CN101970672A - 根霉属淀粉酶在颗粒淀粉水解中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明描述了涉及颗粒淀粉水解的组合物和方法。对于使用本发明组合物和方法可以例如用于乙醇生产。

Description

根霉属淀粉酶在颗粒淀粉水解中的应用

优先权

本申请要求于2008年3月11日提交的美国临时专利申请系列号61/035,648的优先权，在此通过引用以其整体并入。

技术领域

本发明组合物和方法涉及颗粒淀粉水解，可以用于例如乙醇生产。

背景技术

淀粉酶、特别是具有颗粒淀粉水解(GSH)活性的淀粉酶，例如α-淀粉酶和葡糖淀粉酶，是重要的工业酶，用于自含淀粉底物生产有机酸(例如乳酸)、氨基酸(例如谷氨酸)、醇(例如乙醇和丁醇)和其它化合物的方法中。尽管市售可得多种酶用于实施这些方法，但是每种酶都有其自身的局限性和缺点。需要改良的淀粉酶用于工业应用。

发明概述

本发明组合物和方法涉及从根霉属(Rhizopus)获得的α-淀粉酶和/或这些α-淀粉酶与葡糖淀粉酶的组合，其用于有效水解颗粒淀粉、促进终产物例如醇的生产。

一方面，本发明提供了包含根霉属物种(Rhizopus spp.)α-淀粉酶的酶组合物。在一些实施方案中，该α-淀粉酶与SEQ ID NO.1的序列具有至少80％氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，该α-淀粉酶与SEQID NO.1具有至少90％氨基酸序列同一性。在特定实施方案中，该α-淀粉酶与SEQ ID NO.1的序列具有至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，该酶组合物包括根霉属物种α-淀粉酶作为唯一的α-淀粉酶，即组合物中唯一的颗粒淀粉水解组分。在一些实施方案中，该组合物是清洁组合物、洗涤剂组合物、烘焙组合物、动物饲料组合物或淀粉水解酶组合物。

在一些实施方案中，该组合物包含根霉属物种α-淀粉酶和至少一种葡糖淀粉酶。在一些实施方案中，葡糖淀粉酶得自曲霉属(Aspergillus)、踝节菌属(Talaromyces)、腐质霉属(Humicola)或木霉属(Trichoderma)的菌株。在一些实施方案中，葡糖淀粉酶是重组或工程化葡糖淀粉酶。在一个具体的实施方案中，葡糖淀粉酶不是得自米根霉(Rhizopus oryzae)的葡糖淀粉酶。

在一些实施方案中，该组合物被加入到或存在于发酵培养基中。在一些实施方案中，该组合物被加入到或存在于烘焙组合物、动物饲料组合物、清洁组合物或淀粉水解组合物中。

在另一方面，本发明提供了水解淀粉底物的方法，其包括用根霉属物种α-淀粉酶组合物接触淀粉底物。在一些实施方案中，该淀粉是颗粒淀粉。在一些实施方案中，该颗粒淀粉得自玉米、小麦、黑麦、高粱和/或大麦谷粒。在一些实施方案中，该淀粉在低于底物中的颗粒淀粉的淀粉糊化温度的温度水解。

在一个相关方面，本发明提供了用于生产醇的方法，其进一步包括使通过与根霉属物种α-淀粉酶组合物接触而生成的水解淀粉与能将水解的淀粉(例如葡萄糖)转化成醇的微生物接触。在特定的实施方案中，该醇是乙醇。在特定的实施方案中，该微生物是能将葡萄糖转化成乙醇的酵母。在一些实施方案中，提供了生产乙醇的方法，其包括将根霉属物种α-淀粉酶组合物和能将葡萄糖转化成乙醇的微生物与颗粒淀粉一起孵育。

下面借助于附图描述了本发明组合物和方法的这些特征和其它特征。

附图简述

技术人员将理解附图仅用于举例说明目的，并非旨在限制本发明的范围。

图1显示，作为时间(h)的函数，使用里氏木霉(Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶(TrGA)、河内曲霉(Aspergillus kawachi)α-淀粉酶(AkAA)、米根霉α-淀粉酶(RoAA)或其组合所释放的葡萄糖的量(％DP-1(w/v))。

图2显示，作为时间(h)的函数，在pH 5.0的发酵过程中所生产的乙醇(％EtOH(v/v))。

图3显示，作为时间(h)的函数，在pH 4.5的发酵过程中所生产的乙醇(％EtOH(v/v))。

发明详述I.引言

本发明组合物和方法基于下述发现：得自根霉属的某些α-淀粉酶和/或这些α-淀粉酶与葡糖淀粉酶的组合物可以有效地水解淀粉，特别是颗粒淀粉，促进终产物例如醇的生产。按照所选术语的定义，详细描述该组合物和方法的不同方面和实施方案。II.定义

除非另有说明，所有技术术语和科学术语应与其在相关领域中所使用的普通含义一致。为清楚起见定义下列词语和术语：

如本文所用的，术语“淀粉”是指植物的复杂多糖碳水化合物。淀粉分子通常具有式(C₆H₁₀O₅)_x，其中X可以是任何数，并且该分子主要是直链淀粉和支链淀粉的形式。

如本文所用的，术语“颗粒淀粉(granular starch)”是指还未经历过糊化温度的生淀粉。

如本文所用的，术语“颗粒淀粉水解酶”(“GSHE”)或“具有颗粒淀粉水解(GSH)活性的酶”是指具有水解颗粒形式淀粉的能力的酶。

如本文所用的，术语“α-淀粉酶”是指催化α-1，4-糖苷键水解的酶。这些酶被分类为EC 3.2.1.1。这些酶也被描述为实现含有1，4-α-连接的D-葡萄糖单元的多糖中的1，4-α-D-糖苷键的外切水解或内切水解的酶。用于描述这些酶的另一个术语是“糖原酶”。

如本文所用的，术语“葡糖淀粉酶”是指属于淀粉葡糖苷酶类(例如EC 3.2.1.3、葡糖淀粉酶、1，4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶)的酶。这些是外切作用的酶，其从直链淀粉和支链淀粉分子的非还原性末端释放葡糖基残基。所述酶也水解α-1，6和α-1，3键，但比水解α-1，4键慢得多。

