CN101967461A - 一种固氮螺菌的发酵方法与由该方法得到的发酵液及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及本发明涉及一种固氮螺菌的发酵方法，还涉及由该方法得到的发酵液及其用途。本发明的固氮螺菌发酵方法包括菌种活化、扩大培养与发酵培养等步骤。本发明通过pH偶联的补料方式和控制不同发酵阶段的溶氧，使固氮螺菌的发酵水平大幅度提高，发酵菌数可达到70-120亿/ml，固氮螺菌活菌数可完全满足制备固氮微生物肥料的要求，本发明的发酵控制方法简单，并易于发酵规模的放大。使用含有本发明固氮螺菌发酵液的微生物肥料增产效果明显，具有广泛的应用前景。

Description

一种固氮螺菌的发酵方法与由该方法得到的发酵液及其用途

【技术领域】

本发明属于微生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种固氮螺菌的发酵方法，还涉及由该方法得到的发酵液，涉及所述发酵液的用途。

【背景技术】

生物固氮是地球化合态氮素的主要来源，据统计，地球上60％化合态氮源于生物固氮作用。目前，农业上使用的化合态氨来自于合成氨工业，合成氨消耗巨大的能源，而且大量使用化学合成氮肥已对自然环境造成了严重的污染，同时也威胁着食品安全。在农业生产中充分有效的利用生物进行固氮，更高的发挥生物固氮的效力，是解决上述问题的主要途径之一。自上世纪二十年代起相继开展了生物固氮方面的研究，根据固氮生物和植物之间的相互作用关系，通常将自然界中存在的固氮体系分为共生固氮，联合固氮和自生固氮三种。目前，共生固氮菌的作用机理研究的较透彻，且在世界范围内已开发出多款产品，其推广和应用规模也逐渐形成规模；世界上很多国家的豆科作物都接种根瘤菌，尤其是美国和巴西，豆科作物接种共生固氮菌(即豆科根瘤菌)几乎接近100％；但是共生固氮菌的作用作物范围较窄，应用范围有限。

联合固氮菌由于其作用范围广泛，越来越受到人们的重视。联合固氮菌中研究较多的是固氮螺菌属(Azospirillum)，该类固氮螺菌分布广泛，可定植于多种禾本科作物根际，分泌植物生长激素和抗真菌的抗生素，促进种子发芽和根的生长。20世纪70年代末和80年代初，一些国家对固氮螺菌的应用效果进行了田间试验，表明固氮螺菌接种在土壤和气候不同的地区可以提高作物的产量，在60％-70％的试验中可增产5％-30％。固氮螺菌与禾本科作物联合固氮的研究取得了一定的进展，部分国家也将固氮螺菌作为接种剂使用，但是，固氮螺菌作为作物接种剂尚未能产业化。自生固氮菌中研究较多的一类可固氮的光合细菌，该类细菌不仅可以固氮，而且可以合成多种水产养殖类动物所需要的色素，自生固氮研究的模式菌为深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)。

目前，关于固氮螺菌的研究多集中于菌株的改造，色素合成和固氮机理的研究，对于固氮螺菌的发酵和作为商品化的微生物菌剂研究的较少。CN 03109679.4公开了一种促进植物生长型的微生物菌剂制备方法。所述的微生物菌剂由棕色固氮菌、固氮螺菌、巨大芽孢杆菌和泾阳链霉菌按比例组成。该菌剂能促进植物对土壤中矿物元素的吸收利用，抑止根部病原体，可与部分无机肥混合制备无机生物复合肥，提高作物产量，同时还可改善作物的品质。CN 200780101303.0涉及新的生物肥料，所述肥料包含分散泛菌C3菌株的纯培养物、巴西固氮螺菌M3菌株的纯培养物和吲哚-3-乙酸，它们全部固定于单个固体介质中，起缓释体系的作用。

目前，固氮螺菌作为微生物菌剂尚未规模化使用的原因是：1)固氮螺菌发酵单位较低，一般仅有30-50亿/ml；2)保存时间较短，尤其是巴西固氮螺菌，液体菌剂在室温下保存仅3个月；3)应用效果受限于使用方法。因此，固氮螺菌规模化应用首要要解决的问题是其发酵水平和成本，发酵水平的提高可降低发酵成本，提高固氮螺菌存活率，保证产品质量，有益于应用效果的体现和该类菌剂的商品化。

