CN101969999B - 抗nogo‑66受体(ngr)的中和单克隆抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结合Nogo‑66的分离的蛋白，尤其是单克隆抗体。具体来说，这些抗体具有抑制Nogo‑66受体的天然配体的结合及中和Nogo‑66受体的能力。本发明的这些抗体或其部分可用于例如在患有疾病的人中检测NgR及抑制NgR活性，其中NgR或Nogo‑66活性在所述疾病中是有害的。

Description

抗NOGO-66受体(NGR)的中和单克隆抗体及其用途
本申请要求享有2006年11月21日提交的临时申请序列号60/860,256的优先权。
技术领域
本申请描述了Nogo-66受体结合蛋白，尤其是单克隆抗体，其能够结合Nogo-66受体并中和Nogo-66受体的功能。因此这些抗体可用于治疗数种疾病，包括但不限于哺乳动物脑外伤、脊髓损伤、中风、神经变性疾病和精神***症。
背景信息
损伤后哺乳动物中枢神经***(CNS)内的轴突再生通常是不可能的；其结果取决于CNS内神经纤维再生的固有能力与CNS内抑制因子的平衡，所述抑制因子集中在损伤部位的微环境中，主动防止再生从而阻止受损纤维束的再生。
已经证明由少突胶质细胞产生的CNS髓磷脂通过在体外及体内引起生长锥萎缩，是损伤早期轴突生长最相关的抑制(non-permissive)因子，其导致轴突生长的直接抑制(综述参见：Lee等人，2003)。直到最近才鉴定出CNS髓磷脂的主要抑制因子：少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白(OMgp)，髓磷脂相关糖蛋白(MAG)和Nogo-A(Domeniconi等人，2002；综述：Woolf& Bloechinger，2002；McGee & Strittmatter，2003；Lee等人，2003)。后一蛋白包含结构域Nogo-66(GrandPré等人，2000)，其行使主要抑制功能。有趣地是，所有3种抑制蛋白在CNS中都显示高表达水平，并与相同的神经元糖基化磷脂酰肌醇(GPI)部分锚定的受体(Nogo-66受体或NgR)相互作用(Fournier等人，2001)。Nogo-66受体(NgR)是473个氨基酸的糖基化磷脂酰肌醇连接蛋白。它由N末端信号序列，然后是8亮氨酸富集重复结构域、亮氨酸富集重复C端结构域(共同形成所谓的胞外域)和GPI锚定结构域组成。通过GPI锚，NgR与外部神经元质膜连接。
NgR自身属于3种CNS富集的GPI锚定蛋白(被称为NgR、NgR2和NgR3)的家族，具有约40％的序列同一性，但就整体结构组织来说非常类似(Barton等人2003；Lauren等人2003；Pignot等人2003)。尽管NgR是已知的唯一与多种髓磷脂相关抑制分子相互作用的成员，但最近显示MAG也与NgR2相互作用(Venkatesh等人2005)。NgR同系物的功能目前是未知的。NgR自身在啮齿类动物或小鸡发育的早期不表达，但在成年动物中显示高表达水平；NgR在大部分(如果不是全部)CNS区域中表达，包括脊髓(Hunt等人，2002a，b)。已经证明小鸡(Fournier等人，2001)、大鼠(Hunt等人，2002a)和小鼠(Wang等人，2002b)中mRNA和蛋白水平的脊髓表达。在成年CNS组织内，NgR蛋白在所有成熟的神经元(包括它们的轴突末梢)中表达。配体结合NgR起始胞内信号级联反应，其导致轴突生长抑制和生长锥萎缩。因为NgR不包含跨膜结构域，信号转导需要将NgR/配体相互作用信号转导入细胞的共受体。NgR信号转导的起始步骤是其与共受体p75或TROY的相互作用(Wong等人，2002；Shao等人，2005；Park等人，2005)。已经鉴定出第二共受体，被称为Lingo-1。只有NgR、P75或TROY与Lingo-1的三元复合物构成的才是功能性信号复合物(Mi等人，2004；Park等人，2005)。该信号转导的结果是肌动蛋白细胞骨架的重排。在神经元中，这种肌动蛋白细胞骨架的变化引起轴突生长的抑制及生长锥萎缩的诱导。
体外，来自NgR(-/-)小鼠的背根神经节细胞与Nogo66的结合能力较低，在生长锥萎缩分析中对Nogo66、Fc-MAG、OMgp或髓磷脂的抑制作用反应较弱(Kim等人，2004)。在部分或完全的脊髓损伤后，NgR(-/-)小鼠显示脑干束(brainstem tracts)再生的增加，所述脑干束包括红核脊髓束和中缝脊髓束(raphespinal tracts)。甚至在脊髓的完全实验性横切后，NgR(-/-)小鼠在旷场试验中显示增强的功能恢复。在脊髓的半切除及完全横切后，NgR(-/-)小鼠中的恢复显著好于纯合的(+/+)和杂合的同窝小鼠(Kim等人，2004)。
本申请描述了抗NgR的中和单克隆抗体的制备，该抗体选择性的竞争Nogo-66结合，并且被预期改善一些病症，在所述病症中NgR活性可能是有害的。本发明的中和单克隆抗体被预期例如促进受损CNS的神经元再生，尤其是在急性脊髓损伤、脑外伤或神经变性疾病(诸如，亨廷顿氏舞蹈病，帕金森氏病，阿尔茨海默氏病或多发性硬化)之后。
附图简述
图1a和1b：抗体mAb50和mAb51结合人和大鼠NgR。
图2：mAb50和mAb51与AP-Nogo66结合NgR-Fc的竞争。
图3：mAB50和mAB51与Nogo66结合HEK293f细胞上表达的人和大鼠NgR的竞争。
图4：mAB50和mAB51与NTera 2细胞的结合。
图5：NTera 2细胞团块中轴突生长的定量。
图6：hNgR的缺失突变体。
图7：MAG-Fc结合NgR-Fc的竞争。
图8：许可和抑制条件下的大鼠背根神经节神经元，及mAb50对Nogo66诱导的轴突生长抑制的中和。
图9：大鼠DRG细胞中mAB50和mAb51对Nogo66诱导的轴突生长抑制的中和。
序列表
SEQ ID NO.1A：人NGR蛋白
SEQ ID NO.1b：人NgR核苷酸
SEQ ID NO.2a：大鼠NgR蛋白
SEQ ID NO.2b：大鼠NgR核苷酸
SEQ ID NO.3：抗体克隆50VH
SEQ ID NO.4：抗体克隆50VL
SEQ ID NO.5：抗体克隆51VH
SEQ ID NO.6：抗体克隆51VL
SEQ ID NO.7a：AP-NOGO-66蛋白
SEQ ID NO.7b：AP-Nogo-66核苷酸
发明详述
本申请涉及与Nogo受体(NgR)相互作用的分离的结合蛋白，尤其是结合并中和人及大鼠NgR的中和单克隆抗体。这些抗体能够与Nogo-66竞争结合NgR。本申请的其他方面包括利用上述结合蛋白制备药物组合物的方法，及使用这种结合蛋白的方法。
抗体
本申请的主要实施方案包括分离的蛋白或多肽，它们特异性结合Nogo-66受体(NgR)的至少一个表位。术语“分离的蛋白”或“分离的多肽”是根据其起源或衍生来源与其天然状态伴随的天然结合组分不结合的蛋白多肽；基本上不含相同物种的其他蛋白；由不同物种的细胞表达；或在自然界不存在。因此，化学合成的或在不同于其天然来源的细胞的细胞***中合成的多肽将从其天然结合组分“分离”。利用本领域公知的蛋白纯化技术通过分离也可以使蛋白基本上不含天然的结合组分。本文使用的术语“多肽”是指氨基酸的任何聚合链。术语“肽”和“蛋白”与术语多肽可以互换使用，也表示氨基酸的聚合链。术语“多肽”包括天然或人工蛋白，蛋白片段及蛋白序列的多肽类似物。多肽可以是单体或聚合的。
特异性结合Nogo-66受体(NgR)的至少一个表位的分离的蛋白或多肽能够抑制配体与所述NgR的结合。Nogo-66受体(NgR)是473个氨基酸的糖基化磷脂酰肌醇连接蛋白。它由N末端信号序列，然后是8亮氨酸富集重复结构域、亮氨酸富集重复C端结构域(共同形成所谓的胞外域)和GPI锚定结构域组成。通过GPI锚，NgR与外部神经元质膜连接。本发明的蛋白优选的是与人NgR的至少一个表位结合的单克隆中和抗体或其抗原结合片段。Nogo-66是CNS髓磷脂的数种主要抑制因子之一，其诱导轴突生长的抑制并促进圆锥体生长的萎缩。
本文使用的术语“抗体”旨在表示由4条多肽链(由二硫键互连的两条重(H)链和两条轻(L)链)组成的免疫球蛋白分子。如果抗体能够与一种分子特异性反应从而使该分子与抗体结合，则该抗体被称为“能够结合”该分子。术语“表位”表示任意分子能够被抗体结合的部分，其也可被该抗体识别。表位或“抗原决定簇”通常由分子的化学活性表面基团(诸如氨基酸或糖侧链)组成，具有特定的三维结构特征及荷质比特性。
本文使用的术语抗体的“抗原结合片段”(或简单地“抗原片段”)是指抗体的一个或多个部分，它们分别保留特异性结合受体及活化或调节该受体的能力。已经证明抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段行使。术语抗体的“抗原结合部分”包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包括通过绞链区的二硫键连结的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，由抗体单臂的VL和VH结构域组成；(v)dAb片段(Ward等人(1989)Nature 341：544-546)，由VH结构域组成；和(vi)分离的CDR。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，但可以利用重组方法通过合成接头将它们连接，所述合成接头使VL和VH能够被制备为单个蛋白链，其中VL和VH区域配对形成被称为单链Fv(scFv)抗体的单价分子。(参见，例如，Bird等人(1988)Science 242：423-426；Huston等人(1988)Proceedings oftheNational Academy of Science USA 85：5879-5883.)这类scFv抗体还旨在被术语抗体的抗原结合部分包括。其他形式的单链抗体，诸如双体也被该术语包括。双体是二价的双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用的接头太短从而不允许所述两个结构域在相同链上配对，从而迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对，在相同受体上或跨越两个受体分子产生两个抗原结合位点。(参见，例如，Holliger等人(1993)Proceedings of the National Academy of ScienceUSA 90：6444-6448；Poljak等人(1994)Structure 2：1121-1123)。
本文使用的“单克隆抗体”旨在表示抗体分子的制剂，与包含不同抗体的混合物的“多克隆”抗体制剂不同，单克隆抗体具有共同的重链和共同的轻链氨基酸序列。单克隆抗体可以通过数种新技术产生，例如噬菌体、细菌、酵母或核糖体展示，以及典型方法诸如杂交瘤来源的抗体(例如，由杂交瘤技术制备的杂交瘤分泌的抗体，诸如标准的Kohler和Milstein杂交瘤方法((1975)Nature 256：495-497)。本发明的抗体是利用哺乳动物细胞系产生的NgR蛋白在小鼠中通过标准免疫/杂交瘤技术产生。
本文使用的“中和单克隆抗体”旨在表示一种抗体分子制剂，其在与特定抗原结合时能够竞争并抑制天然配体与所述抗原的结合。在本申请的特定情况下，本发明的中和抗体能够与Nogo66竞争结合NgR，并预防由Nogo66结合NgR引起的Nogo66生物活性或功能。
优选的，本申请的单克隆中和抗体是人抗体。术语“人抗体”是指具有对应于或源自人类的免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(例如，参见Kabat等人Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美国健康与社会服务部，NIH出版号91-3242，1991)。但是，本申请的人抗体可以在例如CDRs尤其是CDR3中包括不是由人类免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，在体外通过随机或位点特异性诱变或在体内通过体细胞突变引入突变)。本文使用的术语“CDR”是指抗体可变序列内的互补决定区。在重链和轻链的每个可变区内存在3个CDRs，在每个可变区中分别被称为CDR1、CDR2和CDR3。在不同的实施方案中，抗体是重组抗体或单克隆抗体。本申请最优选的中和抗体在本文中被称为mAb50和mAb51(ATCC号分别为PTA-8383和PTA-8384)。mAb50和mAb51抗体及功能性抗体片段，mAb50和mAb51相关抗体及功能性抗体片段，及与mAb50和mAb51具有相同特性(诸如结合NgR的高亲和力及低解离动力学和高中和能力)的其他抗体和功能性抗体片段被预期作为本发明的一部分。