如本文所用的，术语“寡糖”是指具有2～10个以糖苷键连接的单糖单位的任何化合物。这些简单糖的短链聚合物包括糊精。

如本文所用的，术语“DE”或“葡萄糖当量”是基于干重用于度量总还原糖(以D-葡萄糖计)的浓度的工业标准。未水解的颗粒淀粉的DE基本上为0，而D-葡萄糖的DE为100。

如本文所用的，术语“总糖含量”是指存在于淀粉组合物中的总糖含量。

如本文所用的，术语“干固形物”或“ds”是指基于干重以百分比(％)表示的浆液中的总固形物。

如本文所用的，术语“淀粉结合结构域(SBD)”是指优先与淀粉(多糖)底物结合的氨基酸序列。

如本文所用的，术语“催化结构域”是指多肽中不同于SBD且包含用于底物水解的活性位点的结构区域。

如本文所用的，术语“截短型α-淀粉酶”是指其中淀粉结合结构域的至少部分已被除去的α-淀粉酶。

如本文所用的，术语“糖化作用”是指淀粉至葡萄糖的酶促转化。

术语“液化(liquefaction)”是指在淀粉转化中将糊化的淀粉水解以产生低分子量可溶性糊精的阶段。术语“聚合度”(DP)是指给定糖中脱水吡喃葡萄糖单元的数目(n)。DP1的实例是单糖葡萄糖和果糖。DP2的实例是二糖麦芽糖和蔗糖。为了本文目的，“可比液化工艺”是指，在可比较的条件下，优选地在标化的温度、pH、底物浓度、钙离子浓度等的条件下，进行的液化工艺。优选地，可比液化工艺是基于相等的蛋白质或相等的活性单位来比较的，然而，在某些实施方案中，在可比液化工艺中蛋白质或活性单位、或两者均可以改变。技术人员将理解液化工艺可以是“可比的”所依据的基础。

在液化工艺过程中，淀粉浆液的粘度常用来度量淀粉向更小DP单元的转化。本文有时使用措辞“初始粘度”。技术人员将理解这是一个本领域术语，并非旨在按字面指初始粘度，而是指在例如底物糊化点附近出现的峰粘度。初始粘度用于区分“最终粘度”，“最终粘度”是底物(例如淀粉浆液)在液化工艺结束时的粘度。因此，从粘度随液化工艺的时间-进程变化的图来看，明显地，初始粘度或峰粘度并非立即出现，而是在某段时间(例如少于液化总时间的50％)后出现，更优选在液化总时间的约前1/3或甚至1/4或1/5内出现。例如，在本文例示的液化中，峰粘度通常在前十分钟内出现，之后加入酶，粘度开始下降。当淀粉颗粒在糊化工艺过程中打开时，颗粒内部变得更易受淀粉酶活性作用以及更多切割，从而导致粘度下降。

如本文所用的，短语“同时糖化和发酵(SSF)”是指一种用于生产终产物的工艺，其中微生物例如产乙醇微生物和至少一种酶例如淀粉酶存在在相同的工艺步骤中。SSF也可指在相同反应容器中同时将颗粒淀粉底物水解成包括葡萄糖在内的糖和将糖发酵成醇。

如本文所用的，术语“接触”是指将相应的实体(例如酶、底物、缓冲剂等)以足够紧密的接近方式放置，从而允许反应(例如底物酶促转化为终产物)发生。酶、底物或其它实体可以在溶液或悬浮液中，并且接触可以指混合该溶液或悬浮液。

如本文所用的，术语“酶促转化”通常是指通过酶促作用修饰底物。该术语特别包括通过酶作用修饰颗粒淀粉底物。

如本文所用的，术语“聚合度(DP)”是指给定糖中脱水吡喃葡萄糖单元的数目(n)。单糖例如葡萄糖和果糖被称为DP-1。二糖例如麦芽糖和蔗糖被称为DP-2。DP＞3表示聚合度大于3的聚合物。

如本文所用的，术语“终产物”或“所需终产物”是指通过酶促转化淀粉底物而产生的分子。

如本文所用的，术语“干固形物含量(ds)”是指基于干重以百分比(％)表示(即％wt/wt)的浆液中的总固形物。

如本文所用的，术语“浆液”是指包含不溶固形物的含水混合物。

如本文所用的，术语“残留淀粉”是指在组合物中存在的含淀粉底物发酵之后残留在组合物中的淀粉(可溶或不溶)。

如本文所用的，术语“醪液(mash)”是指水中可发酵的碳分子(例如碳水化合物)的混合物，其可用于生产发酵产品，例如醇。

如本文所用的，术语“釜馏物(stillage)”是指未发酵固形物与水的混合物，其是从发酵醪液中除去醇之后的残留物。

如本文所用的，术语“干酒糟(distillers dried grain)(DDG)”和“含可溶物的干酒糟(distillers dried grain with solubles)(DDGS)”是指谷粒发酵的有用的副产物。

如本文所用的，术语“乙醇生产者”、“乙醇生产微生物”或“产乙醇微生物”是指具有将糖或寡糖转化为乙醇的能力的微生物。产乙醇微生物借助于其表达一种或多种单独或一起可以将糖转化为乙醇的酶的能力而产乙醇。

如本文所用的，术语“回收”、“分离”和“分开”是指化合物、蛋白质、细胞、核酸或氨基酸从与其天然相伴的至少一个成分中移出。

如本文所用的，与细胞有关的术语“转化的”、“稳定转化的”和“转基因的”意指细胞具有非天然的(例如异源的)核酸序列，所述核酸序列被整合到其基因组内，或者以多代维持的游离型质粒形式携带。

如本文所用的，术语“比活性”是指在特定条件下于给定时间内由给定量的酶转化成产物的底物的量。比活性通常表示为单位(U)/mg蛋白质。

如本文所用的，术语“酶单位(U)”是指在规定的测定条件下每分钟生产1微摩尔产物的酶量。例如，术语“葡糖淀粉酶活性单位”(“GAU”)被定义为在60℃和pH 4.2的测定条件下，每小时从可溶淀粉底物(4％ds)生产1g葡萄糖所需的酶的量。在另一个实施例中，颗粒淀粉水解酶单位(GSHE U)是在例如25℃和pH 5.0的测定条件下从颗粒淀粉每分钟生产1mg葡萄糖所需的GSHE的量。在一些实施方案中，GSHE U是在50℃和pH 4.5下从颗粒淀粉底物生产1mg葡萄糖/min所需的GSHE的量。