为此，本发明人针对现有技术存在的问题，经过大量试验克服了这些缺陷，终于完成了本发明。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的目的是提供一种固氮螺菌的发酵方法。

本发明的另一个目的是提供一种含有所述固氮螺菌的发酵液。

本发明的另一个目的是提供含有所述固氮螺菌发酵液的用途。

[技术方案]

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明涉及一种固氮螺菌的发酵方法。

该方法包括下述步骤：

A)菌种活化

LB固体培养基的制备：分别称取氯化钠、酵母浸粉、蛋白胨，混合后用蒸馏水或自来水溶解，得到以重量百分数表示的0.8-1.2％氯化钠、0.4-0.6％酵母浸粉、0.8-1.2％蛋白胨、用无机碱或无机酸将该溶液的pH调节至6.8-7.0，然后加入1.6-2.4％琼脂粉，再在温度121℃下高压灭菌30分钟后，再放置在室温下静置得到LB固体培养基。

把固氮螺菌菌体放在所述的LB固体培养基上进行活化，在培养温度28-32℃下培养至单菌落直径达到2-3mm，菌落呈现淡红色或浅乳黄色。

所述的固氮螺菌是以有机酸作为底物的红螺菌属和固氮螺菌属的菌株。

固氮螺菌是作物生长的有力促进者。对作物来讲，固氮螺菌不与作物形成特殊的结构，而是定植于作物的根际，不同于豆科作物与根瘤菌之间的共生关系，所以它能够用于非豆科作物，例如小麦、玉米、大麦、棉花等各种作物。固氮螺菌除固氮作用外，它的分泌物对促进作物生长也有非常明显的作用，它们能够使作物根系发达，这样，就能够使作物从土壤中吸取更多的水份、矿物质和其他营养物质，于是能够显著改善作物生长状况，增强作物抗逆性，抑制病原微生物，从而能够提高作物产量，同时可以减少化肥的使用量。

红螺菌属拉丁学名(Rhodospirillum Molisch，1907)，细胞弧形或螺旋形，0.8-1.5μm宽，极生鞭毛运动，细胞行二分***，革兰氏染色阴性。属α-变型菌纲(Proteobacteria)。光合内膜囊泡状或片层状。光合色素为细菌叶绿素a和螺菌黄素类类胡萝卜素。醌类以Q或RQ为主。细胞喜在光照厌氧条件下光异养生长。但可在黑暗条件下微好氧或好氧生长；生长需生长因子。模式种：深红红螺菌(R.rubrum)。

优选地，LB固体培养基的组成是以重量百分数表示的1.0％氯化钠、0.5％酵母浸粉、1.0％蛋白胨和2.0％琼脂粉。

所述的无机碱是NaOH或KOH。

所述的无机酸是磷酸或硫酸。

作为调节pH使用的无机碱或无机酸的浓度不是特别关键的，但通常使用的浓度是0.1-1.0N，优选地0.4-0.8N。

本发明使用的氯化钠、酵母浸粉、蛋白胨、琼脂粉都是目前市场上销售的在微生物技术领域里普遍使用的物质，例如所述的琼脂、酵母浸膏粉是北京奥博星生物技术有限公司生产的产品，其余试剂是北京试剂公司生产的产品。

菌种活化使用的设备也是在微生物技术领域里普遍使用的设备。

B)扩大培养

扩大培养的液体培养基的制备：称取下述原料用蒸馏水或自来水溶解，再用无机碱或无机酸将溶液的pH调节至6.8-7.0，再在温度121℃下高压灭菌30分钟，冷却得到所述的扩大培养的液体培养基：

以重量百分数表示，0.12-2.0％C₂-C₄有机酸、0.05-0.15％选自氯化铵或硫酸铵的无机铵盐、0.05-0.3％选自酵母粉、蛋白胨或酶水解酪蛋白的有机氮源、0.02-0.03％硫酸镁、0.01-0.1％磷酸盐和0.001-0.01％选自氯化铁、硼酸、乙二胺四乙酸二钠盐、钼酸钠或柠檬酸铁的微量元素化合物。

