谱相比较会出现很多差异蛋白点，而这些差异蛋白正是病毒感染细胞、细胞防御病毒的具体执行者，寻找这些蛋白并探索它们之间的相互关系将对认识病毒感染和预测感染细胞结局提供大量的研究线索。

2目前，将比较蛋白质组学与病毒学相结合已成为认识病毒-宿主相互作用的重要手段之一。双向电泳技术(Two-dimension Gel Electrophoresis，2-DE)和生物质谱是蛋白质组学研究的核心技术。随着蛋白质组学逐渐走向成熟，其研究技术也不断革新。另外两种软电离质谱技术——电喷雾电离质谱(Electrospray Ionization Mass Spectrometry，ESI-MS)和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser-desorption Ionization Time of FlightMass Spectrometry，MALDI-TOF-MS)的问世又将质谱引入了蛋白质鉴定，尤其是MALDI-TOF-MS技术的运用真正实现了胶上蛋白点高通量、大规模的识别与鉴定。

3.本发明的前期工作，通过借助比较蛋白质组学的技术平台，将HSVI病毒感染的人正常肝细胞L02和未感染L02细胞分别进行2-DE作蛋白质组图，通过PDQuest软件对蛋白点定性、定量分析，再利用MALDI-TOF-MS鉴定差异蛋白。在所发现的差异蛋白中，某些为非细胞的病毒蛋白组分；某些为感染后表达降低或关闭的蛋白分子；另有一些则是感染后表达升高的蛋白分子。通常细胞内的生物大分子在病毒感染后，大约有90％合成关闭或表达下调，仅少部分表达上调。所以，本发明的重点之一为关注这少部分病毒感染后表达升高的新蛋白分子。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明在研究病毒与细胞相互作用的过程中，从HSV1病毒感染人肝L02细胞后的差异蛋白表达谱中筛选得到一个新的、病毒感染细胞后细胞内表达升高的HIRRP蛋白分子并将其从人肝细胞cDNA文库中成功克隆。另外，本发明首次发现HIRRP蛋白分子具有明确的抗HSV1病毒的生物学功能，而且HIRRP蛋白有效的功能结构域位于该分子的N末端。本发明以上所得研究结果为抗病毒的预防和治疗研究提供了新的思路和靶点，具有良好的应用前景。

附图说明

从下面给出的说明结合附图，本发明的技术特征将更加明了。

图1HIRRP蛋白分子的发现的显示图；其中，2-DE差异蛋白电泳法发现HIRRP分子。图A和C为HSVI病毒感染前的细胞样品全景及局部图；图B和D为病毒感染后的细胞样品全景及局部图。与C图作比较，可见在D图上出现了差异表达的蛋白分子“G”，该“G”点即为HIRRP分子。

图2HIRRP分子的克隆和蛋白表达，以及特异性抗血清的制备的显示图；其中，

图2A：所克隆的HIRRP分子全长真核表达载体pcDNA3-HIRRP及不同截短片段载体pcDNA3-HIRRP-N和pcDNA3-HIRRP-C的酶切鉴定图谱。

pcDNA3-HIRRP经EcoR I和Xho I双酶切为630bp的条带(lane 4)。Lane 1和lane 2分别为HIRRP的C端(390bp)及N端(420bp)的酶切鉴定图谱。Lane 3为分子量标准(Takara，DL2000)。

图2B：HIRRP抗原多肽的表达与纯化。同时，以GST蛋白和无菌PBS作为对照免疫小鼠，图2B。Lane 1为蛋白分子量标准，由下到上分别代表14.3KD，20.1KD，29.0KD，44.3KD，66.4KD，972KD分子量大小的蛋白条带；lane 2为IPTG诱导前pGEX-5X-1空载体转化的BL21菌体蛋白，未见GST蛋白的表达；lane3为IPTG诱导前pGEX-HIRRP重组质粒转化的BL21菌体蛋白，未见融合蛋白的表达：lane 4为IPTG诱导3小时后，pGEX-5X-1空载体转化的BL21菌包涵体蛋白，可见GST蛋白的表达；lane 5为IPTG诱导3小时后，pGEX-HIRRP重组质粒转化的BL21菌包涵体蛋白，可见分子量大小为49KD的融合蛋白的表达；lane 6为纯化后的HIRRP融合蛋白，箭头所指处。

