CN101962677A - 一种鉴定禽类性别的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴定禽类性别的方法。本发明方法是通过设计一对特异性引物，对禽类基因组DNA进行PCR扩增，将产物进行琼脂糖凝胶电泳，DNA图谱为单一条带时，待测个体为雄性；DNA图谱为双条带时，待测个体为雌性。本发明所述特异性引物的核苷酸序列如SEQIDNO:1~2所示。本发明方法技术实用性强，重复性好，可以准确鉴别禽类的性别，尤其可用于鉴别雌雄性别在外观上表现一致的禽类。

Description

一种鉴定禽类性别的方法

技术领域

 本发明涉及包含酶或微生物的测定或检验方法领域，具体涉及一种鉴定禽类性别的方法。

背景技术

 目前，人们对禽类的雌雄鉴别主要依赖两种方法，其一是利用RAPD技术筛选W染色体特异STS标记，利用Z染色体上的序列为参照，能扩增出W染色体STS标记片段的为雌性，反之为雄性；其二是随着Ellegren等（1997）发现CHD1（chromo-helicase-DNA binding protein-1）基因在禽类的Z、W染色体上都有分布，并且因进化速率不同导致CHD1-Z和CHD1-W长度不同，从PCR扩增的长度上可以判断禽类雌雄性别。利用CHD1基因，国内外已有研究针对一些珍稀禽类进行了性别分子检测探索，取得了显著进展。然而，一方面现有的研究没有涉及养殖越来越普遍的家鸽、鹌鹑和鹦鹉，另一方面现有的引物主要针对普遍的鸟类物种，与特定鸟类基因组的吻合度低，导致PCR效果差。利用现有的引物对鸽子、鹌鹑和鹦鹉进行了分子检测尝试，发现该引物难以扩增鸽子、鹌鹑和鹦鹉的CHD1基因，并且即便扩增出产物，却并不出现雄性一条带，雌性两条带的理论情形，因此利用现有的引物及方法无法对鸽子、鹌鹑和鹦鹉进行雌雄的准确鉴别。

鸽子、鹌鹑和鹦鹉都属于单态性鸟类，即雌雄性别在外观上表现一致，鸽子还严格遵守“一夫一妻制”，因此准确地进行雌雄鉴别对鸽子、鹌鹑和鹦鹉育种和生产都具有重大意义和经济价值。

中国专利申请200410014222.5公开了利用PCR技术扩增引物来鉴别哺乳动物性别的方法，通过检测Y染色体的存在，从而鉴定了哺乳动物的性别。

中国专利申请200810021280.9通过原鸡和小天鹅CHD基因内含子两端的外显子序列比对，在外显子两端分别涉及上下游引物，通过PCR扩增结果判断肉鸽的性别。但该专利申请所涉及的引物仅可用于鉴别肉鸽的性别，对于肉鸽以外的其它禽类没有通用性。

发明内容

本发明的目的在于根据现有的禽类性别鉴别方法无法准确有效地鉴别外观上难以区分性别的禽类品种的问题，提供一种禽类性别的鉴定方法，该方法既可用于鉴别普通禽类性别，还可用于鉴别外观上难以区分性别的禽类性别。

本发明目的通过以下技术方案予以实现：

运用比较基因组法对NCBI数据库中公布的多种禽类的CHD1序列进行比对，确定在所有禽类中较保守的区域，设计一对原创性引物，引物名称为CHD-NIE-1F（核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示）和CHD-NIE-1R（核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示），该引物与其他已报道的禽类性别鉴定的引物完全不同，可用于几乎所有禽类性别的分子鉴定，具体步骤如下：从禽类羽毛毛囊中分别提取基因组，利用该引物进行PCR扩增，PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳后，DNA图谱为单一条带，可以判定该个体性别为雄性；电泳后，DNA图谱为双带，可以判定该个体性别为雌性。

作为一种优选方案，上述鉴别方法中，所述PCR扩增的反应体系为：

模板DNA                  1μL

10×PCR缓冲液             2.5μL

dNTPs                     0.5μL

Mg²⁺                      1.5μL

引物                      各0.25μL

Taq DNA聚合酶            0.2μL

ddH₂O                     19.05μL。

作为一种优选方案，上述鉴定方法中，所述禽类为鸽子、鹌鹑或鹦鹉。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明方法技术实用性强，重复性好，在保守区域设计引物可以广泛适用于不同禽类性别鉴定，PCR扩增效果好，电泳检测条带清晰，可以准确判定禽类性别，尤其可用于鉴别雌雄性别在外观上表现一致的鸟类。

附图说明

图1是鸽子PCR产物电泳后的图谱，1-6为576 bp单一条带，判定个体性别为雄性；7-12为双带，即含一条576 bp的带和一条368 bp的带，判定个体性别为雌性；