本申请抗NgR抗体与免疫原性NgR多肽或其片段的结合亲和力和离解速率可以通过本领域已知的任何方法确定。例如，可以通过竞争性ELISAs、c RIAs、BIAcore或KinExA技术测量结合亲和力。还可以通过BIAcore或KinExA技术测量离解速率。利用例如BIAcore通过表面等离子体共振测量结合亲和力和离解速率。
本申请优选的抗体与mAB50抗体的序列具有至少90％的氨基酸序列同一性，所述mAB50抗体的序列包括重链可变区(VH区)(包含SEQ IDNO：3的序列)和轻链可变区(VL区)(包含SEQ ID NO：4的序列)。另一个优选的实施方案与mAB51抗体的序列具有至少90％的氨基酸序列同一性，所述mAB51抗体的序列包括重链可变区(VH区)(包含SEQ ID NO：5的序列)和轻链可变区(VL区)(包含SEQ ID NO：6的序列)。
优选的，mAb50和mAb51抗体与人NgR结合的EC50小于1×10-9M，更优选的所述抗体与NgR结合的EC50小于1×10-10，和最优选的所述抗体与NgR结合的EC50小于4×10-11M。
预期抗NgR抗体mAb50和mAb51结合各种形式的人NgR，包括pro-NgR、成熟的NgR和截短的NgR。抗体mAb50和mAb51不与其他NgR同系物(例如NgR2或NgR3)或其他包含LRR的蛋白特异性结合。但是，抗体mAb50和mAb51显示与其他种属NgR(尤其是啮齿类动物NgRs，更具体的是大鼠NgRs)的交叉反应。此外MAb52到62还与小鼠NgR交叉反应。例如，所述抗体结合大鼠NgR(两种抗体对大鼠NgR的IC50约为3×10-11M)。
还预期与本申请的(NgR)相互作用的分离的结合蛋白可以是糖基化结合蛋白，其中其抗体或抗原结合部分包括一个或多个碳水化合物残基。新生的体内蛋白生成可以经受进一步加工，被称为翻译后修饰。尤其是，可以通过酶法(称为糖基化的过程)添加糖(糖基)残基。获得的载有共价连接的寡糖侧链的蛋白被称为糖基化蛋白或糖蛋白。蛋白糖基化取决于目标蛋白的氨基酸序列，以及表达该蛋白的宿主细胞。不同的生物体可能产生不同的糖基化酶(例如，糖基转移酶和糖苷酶)，并提供不同的底物(核苷酸糖)。由于这类因素，蛋白糖基化模式及糖残基的组成将根据表达该特定蛋白的宿主***而不同。可用于本发明的糖残基可以包括，但不限于，葡萄糖，半乳糖，甘露糖，岩藻糖，n-乙酰葡糖胺和唾液酸。优选的糖基化结合蛋白包括使糖基化模式是人的糖残基。
本申请的抗体包括重链恒定区，诸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。此外，所述抗体可以包括轻链恒定区，κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。优选的，所述抗体包括κ轻链恒定区。可选择地，抗体部分可以是诸如Fab片段或单链Fv片段。用以改变抗体效应物功能的Fc部分氨基酸残基的替换是本领域已知的(Winter，等人美国专利号5,648,260；5,624,821)。抗体的Fc部分介导数种重要的效应物功能，诸如细胞因子诱导，ADCC，吞噬作用，补体依赖性细胞毒性(CDC)和及抗体和抗原抗体复合物的半衰期/清除率。一些情况下这些效应物功能是治疗性抗体需要的，但在其它情况下可能不是必需的或甚至是有害的，这取决于治疗目的。某些人IgG同种型，尤其是IgG1和IgG3，分别通过结合FcγRs和补体C1q来介导ADCC和CDC。新生的Fc受体(FcRn)是决定抗体循环半衰期的关键组分。仍在另一个实施方案中，至少一个氨基酸残基在抗体的恒定区(诸如抗体的Fc区)被取代，这样的话该抗体的效应物功能被改变。
重组蛋白的产生
为了进行免疫和ELISA分析，以及轴突生长分析(在“实施例”部分描述)，制备可溶性重组人和大鼠NgR′s。此外，制备与碱性磷酸酶标签融合的配体Nogo66(AP-Nogo66)，其在轴突生长分析中作为抑制因子，而在ELISA和FACS研究(也在“实施例”部分描述)中作为配体。
人和大鼠NgR
人NgR蛋白基于登录号AAG53612。将蛋白DNA(氨基酸27到450)克隆入pSec载体(Ambion)，并通过CHO-K1细胞中的稳定表达产生该蛋白。根据SEQ ID No.1：人NgR蛋白和SEQ ID NO.1b：人NgR核苷酸，表达的受体由完整蛋白的424个氨基酸(氨基酸27到450)组成，在C末端偶联Myc和6×His标签。人secNgR 27-450aa D6CHO-K1细胞在8个40小室的细胞工厂(cell factories)中培养直至融合(大约5天)，每个细胞工厂含5000ml UltraCHO无血清培养基(Cambrex Bio Science)。然后离心40升上清，并用Hemoflow F柱(FreseniusMedical Care)浓缩至500ml。在-80℃冷冻浓缩物。为了进行蛋白纯化，浓缩的蛋白上清用500ml 20mM NaH2PO4；140mM NaCl；pH 7.4补足到1000ml，然后再次浓缩到300ml。再重复一次浓缩步骤，最终向该浓缩物中添加300ml 20mM NaH2PO4；140mM NaCl；pH 7.4。向50ml Ni-NTA-Superflow Fa.(Qiagen catalog #30430)(用20mM NaH2PO4；300mM NaCl；pH 8.0平衡)中添加600ml浓缩物，6℃搅拌1小时，6℃静置，丢弃上清，将Ni-NTA珠子填充到柱中。室温下用10个柱体积(CV)的20mM NaH2PO4；300mMNaCl；pH 8.0洗涤柱，然后用5-10个柱体积的20mM NaH2PO4；300mMNaCl；10mM咪唑；pH 8.0洗涤。用20mM NaH2PO4；300mM NaCl；100mM咪唑；pH 8.0洗脱柱，并收集UV-280nm的活性峰。随后将洗脱物在6℃用5L 25mM Tris/HCl；pH7.0透析过夜，然后在室温下将透析液上样到Q-Sepharose柱(柱大小1.6cm×3cm；体积6ml；AmershamBiosciences目录#_17-0510-01)。缓冲液A是50mM Tris/HCl；pH 7.0。缓冲液B是50mM Tris/HCl；1M NaCl；pH 7.0，流速为2ml/min。梯度是0％B维持5个柱体积；0-50％B为12个柱体积；50-100％B为2个柱体积；100％B维持5个柱体积。所述组分大小是2.5ml。随后，将所述组分在SDS-PAGE上分析，根据它们在SDS-page上的大小和纯度合并所述组分(对高糖基化的NgR-His来说是最高的NgR-His纯度；对低糖基化的NgR-His来说也是最高的NgR-His纯度)。将合并的组分在6℃的12-14kDa透析管中用20mM NaH2PO4；140mM NaCl；pH 7.4再透析一次，所述组分经过0.2μm无菌滤器过滤，并在6℃保存以便以后使用。为了长时间保存，将受体组分等分，保存于-80℃。
将大鼠NgR DNA(登录号AAM46772)克隆入pcDNA3.1(Invitrogen)，并在HEK293F细胞的瞬时表达***中表达和制备。蛋白包含与6×His标签偶联的氨基酸27到450，如SEQ IDNO.2a：大鼠NgR蛋白和SEQ ID NO.2b：大鼠NgR核苷酸所示。通过在HEK293F细胞中标准瞬时表达48-72小时来制备大鼠蛋白。收集细胞上清，按照如上所述用于人蛋白的类似步骤纯化蛋白。在一些实验中使用来自R&D Systems的蛋白。这些蛋白包括人重组NgR/Fc嵌合体(产品目录号1208-NG)和重组小鼠Nogo受体/Fc嵌合体(产品目录号1440-NG)。
NgR的细胞表面表达
为了在细胞表面表达NgR，将包括氨基酸1到473的完整开放阅读框的全长受体序列(分别为大鼠AAM46772和人AAG53612)克隆入pcDNA4。按照标准步骤将质粒转染CHO-K1或HEK293细胞。简单来说，将细胞种入含MEM培养基的培养皿，按照制造商的指示用Fugene6(Roche)转染。利用150μg/ml Zeozin筛选2-3周，并通过FACS验证蛋白表达(参见下面的实施例4)。
为了在HEK293F细胞中瞬时表达，按照制造商的指示(Invitrogen；Free StyleSystem)在悬浮液中转染细胞，48到72小时后收集细胞用于FACS研究(参见实施例部分)。
AP-Nogo66的制备
按标准条件制备AP-Nogo66(SEQ ID NO.7a和SEQ ID NO.7b)。简单来说，将Nogo66克隆入pAPTag5载体，用所述构建体转染HEK293细胞，并用RPMI Glutamax+10％FCS，150μg/ml Zeocin筛选。为了制备蛋白，将HEK293细胞在六个10室细胞工厂(cell factories)直至融合(大约3天)，每个细胞工厂含1200ml RPMI(Invitrogen)加10％FCS。然后弃去上清，每个细胞工厂中添加1200ml Pro293a-CDM(Cambrex BioScience)。将细胞继续培养3天。然后离心7200ml上清，并用HemoflowF柱(Fresenius Medical Care)浓缩至350ml。在添加1mMPefablocSC(ROCHE)后将浓缩物等分，-80℃冷冻。
抗体和抗体生成细胞系的制备
可以通过免疫合适的宿主(例如，脊椎动物，包括人，小鼠，大鼠，绵羊，山羊，猪，牛，马，爬行动物，鱼，两栖动物，及鸟、爬行动物和鱼的卵)产生本申请的抗体。这种抗体可以是多克隆或单克隆的。为了产生本申请的抗体，用本发明的免疫原性NgR多肽或其片段免疫宿主。术语“免疫”在本文中是指将抗原呈递给免疫***全部(immunerepertoire)的过程，不管所述免疫***全部是存在于天然的遗传未改变的生物还是存在于转基因生物中，包括那些被改造显示人工的人类免疫***全部的转基因生物。类似地，“免疫原性制剂”是包含佐剂或其他添加剂的抗原制剂，所述佐剂或其他添加剂将增强该抗原的免疫原性。
可以利用本领域已知的任何方法免疫动物。参见，例如，Harlow andLane，Antibodies：A Laboratory Manual，New York：Cold Spring HarborPress，1990。用于免疫非人动物诸如小鼠，大鼠，绵羊，山羊，猪，牛和马的方法是本领域公知的。参见，例如，Harlow和Lane及美国专利号5,994,619。在一个优选的实施方案中，施用含佐剂的NgR抗原以刺激免疫应答。这类佐剂包括弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂，RIBI(胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激复合物)。这类佐剂可以通过将多肽在局部汇集以防止其快速扩散，或它们包含刺激宿主分泌因子的物质，所述因子对巨噬细胞及免疫***的其他组分具有趋化性。优选的，如果多肽正在施用，免疫接种程序表将涉及所述多肽的两次或更多次施用，持续数周。
预期用与完整的或破裂细胞的细胞膜结合的NgR免疫动物寄主，并通过结合本发明的免疫原性NgR多肽来鉴定本申请的抗体。
在用NgR抗原免疫动物宿主后，可以从该动物获得抗体和/或抗体生成细胞。通过给动物放血或处死动物获得包含抗NgR抗体的血清。当从动物获得后就可以使用血清，免疫球蛋白组分可以获自血清，或可以从血清纯化抗NgR抗体。以这种方式获得的血清或免疫球蛋白是多克隆的，因此具有异质阵列的性质。
抗体生成细胞系