图2C：Western Blot检测HIRRP抗血清。Lane 1为对照组，是转染pcDNA3空质粒的Vero细胞蛋白裂解物；lane 2为实验组，是转染pcDNA3-HIRRP重组质粒的Vero细胞蛋白裂解产物。IB采用HIRRP小鼠抗血清检测，结果发现HIRRP小鼠抗血清能够特异性识别HIRRP分子。HIRRP小鼠抗血清能特异性的识别瞬时转染条件下表达的HIRRP蛋白，图2C。

图3HIRRP蛋白分子具有抗病毒作用的显示图，其中，

图3AHIRRP蛋白分子对HSV1各期重要基因启动子具有转录抑制效应。

图3A-a4：HIRRP对HSVI立早基因a4启动子的转录活性具有抑制作用。将1ug a4CAT报告基因表达质粒分别与不同剂量的pcDNA3-HIRRP质粒共转染Vero细胞。N＝5

图3A-TK：HIRRP对HSVI早期基因TK启动子的转录活性具有抑制作用。将1ug TKCAT报告基因表达质粒分别与不同剂量的pcDNA3-HIRRP质粒共转染Vero细胞。N＝5

图3A-gC：HIRRP对HSVI晚期基因gC启动子的转录活性具有抑制作用。将1ug gCCAT报告基因表达质粒分别与不同剂量的pcDNA3-HIRRP质粒共转染Vero细胞。N＝5

图3B：HIRRP分子的上调能抑制HSV1病毒各期基因mRNA的表达。

图3B-ICP0：HIRRP的高表达能抑制HSVIα基因--ICP0mRNA的表达。与对照组相比，高表达HIRRP的HSVI感染组，在一定时间范围内对HSVI立早基因ICP0mRNA的表达具有抑制作用，数据通过2^-ΔΔCt进行相对定量处理。抑制的高峰出现在感染后1-2h，且呈现一定的时序性。N＝5

图3B-TK：HIRRP的高表达能抑制HSVIβ基因-TKmRNA的表达。与对照组相比，高表达HIRRP的HSVI感染组，在一定时间范围内对HSVI早期基因TK mRNA的表达具有抑制作用，抑制的高峰出现在感染后8h。数据通过2^-ΔΔCt进行相对定量处理。N＝5

图3B-GC：HIRRP的高表达能抑制HSVI γ基因-gCmRNA的表达。与对照组相比，高表达HIRRP的HSVI感染组，在一定时间范围内对HSVI晚期基因gC mRNA的表达具有抑制作用，数据通过2^-ΔΔCt进行相对定量处理。抑制的高峰出现在感染后8h。N＝5

图3B-GB：HIRRP的高表达能抑制HSV1 γ基因-gBmRNA的表达。与对照组相比，高表达HIRRP的HSVI感染组，在一定时间范围内对HSVI晚期基因gB mRNA的表达具有抑制作用，数据通过2^-ΔΔCt进行相对定量处理。抑制的高峰出现在感染后8h。N＝5。

图3C：HIRRP的高表达能降低HSV1的病毒滴度，具有抗病毒效应。

图3C-1：HIRRP上调能降低HSV1病毒滴度。将pcDNA3空质粒与pcDNA3-HIRRP重组质粒分别转染Vero细胞，转染后24h，实验组和对照组细胞均同时感染HSV1(MOI＝0.1)。于感染后的12h、24h、36h、48h收集所有细胞及病毒上清检测样品中的病毒含量。与对照组相比，HIRRP转染组的HSVI滴度水平出现下降，尤其以HSV1感染后24h最为明显，但随着感染时间的增长HIRRP对HSVI的抑制作用逐渐减弱。

图3C-2：下调HIRRP的表达能逆转HIRRP对HSVI病毒滴度的抑制效应。与对照组相比，转染hirrp-miRNA3的HSV1感染组，在HSVI感染后的24h、36h和48h三个时间点能不同程度地逆转HIRRP对病毒的抑制作用。图中病毒的滴度以PFU/ml表示，为每毫升实验样品中的噬斑形成数。

图4HIRRP的抗病毒作用主要通过HIRRP分子的N末端发挥效应的显示图；

HIRRP分子不同截短片段对HSVI病毒滴度的影响。通过筮斑形成单位实验发现与PCDNA3对照组相比，HIRRP-N末端截短片段对HSV1病毒活性具有抑制作用，而HIRRP-C末端抑制作用则要弱于N端蛋白分子。说明HIRRP的功能结构域可能主要位于HIRRP蛋白分子的N末端。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例及附图，对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用以限定本发明。