把步骤A)活化的菌体接入扩大培养的液体培养基中，在温度28-32℃下振荡培养细胞至对数生长期中期。

优选地，扩大培养的液体培养基的组成是以重量百分数表示的0.14-1.8％C₂-C₄有机酸、0.08-0.12％选自氯化铵或硫酸铵的无机铵盐、0.1-0.2％选自酵母粉、蛋白胨或酶水解酪蛋白的有机氮源、0.02-0.03％硫酸镁、0.02-0.08％磷酸盐和0.002-0.008％选自氯化铁、硼酸、乙二胺四乙酸二钠盐、钼酸钠或柠檬酸铁的微量元素化合物。

根据本发明，所述的C₂-C₄有机酸应该理解是碳原子数为2-4的有机酸，例如乙酸、乳酸或苹果酸。

所述的磷酸盐是磷酸氢二钾和磷酸二氢钾，它们的浓度分别为：0.1-2.0g/L和0.4-1.6g/L，并且二者组成非缓冲体系对。

在作为调节pH使用的无机碱或无机酸中，所述的无机碱是NaOH或KOH。所述的无机酸是盐酸或硫酸。它们的浓度不是特别关键的，但通常使用的浓度是0.1-1.0N，优选地0.4-0.8N。

本发明扩大培养使用的设备也是在微生物技术领域里普遍使用的设备。

在本发明中采用高压蒸气灭菌，高压蒸气灭菌是水在大气中在100℃沸腾，在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。

在本发明中，高压灭菌使用的设备例如可以是北京安捷来科学仪器设备有限公司销售的高压灭菌器。

C)发酵培养

发酵培养的发酵培养基的制备：称取下述原料用蒸馏水或自来水溶解，再用无机碱或无机酸将溶液的pH调节至6.8-7.0，再在温度121℃下高压灭菌30分钟，冷却得到所述的发酵培养的液体培养基：

以重量百分数表示，0.5-2.5％C₂-C₄有机酸、0.1-0.15％选自氯化铵或硫酸铵的无机铵盐、0.1-0.3％选自酵母粉、蛋白胨或酶水解酪蛋白的有机氮源、0.02-0.03％硫酸镁、0.01-0.1％磷酸盐和0.001-0.01％选自氯化铁、硼酸、乙二胺四乙酸二钠盐、钼酸钠或柠檬酸铁的微量元素化合物；

优选地，发酵培养的液体培养基的组成是以重量百分数表示的0.4-2.0％C₂-C₄有机酸、0.12-0.14％选自氯化铵或硫酸铵的无机铵盐、0.15-0.25％选自酵母粉、蛋白胨或酶水解酪蛋白的有机氮源、0.02-0.03％硫酸镁、0.01-0.1％磷酸盐和0.001-0.01％选自氯化铁、硼酸、乙二胺四乙酸二钠盐、钼酸钠或柠檬酸铁的微量元素化合物。

根据本发明，所述的C₂-C₄有机酸是乙酸、乳酸、苹果酸。所述的磷酸盐例如可以是磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、磷酸一氢钠或磷酸二氢钠等。

在作为调节pH使用的无机碱或无机酸中，通常使用NaOH或KOH与磷酸或硫酸。它们的浓度通常是0.1-1.0N，优选地0.4-0.8N。

本发明发酵培养使用的设备也是在微生物技术领域里普遍使用的设备。

在本发明中，高压灭菌使用的设备例如可以是北京安捷来科学仪器设备有限公司销售的高压灭菌器。

以所述的发酵培养的液体培养基(以体积计)把3-10％在步骤B)扩大培养的菌体接入发酵罐中，在发酵温度28-32℃下进行发酵，并且进行如下控制，直至细胞生长进入对数生长后期，终止发酵，并进行平板稀释涂布计数：

(1)在固氮螺菌细胞生长延滞期：将转速控制在100-300r/min，溶氧控制在0.3-0.5vvm(air volume/culture volume/min，通气比)；

(2)在细胞对数生长期：将转速控制在200-500r/min，溶氧控制在0.5-0.8vvm，优选地转速控制在450-500r/min，溶氧控制在0.75-0.8vvm。