本申请还描述了永生化的抗体生成杂交瘤，其可以从被免疫的动物制备。优选的，被免疫的动物是表达人免疫球蛋白基因的非人动物，其脾B细胞与来自非人动物的相同种属的骨髓瘤融合。
免疫后，处死动物，按照本领域公知的技术将脾B细胞与永生化的骨髓瘤细胞融合。参见，例如，Harlow和Lane，上文。优选的，骨髓瘤细胞不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌细胞系)。在融合和抗生素选择后，利用NgR或其一部分或表达NgR的细胞筛选杂交瘤。优选的，利用酶联免疫分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)进行初次筛选，优选的利用ELISA(实施例部分提供ELISA筛选的实例)。
挑选抗NgR抗体生成杂交瘤，将其克隆并进一步筛选需要的特性，包括稳健的杂交瘤生长，高抗体生成和下文描述的需要的抗体特性。可以培养杂交瘤，并在同基因动物或缺乏免疫***的动物(诸如裸鼠)中体内扩增或在细胞培养物中体外扩增。筛选、克隆和扩增杂交瘤的方法是本领域普通技术人员公知的。在一个优选的实施方案中，杂交瘤是如上所述的小鼠杂交瘤。在另一个优选的实施方案中，在非人、非小鼠种属诸如大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马中制备杂交瘤。在另一个实施方案中，杂交瘤是人杂交瘤，其中非分泌的人骨髓瘤与表达抗NgR抗体的人细胞融合。
本申请还描述了利用本领域称为筛选淋巴细胞抗体法(SLAM)从分离的单个淋巴细胞产生的重组抗体，所述SLAM描述于美国专利号5,627,052，PCT公开号WO 92/02551和Babcock，J.S.等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：7843-7848。在该方法中，利用抗原特异性的溶血斑分析筛选分泌感兴趣抗体的单个细胞，例如来自任何免疫动物的淋巴细胞，其中利用接头诸如生物素将抗原NgR或其片段与绵羊红细胞偶联，用于鉴定分泌对NgR特异的抗体的单个细胞。在鉴定感兴趣的抗体分泌细胞后，通过逆转录酶-PCR从细胞回收重链和轻链可变区cDNAs，然后可以在哺乳动物宿主细胞诸如COS或CHO细胞中合适的免疫球蛋白恒定区(例如，人恒定区)环境下表达这些可变区。进一步在体外分析和筛选用扩增的免疫球蛋白序列(来自体内筛选的淋巴细胞)转染的宿主细胞，例如通过筛选转染细胞以分离表达抗NgR抗体的细胞。
体外产生的抗体
体外方法也可用于制备本申请描述的抗体，其中筛选抗体文库以鉴定具有所需结合特异性的抗体。用于重组抗体文库的这类筛选方法是本领域公知的。
所述重组抗体文库可以来自于用NgR或NgR的一部分免疫的个体。可选择地，所述重组抗体文库可以来自于未免疫的个体，即，没有用NgR免疫，诸如来自没有接受人NgR免疫的人个体的人抗体文库。通过用包括人NgR(例如，对应于hNgR的一部分的肽)的肽筛选重组抗体文库进而挑选出识别NgR的抗体，以挑选本申请的抗体。进行这类筛选和挑选的方法是本领域公知的，诸如前面章节的参考文献所述。为了挑选对hNgR具有特定结合亲和力的本申请的抗体(诸如以特定koff速率常数(rate constant)与人NgR解离的抗体)，可以使用本领域已知的表面等离子体共振法来挑选具有所需koff速率常数的抗体。为了挑选对hNgR具体中和活性的本申请的抗体(诸如具有特定IC50的抗体)，可以使用本领域已知的标准方法来检测hNgR活性的抑制。
抗体的特性
本申请的mAB50和mAB51或其抗原结合部分，结合人NgR，并且与人NgR解离的koff速率常数为约0.1s-1或更低，优选的1×10-2s-1或更低，更优选的1×10-3s-1或更低，甚至更优选的1×10-4s-1或更低，最优选的1×10-5s-1或更低(通过表面等离子体共振测定)。本文使用的“表面等离子体共振”是指一种光学现象，该光学现象例如利用BIAcore***(PharmaciaBiosensor AB，Uppsala，Sweden and Piscataway，NJ)，通过检测生物传感器基质内蛋白浓度的变化来分析实时的生物特异性相互作用。进一步的描述可以参见U.，等人(1993)Ann.Biol.Clin.51：19-26；U.，等人(1991)Biotechniques 11：620-627；Johnsson，B.，等人(1995)J.Mol.Recognit.8：125-131；和Johnnson，B.，等人(1991)Anal.Biochem.198：268-277。
表1.个体的Biacore动力学速率参数
(抗原：hNgR-Fc嵌合体)
捕获的抗体 同种型 结合速率常数(On-rate)(M-1s-1) 解离速率常数(Off-rate)(s-1) Kd(M)
mAb50 IgG2a，k 3.51×105 4.97×10-5 1.41×10-10
mAb51 IgG2a，k 5.44×105 5.88×10-5 1.08×10-10
本文使用的术语“Kon”旨在表示如本领域已知的抗体与抗原结合以形成抗体/抗原复合物的结合速率常数(on rate constant)。
本文使用的术语“Koff”旨在表示如本领域已知的抗体与抗体/抗原复合物解离的解离速率常数(off rate constant)。本文使用的术语“Kd”旨在表示本领域已知的特定抗体-抗原相互作用的解离常数。
可选择地，本申请的抗体mAb50和mAb51，或其抗原结合部分，抑制人NgR活性的IC50为约1×10-6M或更低，优选的1×10-7M或更低，优选的1×10-8M或更低，更优选的1×10-9M或更低，更优选的1×10-10M或更低，和最优选的1×10-11M或更低。本文使用的术语IC50旨在表示与配体Nogo66竞争结合NgR的抗体的浓度。
融合抗体和免疫粘附素
本申请还描述了融合抗体或免疫粘附素，其可以被制备成包括与另一多肽连接的本申请抗Nogo受体-1抗体的全部或一部分。在一些实施方案中，只有抗Nogo受体-1抗体的可变区与多肽连接。在其他实施方案中，本申请的抗Nogo受体-1抗体的VH结构域与第一多肽连接，而该抗体的VL结构域与第二多肽连接，所述第二多肽与第一多肽结合从而允许VH和VL结构域彼此相互作用以形成抗体结合位点。在其他实施方案中，VH结构域与VL结构域被接头分离，该接头允许VH和VL结构域彼此相互作用(参见下文的单链抗体(Single ChainAntibodies))。然后将VH-接头-VL抗体与感兴趣的多肽连接。该融合抗体用于将多肽定向到表达Nogo受体-1配体的细胞或组织。感兴趣的多肽可以是治疗剂，诸如毒素，或可以是诊断剂，诸如酶；还可以是容易显影的，诸如辣根过氧化物酶。此外，通过两个(或更多个)单链抗体彼此连接可以产生融合抗体。这适用于以下情况：如果需要在单条多肽链上产生二价或多价抗体，或如果需要产生双特异性抗体。
一个实施方案提供一种标记的结合蛋白，其中本申请的抗体或抗体部分衍生出或连接有另一个功能分子(例如，另一个肽或蛋白)。例如，本申请的标记结合蛋白可以通过以下方法产生：将本申请的抗体或抗体部分功能性连接到(通过化学偶联，基因融合，非共价结合或相反)到一种或者多种其他分子实体，诸如核酸，另一个抗体(例如，双特异性抗体或一种双价抗体(diabody))，可检测的试剂，细胞毒性剂，药物试剂，和/或可以调节所述抗体或抗体部分与另一分子(诸如链霉亲和素核心区或多聚组氨酸标签)结合的蛋白或肽。
本申请的抗体或抗体部分可以衍生出的有效可检测试剂包括荧光化合物。示例性的荧光可检测试剂包括荧光素，异硫氰酸荧光素，若丹明，5-二甲胺-1-萘磺酰氯，藻红蛋白等等。抗体也可以衍生有可检测的酶，诸如碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，葡萄糖氧化酶等等。当抗体衍生有可检测的酶时，通过添加其他试剂(酶利用其产生可检测的反应产物)检测该酶。例如，当存在可检测的试剂辣根过氧化物酶时，添加过氧化氢和二氨基联苯胺导致可检测的显色反应产物。抗体还可以衍生有核酸、生物素，并通过抗生物素蛋白或链霉亲和素结合的间接测量进行检测。
本申请的另一个实施方案提供结晶的结合蛋白。本文使用的术语“结晶的”是指以晶体形式存在的抗体或其抗原结合部分。晶体是物质的固体形式，其不同于其他形式诸如无定形固态或液晶态。晶体由原子、离子、分子(例如，蛋白诸如抗体)或分子组合(例如，抗原/抗体复合物)的规则、重复三维排列组成。这些三维排列按照本领域公知的特定数学关系进行排列。晶体中重复的基本单位或结构单元被称为不对称单位。排列(符合指定的、明确定义的晶体学对称)中不对称单位的重复提供晶体的“晶胞”。晶胞通过规则平移在全部三维空间的重复提供晶体。参见Giege，R.and Ducruix，A.Barrett，Crystallization ofNucleic Acids andProteins，a Practical Approach，2nd ea.，pp.20 1-16，OxfordUniversityPress，New York，New York，(1999)。
优选的本申请描述了本文所述完整的抗NgR抗体及其片段的晶体，以及包括这种晶体的制剂和组合物。在一个实施方案中，结晶的结合蛋白比该结合蛋白的可溶性对应物具有更长的体内半衰期。在另一个实施方案中，结合蛋白在结晶后保留生物活性。
本发明的结晶结合蛋白可以通过本领域已知的方法制备。
单链抗体
本申请包括结合本发明的免疫原性NgR的单链抗体(scFv)。为了制备scFv，将VH-和V-编码DNA可操作的连接到编码柔性接头的DNA，例如编码氨基酸序列(G1Y4-Ser)，这样的话VH和VL序列可以被表达为邻接的单链蛋白，其中VL和VH区域通过柔性接头连接(参见例如，Bird等人(1988)Science 242：423-426；Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883；McCafferty等人，30 Nature(1990)348：552-554)。如果只使用单个VH和VL，则该单链抗体可以是单价的；如果使用两个VH和VL，则其是二价的；或如果使用超过两个VH和VL，则其是多价的。
嵌合抗体
本申请还包括双特异性抗体或其抗原结合片段，其中一种特异性是针对本申请的免疫原性Nogo受体-1多肽。例如，可以产生嵌合抗体，其通过一个结合结构域与本发明的免疫原性NgR多肽特异性结合，通过第二结合结构域与第二分子特异性结合。术语“嵌合抗体”表示包括来自一个物种的重链和轻链可变区序列及来自另一个物种的恒定区序列的抗体，诸如具有与人恒定区连接的小鼠重链和轻链可变区的抗体。嵌合抗体可以通过重组分子生物技术产生，或可以物理上偶联。此外，可以产生包含超过一个VH和VL的单链抗体，该抗体特异性结合本发明的免疫原性多肽和另一个分子，所述分子与减弱的髓磷脂介导生长锥萎缩及轴突生长和萌芽的抑制有关。可以利用公知的技术例如Fanger等人Immunol Methods4：72-81(1994)和Wright and Harris，20(上文)产生这种双特异性抗体。在一些实施方案中，利用本发明抗体的一个或多个可变区制备嵌合抗体。在另一个实施方案中，利用所述抗体的一个或多个CDR区制备嵌合抗体。术语“人源化抗体”是指包括非人物种(例如，小鼠)的重链和轻链可变区序列的抗体，但其中至少一部分VH和/或VL序列被改变的更“像人”，即，更类似于人类种系的可变序列。一类人源化抗体是CDR移植抗体，其中将人CDR序列引入非人VH和VL序列以取代相应的非人CDR序列。
人源化抗体
人源化抗体是结合目标抗原的非人物种的抗体分子，其具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDRs)及来自人免疫球蛋白分子的骨架区。已知的人Ig序列是本领域公知的。这类输入的序列可用于降低免疫原性，或降低、增强或改变结合、亲和力、结合率、离解率、亲合力(avidity)、特异性、半衰期或任何其他相应的特性，这些都是本领域已知的。