实施例1

—HIRRP蛋白分子的获取方法：

(1)样品制备：HSV1感染24h后分别收集感染后和未感染病毒的L02细胞并按试剂盒操作处理细胞样品(Promega公司)；

(2)双向电泳(Two2dimensioD Gel Electrophoresis，2-DE)。分别提取细胞总蛋白300μg作为上样量，水化上样缓冲液350μl泡胀IPG胶条。聚焦电泳程序为：50V，主动水化16h；经除盐、升压过程后，10000V聚焦60000伏特小时。聚焦完成后，分别在平衡液中平衡15min。胶条转移至12％SDS2PAGE胶上端，进行第二向蛋白质分离。起始时用低电压70V电泳30min，之后升高电压至180V，待溴酚蓝达到底部边缘时停止电泳。电泳完成后，对22DE胶进行银染。采用投射扫描模式进行图像采集，并运用PDQuest专业软件分析蛋白表达差异点；

(3)生物质谱分析：完成蛋白点的切取和质谱鉴定，MALDI-TOF-MS质谱鉴定由上海基康生物公司完成。所得蛋白点的肽指纹图谱PMF与MatrixscicDce数据库进行比对，由Mascot软件完成检索；

(4)HIRRP分子即为HSV1感染L02细胞后细胞内表达升高的差异蛋白(见图1)。

实验结果：

(1)通过与NCBI等数据库资料进行比对，得到HIRRP的背景资料如下：Gl号16552881；生物信息学预测的结果为HIRRP无明显的核定位信号，在细胞内的分布不限于特定的细胞功能区，无显著的已知功能结构域，可能存在某些信号分子的磷酸化位点等，目前为功能未知的细胞内蛋白分子。

(2)测定所述的HIRRP蛋白分子的具有序列表中SEQ ID №：1所述的核苷酸序列和序列表中SEQ ID №：2所述的氨基酸序列。

(3)HIRRP生物信息学测定

HIRRP(GI：16552881，Unnamed Protein)编码序列CDS：630bp

(4)基因组定位(Genome version：UCSC Build35)

从UCSC的基因组数据库获知HIRRP基因的染色体定位。

Chromosome No：chr17(-)，即17号染色体

Locus position：71427465..-71417522

(5)生物信息学测定

蛋白氨基酸序列：209aa

信号肽预测(SignalP)：运用SignalP软件30预测HIRRP蛋白序列后提示：其N-端没有信号肽。

亚细胞定位(TargetP)：TargetP软件(http://www.cbs dtu.dk/services/TargetP/)对HIRRP细胞内定位预测结果如提示：此蛋白没有特定的定位信号肽，在细胞中的分布不限定于特殊的细胞功能区。

其它测定：HIRRP蛋白可能存在1个cAMP磷酸化位点、2个PKC磷酸化位点和5个CK2磷酸化位点。HIRRP蛋白在NCBI-CDD数据库中检索结果为：HIRRP与目前CDD数据库中的保守序列模式或基序之间未发现同源性。

实施例2

——HIRRP蛋白分子的克隆

方法：HIRRP分子在细胞的基础状态或是生理水平下基本无表达，因此本发明采用HSV1病毒感染后的293细胞样本为模板进行扩增。

(1)pcDNA3-HIRRP的构建：以293细胞cDNA为扩增模板，HIRRP-F和HIRRP-R为上下游引物，PCR获得编码HIRRP蛋白的hirrp基因，经EcoRI和XhoI酶切后连入pcDNA3，重组质粒经酶切和测序予以鉴定。

F：aatgaattcatggagcggctccgggagc

R：atagtcgacagcctgctctcagcttttg

(2)pcDNA3-HIRRP-N的构建：以pcDNA3-HIRRP为模板，pcDNA3-HIRRP-N端F和R为上下游引物，PCR获得编码HIRRP 1～140aa的基因，经EcoRI和XhoI双酶切后连入pcDNA3，重组质粒经酶切和测序予以鉴定。

F：aatgaattcatggagcggctccgggagc

R：atactcgagtcactgctcggcagtcacc

(3)pcDNA3-HIRRP-C的构建：以pcDNA3-HIRRP为模板，pcDNA3-HIRRP-C端F和R为上下游引物，PCR获得编码HIRRP 81～210aa的基因，经EcoRI和XhoI双酶切后连入pcDNA3，重组质粒经酶切和测序予以鉴定