如本文所用的，术语“产量(yield)”是指在反应中生产的终产物或所需终产物的量。产量可以是指以克或摩尔计的产物的量、以ml计的产物的体积、以g/L或mol/L计的产物的浓度等。

如本文所用的，术语“蛋白质”和“多肽”可互换地用来指由肽键所连接的氨基酸残基单链组成的分子。本文使用常规的1字母或3字母代码表示氨基酸残基。除非另有说明，所有多肽均以N端至C端的方向书写。

如本文所用的，术语“核酸”和“多核苷酸”可互换地用来指核苷酸聚合物，包括DNA、RNA、cDNA、DNA/RNA杂种、或化学修饰的核酸。核酸可以是单链或双链的。因为遗传密码是简并的，所以超过一个的密码子可以用于编码特定的氨基酸，并且本发明包括编码特定氨基酸序列的所有多核苷酸。除非另有说明，所有多核苷酸均以5′至3′的方向书写。

如本文所用的，涉及多核苷酸或多肽的术语“异源的”是指在给定的宿主细胞中非天然存在的、或者在宿主细胞中于不同调节元件的控制下天然表达的多核苷酸或多肽。

如本文所用的，涉及多核苷酸或多肽的术语“同源的”是指在宿主细胞中天然发生的多核苷酸或多肽。

如本文所用的，术语“基因”是指编码特定多肽链的多核苷酸序列(例如DNA片段)，任选地在该编码序列之前和之后组合任何调节和元件和控制元件，例如5′非翻译序列(5′UTR)或“前导”序列、3′UTR或“尾随”序列、位于编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)、RNA聚合酶结合序列、启动子、增强子、终止子等。

如本文所用的，术语“重组”当被用于细胞、核酸、蛋白质或载体时，是指该细胞、核酸、蛋白质或载体通过引入异源核酸或蛋白质或通过改变天然核酸或蛋白质而被修饰，或是指该细胞是来自被如此修饰的细胞、或蛋白质在非天然或遗传上修饰的环境中(例如在用于原核或真核***的表达载体中)被表达。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内不存在的核酸或多肽，或表达原本被异常表达、欠表达、过表达或根本不表达的天然基因。

如本文所用的，术语“表达”是指基于基因的核酸序列产生多肽的过程。该过程既包括转录又包括翻译。

如本文所用的，术语“载体”、“DNA构建体”、“转化DNA”等是指可以瞬时或稳定地引入到一种或多种细胞类型中的多核苷酸。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、盒(cassette)等。

如本文所用的，在将核酸序列***到细胞中的上下文中，术语“引入”意指“转染”、“转化”或“转导”，并且包括将核酸序列并入到真核细胞或原核细胞中，在其中该核酸序列可以整合入到该细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中、转变成自主复制子、或瞬时表达(例如转染的mRNA)。

如本文所用的，术语“源自(derived)”包括术语“起源自(originated from)”、“得自(obtained)”、“可得自(obtainable from)”和“分离自(isolated from)”。

如本文所用的，术语“宿主细胞”或“宿主菌株”是指包含载体且支持该载体的复制和/或转录以例如表达感兴趣的多肽的细胞。宿主细胞包括细菌、酵母、丝状真菌、植物细胞和动物细胞。

如本文所用的，术语“丝状真菌”是指包括真菌亚门(Eumycotina)的丝状形式真菌在内的真核微生物。这些真菌的特征是具有由几丁质、纤维素和其它复杂多糖组成的营养菌丝体。丝状真菌与酵母是形态学、生理、和遗传不同的。示例性的丝状真菌是木霉属物种(Trichoderma spp.)，其之前被分类为肉座菌属物种(Hypocrea spp.)。示例性木霉属物种包括长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉、绿色木霉(Trichoderma viride)和红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)。

如本文所用的，术语“野生型(wt)”是指天然或天生的生物体、核酸或蛋白质。在很多情况下，野生型生物体、核酸或蛋白质用作制备或鉴定突变体或变体的“亲本”。

如本文所用的，术语“亲本”是指用作制备或鉴定突变体或变体的基础的生物体、核酸或蛋白质。

如本文所用的，术语“突变体”或“变体”是指这样的生物体、核酸或蛋白质，其源自亲本生物体、核酸或蛋白质但与亲本相比包括至少一个遗传或生物化学的变化。例如，当突变体或变体为多肽时，其相对于亲本多肽包括至少一个氨基酸置换、缺失或***，或者相对于亲本多肽是化学修饰的。当突变体或变体是多核苷酸时，其相对于亲本多核苷酸包括至少一个碱基置换、缺失或***，或者相对于亲本多核苷酸是被化学修饰的。当突变体或变体是生物体时，其包括至少一个在亲本生物体中不存在的多核苷酸或多肽。

变体多核苷酸或多肽可以与亲本多核苷酸或多肽具有某一百分比的序列同一性(例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和甚至至少99％)，由此当比对时，在这两个序列的比较中该百分比的碱基或氨基酸残基是相同的。比对和百分比同源性或同一性可以使用任何本领域已知的合适软件程序来确定，所述程序例如为在CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel F.M.等人(编辑)1987，增刊30，第7.7.18部分)中所述的那些。这些程序包括GCG Pileup程序、FASTA(Pearson等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA 85：24442448)和BLAST(BLAST Manual，Altschul等人，Natl Cent.Biotechnol.Inf.，Natl Lib.Med.(NCIB NLM NIH)，Bethesda，Md.和Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：33893402)。其它比对程序包括ALIGN Plus(Scientific and Educational Software，PA)(优选使用缺省参数)和在Sequence Software Package Version 6.0中可得的TFASTA Data Searching Program(Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，Wis.)。

变体多核苷酸可以另外地或备选地与亲本多核苷酸(或其互补物)的序列互补，由此它们可通过杂交进行鉴定。如本文所用的，严格条件是50℃和0.2X SSC(1X SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH 7.0)，高度严格条件是65℃和0.1X SSC，但是其它缓冲***和温度也可以用于杂交。杂交和洗涤条件是本领域众所周知的，如Sambrook等人(1989)的第9章和11章所例示。