(3)在发酵培养过程中，根据pH变化进行C₂-C₄有机酸补料，即采用pH偶联的补料方式进行C₂-C₄有机酸补料，以便保证在发酵过程中碳源浓度处于恒定水平；所述补料液的C₂-C₄有机酸重量百分浓度为20-90％，优选地，所述补料液的C₂-C₄有机酸浓度是重量百分浓度30-40％。

优选地，所述的发酵培养基初始碳氮比是5-17∶1。

所述的平板稀释涂布计数方法描述如下：

将发酵液稀释10^-1到10^-8，并选取10^-6、10^-7和10^-83个梯度的稀释液，取100μl涂布于所述的LD固体培养基上(每个梯度三个平行)，在温度28-32℃下培养至单菌落直径达到2-3mm，然后选取20-100个单菌落/平板的稀释梯度的平板，求得该稀释梯度下的菌落平均数，并计算其发酵液活菌数。在10^-7梯度下求得的菌落平均数的数值即是发酵液中活菌数(活菌数的单位为亿/ml)。

采用所述的平板稀释涂布计数方法测定得到，采用本发明方法制备的发酵液的活菌数可以达到70-120亿个/ml。

本发明还涉及采用本发明发酵方法得到的发酵液，其特征在于它含有的固氮螺菌活菌数为70-120亿个/ml。

本发明还涉及所述的发酵液在制备固氮微生物肥料中的用途。

[有益效果]

本发明方法实施简便，可以得到活菌数为70-120亿个/ml的发酵液，远高于现有技术的30-50亿个/ml，而且本发明发酵液在室温下保存12个月以上，固氮螺菌活菌数可完全满足制备固氮微生物肥料的要求。使用含有本发明固氮螺菌发酵液的微生物肥料不仅增产效果明显，例如玉米可增产5-10％，水稻可增产3-6％；不仅如此，还能大大增强作物的抗逆性。

【附图说明】

图1是不补料条件下巴西固氮螺菌生长曲线

图2是磷酸盐缓冲体系条件下巴西固氮螺菌的生长曲线

图3是巴西固氮螺菌在pH偶联的补料及分阶段控制溶氧条件下的生长曲线

图4是深红红螺菌在pH偶联的补料及分阶段控制溶氧条件下的生长曲线

【具体实施方式】

实施例1

本实施例的固氮螺菌发酵方法是不进行补料条件下的发酵，发酵过程中pH值随着培养时间逐渐增加。

该方法实施步骤如下：

A)菌种活化：

LB固体培养基的制备：分别称取氯化钠、酵母浸粉、蛋白胨、琼脂粉，混合后用蒸馏水溶解，得到以重量百分数表示的1.0％氯化钠、0.5％酵母浸粉、1.0％蛋白胨的溶液，用0.1N氢氧化钠水溶液或0.1N磷酸水溶液将该溶液的pH调节至6.8-7.0，加入2.0％的琼脂粉，再在温度121℃下高压灭菌30分钟后，再放置在室温下静置得到LB固体培养基。

将Azospirillum brasilense Yu62接种到所述的LB固体培养基上，在温度30℃下培养40-48h，得到单菌落直径达到2-3mm，菌落呈现浅乳黄色，菌苔有褶皱现象。

B)扩大培养：

扩大培养的液体培养基的制备：称取下述原料用蒸馏水溶解，再用0.1N氢氧化钠水溶液或0.1N磷酸水溶液将溶液的pH调节至6.8-7.0，再在温度121℃下高压灭菌30分钟，冷却得到所述的扩大培养的液体培养基：

以重量百分数表示，2％乳酸、0.10％氯化铵、0.15％酵母粉、0.02％硫酸镁、0.05％磷酸一氢钾和0.005％氯化铁微量元素化合物。

将步骤A)活化的菌种接种于装有20-25ml上述扩大培养的液体培养基的50ml的三角瓶中，在温度30℃下以180r/min振荡15-18h，菌体生长至对数中期。

C)发酵培养：

发酵培养的发酵培养基的制备：称取下述原料用蒸馏水溶解，再用0.1N氢氧化钠水溶液或0.1N盐酸将溶液的pH调节至6.8-7.0，再在温度121℃下高压灭菌30分钟，冷却得到所述的发酵培养的液体培养基：