F：aatgaattcatgctggggatccggcagc

R：atactcgagtcagcctgctctcagcttt

结果

成功构建HIRRP全长及不同截短片段的真核表达质粒，如图2A所示：

①pcDNA3-HIRRP重组质粒的构建：PCR获得编码HIRRP的hirrp基因ORF，连入pcDNA3载体。经EcoR I和Xho I双酶切为630bp的一个条带，经双向测序证实已成功构建pcDNA3-HIRRP重组质粒(lane 4)。

②pcDNA3-HIRRP-N重组质粒的构建：PCR获得编码HIRRP的hirrp基因1-420bp的CDS序列，连入pcDNA3载体。经EcoR I和Xho I双酶切为420bp的一个条带，经双向测序证实已成功构建pcDNA3-HIRRP-N重组质粒(lane 2)。

③pcDNA3-HIRRP-C重组质粒的构建：PCR获得编码HIRRP的hirrp基因241bp-630bp的CDS序列，连入pcDNA3载体。经EcoRI和Xho I双酶切为390bp的一个条带，经双向测序证实已成功构建pcDNA3-HIRRP-重组质粒(lane 1)。

实施例3

——HIRRP蛋白的表达

方法：

(1)pGEX-HIRRP的构建及鉴定：以pcDNA3-HIRRP为模板，pGEX-HIRRP的F和R为上下游引物，PCR获得hirrp基因，经EcoR I和Sal I双酶切后连入pGEX-5X-1，重组质粒经酶切和测序予以鉴定。

(2)经EcoRI和Sal I双酶切为630bp的一个条带，经双向测序证实已经成功构建pGEX-HIRRP重组质粒。

F：aatgaattcatggagcggctccgggagc

R：atagtcgacagcctgctctcagcttttg

(3)HIRRP蛋白在原核细胞中的表达及纯化：

诱导经pGEX-HIRRP质粒转化的大肠杆菌表达外源蛋白

①以质粒pGEX-5X-1(作为对照菌)、pGEX-HIRRP分别转化感受态细胞BL21(DE3)，转化菌涂于含有Amp的LB平板，37℃倒置培养16h；

②分别挑取携带pGEX-5X-1、pGEX-HIRRP质粒的单菌落接种于3ml含有Amp的2×YT液体培养基中，37℃，200rmp过夜培养；

③将上述小摇工程菌以1∶100的比例接种于含有Amp的新鲜2×YT液体培养基中，37℃，200rmp培养约3h，当OD600达0.4～0.6时，向菌液中加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，诱导培养3h；

④取1ml上述菌培养液于4℃12000rpm离心30sec，沉淀用400μl PBS(pH7.4)重悬，取15μl加入等体积的2×裂解上样缓冲液，混匀，沸水中放置10min后，进行12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide Gel Electrophoresis，PAGE)电泳。

表达蛋白的分离纯化：

挑取携带pGEX-HIRRP质粒的单菌落接种于含有Amp的2×YT液体培养基中，37℃，200rmp过夜培养；

①将小摇工程菌以1∶50或1∶100的比例接种于500ml含有Amp的新鲜2×YT液体培养基中，培养约3h，当OD600达0.4～0.6时，以终浓度1mmol/L的IPTG诱导培养3h；

②诱导表达后，以4000rpm，4℃离心15min收集菌体，以20ml PBS悬浮；

③在悬浮液中加入溶菌酶至终浓度05mg/ml及蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度为01mmol/L，冰浴30min；

④将菌体样品置于冰浴，用微探头超声波发生器破碎细胞，功率200W，占空比50％，4s/次，间隔4s，时间4min，超声后12500rpm 4℃离心10min，分离上清与包涵体；

⑤将包涵体重悬于2ml 6M尿素(裂解包涵体)，42℃放置30min使蛋白溶解，8000rpm离心10min，吸出上清得到溶解后的表达蛋白；

⑥10％SDS-PAGE电泳并用考马斯亮兰染色后，割取相应分子量的蛋白质凝胶条带；

⑦用去离子水冲洗已处理好的透析袋，将切下的凝胶条带装入透析袋中，加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液，两端用夹子夹紧，4℃，100V电泳3h；反转电压正负极，100V，1min，吸取蛋白溶液；