人骨架区的骨架残基可以用来自CDR供体抗体的对应残基替换，以改变(优选的提高)抗原结合。这些骨架替换可以利用本领域公知的方法鉴定，例如，通过对CDR和骨架残基的相互作用建模，以鉴定对于抗原结合重要的骨架残基，并进行序列比较以鉴定特定位置的罕见骨架残基。(参见，例如，Queen等人，美国专利号5,585,089；Riechmann等人，Nature332：323(1988)，其在此完整引入作为参考。)通常提供有三维免疫球蛋白模型，并且其被本领域技术人员所熟知。可以获得计算机程序，其说明和展示挑选的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构。对这些展示的检查可以分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合能力的残基。采用这种方法，可以选择FR残基并与共有的输入序列组合，这样的话就可以实现需要的抗体特性，例如对靶抗原增加的亲和力。通常，CDR残基直接并且最实质地参与影响抗原结合。可以利用本领域已知的各种技术将抗体人源化，诸如但不限于以下描述：Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.151：2623(1993)，Padlan，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等人，ProteinEngineering 7(6)：805-814(1994)；Roguska.等人，PNAS 91：969-973(1994)。
衍生和标记的抗体
本申请的抗体或抗原结合片段可以衍生出或连接有另一个功能分子(例如，另一个肽或蛋白)。通常，抗体或抗原结合片段的衍生不会因为所述衍生或标记而对与本发明免疫原性多肽的结合产生不利影响。
例如，可以将本申请的抗体或抗体部分功能性连结(通过化学偶联，基因融合，非共价结合或者相反)到一个或多个其他分子实体，比如另一个抗体(例如，双特异性抗体或双价抗体)，检测剂，细胞毒性剂，药物试剂，和/或可以调节所述抗体或抗原结合片段与另一个分子(诸如链霉亲和素核心区或多聚组氨酸标签)结合的蛋白或肽。此外，抗体或其抗原结合部分可以是更大的免疫免疫粘附素分子的一部分，由所述抗体或抗体部分与一个或多个其他或不同的蛋白或肽的共价或非共价结合形成。这种免疫粘附素分子的实例包括使用链霉亲和素核心区制备四聚体的scFv(Kipriyanov等人(1995)Human Antibodies andHybridomas6：93-101)及使用半胱氨酸残基、标记物肽和C端多聚组氨酸标签制备二价和生物素化的scFv分子(Kipriyanov等人(1994)MolecularImmunology 31：1047-1058)。可以利用常规技术，诸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶分别消化完整的抗体，来制备抗体部分，诸如Fab和F(ab′)2片段。此外，可以利用标准重组DNA技术获得抗体、抗体部分和免疫粘附素分子。
可以通过交联两个或更多个抗体(相同类型或不同类型的，例如，以产生双特异性抗体)来制备衍生抗体。合适的交联剂包括那些异型双功能的，具有被合适的间隔物(例如间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)分隔的两个不同活性基团，或是同型双功能的(例如，辛二酸二琥珀酰亚胺酯)。这种接头由Pierce Chemical Company，Rockford，III提供。
衍生抗体也可以是标记抗体。例如，从本发明抗体或抗体部分衍生出的检测剂是荧光化合物，包括荧光素，异硫氰酸荧光素，若丹明，5-二甲胺-1-萘磺酰氯，藻红蛋白，镧系荧光体等等。抗体还可以用酶(用于检测)标记，诸如辣根过氧化物酶，半乳糖苷酶，荧光素酶，碱性磷酸酶，葡糖氧化酶等等。在用可检测的酶标记的实施方案中，通过添加其他试剂(酶利用其产生可检测的反应产物)检测该抗体。例如，辣根过氧化物酶与过氧化氢和二氨基联苯胺。抗体还可以用生物素标记，并通过抗生物素蛋白或链霉亲和素结合的间接测量进行检测。抗体还可以标记有预先确定的多肽表位，该多肽表位被第二报告分子识别(例如，亮氨酸拉链配对序列，第二抗体的结合位点，金属结合结构域，表位：标签)。抗Nogo受体-1抗体或其抗原片段也可以标记有放射性标记的氨基酸。该放射性标记可用于诊断和治疗两种目的。放射性标记的抗Nogo受体-1抗体可用于诊断，例如用于确定个体的Nogo受体-1水平。此外，放射性标记的抗Nogo受体-1抗体可以治疗性的用于治疗脊髓损伤。
多肽的标记物的实例包括，但不限于，下列放射性同位素或放射性核苷酸15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho、153Sm。抗Nogo受体-1抗体或其抗原片段还可以衍生有化学基团诸如聚乙二醇(PEG)，甲基或乙基，或碳水化合物基团。这些基团可用于改进抗体的生物学特性，例如，延长血清半衰期或增强组织结合。此外，多肽的标记物可以包括核酸，例如用于PCR检测或增强基因表达的DNA，或在载有NgR的细胞或组织中抑制基因表达的siRNA。
可以通过本领域已知的任何方法确定抗Nogo受体-1抗体的类型和亚类。通常，利用对抗体的特定类型和亚类特异的抗体来确定抗体的类型和亚类。这类抗体是商品化提供的。可以通过ELISA、Western Blot以及其他技术确定类型和亚类。可选择地，可以通过如下方法确定类型和亚类：对抗体重链和/或轻链恒定区的全部或一部分测序，将它们的氨基酸序列与各种类型和亚类的免疫球蛋白的已知氨基酸序列进行比较，确定该抗体的类型和亚类。
抗NgR抗体对NgR活性的抑制
本申请的抗Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段，抑制配体与NgR的结合。可以利用本领域已知的任何方法，例如ELISA、RIA或功能性拮抗作用测量这种抑制的IC50。IC50可以在0.01到100nM之间变化。优选的，IC50在1到10nM之间。更优选的，本发明的抗Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段的IC50在0.1nM到1nM之间。最优选的，IC50低于0.1nM。
双可变域抗体
本文使用的双可变域(DVD)结合蛋白是包括两个或更多个抗原结合位点的结合蛋白，并且它们是四价或多价结合蛋白。术语“多价结合蛋白”在本说明书中使用时表示包括两个或更多个抗原结合位点的结合蛋白。多价结合蛋白优选的被改造为具有3个或更多个抗原结合位点，其通常不是天然存在的抗体。术语“多特异性结合蛋白”是指能够结合两个或更多个相关或无关靶的结合蛋白。这种DVDs可以是单特异性的(即能够结合一种抗原)或多特异性的(即能够结合两种或更多种抗原)。包括两条重链DVD多肽和两条轻链DVD多肽的DVD结合蛋白被称为DVD Ig。DVD Ig的每一半包括一条重链DVD多肽，一条轻链DVD多肽和两个抗原结合位点。每个结合位点包括一个重链可变域和一个轻链可变域，每个抗原结合位点总共有6个CDRs参与抗原结合。DVD结合蛋白及制备DVD结合蛋白的方法公开于美国专利申请号11/507,050，其在此引入作为参考。本发明旨在包括能够结合NgR的含有DVD结合蛋白的结合蛋白。优选的DVD结合蛋白能够结合NgR和第二靶标。所述第二靶标选自斥性导向分子(repulsive guidance molecule，RGM)、Nogo-A、MAG、OMgp、CSPG。CSPG可以选自聚集蛋白聚糖，短蛋白聚糖，多功能蛋白聚糖，神经蛋白聚糖，磷酸聚糖或Te38。因此，这些实例包括meylin来源的抑制剂，以及NgR的已知神经元共受体。
双特异性抗体
本申请还描述了“双特异性抗体”技术。双特异性抗体可以作为激动剂，拮抗剂，或在不同的组合中作为激动剂和拮抗剂。本文使用的术语“激动剂”是指与不存在激动剂时观察到的活性或功能相比，当接触感兴趣的分子时引起所述分子的某一活性或功能大小增加的调节剂。本文使用的术语“拮抗剂”或“抑制剂”是指与不存在拮抗剂时观察到的活性或功能相比，当接触感兴趣的分子时引起所述分子的某一活性或功能大小降低的调节剂。具体的感兴趣的拮抗剂包括那些阻断或调节Nogo-66生物活性的拮抗剂。Nogo-66的拮抗剂和抑制剂可能包括，但不限于任何分子，优选的是与Nogo-66受体(NgR)相互作用的单克隆抗体。
应当注意到与NgR的相互作用可能导致受体或其他配体/细胞膜组分的结合和中和，从而可用于抗多种疾病的加强或协同功能。
本申请还描述了与NgR共受体(像NgR和p75，NgR和TROY，NgR和LINGO-1)结合的NgR抗体。本申请还包括在NgR和其配体及NgR和髓磷脂来源的抑制因子之间交叉反应的抗体。这些可以在NgR和RGM(repulsive guidance molecule)、NGR和Nogo-A、NGR和MAG、NgR和OMpg、NgR和CSPG之间交叉反应的抗体。CSPG可以选自聚集蛋白聚糖，短蛋白聚糖，多功能蛋白聚糖，神经蛋白聚糖，磷酸聚糖或Te38。因此，这些实例包括meylin来源的抑制剂，以及NgR的已知神经元共受体。
本申请还描述了NgR和生长因子受体之间的双特异性抗体，包括但不限于，神经生长因子(NGF)，脑源性神经营养因子(BDNF)，表皮生长因子(EGF)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，神经营养素，血小板衍生生长因子(PDGF)，红细胞生成素(EPO)，促血小板生成素(TPO)，筒箭毒碱(GDF-8)，生长分化因子-9(GDF9)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF或FGF2)，神经胶质源性神经营养性因子(GDNF)，睫状神经营养性因子(CNTF)。
抗体的用途
考虑到本申请的中和抗体或其部分结合人NgR的能力，它们可以在常规免疫分析(诸如酶联免疫吸附(ELISA)、放射免疫分析(RIA)或组织免疫组织化学)中用于检测人NgR(例如，在生物样品中，诸如血清或血浆)。本申请提供一种检测生物样品中人NgR的方法，包括将生物样品与本发明的抗体或抗体部分接触，并检测结合人NgR的抗体(或抗体部分)或未结合的抗体(或抗体部分)，从而检测所述生物样品中的人NgR。所述抗体用可检测的物质直接或间接地标记，从而有利于结合或未结合抗体的检测。合适的可检测物质包括各种酶，辅基，荧光物质，发光物质和放射性物质。合适酶的实例包括辣根过氧化酶，碱性磷酸酶，beta-半乳糖苷酶，或乙酰胆碱酯酶；合适辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适荧光物质的实例包括伞形酮，荧光素，异硫氰酸荧光素，若丹明，二氯三嗪基胺荧光素，丹磺酰氯或者藻红蛋白；发光物质的实例包括氨基苯二酰肼；和合适放射性物质的实例包括3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho、153Sm。
优选的本申请的抗体和抗体部分在体外和体内均能够中和人NgR活性。因此，本发明的这类抗体和抗体部分可用于抑制Nogo-66结合NgR或其引起的活性。
在另一个实施方案中，本申请提供一种降低个体中Nogo-66活性或NgR活性的方法，有利地个体患有的疾病或病症中NgR产生的活性是有害的。本申请提供降低患有这类疾病或病症的个体中NgR活性的方法，所述方法包括给个体施用本申请的抗体或抗体部分，这样的话所述个体中NgR活性被降低。优选的，所述NgR是人的，所述个体是人类个体。此外，所述个体可以是表达能够结合本发明抗体的NgR的哺乳动物。此外，所述个体可以是已经导入NgR的哺乳动物。为了治疗目的可以将本申请的抗体给人类个体施用。此外，为了兽医学目的或作为人类疾病的动物模型，可以将本申请的抗体给表达能够结合所述抗体的NgR的非人哺乳动物施用。对于后者，这种动物模型可用于评价本发明抗体的治疗效果(例如，剂量和施用时程的试验)。
本文使用的术语“NgR活性是有害的病症”旨在包括以下疾病和其他病症：患有所述病症的个体中NgR的存在或其引起的活性已经被证明或被怀疑导致所述病症的病理生理学或是导致所述病症恶化的因素。因此，NgR活性是有害的病症是如下所述的病症，其中预期NgR活性的降低将缓解所述病症的症状和/或延缓其进展。可以用本发明抗体治疗的病症的非限制性实例包括下面关于本发明抗体的药物组合物的部分描述的那些病症。