除非上下文中另外明确地指出，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数形式。因此，例如，提及“一个(a)酶”时包括提及多个此类酶，并且提及“该(the)制剂”时包括提及一种或多种制剂及本领域技术人员已知的其等价物，等等。

“SPEZYME

FRED”是Genencor International生产的市售可得的酶制剂，其包括作为活性成分的具有置换M15T、H133Y、N188S和A209V的地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)α-淀粉酶的工程化变体。比活性最小为17,400AAU/g。

涉及数值或数值范围的术语“约”是指，该数值可以比所述值大10％或小10％。在其它实施方案中，“约”表示数值可以比所述值大5％或小5％。

数值范围包括限定该范围的数。III.涉及得自根霉属物种的α-淀粉酶的组合物和方法

本发明组合物和方法是基于下述发现：得自根霉属物种的某些α-淀粉酶和/或这些根霉属α-淀粉酶与葡糖淀粉酶的组合可以有效地水解淀粉，以有助于终产物例如醇的生产。本发明根霉属α-淀粉酶组合物可以特别有效地用于还未经历过其糊化温度的颗粒淀粉。本发明组合物和方法的各个方面和实施方案包括下面描述的那些。

在第一方面，提供了包括根霉属物种α-淀粉酶多肽的组合物。该根霉属物种α-淀粉酶多肽可以是该组合物中存在的唯一α-淀粉酶多肽，或者该组合物可以包括一种或多种其它的α-淀粉酶多肽。以这种方式，组合物可以主要由该根霉属物种α-淀粉酶多肽组成。可以将组合物加至含生淀粉的植物材料中以影响淀粉水解和/或醇生产，其中该根霉属物种α-淀粉酶多肽在该组合物中起颗粒淀粉水解组分的作用。

在一些实施方案中，本发明α-淀粉酶来自根霉属物种，例如厚孢根霉(Rhizopus achlamydosporus)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、无接合孢子根霉(Rhizopus azygosporus)、华根霉(Rhizopus chinensis)、德氏根霉(Rhizopus delemar)、台湾根霉(Rhizopus formosaensis)、日本根霉(Rhizopus japonicas)、爪哇根霉(Rhizopus javanicus)、小孢根霉(Rhizopus microsporus)、黑根霉(Rhizopus nigricans)、雪白根霉(Rhizopus niveus)、少孢根霉(Rhizopus oligosporus)、米根霉、Rhizopus pygmaeus、Rhizopus rhizopodiformis、希伯来根霉(Rhizopus schipperae)、Rhizopus semarangensis、Rhizopus sontii、匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)、Rhizopus thermosus、东京根霉(Rhizopus tonkinensis)、小麦曲根霉(Rhizopus tritici)或Rhizopus usamii。在一些实施方案中，本发明根霉属α-淀粉酶是米根霉α-淀粉酶。

在一些实施方案中，本发明根霉属α-淀粉酶是重组α-淀粉酶。重组α-淀粉酶的序列可以任选地不同于天然存在的根霉属α-淀粉酶的序列。重组α-淀粉酶通常在适合的宿主细胞中表达，其中所述宿主被基因工程化以表达该根霉属α-淀粉酶。在一些实施方案中，使用丝状真菌细胞作为宿主细胞。示例性丝状真菌宿主是曲霉属物种、木霉属物种、镰孢菌属物种、青霉属物种或根霉属物种。示例性的真菌宿主细胞包括但不限于构巢曲霉(A.nidulans)、泡盛曲霉(A.awamori)、米曲霉(A.oryzae)、棘孢曲霉(A.aculeatus)、黑曲霉(A.niger)、日本曲霉(A.japonicus)、河内曲霉(A.kawachi)、里氏木霉、绿色木霉(T.viride)、尖孢镰孢(F.oxysporum)、腐皮镰孢(F.solani)和米根霉。表达重组多肽的方法，包括可以使用的载体以及宿主细胞的转化和培养，在本领域已知并且在出版物例如WO2005/117,756中公开。

在一些实施方案中，本发明α-淀粉酶具有与下示的SEQ IDNO：1的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列。此序列与示例的根霉属α-淀粉酶相应。MKSFLSLLCSVFLLPLVVQSVPVIKRASASDWENRVIYQLLTDRFAKSTDDTNGCNNLSDYCGGTFQGIINHLDYIAGMGFDAIWISPIPKNANGGYHGYWATDFSQINEHFGTADDLKKLVAAAHAKNMYVMLDVVANHAGIPSSGGDYSGYTFGQSSEYHTACDINYNSQTSIEQCWISGLPDINTEDSAIVSKLNSIVSGWVSDYGFDGLRIDTVKHIPLAFLILKMETLKDIDVLVNFIDNHDQPRLLSKADQSLVKNALAYSFMVQGIPVLYYGTEQSFKGGNDPNNREVLWTTGYSTTSDMYKFVTTLVKARKGSNSTVNMGIAQTDNVYVFQRGGSLVVVNNYGQGSTNTITVKAGSFSNGDTLTDVFSNKSVTVQNNQITFQLQNGNPAIFQKK

在一些实施方案中，本发明α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQ IDNO：1的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。在一些实施方案中，本发明α-淀粉酶具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明α-淀粉酶具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列95％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明α-淀粉酶具有与SEQID NO：1的氨基酸序列97％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明α-淀粉酶具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明α-淀粉酶具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明α-淀粉酶具有颗粒淀粉水解(GSH)活性，该活性可以如本文所述进行测定。在一些实施方案中，本发明α-淀粉酶具有GSH活性，该活性为具有SEQ ID NO：1的序列的α-淀粉酶的GSH活性的至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％。

在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1的序列具有至少70％、至少80％、至少85％或甚至至少90％或更多的序列同一性的氨基酸序列将包括使用L-氨基酸的保守氨基酸置换，其中一个氨基酸被另一个生物学上类似的氨基酸取代。保守氨基酸置换是保持被置换的氨基酸的总电荷、疏水性/亲水性、和/或空间大小的那些氨基酸置换。保守置换的非限制性实例包括下组之间的那些置换：Gly/Ala、Val/Ile/Leu、Lys/Arg、Asn/Gln、Glu/Asp、Ser/Cys/Thr和Phe/Trp/Tyr。其它保守置换可以取自下表。表1-保守氨基酸取代