⑧搅拌蛋白溶液同时缓缓加入-20℃预冷的5倍体积的冰丙酮，-20℃放置30min，4℃，12500rmp离心20min后倒去上清，使残余丙酮自然挥发；

⑨ddH₂O重悬沉淀，蛋白溶液经SDS-PAGE和Lowry法进行检测。

结果：

通过将全长的hirrp基因连入到原核表达载体pGEX-5X-1并在大肠杆菌BL21(DE3)中经过IPTG诱导表达，得到了HIRRP的全长表达蛋白。进一步分离菌体中上清和包涵体显示，HIRRP在包涵体中的表达含量非常高。经切胶纯化后，得到纯度较高的HIRRP包涵体蛋白(图2B)用于免疫小鼠制备HIRRP小鼠抗血清；同时，以GST蛋白和无菌PBS作为对照免疫小鼠。

实施例4

——动物免疫及制备抗血清

1.方法：

纯化后的GST蛋白，GST-HIRRP融合蛋白分别以1∶1的比例与弗氏完全佐剂乳化混匀(初免)，用微量注射器对6周龄的昆明小鼠进行腹部皮下多点注射免疫，另外以注射PBS组作为对照。0、2、4周时各免疫一次(第1次免疫用弗氏完全佐剂，第2、3次免疫用弗氏不完全佐剂)。免疫剂量为50μg/只/次，每个点约注射70ul-100ul；于第3次免疫后7天，小鼠尾部取血，收集血清，通过ELISA法检测免疫效果，若未达预期免疫效果，可再同前法加强免疫一次。于末次免疫之后七天，用眼球摘除法收集小鼠血清。采集的血样于37℃放置1h，4℃放置过夜，12000rpm离心5min，收集上层血清，-20℃分装保存备用。

Western Blot检测抗血清。6孔板中的Vero细胞长至60％--70％汇片时，用Lipofectamine2000分别向每孔细胞转染4μgpcDNA3和4μg pcDNA3-HIRRP，转染后培养40h提取细胞蛋白。以前期实验得到的小鼠抗HIRRP血清检测HIRRP蛋白在真核细胞中的表达；另设未转染细胞的蛋白提取液及转染pcDNA3的蛋白细胞提取液作为阴性对照。

2.结果：

通过Western Blot检测pcDNA3-HIRRP质粒转染的Vero细胞蛋白裂解产物，验证HIRRP小鼠抗血清能否特异识别HIRRP蛋白。Western Blot检测结果证实：对于转染pcDNA3-HIRRP质粒的Vero细胞，HIRRP小鼠抗血清能够特异性识别23KD的蛋白条带；而对于仅转染pcDNA3空质粒的细胞样品，未能检测出HIRRP蛋白条带(图2C)。而GST蛋白免疫的小鼠制备的对照血清则成阴性反应(图略)。说明，HIRRP小鼠抗血清能特异性的识别瞬时转染条件下表达的HIRRP蛋白。

实施例5

——HIRRP的功能确定：抗病毒活性

方法：

1.转录水平——检测HIRRP对HSV-1启动子转录活性的影响

6孔板中的Vero细胞长至60％--70％汇合时，以Lipofectamine 2000分别转染CAT报告基因表达质粒(pCAT-α4、pCAT-TK、pCAT-gC enhancer)与不同剂量的pcDNA3-HIRRP。每孔转染不同剂量的pcDNA3以使各孔转染的DNA总量保持一致，另设仅转染pcDNA3及CAT报告基因表达质粒作为本底对照，同时每孔转染等量的pSV-β-Galactosidase作为内对照控制转染效率不同所产生的误差。每组转染质粒配方如表1，表2和表3所示。转染40h后进行CAT活性分析及β-gal活性测定。将本底对照的CAT活性值视为100，分别得到各实验组的CAT相对活性值。将本底对照β-gal活性值视为100，分别得到各实验组的β-gal相对活性值。

表1检测HIRRP对HSVIα4启动子转录活性的影响时转染质粒配方

表2检测HIRRP对HSVITK启动子转录活性的影响时转染质粒配方

表3检测HIRRP对HSVIgC启动子转录活性的影响时转染质粒配方

2.病毒mRNA水平。

HIRRP高表达对HSV-1α、β、γ基因mRNA表达的影响

①6孔板中的Vero细胞长至60％-70％汇合时，将4μg pcDNA3和4μg pcDNA3-HIRRP分别转染Vero细胞，培养24h后，HSV-1以M.O.I＝1感染Vero细胞，分别在感染后0h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h提取细胞总RNA，逆转录为cDNA后，Real-time PCR扩增ICP0、TK、gC、gB mRNA及内参β-actin mRNA。