已经证明NgR在与各种疾病有关的病理学中起着重要作用，所述疾病涉及与神经变性或神经再生过程的抑制有关的神经疾病，导致瘫痪。该疾病包括肌萎缩侧索硬化，臂丛损伤，脑损伤，包括外伤性脑损伤，脑瘫，脊髓小脑性共济失调，Guillain-Barré综合征，脑白质营养不良症，多发性硬化，脊髓灰质炎后(Post Polio)，脊柱裂，脊髓损伤，棘肌萎缩，脊柱瘤，中风，横贯性脊髓炎。此外，已经证明NgR在以下疾病中起作用：痴呆，老年性痴呆，轻度认知受损，阿尔茨海默尔相关痴呆，亨廷顿氏舞蹈病，迟发性运动障碍，痉挛，躁狂症，帕金森氏病，唐氏综合征，重症肌无力。
NgR及其配体也可能参与涉及已知炎性元件的炎性或自身免疫性疾病的产生和发展(Teng & Tang，2005；Fontoura & Steinmann，2006)。这些疾病包括，但不限于风湿性关节炎，骨关节炎，青少年慢性关节炎，脓毒性关节炎，莱姆关节炎，牛皮癣关节炎，反应性关节炎，脊椎关节病，全身性红斑狼疮，克罗恩氏病，溃疡性结肠炎，炎症性肠病，胰岛素依赖型糖尿病，甲状腺炎，哮喘，变应性疾病，银屑病，皮炎硬皮病，移植抗宿主病，器官移植排斥，与器官移植有关的急性或慢性免疫病，结节病，动脉粥样硬化，弥漫性血管内凝血，川崎氏病，格雷夫氏病，肾病综合征，慢性疲劳综合征，眶坏死性肉芽肿病，过敏性紫癜(Henoch-Schoenlein purpurea)，肾微型血管炎，慢性活动型肝炎，葡萄膜炎，脓毒性休克，中毒性休克综合征，败血综合征，恶病质，传染性疾病，寄生虫疾病，获得性免疫缺乏综合症，急性横贯性脊髓炎，亨廷顿氏舞蹈病，帕金森氏病，阿尔茨海默氏病，中风，原发性胆汁性肝硬化，溶血性贫血，恶性肿瘤，心力衰竭，心肌梗死，艾迪生氏病，散发性I型多腺缺陷和II型多腺缺陷，施密特氏综合征，成年(急性)呼吸窘迫综合征，脱发，斑形脱发，血清阴性关节病，关节病，莱特尔氏病，牛皮癣关节病，溃疡性结肠炎关节病，肠病滑膜炎，与衣原体、耶尔森氏菌和沙门氏菌有关的关节病，脊椎关节病，动脉粥样化病/动脉硬化，特应性***反应，自身免疫性大疱病，寻常天疱疮，落叶型天疱疮，类天疱疮，线状IgA病，自身免疫性溶血贫血症，Coombs阳性溶血贫血症，获得性恶性贫血，青少年恶性贫血，肌痛脑炎/Royal FreeDisease，慢性皮肤粘膜念珠菌病，巨细胞性动脉炎，原发硬化性肝炎，隐原性自身免疫性肝炎，获得性免疫缺陷病综合征，获得性免疫缺陷相关疾病，乙肝，丙肝，普通变异性免疫缺陷(普通变异性血丙种球蛋白过少)，扩张性心肌病，雌性不育，卵巢衰竭，卵巢早衰，纤维化肺病，隐原性弥漫性纤维化性肺泡炎，炎症后间质性肺病，间质性肺炎，***病相关间质性肺病，混合***病相关肺病，***性硬化相关间质性肺病，风湿性关节炎相关间质性肺病，全身性红斑狼疮相关肺病，皮肌炎/多肌炎相关肺病，肖格伦氏病相关肺病，关节强硬性脊椎炎相关肺病，血管炎弥散性肺病，铁质沉着出血相关肺病，药物诱导的间质性肺病，纤维化，放射性纤维化，闭塞性细支气管炎，慢性嗜酸细胞性肺炎，淋巴细胞渗透性肺病，传染后间质性肺病，痛风性关节炎，自身免疫性肝炎，1型自身免疫性肝炎(典型的自身免疫性或狼疮样肝炎)，2型自身免疫性肝炎(抗LKM抗体肝炎)，自身免疫性介导的低血糖，B型胰岛素抗性伴黑棘皮症，甲状旁腺机能减退，与器官移植有关的急性免疫病，与器官移植有关的慢性免疫病，骨关节病，原发性硬化性胆管炎，1型银屑病，2型银屑病，特发性白细胞减少症，自身免疫性中性粒细胞减少症，肾病NOS，肾小球性肾炎，肾微型血管炎，莱姆病，盘状红斑狼疮，男性原发不育或NOS，***自身免疫，多发性硬化(所有亚型)，交感性眼炎，肺动脉高血压继发性***病，肺出血肾综合征，结节性多发性动脉炎的肺部现象，急性风湿热，类风湿性脊椎炎，斯蒂尔氏病，***性硬化，肖格伦氏综合征，高安氏病/动脉炎，自身免疫性血小板减少症，特发性血小板减少症，自身免疫性甲状腺病，甲状腺机能亢进，甲状腺肿自身免疫性甲状腺功能减退(桥本氏病)，萎缩性自身免疫性甲状腺功能减退，原发性黏液腺瘤病，晶状体源性葡萄膜炎，原发性血管炎，白癜风急性肝病，慢性肝病，酒精性肝硬变，酒精诱导型肝损伤，胆汁淤积，特应性肝病，药物诱导型肝炎，非酒精脂肪性肝炎，***反应和哮喘，B组链球菌(GBS)感染，精神错乱(例如，抑郁和精神***症)，Th2型和Th1型介导的疾病，急性和慢性疼痛(不同形式的疼痛)，和癌症诸如肺癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、***癌和直肠癌及造血***恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)。本申请的人抗体和抗体部分可用于治疗患有自身免疫性疾病的人，尤其是那些与炎症有关的疾病，包括，类风湿性脊椎炎，***反应，自身免疫性糖尿病，自身免疫性葡萄膜炎。
并且还知道NgR与其他蛋白相互作用，这些蛋白包括但不限于与细胞粘附、细胞迁移、细胞追踪(cell tracking)、轴突路径选择有关的蛋白及细胞外基质蛋白。本申请包括的潜在治疗组合可能包括抗NgR的抗体和脑信号蛋白(尤其是Sema-1a，1b；Sema-2a；Sema3A，B，C，D，E，F；Sema4A，D；Sema5A；Sema6D；Sema7A；Sema VA)，丛蛋白(Plexin-A1-4，Plexin-B1-3，Plexin-C1，Plexin-D1，Tim-2)，神经毡蛋白(神经毡蛋白-1和神经毡蛋白-2)，钙粘素(E-钙粘素和N-钙粘素)，导蛋白(导蛋白-1)，肝配蛋白(EphA3，4，6，7，8；B2，B3)Eph受体，Eph配体，Ig CAMs，生腱蛋白-C，CSPGs，生腱蛋白，Sema 3A，纤维连接蛋白，层粘连蛋白-1，胶原蛋白(例如胶原蛋白-IV)，Robo，Abl，N-Cadherin，L1，NCAM。
已经描述NgR还与胞外淀粉样前体蛋白片段(Aβ)相互作用。因此，本申请包括抗NgR和Aβ种类(Aβ1-40，Aβ1-42，Aβ寡聚体，Aβ多聚体，Aβ globulomer)的抗体的组合。这类联合疗法有利于阿尔茨海默氏病的治疗。所述联合可能转化为对AD患者中轴突生长/神经保护和斑块负荷的减轻和认知性能的双重效果。轴突和树突状丢失是阿尔茨海默氏病非常早期的标志，而联合治疗可能非常有效。
并且，如先前的描述，如上所述任一伴侣之间的双特异性抗体可能是有效的。如上所述的这类抗体制品可用于治疗，帕金森氏病，脊髓损伤，外伤性脑损伤，多发性硬化，周围神经损伤，精神***症，抑郁，焦虑以及任意上文提及的可塑性和轴突发育和神经毒性相关疾病。
本申请的抗体可以与肽组合以便跨膜转移到包括胞内靶蛋白。这类肽序列可以包括，但不限于，tat，触角足(antennapedia)，poly-args，一些抗微生物肽。这类肽允许转移穿膜，包括细胞质膜，以及上皮和内皮膜，包括血脑屏障，肠粘膜，脑膜，等等。
这类肽还可以使细胞信号转导抑制剂进入细胞，所述抑制剂包括抗NgR信号转导分子的抗体或小分子，包括ROCK、小GTPases、肌动蛋白和髓磷脂稳定剂。
本申请的抗体或抗体部分还可以与用于治疗如上面段落所述病症(所述病症涉及NgR活性)的一个或多个其他小分子治疗剂一起施用。应理解本申请的抗体或其抗原结合部分可以单独使用或与其他试剂(例如治疗剂)联用，所述其他试剂由技术人员根据其预期目的进行选择。例如，其他试剂可以是本领域公认的有利于治疗本发明抗体所治疗疾病或病症的治疗剂。所述额外的试剂还可以是赋予治疗组合物有利特性的试剂，例如，影响组合物粘性的试剂。优选的组合可以包括，但不限于，抗精神病剂诸如，但不限于维思通、奥氮平、Quetiapine、吩噻嗪类(氯丙嗪、氟奋乃静、左美丙嗪、氰噻嗪、奋乃静、丙氯拉嗪、丙嗪、硫利哒嗪、三氟拉嗪)、丁酰苯类(二苯哌丙林、氟哌啶醇)、苯噻庚乙胺、洛沙平、Aripiprazole、Sertoline、齐拉西酮、Rho激酶活性(ROCK)的小分子抑制剂，包括化合物例如法舒地尔(fasudil)，二甲基法舒地尔(dimethylfasudil)或任意其他的ROCK抑制剂，抗GABA A受体或促代谢型谷氨酸受体(mGluRs)的小受体配体，非甾体抗炎药物(NSAIDS)，抗炎皮质类固醇诸如甲基强的松龙。
本发明的药物组合物
可以将本申请的抗体和抗体部分掺入适于给个体施用的药物组合物。本申请的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的抗体或抗体部分。“治疗有效量”是指能够有效的在剂量方面和一段时间内实现所需治疗结果必需的量。抗体或抗体部分的治疗有效量可以由本领域技术人员确定，其将根据各种因素而变化：诸如疾病状况、个体的年龄、性别和体重，及所述抗体或抗体部分在个体中引发所需应答的能力。治疗有效量还表示抗体或抗体部分的治疗有益作用超过任何毒性或不利作用。“预防有效量”是指能够有效的在剂量方面和一段时间内实现所需预防结果必需的量。通常，因为预防剂量是在患病前或疾病早期用于个体，所以预防有效量将低于治疗有效量。
通常，药物组合物包括本发明的抗体或抗体部分及药学上可接受的载体。本文使用的“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何及所有溶剂，分散介质，包衣、抗细菌和抗真菌剂，等渗剂和吸收延迟剂，等等。药学上可接受载体的实例包括以下一种或多种：水，盐水，磷酸盐缓冲液，葡萄糖，甘油，乙醇等等，及其组合。多数情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如，糖，多元醇(诸如甘露醇，山梨糖醇)，或氯化钠。药学上有效的载体可以进一步包括少量辅助物质诸如湿润剂或乳化剂，防腐剂或缓冲液，其增强抗体或抗体部分的保存期限或有效性。
本申请的组合物可以采用各种形式。这些形式包括，例如，液体、半固体和固体剂型，诸如液体溶液(例如，可注射的和不溶解的溶液)，分散剂或悬液，片剂，丸剂，粉剂，脂质体和栓剂。优选的形式取决于预期的施用方式和治疗应用。一般优选的组合物采用可注射或不溶解溶液的形式，诸如类似于那些利用其他抗体被动免疫人的组合物。优选的施用模式是肠胃外的(例如，静脉内，皮下，腹腔内，肌内)。在一种优选的实施方案中，通过静脉内输注或注射施用抗体。在另一个优选的实施方案中，通过肌内或皮下注射施用抗体。另一个优选的实施方案包括抗体的鞘内施用。
在制备和保存条件下，治疗组合物通常必须是无菌和稳定的。可以将组合物配制为溶液，微乳剂，分散剂，脂质体，或其他适于高药物浓度的有序结构。根据需要，将所需量的活性化合物(即，抗体或抗体部分)与上面所列成分中的一种或者组合掺入合适的溶剂，继之以过滤灭菌，可以制备无菌注射溶液。通常，通过将活性化合物掺入无菌赋形剂来制备分散剂，所述赋形剂包含碱性分散介质和来自那些上面列举的所需其他成分。就用于制备无菌注射溶液的无菌冻干粉剂来说，优选的制备方法是真空干燥和喷雾干燥，这从先前其无菌滤液产生活性成分以及任意其他所需成分的粉剂。例如，通过使用包衣诸如卵磷脂，就分散剂来说通过维持需要的粒径以及通过使用表怖活性剂，可以维持溶液适当的流动性。通过在组合物中包括延缓吸收的试剂(例如，单硬脂酸盐和明胶)，可以实现注射组合物的延长吸收。
可以通过本领域已知的各种方法施用本申请的抗体和抗体部分，尽管对于许多治疗应用来说，优选的施用途径/模式是皮下注射、静脉注射或输注。技术人员将理解，施用途径和/或模式将根据预期结果而改变。在某些实施方案中，可以将避免化合物快速释放的载体(诸如控释剂，包括植入物、透皮片和微包埋输送***)与活性化合物一起制备。可以使用可生物降解、生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯，聚酐，聚乙醇酸，胶原，聚正酯，和聚乳酸。制备这类制剂的许多方法是获得专利的，并为本领域技术人员公知。参见，例如，Robinson，ed.，Sustainedand Controlled Release Drug Delivery Systems，MarcelDekker，Inc.，NewYork，1978。