在其它的实施方案中，氨基酸置换不是保守置换。

在一些实施方案中，本发明α-淀粉酶是包含与SEQ ID NO：1至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％序列同一性的氨基酸序列的片段，其中该片段包含至少350个氨基酸、至少375个氨基酸或甚至至少390个氨基酸。该片段优选具有GSH活性，所述GSH活性为具有SEQ ID NO：1的序列的α-淀粉酶的GSH活性的至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％，该活性可以使用本文所述的测定法进行测定。在一些实施方案中，α-淀粉酶的片段不具有淀粉结合结构域，或者包括截短型淀粉结合结构域。

在一些实施方案中，本发明组合物还包括一种或多种葡糖淀粉酶。具体葡糖淀粉酶(或多种葡糖淀粉酶)的选择通常不认为是关键的。合适的葡糖淀粉酶包括天然存在的野生型葡糖淀粉酶以及变体和基因工程化突变体/变体葡糖淀粉酶，包括杂种或嵌合葡糖淀粉酶。许多合适的葡糖淀粉酶由细菌、植物和真菌内源性表达，并且很多已得到克隆，且在相同或不同的生物体中被异源表达。在特定的实施方案中，使用丝状真菌葡糖淀粉酶。当本发明根霉属物种α-淀粉酶多肽是组合物中存在的唯一的α-淀粉酶多肽时，可以说该组合物主要由根霉属物种α-淀粉酶多肽和葡糖淀粉酶组成。

可以在本发明组合物和方法中使用的示例性葡糖淀粉酶包括：黑曲霉G1和G2葡糖淀粉酶(Boel等人(1984)EMBO J.3：1097-1102、WO 92/00381、WO 00/04136和美国专利号6,352,851)；泡盛曲霉葡糖淀粉酶(WO 84/02921)；米曲霉葡糖淀粉酶(Hata等人(1991)Agric.Biol.Chem.55：941-949)；和Aspergillus shirousami葡糖淀粉酶(Chen等人(1996)Prot.Eng.9：499-505；Chen等人(1995)Prot.Eng.8：575-582；和Chen等人(1994)Biochem J.302：275-281)。有用的葡糖淀粉酶还可以得自踝节菌属(Talaromyces)菌株，例如源自T.emersonii、T.leycettanus、T.duponti和嗜热踝节菌(T.thermophiles)的那些菌株(WO 99/28488，美国专利号RE32,153和4,587,215)；木霉属菌株，例如里氏木霉，特别是与在美国专利公开号2006-0094080中公开的SEQ ID NO：4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和甚至至少98％氨基酸序列同一性的葡糖淀粉酶；根霉属菌株，例如雪白根霉和米根霉；毛霉属(Mucor)菌株和腐质霉属菌株，例如灰腐质霉(H.grisea)(Boel等人(1984)EMBO J.3：1097-1102、WO 92/00381、WO 00/04136、Chen等人(1996)Prot.Eng.9：499-505、Taylor等人(1978)Carbohydrate Res.61：301-308、美国专利号4,514,496、4,092,434、4,618,579、Jensen等人(1988)Can.J.Microbiol.34：218-223和WO 2005/052148的SEQ ID NO：3)。在一些实施方案中，葡糖淀粉酶将与WO 05/052148的SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和甚至至少99％序列同一性。其它葡糖淀粉酶包括得自Athelia rolfsii的葡糖淀粉酶及其变体(WO 04/111218)。

具有葡糖淀粉酶活性且商业上使用的酶产自例如黑曲霉(商品名DISTILLASE、OPTIDEX L-400和G ZYME G9904X，来自美国丹尼斯科公司(杰能科分部))和根霉属物种(商品名CU.CONC，来自日本Shin Nihon Chemicals)。另外的酶包括三种形式的根霉属物种葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)，即“Gluc1”(MW  74,000)、“Gluc2”(MW  58,600)和“Gluc3”(MW 61,400)。

在一些实施方案中，在本发明的组合物和方法中使用的葡糖淀粉酶具有与下示的SEQ ID NO：2的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列。此序列与示例的葡糖淀粉酶TrGA相应。SVDDFISTETPIALNNLLCNVGPDGCRAFGTSAGAVIASPSTIDPDYYYMWTRDSALVFKNLIDRFTETYDAGLQRRIEQYITAQVTLQGLSNPSGSLADGSGLGEPKFELTLKPFTGNWGRPQRDGPALRAIALIGYSKWLINNNYQSTVSNVIWPIVRNDLNYVAQYWNQTGFDLWEEVNGSSFFTVANQHRALVEGATLAATLGQSGSAYSSVAPQVLCFLQRFWVSSGGYVDSNINTNEGRTGKDVNSVLTSIHTFDPNLGCDAGTFQPCSDKALSNLKVVVDSFRSIYGVNKGIPAGAAVAIGRYAEDVYYNGNPWYLATFAAAEQLYDAIYVWKKTGSITVTATSLAFFQELVPGVTAGTYSSSSSTFTNIINAVSTYADGFLSEAAKYVPADGSLAEQFDRNSGTPLSALHLTWSYASFLTATARRAGIVPPSWANSSASTIPSTCSGASVVGSYSRPTATSFPPSQTPKPGVPSGTPYTPLPCATPTSVAVTFHELVSTQFGQTVKVAGNAAALGNWSTSAAVALDAVNYADNHPLWIGTVNLEAGDVVEYKYINVGQDGSVTWESDPNHTYTVPAVACVTQVVKEDTWQS

重组葡糖淀粉酶的序列可以但并不必不同于天然葡糖淀粉酶的序列。

重组葡糖淀粉酶可以在宿主细胞中表达，所述宿主细胞包括但不限于曲霉属物种(例如河内曲霉)、根霉属物种(例如米根霉)或木霉属物种(例如里氏木霉)细胞。

在一些实施方案中，本发明组合物包括具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％序列相同的氨基酸序列的根霉属物种α-淀粉酶和不是根霉属葡糖淀粉酶的葡糖淀粉酶。在一些实施方案中，本发明组合物包括具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％序列相同的氨基酸序列的根霉属物种α-淀粉酶和为野生型或变体曲霉属、木霉属、踝节菌属或腐质霉属葡糖淀粉酶的葡糖淀粉酶。