②基本实验操作：

提取细胞总RNA：按照北京天根公司总RNA提取试剂盒操作说明提取细胞总RNA；

RNA逆转录为cDNA：按照北京天根公司逆转录试剂盒操作说明操作，每个样品RNA的逆转录总量为2ug；Real-time PCR及数据处理：以cDNA为模板，以ICP0F、ICP0R为引物扩增ICP0mRNA，以TK F、TK R为引物扩增TKmRNA，以gC F、gC R为引物扩增gC mRNA，以gB F、gB R为引物扩增gB mRNA，以actin F、actin R为引物扩增β-actinmRNA作为内参。使用RealMasterMix(sybr green)PCR体系进行扩增，扩增参数：95，3min；95℃，10sec；56℃，10sec；68℃，40sec；35cycles。数据用lg2^-ΔΔCT进行相对定量处理。

3.病毒滴度水平——病毒滴定法检测HIRRP的高表达对HSV1活性的影响

①HSV-1病毒样品的收取：6孔板中的Vero细胞长至60％-70％汇合时，将4μg pcDNA3和4μg pcDNA3-HIRRP质粒分别转染Vero细胞，培养24h后，HSV-1以MOI＝0.01感染Vero细胞，分别在感染后的12h、24h、36h、48h以严格无菌操作条件下收取病毒样品(连同细胞和培养液)，用于后续试验。所收取的病毒样品应避免反复冻融。

②HSV-1病毒的滴定：

病毒滴定之CPE法：操作见前述。病毒滴定之噬斑形成单位法(PFU法)：Vero细胞铺板：6孔板每孔种Veor细胞数约为20×10¹。待细胞生长至95％以上汇合时开始实验。病毒样品的稀释：将前期收集到的病毒样品1000rpm，RT，离心10min。取100ul上清用无FCS的病毒稀释液连续做10倍稀释，得到-1，-2，-3，-4，-5等稀释度的样品工作液。以PBS洗细胞两遍，吸净孔内残余PBS。每孔加入稀释好的病毒工作液500ul，左右摇动混匀。将6孔板放入细胞培养箱，培养1h，中途每隔30分钟晃动一次。将配置好的2％琼脂糖于45-47℃水浴充分融化。等体积的2％琼脂与预温2×DMEM混匀，快速加到已吸附完病毒的细胞表面。此时病毒吸附液已弃除。注意应尽量保持Agar与DMEM混合物的温度在37-41℃之间。6孔板每孔约加混合物2.5-3ml，加的过程中防止气泡的产生。

将6孔板于RT静置20min-30min，使琼脂混合物充分凝固。6孔板至于37℃孵箱倒置培养，直至噬斑出现(约4-5天)。固定：每孔加入1.5ml 4％多聚甲醛，室温固定1h。去除多聚甲醛以及琼脂层，每孔加入1ml 05％的结晶紫染液，RT染色30min-1h，吸弃染色液，用自来水轻轻冲洗干净上层浮色，RT晾干。将6孔板置于光学显微镜下拍照并保存。

4.siRNA-hirrp的导入对HSVI病毒滴度的影响

实验设计：对于6孔板的每孔L02细胞，以siRNA-n.c.作为对照组，siRNA3-hirrp作为实验组分别与lipo 2000混合后进行转染。转染方法同前。转染后的24h以MOI＝0.1接种HSVI病毒，于接种后的24h，36h，48h三个时间点收样。病毒样品液的收样方法同前述。通过PFU法进行HSVI病毒滴度的测定：方法同前。

实验结果：

1HIRRP对HSV1a4、TK、GC的启动子具有转录抑制效应。

本发明采用包含HSV1病毒α4、TK和gC启动子的氯霉素乙酰转移酶报告基因pCAT-α4、pCAT-TK和pCAT-gC来检测HIRRP对HSV1不同基因启动子的影响。实验结果表明，与转染pcDNA3空载体相比，HIRRP蛋白的表达上调对HSVI病毒α4、TK和Gc基因的启动子均具有明显的转录抑制活性，并且在一定程度上呈现良好的量效关系。

图3A-a4结果表明：将1ug HSV1立即早期基因a4CAT报告基因表达质粒分别与不同剂量的pcDNA3-HIRRP质粒共转染Vero细胞，可见HIRRP蛋白分子对HSVI立早基因a4启动子的转录活性具有抑制作用，且在一定时间范围内呈现较好的时效性；图3A-TK结果发现：将1ug TK CAT报告基因表达质粒分别与不同剂量的pcDNA3-HIRRP质粒共转染Vero细胞。HIRRP蛋白分子对HSVI早期基因TK启动子的转录活性具有抑制作用，同样具有良好的时效性。并且对于HSV1的晚期基因g C，通过图3A-gC的实验结果证实，在一定的时间范围内HIRRP蛋白分子对HSVI晚期基因gC启动子的转录活性也具有抑制作用。