在某些实施方案中，本申请的抗体或抗体部分可以与例如惰性稀释剂或可吸收的可食载体口服施用。还可以将化合物(如果需要，和其他成分)装入硬壳或软壳胶囊，压成片剂，或直接掺入个体的食物。对于口服治疗性施用来说，化合物可以与赋形剂混合，并以可吸收片剂、***片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬液、糖浆、薄片等等形式使用。为了通过肠胃外施用以外的途径施用本发明的化合物，可能必须用防止其灭活的材料包裹所述化合物，或将所述化合物与防止其灭活的材料共施用。
实施例
本申请将通过下列实施例进一步阐述，总之其目的只在于说明本申请而非限制其范围。
实施例1.抗体的产生。
分别用重组的人和大鼠NgR蛋白(SEQ ID NO：1a和SEQ ID NO：2a)免疫A/J小鼠(The Jackson Laboratories，Bar Harbor Me)。用50ug重组人或大鼠NgR蛋白皮下免疫小鼠4次，第一次注射NgR蛋白溶于弗氏完全佐剂，后三次免疫NgR蛋白溶于ImmuneasyTM(Qiagen)。在融合前4天，给小鼠静脉内注射10ug抗原。为了融合，利用Kohler和Milstein的标准技术(Kohler G and Milstein C；Nature Vol.256，第495-497页(1975)，将免疫动物的脾细胞与SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞按5∶1比例融合。融合后7到10天，当观察到肉眼可见的杂交瘤菌落时；透过过ELISA分析法检测上清。在4℃将溶于PBS的1ug/ml重组人或大鼠NgR蛋白包被ELISA板过夜，并在室温下封闭1小时。温育稀释上清，利用山羊抗小鼠IgFc-HRP偶联物检测结合。将在ELISA中产生抗体阳性的杂交瘤细胞扩大规模培养，并通过有限稀释法亚克隆。利用Zymed EIA分型试剂盒确定抗体的同种型。
已经建立不同的ELISA形式，它们通常被用作鉴定结合人、大鼠或小鼠NgR的抗体的头道筛选。然后对ELISA分析法中有反应的抗体进行检测，检验其结合稳定表达重组人NgR或重组大鼠NgR的HEK或CHO细胞，而不结合它们的未转染或对照细胞。对于ELISA形式来说，制备可溶性受体(参见上文)。对于FACS研究来说，在重组细胞系中表达全长NgR蛋白。
ELISA结合和FACS分析中Mab 50SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4和Mab51 SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的结果显示于表2。
表2.Mab 50和Mab 51结合特性的概述
单克隆抗体 ELISA结合 ELISA结合 FACS结合 FACS结合 FACS结合 FACS结合 同种型
HuNgR6X His Rat NgR6x His HEK293NGR HEK293对照 CHO K1RatNGR CHOK1对照
Mab 50 阳性 阳性 阳性 阴性 阳性 阴性 IgG2a，k
Mab 51 阳性 阳性 阳性 阴性 阳性 阴性 IgG2a，k
利用相同的实验方案获得其他抗体Mab 1，Mab 52，Mab 53，Mab54，Mab 55，Mab56，Mab 57，Mab 58，Mab 59，Mab 60，Mab 61和Mab 62。
实施例2.通过ELISA测定抗体特异性和结合亲和力。
为了测定实施例1产生的单克隆抗体的特异性，利用NgR-Fc(包括人NgR的氨基酸Met 1到Ser 447及人Fc片段的融合蛋白(R&D Systems))和大鼠NgR(SEQ ID NO.2a)进行ELISA。将两种配体都固定到96孔微量滴定板(Nunc Maxisorb；0.2μg/孔)上。使用溶于Tris-HCL，pH 7.2的2％牛血清白蛋白(BSA)(作为封闭试剂)在室温下作用2小时。使用起始于10,000ng/ml浓度的单克隆抗体。利用辣根过氧化物酶(Sigma)标记的抗小鼠二抗检测结合的抗体，并在标准条件下利用3，3′，5，5′-四甲基联苯胺底物(TMB，Pierce)显色。mAb50和mAb51特异性的结合人NgR。当利用0.2μg人NgR-Fc/孔时，对于浓度低于20ng/ml的两种单克隆抗体来说均观察到50％的结合(图1A)。在类似的实验中，mAb50和mAb51还特异性结合由大鼠NgR的氨基酸组成的多肽。当在96孔微量滴定板中利用0.2μg大鼠NgR/孔时，对于浓度低于20ng/ml的两种单克隆抗体来说均观察到50％的结合(图1B)。本发明的剩余单克隆抗体(mABs)也结合人和大鼠NgR。由每种抗体获得的信号差异表明结合亲和力的差异(参见表3)。
表3.利用人或大鼠NgR的mAbs EC50值的概述
实施例3.利用斑点印迹和Western印迹表征与可溶性人和大鼠NgR结合的抗体。
对于斑点印迹来说，将2μl溶于TTBS缓冲液的不同浓度的蛋白点在干硝酸纤维素膜上。对于Western印迹来说，将滤纸和硝酸纤维素在含20％甲醇的Novex转移缓冲液中浸泡10分钟。在Novex室中室温恒定电流(100mA)条件下2小时实现印迹。
每个样点添加蛋白的量为：
a)100μg/ml≈200ng/样点
b)50μg/ml≈100ng/样点
c)10μg/ml≈20ng/样点
d)5μg/ml≈10ng/样点
e)1μg/ml≈2ng/样点
f)500ng/ml≈1ng/样点
在探针点样后，开始免疫检测步骤前先将膜在室温下干燥10分钟。
所有被检测的单克隆抗体都结合人和大鼠NgR。由不同抗体获得的信号之间的差异表明结合亲和力的差异。(在我们利用硝酸纤维素膜检测的条件下，MAB61在印迹中没有显示高背景。)结合是抗体依赖性的，因为去除针对NgR的抗体后“对照”不显示任意信号。
单克隆抗体与Western印迹上变性NgR的反应不同。只有MAB1对人及大鼠NgR显示突出的信号。作为抗体结合能力的对照，在将蛋白从SDS凝胶转移后，将包含非变性人NgR和非变性大鼠NgR的斑点点样在硝酸纤维素膜上。这些斑点用作证明全部单克隆抗体与相同硝酸纤维素膜上非变性蛋白结合的阳性对照。结果概述于表4。
表4.斑点印迹和Western印迹分析。
+++：非常强的信号；++：强的信号；+：有信号；
-：无信号；～：无相关信号.
实施例4.AP-Nogo66结合可溶性人Nogo受体(hNgR-Fc)的竞争
为进一步表征单克隆抗体，使用类似于实施例2的结合分析法的竞争分析法来检测实施例1中产生的mAbs抑制AP-Nogo66结合人NgR-Fc的能力。将溶于50mM碳酸钠缓冲液pH9的NgR-Fc(0.2μg/孔)在96孔微量滴定板(Nunc Maxisorb)中4℃固定过夜，然后用溶于Tris-HCL，pH7.2的2％BSA在室温下封闭2小时。向所述孔中添加浓度恒定的AP-Nogo66(终浓度0.15nM，溶于含0.1％BSA的Tris-HCL，pH 7.2)和浓度增加的mAbs。将板在室温下温育90分钟。每次温育步骤期间，用清洗缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.2和0.05％ Tween20)清洗板。利用AttoPhos底物(Roche)检测AP-Nogo66的结合，并在Polarstar(BMG)装置中测量荧光单位。图2显示在0分钟和30分钟针对mAb 50和mAb 51所获测量值的相对荧光单位(RFU)。结合被mAb 50和mAb 51完全阻断，而抑制AP-Nogo66与人NgR-Fc结合的50％需要10倍摩尔过量的所述两种抗体。剩余抗体，除了mAb1外的Mab 52、Mab 53、Mab 54、Mab55、Mab 56、Mab57、Mab 58、Mab 59、Mab 60、Mab 61和Mab 62，以类似于mAb 50和51的浓度范围阻断AP-Nogo66与可溶性Nogo受体的结合。
实施例5.mAB50和mAB51与AP-Nogo66结合HEK293f细胞上表达的人和大鼠NgR的竞 争
为进一步表征如实施例1所述产生的mAbs的结合和竞争特性，使用瞬时表达人或大鼠NgR的HEK293f细胞的悬液。转染后48小时，将细胞种于96孔微量滴定板(NuncMaxisorb)，并用磷酸缓冲盐溶液(包含1％BSA的PBS)清洗。添加1μg/200μl AP-Nogo66(终浓度40nM)和不同浓度的单克隆抗体(20μg，4，0.8和0.16μg/200μl)，并在4℃温育1小时。将具有相同同种型的单克隆抗体作为阴性对照。AP-Nogo66的结合利用抗碱性磷酸酶抗体(Sigma)检测，所述抗体用Zenon小鼠IgG2a标记试剂盒(Invitrogen)标记有Alexa Fluor。在4℃温育二抗1小时。温育结束后，用PBS清洗细胞并进行FACS分析。在20μg/200μl浓度(20倍摩尔过量)，多克隆抗NgR抗体和NgR-Fc(均购自R&D Systems)封闭60％到70％的AP-Nogo66结合，而mAb 50和51封闭大约90％的AP-Nogo66结合。对于mAb 50和mAB 51在浓度为20mg的大鼠和人NgR中的抗体同种型对照显示于图3a。抗体同种型对照用黑线表示(最左边的信号)，无任何抗体条件下的AP-Nogo66结合用红线表示(最右边的信号)。人和大鼠NgR与AP-Nogo66的结合非常一致。在所述两种抗体均存在的条件下，AP-Nogo66荧光在表达人和大鼠NgR的HEK293f细胞中变为较低的强度(阴影；绿色区域)。利用不同的抗体浓度，通过Kolmogorov-Smirnov(K-S)分析法确定，对于人和大鼠NgR来说利用2倍摩尔过量的单克隆抗体50和51对AP-Nogo66观察到IC50。
图3b显示不同浓度mAb 50和mAb 51(即20.0μg，4.0，0.8和0.16μg/200μl)的结果。本发明的其他mAbs以类似于mAb 50和51的浓度范围阻断AP-Nogo66与HEK293f细胞表达的Nogo受体的结合。参见表5，其指示AP-Nogo66结合HEK293f细胞表达的人NgR的50％竞争所需的抗体量。
表5.AP-Nogo 66与人和大鼠HEK293f细胞的竞争。
mAb 50％竞争(μg)
505152535455565758596062 0,50,5330,80,60,80,20,230,80,3
实施例6.NTera2细胞中mAB50和mAb51对Nogo66诱导的轴突生长抑制的中和。
利用人NTera-2细胞和啮齿类动物(小鼠皮层神经元，大鼠皮层神经元和大鼠小脑颗粒神经元)细胞类型，及AP-Nogo66和髓磷脂作为配体，在紧密模拟体内情况的功能性***中研究本发明抗体对轴突生长的影响。
利用视黄酸可以将NTera2细胞(人畸胎癌细胞系)分化为神经元样细胞，其表达NgR mRNA(PCR)和细胞表面蛋白，这通过多克隆抗体与NgR的适度结合证实(FACS结合)。分别利用同种型对照抗体(无阴影区)及mAb 50和mAb 51(阴影区)，通过FACS分析法检测NTera-2中天然人NgR在细胞表面的表达(图4)。通过阴影区显示两种抗体与Ntera-2细胞表面表达的NgR的结合。
在尽可能接近人神经元的体外***中分析这些分化细胞中的轴突生长或生长锥萎缩。将NTera2细胞(来自German National ResourceCenter for Biologicals，DMSZ，Braunschweig)解冻，种于含DMEM培养基(Gibco #31966-021+10％胎牛血清(FCS)+5％马血清(PS))的175cm2培养瓶(Greiner bio-one #660175)中。培养数天后，重新种植细胞。为此目的，用PBS(Gibco #14190-094)清洗细胞一次，再用胰蛋白酶/EDTA(Gibco #25300-054)清洗，与胰蛋白酶/EDTA温育5分钟。为了进行分化，重悬细胞，将2.5×106个细胞种于175cm2瓶，所述瓶中含DMEM(Gibco31966-021，Lot.Nr.3092594)加10％FCS+5％PS，加1％青霉素/链霉素(5000/5000单位/mL)，加终浓度10μM的视黄酸(SIGMA #R2625)。