在一些实施方案中，组合物中α-淀粉酶活性(SSU或AAU)与葡糖淀粉酶活性(GAU)的比率为约20∶1至约1∶20、约15∶1至约1∶15、约10∶1至约1∶10、约5∶1至约1∶5、或约4∶1至约1∶4。

在一些实施方案中，包括α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的上述组合物还包括另外的酶，包括但不限于，蛋白酶、纤维素酶、植酸酶、支链淀粉酶、其它α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、及其组合。示例性的另外(或第二)α-淀粉酶包括分离自嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、芽孢杆菌物种TS-23等的那些α-淀粉酶。市售可得的酶包括由Genencor，International生产的SPEZYME

FRED和SPEZYME

ETHYL。当组合物包括第二α-淀粉酶时，与缺乏本发明根霉属物种α-淀粉酶的组合物相比较，该根霉属物种α-淀粉酶赋予该组合物有利的特征。

在一些实施方案中，组合物是发酵培养基、清洁组合物、洗涤剂组合物、烘焙组合物、动物饲料组合物或淀粉转化酶组合物。在一些实施方案中，组合物可以用于执行淀粉转化，特别是用于水解颗粒淀粉。

在另一方面，提供了使用根霉属物种α-淀粉酶的方法。在一些实施方案中，该方法包括将含颗粒淀粉的底物与包括根霉属物种α-淀粉酶的组合物接触。含颗粒淀粉的底物包括谷粒，例如小麦、玉米(玉蜀黍)、黑麦、高粱(蜀黍)、稻、小米、大麦、黑小麦及其组合。其它底物包括木薯(木薯粉)、马铃薯、甘薯、甜菜、甘蔗和豆类例如大豆和豌豆。

在一些实施方案中，完整谷粒可以用作颗粒淀粉源。完整谷粒包括玉米、小麦、黑麦、大麦、高粱及其组合。在其它的实施方案中，颗粒淀粉可以得自分级分离的谷物谷粒，包括纤维、胚乳和/或胚芽组分。在一些实施方案中，可以将得自不同来源的植物材料混合在一起以得到底物(例如玉米和蜀黍或玉米和大麦)。优选底物是浆液的形式。

用于分级分离植物材料例如玉米和小麦的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，植物材料通过各种方法例如研磨来制备。两种一般研磨工艺是湿磨和干磨。研磨方法是众所周知的，并且可以参考THEALCOHOL TEXTBOOK：A REFERENCE FOR THE BEVERAGE，FUEL AND INDUSTRIAL ALCOHOL INDUSTRIES第3版K.A.Jacques等人(编辑)(1999)Nottingham University Press.，参见例如第2和4章。

在一些实施方案中，将通过研磨或其它方法粉碎的植物材料与溶液组合以形成包含颗粒淀粉底物的浆液。在一些实施方案中，浆液包括来自淀粉加工的侧流(side stream)，例如回流物(backset)。在一些实施方案中，浆液包含约15至约55％ds(例如20-50％、25-45％、25-40％、20-35％和30-35％)。

在一些实施方案中，该方法包括将包含颗粒淀粉底物的浆液与根霉属物种α-淀粉酶组合物接触。该接触可以是15分钟至约20小时(例如约30分钟至10小时，或30分钟至5小时)的时间。pH通常保持在4.0至小于约6.5。在一些实施方案中，该接触在约60℃至约120℃，例如约60℃至约85℃、约40℃至约85℃、和约50℃至约80℃的温度进行足够长的时间，从而使淀粉水解。

在一些实施方案中，接触在低于淀粉糊化温度约0至30℃的温度进行。此温度可以是低于淀粉糊化温度约0至约25℃、约0至约20℃、约0至约15℃和甚至约0至约10℃。具体温度将是变化的，取决于浆液中的颗粒淀粉的类型。例如，玉米的淀粉糊化温度通常高于小麦或黑麦的淀粉糊化温度。在一些实施方案中，此温度为约45至约80℃，约50至约75℃、或约50至约70℃。在一些实施方案中，该温度为约65℃，低于约62℃，低于约60℃或低于约55℃。在其它实施方案中，该温度高于约40℃，高于约45℃，高于约50℃，或高于约55℃。

根霉属物种α-淀粉酶的有效量可以通过技术人员例如使用本文所述的测定法来确定。在一些实施方案中，该量为约0.1至约50AAU/gds，包括约0.1至约15AAU/g ds、约0.1至约10AAU/g ds和约0.1至约5AAU/g ds。

在一些实施方案中，对浆液实现液化步骤，包括在pH约4.0至约6.0，使温度增加，例如高于淀粉糊化温度约0至约45℃(例如至65℃～120℃、70℃～110℃、70℃～90℃)，持续约2分钟至约6小时(例如约2分钟至约4小时)的时间。可以通过使用常规的高温喷射蒸煮***(jet cooking system)短时间增加温度，以完成颗粒淀粉的糊化。糊化的淀粉可以在约75℃至约95℃(在一些实施方案中，约80℃至约85℃)的温度进一步水解约30至约120分钟的时间。在一些实施方案中，可以将第二剂量的α-淀粉酶加至液化步骤中。在其它的实施方案中，无另外的α-淀粉酶加入。在一些实施方案中，该额外剂量包括根霉属物种α-淀粉酶。在一些实施方案中，该根霉属物种α-淀粉酶是在该额外剂量中使用的唯一的α-淀粉酶。

本方法还包括用如上所述的葡糖淀粉酶将液化的底物糖化。在一些实施方案中，颗粒淀粉中至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和甚至至少99％的干固形物被水解。在一些实施方案中，颗粒淀粉底物被完全水解。在一些实施方案中，至少90％的颗粒淀粉在100小时内被水解。在某些实施方案中，至少90％的颗粒淀粉底物在24小时内被水解。在其它实施方案中，至少95％的颗粒淀粉底物在24小时内被水解。

葡萄糖的产量(溶解的总干固形物的百分比)可以是至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％和98％。但是，在优选的实施方案中，葡萄糖被连续生产，并且基本上所有的葡萄糖都被用于工艺中生产终产物，例如乙醇(参考MOLECULAR STRUCTUREAND FUNCTION OF FOOD CARBOHYDRATE，ED.G.G. BIRCH ETAL，APPLIED SCIENCE PUBLISHERS，LONDON)。