实施例6

-HIRRP的高表达能够抑制HSV1病毒ICP0，TK，gC，gB基因RNA的表达。

本发明以pcDNA3空质粒作为对照组，pcDNA3-HIRRP作为实验组转染Vero细胞，转染后24h，每孔以MOI＝1接种HSVI，接种后0h，1h，2h，4h，6h，8h，10h和12h收样。按试剂盒操作步骤提取RNA，逆转录，并通过Real Time PCR检测HSVI各期代表基因的表达。以β-actin作为内参照，实验数据按公式2^-ΔΔCt进行计算。结果发现，HIRRP的过表达，对HSV1的立早基因ICP0(图3B-ICP0)，早期基因TK(图3B-TK)，晚期基因gC(图3B-gC)和gB(图3B-gB)的mRNA表达水平均具有抑制作用。并且HIRRP对α、β、γ基因表达的在抑制作用上也呈现出不同的规律，具有时序性。

具体结果描述为：

图3B-ICP0：HIRRP的高表达能抑制HSVIα基因--ICP0mRNA的表达。与对照组相比，高表达HIRRP的HSVI感染组，在一定时间范围内对HSVI立早基因ICP0 mRNA的表达具有抑制作用，抑制的高峰出现在感染后1-2h，且呈现一定的时序性。图3B-TK：HIRRP的高表达能抑制HSVIβ基因-TK mRNA的表达。与对照组相比，高表达HIRRP的HSVI感染组，在一定时间范围内对HSVI早期基因TK mRNA的表达具有抑制作用，抑制的高峰出现在感染后8h。图3B-gC：HIRRP的高表达能抑制HSVIγ基因-gC mRNA的表达。与对照组相比，高表达HIRRP的HSVI感染组，在一定时间范围内对HSVI晚期基因gCmRNA的表达具有抑制作用，且抑制的高峰出现在感染后8h。图3B-gB：HIRRP的高表达能抑制HSVI γ基因-gB mRNA的表达。与对照组相比，高表达HIRRP的HSVI感染组，在一定时间范围内对HSVI晚期基因gB mRNA的表达具有抑制作用，抑制的高峰出现在感染后8h。以上实验数据均通过2^-ΔΔCt进行相对定量处理，N＝5。

实施例7

——上调的HIRRP能够抑制HSVI的增殖，而HIRRP分子的Knock-down能逆转HIRRP对HSV1病毒的抑制作用，表现为病毒滴度的升高。

高表达的HIRRP：以pcDNA3空质粒作为对照组，pcDNA3-HIRRP作为实验组，于转染Vero细胞后的24h，每孔Vero细胞以MOI＝0.1接种HSVI，于病毒接种后24h，36h，48h收样。按常规操作进行HSVI的病毒滴度检测。结果发现(图3C-1)：HIRRP上调能降低HSV1病毒滴度。感染后24h、36h、48h所收集细胞及病毒上清检测样品中的病毒含量与对照组相比，HIRRP转染组的HSVI滴度水平出现下降，尤其以HSV1感染后24h最为明显，但随着感染时间的增长HIRRP对HSVI的抑制作用逐渐减弱。

HIRRP的低表达：为了从反方向验证HIRRP对HSVI病毒的影响，即在HIRRP低表达的状态下观察其对HSVI病毒的抑制作用会出现如何改变。结果发现(图3C-2)：hirrp-siRNA能拮抗HIRRP对HSVI病毒滴度的抑制作用。以con-siRNA为对照组，hirrp-siRNA为实验组，分别转染L02细胞。于转染siRNA的24h后按MOI＝0.1的比例接种HSVI，于接种后的24h，36h和48h收获病毒样品，通过PFU法进行病毒滴度的测定。结果表明，与对照组相比，转染hirrp-siRNA的HSV1感染组，在HSV1感染后的24h、36h和48h三个时间点能不同程度地逆转HIRRP对病毒的抑制作用，从而表现为实验组病毒滴度的升高。尤其在24h这个时间点，HSVI滴度的升高效应最为明显。图中病毒的滴度以PFU/ml表示，为每毫升实验样品的噬斑形成数。