为了进行分化，在3周时间内，每周两次向NTera2细胞中添加终浓度10μM的视黄酸(SIGMA #R2625)。分化21天后，重新种植细胞。为此目的，用PBS清洗细胞一次，再用胰蛋白酶/EDTA清洗，然后与胰蛋白酶/EDTA温育5分钟。将细胞重悬，按1∶6拆分，，种于6个含DMEM(Gibco31966-021，Lot.Nr.3092594)+10％FCS+5％PS+1％PenStrep)的175cm2瓶2-3天。2-3天后细胞用PBS清洗，物理法解离，在1000rpm离心5分钟，重悬于Neurobasal培养基(Gibco#21103-049)加2mM L-谷氨酰胺(Gibco #25030-024)加青霉素/链霉素加B27-Supplement)，在Erlenmeyer烧瓶中(Corning#431143)预聚集。然后将106细胞/mL添加到2×15mL聚集培养基(Neurobsalmedium(Gibco #21103-049)加2mM L-谷氨酰胺(Gibco#25030-024)加青霉素/链霉素加B27-Supplement))，37℃5％CO2条件下温和搅动过夜，并种于用抑制型和对照底物预包被的96孔板(BiocoatPoly-D-Lysin Cellware 96-WellBlack/Clear Plate Becton Dickinson #354640(356640))。对于抑制型底物来说，96孔板的一半用溶于无菌PBS的100μL AP-Nogo66(AP-Nogo66浓度是15μg/mL)加层粘连蛋白(Sigma，L-2020，Lot 014K4060，(母液1mg/mL))预包被；每孔层粘连蛋白的最终量是20μg。对于允许型底物(permissive substrate)来说，板的另一半用100μl层粘连蛋白(20μg)包被。温育2小时后，板用PBS清洗两次，将50μl预聚集的细胞悬液种于添加40μl培养基的每孔。板在37℃温育2小时，最终添加10μl预稀释的mAb 50或mAb 51溶液，得到1到100μg/mL之间的最终抗体浓度。将细胞在37℃，5％CO2条件下温育过夜，之后那天用2％多聚甲醛(SIGMA #P-6148)固定，4℃保存用于后续分析。利用软件AxioVision LE Rel.4.1进行轴突生长的分析，借此使用标准鉴定参数(聚集区及聚集区&轴突生长区)。
利用如上所述的方法定量来自NTera2聚集物的轴突生长。结果显示于图5，在2μg/ml的mAb50和1μg/ml的mAb51处观察到轴突生长的显著改善。对Nogo66治疗的显著性：*＝p-值＜0.05；***＝p-值＜0.001。
对于抗体Mab52，53，54，55，56，57，58，59，60，61和62来说，也获得轴突生长抑制的改善。Mab1和Mab4不改善AP-Nogo66对轴突生长的抑制。
实施例7.hNgR的缺失突变体：抗体的表达、纯化和结合。
通过缺失C末端氨基酸以防止GPI-接头形成(最后450个氨基酸)和膜吸附，及利用有可能增加分泌蛋白量的分泌信号，可以将hNgR表达为可溶性蛋白。使用的表达***基于表达质粒在293F细胞中的瞬时转染。利用Ni-NTA(Nickel-次氮基三乙酸)珠子捕获His标记的分泌蛋白。通过PAGE和利用his标记无关蛋白(RGM A-His)作为阴性对照的Western印迹，分析洗脱蛋白的纯度和大小。为了更好的调整这些制品中的NgR蛋白，利用预期能检测所有缺失突变体的针对hNgR的多克隆抗体(AF1208)通过斑点印迹测量NgR的量。利用针对不同NgR缺失突变体的蛋白校正量进行斑点印迹。斑点印迹用于所列抗体的免疫检测。
利用表达NgR缺失突变体的293F细胞的细胞培养上清作为未纯化NgR的来源，进一步表征抗体与NgR缺失突变体的结合。
(i)根据Fournier等(Truncated Soluble Nogo Receptor Binds Nogo-66andBlocks Inhibition of Axon Growth by Myelin(截短的可溶性Nogo受体结合Nogo-66并阻断髓磷脂对轴突生长的抑制)；Alyson E.Fournier，Graham C.Gould，Betty P.Liu，Stephen M.Strittmatter；The Journal ofNeuroscience，October 15，2002，22(20)：8876-8883)制备NgR缺失突变体。文献中(Fournier等人)已经描述了人NgR的七(7)种缺失突变体。从pSecTag2A IgK/hNgR 27-450/Myc/His产生7种突变构建体。该构建体在pSecTag2A载体中包含与IgK前导肽融合的人NgR的氨基酸27-450的编码区及C末端Myc-和His标签。产生下列构建体：
·pSecTag2AigK/hNgR 27-450/Myc/His
·pSecTag2AigK/hNgR 58-450/Myc/His
·pSecTag2AigK/hNgR27-450/Δ58-106/Myc/His
·pSecTag2AigK/hNgR27-450/Δ106-155/Myc/His
·pSecTag2AigK/hNgR27-450/Δ155-202/Myc/His
·pSecTag2AigK/hNgR27-450/Δ203-250/Myc/His
·pSecTag2AigK/hNgR27-450/Δ260-310/Myc/His
·pSecTag2AigK/hNgR 27-310/Myc/His
利用QuikChange II XL定点诱变试剂盒(Stratagene，#200521)产生除pSecTag2AigK/27-310/Myc/His以外的所有构建体，并在E.coli XL10Gold细胞中进行转化。对于pSecTag2AigK/NgR/27-310/Myc/His来说，扩增编码序列的相应区域并将其克隆入pSecTag2A。下列诱变和扩增引物用于缺失NgR编码区的不同部分。
1.pSecTag2AigK/hNgR 58-450/Myc/His
Mey 1008：正义引物
GCCAGGCGCGCCGTACGAAGCTTATGCGCCAGCCAGCGCATCTTCCTGC
ACGGC
载体序列
hNgR序列，起始于氨基酸A58
Mey 1009：反义引物
GCCGTGCAGGAAGATGCGCTGGCTGGCGCATAAGCTTCGTACGGCGCGC
CTGGC
载体序列
hNgR序列，起始于氨基酸A58
2.pSecTag2AigK/hNgR27-450/Δ58-106/Myc/His
Mey 1014：正义引物
GCTGTGCCCGTGGGCATCCCTGCTGCCCTCCTGGAGCAGCTGGACCTCAGCGATAATGC
hNgR序列，直至氨基酸A58
hNgR序列，起始于氨基酸L106
Mey 1015：反义引物
GCATTATCGCTGAGGTCCAGCTGCTCCAGGAGGGCAGCAGGGATGCCCACGGGCACAGC
hNgR序列，直至氨基酸A58
hNgR序列，起始于氨基酸L106
3.pSecTag2AigK/hNgR27-450/Δ106-154/Myc/His
Mey 1021：正义引物
GCGGCTGCCTTCACTGGCCTGGCCGCCCTGCAGTACCTCTACCTGCAGGA
CAACGC
hNgR序列，直至氨基酸A105
hNgR序列，起始于氨基酸A155
Mey 1022：反义引物
GCGTTGTCCTGCAGGTAGAGGTACTGCAGGGCGGCCAGGCCAGTGAAGGC
AGCCGC
hNgR序列，直至氨基酸A105
hNgR序列，起始于氨基酸A155
4.pSecTag2AigK/hNgR27-450/Δ155-202/Myc/His
Mey 1023：正义引物
CGGGGCTGTTCCGCGGCCTGGCTAGCCTCGACCGTCTCCTACTGCACCAG
AACCGC
hNgR序列，直至氨基酸A154
hNgR序列，起始于氨基酸S203
Mey 1024：反义引物
GCGGTTCTGGTGCAGTAGGAGACGGTCGAGGCTAGCCAGGCCGCGGAACA
GCCCCG
hNgR序列，直至氨基酸A154
hNgR序列，起始于氨基酸S203
5.pSecTag2AigK/hNgR27-450/Δ203-250/Myc/His
Mey 1025：正义引物
GAGCGCGCCTTCCGTGGGCTGCACGCCCTGCAGTACCTGAGGCTCAACG
ACAACC
hNgR序列，直至氨基酸H202
hNgR序列，起始于氨基酸A251
Mey 1026：反义引物
GGTTGTCGTTGAGCCTCAGGTACTGCAGGGCGTGCAGCCCACGGAAGGC
GCGCTC
hNgR序列，直至氨基酸H202
hNgR序列，起始于氨基酸A251
6.pSecTag2AigK/hNgR27-450/Δ260-310/Myc/His
Mey 1027：正义引物
GCGTGCCCTGCAGTACCTGAGGCTCAACGACGTGGCCACCGGCCCTTACCAT
CCCATCTG
hNgR序列，直至氨基酸D259
hNgR序列，起始于氨基酸V311
Mey 1028：反义引物
CAGATGGGATGGTAAGGGCCGGTGGCCACGTCGTTGAGCCTCAGGTACTG
CA
hNgR序列，直至氨基酸D259
hNgR序列，起始于氨基酸V311
7.pSecTag2AigK/hNgR27-310/Myc/His
Mey 1016：正义引物
CCCCAAGCTTATGCCCAGGTGCCTGC
hNgR序列，起始于氨基酸C27
Mey 1030：反义引物
CCCCGAATTCCAGCGCAGCCCTGCAGGTC
hNgR序列，直至氨基酸A310
参见图6的图示。
(ii)NgR缺失突变体的表达。
人NgR C末端氨基酸的缺失导致膜锚定特性的丢失及可溶性受体蛋白在细胞上清中的存在。在N末端，hNgR的信号肽(氨基酸1-27)被载体中编码的信号肽取代。因此使用起始于hNgR的氨基酸27、终止于hNgR的氨基酸450的N末端和C末端缺失变体(hNgR27-450)作为这些突变体的基础，以使可溶性蛋白存在于细胞上清。此外，这些突变体包含短的氨基酸标签以便纯化这些蛋白。hNgR突变体的DNA在293F细胞中瞬时表达。72小时后通过离心收集细胞上清。按下文方法进行蛋白纯化。利用下列编码7种不同人NgR突变体的DNA进行转染。
·pSecTag2AigK/hNgR 27-450/Myc/His
·pSecTag2AigK/hNgR 58-450/Myc/His
·pSecTag2AigK/hNgR27-450/Δ58-106/Myc/His
·pSecTag2AigK/hNgR27-450/Δ106-155/Myc/His
·pSecTag2AigK/hNgR27-450/Δ155-202/Myc/His
·pSecTag2AigK/hNgR27-450/Δ203-250/Myc/His
·pSecTag2AigK/hNgR27-450/Δ260-310/Myc/His
·pSecTag2AigK/hNgR 27-310/Myc/His
hNgR突变体的DNA在293F细胞中瞬时表达。
(iii)利用Ni-螯合物亲和力(Ni-NTA)纯化NgR蛋白
使用Ni-NTA超流珠(Qiagen Qiagen #1018611)。将珠子用PBS(磷酸盐缓冲液，Invitrogen)清洗3次，通过在13500rpm离心珠子悬液，弃去上清，并在新配PBS中重悬珠子。30ml细胞培养上清使用200μl珠子悬液。将珠子与细胞培养上清在4℃旋转器(60rpm)上温育过夜，温育后离心(10分钟，3000rpm)沉淀珠子。弃去上清，用PBS清洗珠子3次。利用250μl洗脱缓冲液(PBS，160mM NaCl，150mM Imidazol)从珠子洗脱结合的蛋白。在室温下旋转器上温育30分钟后，通过在13.500rpm离心3分钟沉淀珠子。提取上清。将洗脱蛋白在-20℃冷冻用于进一步分析。
利用hNgR缺失突变体的斑点印迹实验的数据概述于表6。
表6
+++：非常强的信号；++：强的信号；
+：有信号；-：无信号；～：无相关信号.