以重量百分数表示，2.0％乳酸、0.12％硫酸铵、0.2％酵母粉、0.03％硫酸镁、0.05％磷酸一氢钾和0.005％氯化铁微量元素化合物；

将步骤B)得到的种子接种到5L发酵罐中(装液量为60％)，接种量为10％。发酵温度为30℃，发酵过程中搅拌转速控制在350-400r/min，溶氧控制在0.5vvm，发酵过程中不调节pH值，也不进行补料，通过上述控制工艺，发酵周期为16-20h(见附图1)，在600nm处细胞吸光值可达到7-8OD(光密度)，并通过稀释平板计数，发酵液活菌数可达到31-33亿/ml。

实施例2

本实施例的实施方式与实施例1相同，但是在发酵过程中将磷酸盐制备成缓冲体系对，使发酵过程中pH基本不发生变化，pH值偶联的补料不能进行。

该方法实施步骤如下：

本实施例按照实施例1的步骤A和B进行，而发酵过程按照下述方式进行：

1)发酵培养基：将磷酸二氢钾由0.4g/L改变为0.52g/L，将磷酸氢二钾由0.1g/L改变为1.4g/L，使磷酸盐形成缓冲体系对，在在发酵培养基灭菌时，磷酸盐需要单独灭菌，并在接种前加入到发酵培养基中。

2)发酵培养：将活化好的种子接种到5L发酵罐中(装液量为60％)，接种量为10％。发酵温度为30℃，发酵过程中搅拌转速为450r/min，通气量为0.8vvm。通过上述工艺控制，发酵16h后，细胞生长趋缓，18h终止发酵(见附图2)；在600nm出的细胞吸光值可达到13OD，并通过稀释平板计数，发酵液活菌数可达到82.3亿/ml。

实施例3

本实施例的固氮螺菌发酵方法是以pH值偶联的补料方式及阶段性控制溶氧相结合的发酵工艺进行控制。

该方法实施步骤如下：

该实施例使用的培养基和实施方式与实施例1的相同，但是在发酵过程中溶氧和pH偶联的补料方式为：

搅拌转速控制方式是在0-8h，350-400r/min，在8-16h，450-500r/min；通气量控制方式是在0-8h，0.5vvm；8h到发酵结束的通气量为0.8vvm，补料的乳酸浓度为30％。通过上述工艺控制，发酵16-18h细胞进入对数生长后期，终止发酵；发酵周期为16-18h(见附图3)，在600nm处细胞吸光值可达到15-18OD，并通过稀释平板计数，发酵液活菌数可达到110-125亿/ml。

实施例4

本实施例描述以深红红螺菌作为研究对象，进行pH偶联的补料方式及阶段性溶氧控制的细胞生长。

该实施例的实施步骤如下：

A)菌种活化：将Rhodospirillum rubrum ATCC1170接种到斜面LB培养基上，30℃培养40-48h，活化好的菌种的单菌落直径2-3mm，菌落呈现深红色，且单菌落直径2-3mm。

B)种子培养：将步骤1活化的菌种接种于装有20-25ml液体培养基的50ml的三角瓶中，30℃振荡20-24h(振荡培养转速为100r/min)。

C)种子培养：将步骤2得到的菌种取10ml接种于装有150-200ml用于扩大培养的液体培养基中(500ml的三角瓶中)，30℃振荡培养15-20h(振荡培养转速为100r/min)。

D)发酵培养：将步骤C)中活化好的种子接种到5L发酵罐中(装液量为60％)，发酵培养基的磷酸盐浓度为：磷酸氢二钠0.03％，磷酸二氢钠0.07％，接种量为10％。发酵温度为30℃，发酵过程中搅拌转速控制为：0-8h，100-200r/min，8h至发酵结束，200-300r/min；通气量控制为：0-8h，0.2-0.3；8h到发酵结束的通气量为0.3-0.5，补料的苹果酸浓度为20％。

通过上述工艺控制，发酵4-8h细胞进入对数生长期，90-100h细胞生长至稳定期，终止发酵(见附图4)；在600nm处细胞吸光值可达到10-12OD，并通过稀释平板计数，发酵液活菌数可达到76亿/ml。

Claims (10)