实施例8

——HIRRP分子功能结构域的界定：功能域位于N末端

1.方法：HIRRP不同截短片段对HSVI病毒滴度的影响

HSV-1病毒样品的收取：6孔板中的Vero细胞长至60％-70％汇合时，将4μgpcDNA3-HIRRP、4μg pcDNA3-HIRRP-N和4μg pcDNA3-HIRRP-C质粒分别转染Vero细胞，培养24h后，HSV-1以MOI＝0.01感染Vero细胞，分别在感染后的24h、36h、48h在严格无菌操作条件下收取病毒样品(连同细胞和培养液)，用于后续试验。所收取的病毒样品应避免反复冻融。

2HSV-1病毒的滴定：PFU法Vero细胞铺板；

6孔板每孔种Veor细胞数约为20×10⁴。待细胞生长至95％以上汇合时开始实验。病毒样品的稀释：将前期收集到的病毒样品1000rpm，RT，离心10min。取100ul上清用无FCS的病毒稀释液连续做10倍稀释，得到-1，-2，-3，-4，-5等稀释度的样品工作液。以PBS洗细胞两遍，吸净孔内残余PBS。每孔加入稀释好的病毒工作液500ul，左右摇动混匀。d)将6孔板放入细胞培养箱，培养1h，中途每隔30分钟晃动一次。e)将配置好的2％琼脂糖于45-47℃水浴充分融化。等体积的2％琼脂与预温2×DMEM混匀，快速加到已吸附完病毒的细胞表面。此时病毒吸附液已弃除。注意应尽量保持Agar与DMEM混合物的温度在37-41℃之间。6孔板每孔约加混合物2.5-3ml，加的过程中防止气泡的产生。将6孔板于RT静置20min-30min，使琼脂混合物充分凝固。6孔板至于37℃孵箱倒置培养，直至噬斑出现(约4-5天)。固定：每孔加入1.5ml 4％多聚甲醛，室温固定1h。去除多聚甲醛以及琼脂层，每孔加入1ml 0.5％的结晶紫染液，RT染色30min-1h，吸弃染色液，用自来水轻轻冲洗干净上层浮色，RT晾干。将6孔板置于光学显微镜下拍照并保存。

实验结果：

本发明在HSV1病毒整体水平也对HIRRP不同截短片段的功能进行了检测。实验分别以pcDNA3、pcDNA3-HIRRP-N和pcDNA3-HIRRP-C三种质粒分别转染Vero细胞，于转染后24h接种HSVI(MOI＝0.1)，病毒感染后24h收取样品通过PFU法检测HSVI病毒滴度。结果如图4所示：与pcDNA3对照组相比，在24h、36h及48h这三个时间点范围内转染HIRRP-N末端截短片段质粒的病毒样品组对HSVI病毒活性具有抑制作用，而HIRRP-C末端抑制作用则要弱于N端蛋白分子。说明HIRRP的功能结构域可能主要位于HIRRP蛋白分子的N末端。图中病毒的滴度以PFU/ml表示，为每毫升实验样品中的噬斑形成数。

最后还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明并不限于以上以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均认为是本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种人源HIRRP蛋白分子，其特征在于：它的cDNA核苷酸序列如SEQ ID №：1所述。

2.一种人源HIRRP蛋白分子，其特征在于：它的cDNA编码氨基酸序列如SEQ ID №：2所述。

3.一种权利要求1或2所述的人源HIRRP蛋白分子的制备方法，其特征在于采用以下步骤：

(1)HIRRP的发现是通过2-DE差异蛋白电泳，比较HSV1病毒感染及未感染L02细胞的蛋白表达谱，并利用MODI-TOF-MS技术而寻找到的差异蛋白分子；

(2)HIRRP基因的克隆：通过对HSV1感染后细胞总RNA的提取，从人肝细胞cDNA文库中克隆出HIRRP的基因并构建相应的真核表达载体；

(3)HIRRP蛋白的表达：将HIRRP基因连入蛋白表达载体，并得到HIRRP表达的全长蛋白，同时制备HIRRP的小鼠抗血清，用于HIRRP分子的检测。

4.一种权利要求1或2所述的人源HIRRP蛋白分子功能结构域的确定方法，其特征在于，通过噬斑形成单位实验(PFU)证实：HIRRP分子的功能结构域主要位于N端1～80aa的区域；高表达的HIRRPN末端分子片段，能抑制HSV1病毒的增殖，表现为HSV1滴度的降低，而C末端片段分子作用不甚明显。

5.权利要求1或2所述的人源HIRRP蛋白分子对HSV1病毒抑制效应的应用。

Images