实施例8 A.MAG-Fc结合NgR-Fc的竞争
为进一步表征单克隆抗体，使用类似于实施例2的结合分析法的竞争分析法来检测实施例1中产生的两种mAbs抑制MAG-Fc结合人NgR-Fc的能力。将溶于50mM碳酸钠缓冲液pH 9的NgR-Fc(0.2μg/孔，R & D Systems)在96孔微量滴定板(Nunc Maxisorb)中4℃固定过夜，然后用溶于Tris-HCL，pH 7.2的2％BSA在室温下封闭2小时。
通过Zenon人IgG标记试剂盒(Molecular Probes)利用辣根过氧化物酶标记MAG-Fc(R&D Systems重组大鼠MAG/Fc Chimera，目录号538-MG)。向所述孔中添加恒定浓度的标记MAG-Fc(终浓度50ng/ml，溶于含0.1％BSA的Tris-HCL，pH 7.2)及指定浓度的mAb 50和mAb 51。将其在室温下温育60分钟，并利用未标记的MAG-Fc和NgR-Fc作为对照。每次温育步骤期间，用清洗缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.2和0.05％Tween20)清洗板。在标准条件下利用3，3′，5，5′-四甲基联苯胺底物(TMB，Pierce)显色标记的MAG-Fc。如图7所示，mAb 50(闭合三角形)和mAb51(空心三角形)不抑制MAG-Fc与人NgR的结合。MAG-Fc和NgR-Fc与标记的MAG-Fc(闭合环)竞争结合NgR-Fc(一种融合蛋白，包括人NgR的氨基酸Met 1到Ser 447及人Fc片段(R&D Systems)；闭合正方形)。因此，在这些条件下mAb 50和mAb 51不与MAG竞争结合NgR(Figure7)。在这些条件下也没有其他剩余的抗体与MAG竞争结合NgR。
实施例8 B.OMgp结合NgR-Fc的竞争
为进一步表征单克隆抗体，使用类似于实施例8a的结合分析法的竞争分析法来检测实施例1中产生的两种mAbs抑制oMgp结合人NgR-Fc的能力。将溶于50mM碳酸钠缓冲液pH9的NgR-Fc(0.2μg/孔，R & D Systems)在96孔微量滴定板(Nunc Maxisorb)中4℃固定过夜，然后用溶于Tris-HCL，pH 7.2的2％BSA在室温下封闭2小时。向所述孔中添加恒定浓度的人OMgp(R&D Systems/1673-OM；终浓度500ng/ml，溶于含0.1％BSA的Tris-HCL，pH 7.2)及指定浓度的mAb 50和mAb 51。将该混合物在室温下温育60分钟。利用标记辣根过氧化物酶的抗His抗体(Roche)检测OMgp结合。每次温育步骤期间，用清洗缓冲液(10mMTris-HCl，pH7.2和0.05％Tween20)清洗板。在标准条件下利用3，3′，5，5′-四甲基联苯胺底物(TMB，Pierce)显色标记的抗His抗体。
如表7所示，mAb 50和mAb51部分阻断OMgp与人NgR的结合(30-40％范围)。其他抗体，除mAb52和mAb59外，也部分阻断OMgp与人NgR的结合，甚至在超过100倍摩尔过量的直至80μg/ml的浓度(表7)。
表7.
mAb 最大竞争(％)
14505152535455565758596062 269333602723353717320522
实施例9.大鼠DRG中mAB50和mAb51对Nogo66诱导的轴突生长抑制的中和。
使用出生后3-6天的大鼠幼崽的背根神经节(DRGs)研究抗NgR抗体对轴突生长的作用。
为了制备DRGs，用手术剪给6-8只大鼠幼崽断头。通过去除腹部器官和椎骨，从腹面解剖脊椎。然后，借助于精细手术剪纵向打开脊椎。取出脊髓及粘附的DRGs，将其转移到含PBS的10cm培养皿。利用两把精细镊从DRGs中剔除脊髓和连接的神经纤维，将其转移到含1ml PBS的35mm培养皿。在收集所有DRGs后，添加溶于PBS的0.5ml胶原酶溶液(4mg/ml I型胶原酶，Worthington #CLS-1)，将DRGs在37℃温育20-30分钟。添加0.5ml胰蛋白酶溶液(0.5％胰蛋白酶(SERVA #37290)，溶于PBS)，将DRGs在37℃再温育15-25分钟。将DRGs转移到15ml管，添加10ml培养基(DMEM Nut Mix F12(Gibco #31330-038)，加5％FCS(Gibco，热灭活)加5％马血清(Sigma，热灭活)加1％青霉素/链霉素(Gibco #15140-122))。在DRGs沉降到管底后，去除上清。在2ml培养基中离解DRGs，利用穿过Pasteur移液管3-5次，然后再穿过缩径开口的Pasteur移液管2-3次。在细胞团沉降后，将包含解离细胞的上清转移到新管。通过在1000rpm离心5分钟收集细胞，将其重悬于2ml培养基，计数，并用添加神经生长因子(NGF；62.5μg/ml终浓度，Roche #1014331)的培养基稀释到所需细胞密度。将4000-7000个细胞种于每孔80μl体积的聚赖氨酸包被96孔板(例如，Beckton Dickinson #356640)，所述板已经另外用100μl包被溶液(1瓶层粘连蛋白(1mg/ml Sigma #L-2020)，用50ml无菌水稀释)，然后在37℃温育30分钟到3小时。在细胞种植后添加体积为10μl的浓度增加的抗体。在37℃的CO2培养箱中温育2小时后，添加10μl AP-Nogo66。细胞生长18-30小时，通过添加100μl溶于PBS(磷酸盐缓冲液；Gibco #14190-094)的4％多聚甲醛溶液进行固定，然后在4℃温育至少12小时。作为96孔板的替代，使用24孔板(例如，Falcon #353047)及聚赖氨酸包被的盖玻片(例如，Becton Dickinson #354085)，并用500μl包被溶液进行包被。使用抗-βIII微管蛋白抗体(例如，Abcam #ab14545)及Cy3-偶联二抗(例如，Jackson ImmunoResearch #715-165-151)，通过间接免疫荧光法显示轴突生长。通过向二抗添加Bisbenzimide(H33258)对细胞核进行染色。在BDTM Pathway Bioimager(Beckton Dickinson)上获取10×放大倍数的显微图像，并利用AttoNO(Beckton Dickinson)软件测定轴突长度。将轴突生长归一化为每幅图像中DRG的数目。图8显示作为一个实例，mAb50对AP-Nogo66-诱导的轴突生长抑制的中和。图9显示分别利用抗体mAb50和mAb 51的实验的结果。与没有AP-Nogo66(第1栏)的对照条件相比，AP-Nogo66的应用明显降低了轴突生长的长度(第2栏)。两种抗体均以剂量依赖性方式中和AP-Nogo66诱导的轴突生长的抑制。与没有抗体的AP-Nogo66应用(第2栏)相比，对于两种抗体来说，在50μg/ml(最后一栏)被归一化为DRG数目的轴突长度是统计上不同的。
对于抗体Mab52，53，54，55，56，57，58，59，60，61和62来说，也获得轴突生长抑制的改善。Mab1和Mab4不改善AP-Nogo66对轴突生长的抑制。
从这些结果可以总结得出，这类抗体具有在生长抑制环境中刺激轴突生长的潜能。

Claims (36)

1.一种单克隆中和抗体或其抗原结合片段，其与Nogo-66受体的至少一个表位特异性相互作用，其中所述单克隆中和抗体或其抗原结合片段包含：
包括包含SEQ ID NO：3的序列的重链可变区(VH区)的序列；和
包括包含SEQ ID NO：4的序列的轻链可变区(VL区)的序列。
2.权利要求1的中和抗体，其中所述中和抗体降低Nogo-66与受体结合的能力。
3.权利要求1的中和抗体，其中所述中和抗体能够中和Nogo-66受体。
4.权利要求1的抗体，其中所述Nogo-66受体选自人，短尾猴，大鼠，小鸡，蛙和鱼。
5.权利要求1的抗体，其中所述Nogo-66受体的多肽序列与选自SEQ ID NO：1a和SEQ IDNO：2a的氨基酸序列具有90％同源性。
6.权利要求1的抗体，其中所述Nogo-66受体由与核酸序列SEQ ID NO：1b和SEQ ID NO：2b具有90％同源性的核酸编码。
7.权利要求1的抗体，其具有范围从10-7M到10-13M的解离常数(Kd)。
8.权利要求1的抗体，其具有范围从103M-1s-1到107M-1s-1的结合速率常数(Kon)。
9.权利要求1的抗体，其具有范围从10-3s-1到至少10-6s-1的解离速率常数(Koff)。
10.权利要求1的抗体，其具有范围从10-6s-1到至少10-12s-1的IC50值。
11.权利要求1的抗体，其结合人NgR的EC50范围为1×10-9M到1×10-11M。
12.权利要求1的抗体，其结合人NgR，其中所述抗体是糖基化的。
13.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是小鼠抗体，人源化抗体，完全人的抗体，嵌合抗体，人源化抗体的抗原结合片段，或嵌合抗体的抗原结合片段。
14.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是选自Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段和Fv片段的抗原结合片段。
15.一种单克隆抗体，其特异性结合Nogo-66受体的至少一个表位，其中所述单克隆抗体是由杂交瘤细胞系ATCC NO.PTA-8383分泌的单克隆抗体。
16.权利要求15的单克隆抗体，其中所述结合导致Nogo-66受体的失活。
17.一种产生权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段的杂交瘤细胞系，所述单克隆抗体特异性结合Nogo-66受体的至少一个表位。
18.权利要求17的杂交瘤细胞系，其中所述杂交瘤选自小鼠和人杂交瘤。
19.权利要求17的杂交瘤细胞系，其中所述杂交瘤选自大鼠，绵羊，猪，牛，山羊和马杂交瘤。
20.权利要求1的单克隆中和抗体或其抗原结合片段，具有选自以下的至少一个特征：
a)以nM范围或更低的亲和力结合哺乳动物NgR；
b)在轴突生长分析法中以nM或更低效能体外功能性拮抗Nogo-66结合；
c)在轴突生长分析法中以nM或更低效能体外功能性拮抗Nogo-66结合；
d)在视神经压榨伤模型中体内诱导萌生；和
e)体内减轻实验性脊髓损伤。
21.一种分离的核酸，其编码权利要求1的单克隆中和抗体或抗原结合片段。
22.一种包括权利要求21的分离的核酸的载体，其中所述载体选自pcDNA；pTT；pTT3；pEFBOS；pBV；pJV和pBJ。
23.一种用权利要求22的载体转化的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。
24.权利要求23的宿主细胞，其中所述动物细胞是选自HEK293、CHO和COS的哺乳动物细胞。
25.一种用权利要求22的载体转化的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。
26.一种制备如权利要求1所述的结合人和/或大鼠NgR的单克隆中和抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在足以产生结合人和/或大鼠NgR的单克隆中和抗体或其抗原结合片段的条件下在培养基中培养宿主细胞。
27.一种药物组合物，所述组合物包括权利要求2或3的单克隆抗体或抗原结合部分和药学上可接受的载体。
28.权利要求2或3的抗体在制备用于在需要其的个体中减少Nogo-66结合Nogo-66受体的药物中的用途。
29.权利要求2或3的抗体在制备用于逆转Nogo-66诱导的轴突生长抑制的药物中的用途。
30.权利要求2或3的抗体单独地或与其他治疗剂联合地在制备用于治疗个体与NgR活性有关的疾病的药物中的用途。
31.权利要求30的用途，其中所述疾病包括神经学疾病，所述神经学疾病选自肌萎缩侧索硬化，臂丛损伤，脑损伤，Friedrich′s共济失调，脑白质营养不良症，多发性硬化，脊髓灰质炎后综合征，脊髓损伤，棘肌萎缩，脊柱瘤，中风，和横贯性脊髓炎。
32.权利要求30的用途，其中所述疾病包括神经学疾病，所述神经学疾病选自痴呆，轻度认知受损，亨廷顿氏舞蹈病，迟发性运动障碍，痉挛，躁狂症，帕金森氏病，steel-Richard综合征，重症肌无力，神经创伤，血管淀粉样变性，具有淀粉样变性的脑出血I，脑炎症，Friedrich′s共济失调，急性精神错乱，肌萎缩性侧索硬化，青光眼和阿尔茨海默氏病。
33.权利要求2或3的抗体单独地或与其他治疗剂联合地在制备用于降低患病个体中人NgR活性的药物中的用途，所述疾病中NgR活性是有害的。
34.权利要求31的用途，其中所述脑损伤选自外伤性脑损伤和脑瘫。
35.权利要求31的用途，其中所述脊髓损伤选自脊柱裂和Guillain-Barré综合征。
36.权利要求32的用途，其中所述痴呆选自老年性痴呆、阿尔茨海默尔相关痴呆和唐氏综合征。
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