1.一种固氮螺菌的发酵方法，其特征在于该方法包括下述步骤：

A)菌种活化

LB固体培养基的制备：分别称取氯化钠、酵母浸粉、蛋白胨，混合后用蒸馏水或自来水溶解，得到以重量百分数表示的0.8-1.2％氯化钠、0.4-0.6％酵母浸粉、0.8-1.2％蛋白胨，用无机械或无机酸将该溶液的pH调节至6.8-7.0，然后加入1.6-2.4％琼脂粉，再在温度121℃下高压灭菌30分钟后，再放置在室温下静置得到LB固体培养基；

把固氮螺菌菌体在所述的LB固体培养基上进行活化，在培养温度28-32℃下培养至单菌落直径达到2-3mm；

B)扩大培养

扩大培养的液体培养基的制备：称取下述原料用蒸馏水或自来水溶解，再用无机碱或无机酸将溶液的pH调节至6.8-7.0，再在温度121℃下高压灭菌30分钟，冷却至室温得到所述的扩大培养的液体培养基：

以重量百分数表示，0.12-2.0％ C₂-C₄有机酸、0.05-0.15％选自氯化铵或硫酸铵的无机铵盐、0.05-0.3％选自酵母粉、蛋白胨或酶水解酪蛋白的有机氮源、0.02-0.03％硫酸镁、0.01-0.1％磷酸盐和0.001-0.01％选自氯化铁、硼酸、乙二胺四乙酸二钠盐、钼酸钠或柠檬酸铁的微量元素化合物；

把步骤A)活化的菌体接入扩大培养的液体培养基中，在温度28-32℃下振荡培养至对数生长中期；

C)发酵培养

发酵培养的发酵培养基的制备：称取下述原料用蒸馏水或自来水溶解，再用无机碱或无机酸将溶液的pH调节至6.8-7.0，再在温度121℃下高压灭菌30分钟，冷却得到所述的发酵培养的液体培养基：

以重量百分数表示，0.5-2.5％C₂-C₄有机酸、0.1-0.15％选自氯化铵或硫酸铵的无机铵盐、0.1-0.3％选自酵母粉、蛋白胨或酶水解酪蛋白的有机氮源、0.02-0.03％硫酸镁、0.01-0.1％磷酸盐和0.001-0.01％选自氯化铁、硼酸、乙二胺四乙酸二钠盐、钼酸钠或柠檬酸铁的微量元素化合物；

以所述的发酵培养的液体培养基(以体积计)把3-10％在步骤B)扩大培养的菌体接入发酵罐中，在发酵温度28-32℃下进行发酵，并且进行如下控制，直至细胞生长进入对数生长后期，终止发酵，并进行平板稀释涂布计数：

(1)在固氮螺菌细胞生长延滞期：将转速控制在100-300r/min，溶氧控制在0.3-0.5vvm；

(2)在细胞对数生长期：将转速控制在200-500r/min，溶氧控制在0.5-0.8vvm；

(3)在发酵培养过程中，根据pH变化进行C₂-C₄有机酸补料，以便保证在发酵过程中碳源浓度处于恒定水平；所述补料液的C₂-C₄有机酸重量百分浓度为20-90％。

2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于所述的固氮螺菌是以有机酸作为底物的红螺菌属和固氮螺菌属的菌株。

3.根据权利要求1的发酵方法，其特征在于所述的无机碱是NaOH或KOH。

4.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于所述的无机酸是盐酸或硫酸。

5.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于所述的C₂-C₄有机酸是可以是乙酸、乳酸或苹果酸。

6.根据权利要求1或5所述的发酵方法，其特征在于所述的C₂-C₄有机酸的重量百分浓度为30-40％。

7.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于在细胞对数生长期，将转速控制在450-500r/min，溶氧控制在0.75-0.8vvm。

8.根据权利要求1所述，其特征在于所述的磷酸盐是磷酸氢二钾和磷酸二氢钾，它们的浓度分别为：0.1-2.0g/L和0.4-1.6g/L，并且二者组成非缓冲体系对。

9.采用权利要求1-8权利要求所述发酵方法得到的发酵液，其特征在于它含有的固氮螺菌活菌数为70-120亿个/ml。

10.根据权利要求9所述的发酵液在制备固氮微生物肥料中的用途。

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