在一些实施方案中，该方法包括同时糖化和发酵(SSF)，其中水解步骤和发酵步骤同时进行。为了影响糖化和发酵，将葡糖淀粉酶加至与根霉属物种α-淀粉酶接触的含颗粒淀粉底物的浆液中。根霉属物种α-淀粉酶和葡糖淀粉酶可以分开供应或以组合形式供应，并且可以以粗细胞培养基、无细胞滤液或纯化的酶的形式供应。可选地，将表达根霉属物种α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的细胞加至浆液中。

在一些实施方案中，在糖化和/或发酵的过程中，可以包括葡糖淀粉酶与第二种酶，包括非淀粉多糖水解酶，包括但不限于纤维素酶、半纤维素酶、木糖聚酶、蛋白酶、植酸酶、支链淀粉酶、β-淀粉酶、脂肪酶、角质酶(cutinase)、果胶酶、β-葡聚糖酶、半乳糖苷酶、酯酶、环糊精转糖基转移酶(CGT酶)、β-淀粉酶及其组合。

发酵中使用的生物体将取决于所需终产物。通常地，如果乙醇是所需终产物，那么酵母用作发酵生物体。在一些实施方案中，产乙醇微生物是酵母，尤其是酵母菌属(Saccharomyces)，例如酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株(美国专利号4,316,956)。多种酿酒酵母是市售可得的，且包括但不限于FALI(Fleischmann’s Yeast)、SUPERSTART(Alltech)、FERMIOL(DSM Specialties)、RED STAR(Lesaffre)和Angel酒精酵母(Angel Yeast Company，China)。用于本发明方法的起子酵母的量是可以在适宜的时间内有效产生商业价值量的乙醇(例如在小于72小时内从具有约25至约40％DS的底物生产至少10％乙醇)的酵母量。酵母细胞通常以约10⁴至约10¹²的量(在一些实施方案中，每ml发酵肉汤约10⁷至约10¹⁰活酵母计数)供应。酵母在发酵中的应用是众所周知的，参考THEALCOHOL TEXTBOOK，K.JACQUES等人苄基，1999，NOTTINGHAMUNIVERSITY PRESS，UK。

在一些实施方案中，由本发明方法产生的乙醇的量为至少约8％、至少约10％、至少约12％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％或甚至至少约18％(v/v)。任选地，在发酵后，可以通过本领域众所周知的方法(例如蒸馏、超滤、分子筛脱水)将醇(例如乙醇)进行提取、纯化和回收。根据本发明工艺所得的乙醇可以用作燃料乙醇、可携带的乙醇(portable ethanol)或工业乙醇。

在另外的实施方案中，通过使用本领域已知的合适发酵微生物，发酵终产物可以包括但不限于甘油、1，3-丙二醇、葡糖酸盐、2-酮基-D-葡糖酸盐、2，5-二酮基-D-葡糖酸盐、2-酮基-L-古洛糖酸、琥珀酸、乳酸、氨基酸及其衍生物。更具体地说，当乳酸是所需终产物时，可以使用乳杆菌属物种(Lactobacillus sp.)(干酪乳杆菌(L.casei))；当甘油或1，3-丙二醇是所需终产物时，可以使用大肠杆菌(E.coli)；当2-酮基-D-葡糖酸盐、2，5-二酮基-D-葡糖酸盐和2-酮基-L-古洛糖酸是所需终产物时，可以使用柠檬泛菌(Pantoea citrea)作为发酵微生物。上文的列举仅仅是实例性的，本领域技术人员将知道可以适用于获得所需终产物的许多发酵微生物。

通过下面实施例，本发明组合物和方法的其它方面和实施方案将是明显的，但这些实施例不应解释为具有限制性。

实施例

本文使用下面的缩写：RoAA(具有在SEQ ID NO：1中公开的序列的纯化的根霉属α-淀粉酶组合物)；TrGA(里氏木霉葡糖淀粉酶)；AkAA(美国专利号7,037,704的图2中公开的具有SEQ ID NO：3的序列的成熟蛋白的河内曲霉α-淀粉酶)；GA(葡糖淀粉酶)；GAU(葡糖淀粉酶单位)；AAU(α-淀粉酶单位)；wt％(重量百分比)；℃(摄氏度)；rpm(每分钟转数)；H2O(水)；dH2O(去离子水)；g或gm(克)；μg(微克)；mg(毫克)；μL(微升)；ml或mL(毫升)；mm(毫米)；μm(微米)；M(摩尔)；mM(毫摩尔)；μM(微摩尔)；U(单位)；V(伏特)；MW(分子量)；see(秒)；min(s)(分钟)；hr(s)(小时)；DO(溶解氧)；和EtOH(乙醇)。

以下测定法和方法用于下面所提供的实施例：α-淀粉酶活性

α-淀粉酶活性可以按可溶性淀粉单位(SSU)来确定，以等份的酶样品在pH 4.5、50℃水解可溶性马铃薯淀粉底物(4％DS)的程度为基础。还原糖含量使用如Miller，G.L.(1959)Anal.Chem.31：426-428中所描述的DNS方法测定。

α-淀粉酶活性(AAU)已经通过淀粉水解速率确定，反映为分光光度计测量的碘染色能力的下降速率。1AAU的细菌α-淀粉酶活性是在标准条件下每分钟水解10mg淀粉所需要的酶量。葡糖淀粉酶活性

以葡糖淀粉酶活性单位(GAU)计的葡糖淀粉酶活性使用PNPG测定法来测量。PNPG测定法基于葡糖淀粉酶催化对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)水解为葡萄糖和对硝基苯酚的能力。在碱性pH，对硝基苯酚形成黄色，该黄色可以在400nm经分光光度计测量以用于计算GAU。一个葡糖淀粉酶单位是在指定的测定条件下每小时自可溶性淀粉底物释放1g还原糖(按葡萄糖计算)的酶的量。实施例1：自根霉属M1提取物纯化α-淀粉酶

粗制根霉属M1酶提取物得自BioCon(Bangalore，India)，为干粉状。经确定，提取物包括α-淀粉酶和葡糖淀粉酶活性，从而需要分级分离。

简单地说，将该粉末以40g/L的浓度溶于水中。取500ml加样于以10mM醋酸钠平衡至pH 5.0的20x300mm的POROS HS(阳离子交换)树脂柱。α-淀粉酶活性流过该柱，不发生结合，而污染性葡糖淀粉酶活性与该柱结合，并被去除。收集α-淀粉酶活性，将其加至用10mM醋酸钠平衡至pH 5.0的20x300mm POROS HQ(阴离子交换)树脂柱。再次，α-淀粉酶活性流过该柱，不结合，而其它的污染性蛋白与该柱结合，并被去除。收集α-淀粉酶活性，并使用截留10,000道尔顿分子量的PES膜在Amicon(Millipore Corp.，Billerica，MA)Stirred Cell(搅拌式超滤装置)中通过超滤进行浓缩。

将硫酸铵加至浓缩的含有α-淀粉酶活性的柱流过物中，至1.0摩尔的终浓度，然后将该物加至用10mM醋酸钠pH 5.0、1.0M硫酸铵平衡的POROS HP2(疏水树脂)柱。如前一样，α-淀粉酶活性流过该柱，不发生结合，而污染性蛋白质与该柱结合，并被去除。收集α-淀粉酶活性，并用10mM醋酸钠透析。制品的纯度通过Novex SDS-PAGE(Invitrogen，Carlsbad，CA)评估，估计纯度高于95％。该纯化的α-淀粉酶(RoAA)的氨基酸序列通过标准方法确定，并示为SEQ ID NO：1。实施例2：在与TrGA联合的情况下RoAA和AKAA对从生淀粉释放葡萄糖的影响

使用生玉米淀粉作为底物，在葡萄糖释放测定法中比较了RoAA与河内曲霉α-淀粉酶(AkAA)。以1.5AAU/g干固形物的剂量施用AkAA，而以与AkAA相等的蛋白质或相等的活性为基础施用RoAA剂量。此外，测定淀粉酶对由里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)引起的葡萄糖释放的相对影响。单独或在AkAA或RoAA的存在下以0.5GAU/g干固形物的剂量施用TrGA。制备32％生淀粉浆液，用稀硫酸将浆液pH调至4.2。将此浆液放在32℃水浴中，并轻轻混合3小时。在多个时间间隔，取样用于HPLC分析。葡萄糖释放被测量为％DP-1(w/v)。结果示于图1中。实施例3：RoAA在同时糖化和发酵(SSF)过程中的作用

在未蒸煮过的研碎的全玉米底物的同时糖化和发酵(SSF)中，比较了RoAA与AkAA和SPEZYME FRED(Genencor International Inc.)。以2.25AAU/g干固形物剂量施用AkAA，RoAA和SPEZYME FRED以基于与AkAA等蛋白的剂量使用。以0.75GAU/g干固形物剂量施用TrGA。制备含有200ppm尿素的32％(ds)玉米粉浆液，并用稀硫酸将浆液pH调至4.5或5.0。在含有100gm醪液(浆液)的125ml烧瓶中进行发酵。加入所需的酶水平，然后加入3ml增殖的酵母浆液以开始发酵。酵母接种物通过将0.26gm干Fali酵母加至100gm醪液来制备。将此浆液放在32℃水浴中，并轻轻混合约17小时。在多个时间间隔，取出发酵样品用于HPLC分析。结果示于图2和3。

本文所提及的所有参考和出版物通过引用以其整体并入。所述的组合物和方法的各个方面和实施方案旨在举例说明而非限制，技术人员将认识到另外的方面和实施方案。为了方便提供了标题，而在每一标题下提供的描述适用于整篇文件，除非下上文另有明确说明。

Claims (20)

1.一种组合物，其包含主要由α-淀粉酶和葡糖淀粉酶组成的多肽组分，其中所述α-淀粉酶是根霉属α-淀粉酶。

2.权利要求1的组合物，其中所述根霉属α-淀粉酶是所述组合物中唯一的颗粒淀粉水解组分。

3.权利要求1的组合物，其中所述根霉属α-淀粉酶是重组α-淀粉酶。

4.权利要求1的组合物，其中所述根霉属α-淀粉酶与SEQ ID NO.1的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。

5.权利要求1的组合物，其中所述根霉属α-淀粉酶具有SEQ IDNO.1的序列。

6.权利要求1的组合物，其中所述葡糖淀粉酶是重组葡糖淀粉酶。

7.权利要求1的组合物，其中所述葡糖淀粉酶是根霉属葡糖淀粉酶。

8.权利要求1的组合物，其中所述葡糖淀粉酶是木霉属、曲霉属、踝节菌属或腐质霉属葡糖淀粉酶。

9.权利要求1的组合物，其还包含选自下组的酶：蛋白酶、纤维素酶、支链淀粉酶、第二α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、及其组合。

10.一种组合物，其包含重组α-淀粉酶和葡糖淀粉酶，其中所述重组α-淀粉酶是根霉属α-淀粉酶。

11.权利要求10的组合物，其中所述α-淀粉酶与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。

12.权利要求10的组合物，其中所述α-淀粉酶具有SEQ ID NO：1的序列。

13.权利要求10的组合物，其中所述葡糖淀粉酶是重组葡糖淀粉酶。

14.权利要求10的组合物，其中所述葡糖淀粉酶是根霉属葡糖淀粉酶。

15.权利要求10的组合物，其中所述葡糖淀粉酶是木霉属、曲霉属、踝节菌属或腐质霉属葡糖淀粉酶。

16.权利要求10的组合物，其还包含选自下组的酶：蛋白酶、纤维素酶、支链淀粉酶、第二α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、及其组合。

17.一种水解颗粒淀粉的方法，其包括将含有颗粒淀粉的底物与权利要求1的组合物接触。

18.权利要求17的方法，其中所述底物是玉米、小麦、高粱、大麦、黑麦或其组合。

19.权利要求17的方法，其中孵育所述底物和组合物，其中孵育的温度和时间长度足以水解颗粒淀粉。

20.一种生产乙醇的方法，其包括将含有颗粒淀粉的底物和能将葡萄糖转化成乙醇的微生物与权利要求1的组合物一起孵育。

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