图2是鹌鹑PCR产物电泳后的图谱，1、2为446 bp单一条带，判定个体性别为雄性；3、4为双带，即含一条446 bp的带和一条614 bp的带，判定个体性别为雌性；

图3是鹦鹉PCR产物电泳后的图谱， 2、3为625bp单一条带，判定个体性别为雄性； 1为双带，即含一条458 bp的带和一条625 bp的带，判定个体性别为雌性。

具体实施方式

    以下结合实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例

1. 羽毛采样及DNA提取

（1）拔取鸽子、鹌鹑或鹦鹉尾部下的中毛数根，放入高压消毒过离心管内，带回实验室；

（2）用洁净的剪刀剪下一根长约2 mm 的羽毛根部，放入1.5mL 离心管中；

（3）加入400μL蛋白酶K消化液〔10mmol/L Tris-HCl （PH 8.0），0.2 mmol/L EDTA（PH 8.0），10mmol/L DTT，0.5mg/ mL 蛋白酶K〕，上下摇动使蛋白酶K消化液与羽毛充分混匀，于37℃水浴过夜；

（4）水浴后取出样品，加入等体积（约400～500μL）的饱和苯酚/氯仿1：1混合溶液，振荡混匀（约10min），10000rpm离心10min；

（5）用移液枪将含有DNA的上层水相小心移至新的离心管中，如果在水相和有机相交界处有白色沉淀物，则重新抽提有机相，合并水相；

（6）所得上清液加入等体积（约150～200μL）的氯仿，振荡混匀，10000rpm离心10min；

（7）取上清，加入十分之一体积（约15～20μL）的醋酸钠，上下颠倒数次；

（8）加入两倍体积（加盐之后计算的体积，约160～440μL）预冷无水乙醇，振荡混匀，并置于－20 ℃沉淀20 min或更长时间，使DNA析出；

（9）10000rpm离心5min，弃上清，往沉淀中加入1mL 70%乙醇，颠倒离心管数次，10000rpm离心5min；

（10）弃上清，离心管敞口置于干燥箱内37℃烘至无酒精味，加入15 μL TE缓冲液或灭菌双蒸水，轻摇，室温过夜使其溶解，并于4℃保存。

2. 引物设计

采用比较基因组法对NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中公布的多种鸟类的CHD1序列进行比对，确定在鸟类中较保守的区域，利用Genetool软件包设计一对原创性引物：CHD-NIE-1F（核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示）和CHD-NIE-1R（核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示）。该引物与其他已报道的鸟类性别鉴定的引物完全不同，可用于几乎所有鸟类性别的分子鉴定。

3. PCR扩增

10μL反应体系中加入模板1μL、含Mg2+的缓冲液5μL，25mM/L的上下游引物各0.2μL、1U的Taq酶及双蒸水。PCR反应条件为：94℃ 3min，35个循环：94℃ 30s，53℃ 30s，72℃延伸30s，后延伸10min，反应产物于4℃保存。表2是PCR的反应体系。

表1   PCR反应混合体系

4. 性别判定

将PCR扩增产物采用1.5%琼脂糖凝胶电泳，鸽子性别鉴定检测结果如图1所示，公鸽为一条带，长度576 bp（如SEQ ID NO:3所示），母鸽为两条带，其中一条与公鸽一样长576 bp的带（如SEQ ID NO:4所示），另一条带则368 bp（如SEQ ID NO:5所示）。鹌鹑性别鉴定检测结果如图2所示，公鹌鹑为一条长度446 bp的带（如SEQ ID NO:6所示），母鹌鹑则是长度446 bp（如SEQ ID NO:7所示）和614 bp（如SEQ ID NO:8所示）的两条带。鹦鹉性别鉴定检测结果如图3所示，公鹦鹉为一条长度625 bp的带（如SEQ ID NO:9所示），母鹦鹉则是长度为458 bp（如SEQ ID NO:10所示）和625 bp（如SEQ ID NO:11所示）的两条带。鸽子、鹌鹑及鹦鹉PCR鉴定的结果与采样现场鉴定的结果相符。

5. 利用DNAStar软件对测序结果进行序列分析

在鉴定成功的样本各选取鸽子、鹌鹑及鹦鹉的一公一母的PCR产物，送英骏生物公司测序，以验证鉴别的准确性。使用MEGA和DNASTAR的MegAlign和SeqMan软件对鸽子、鹦鹉和鹌鹑的测序结果进行分析，证实为CHD1基因。

Claims (4)

1.一种鉴定禽类性别的方法，其特征在于所述方法是通过设计一对特异性引物，核苷酸序列如SEQ ID NO:1~2所示，对禽类基因组DNA进行PCR扩增，将产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据带型判断性别，DNA图谱为单一条带时，待测个体为雄性；DNA图谱为双条带时，待测个体为雌性。

2.根据权利要求1所述鉴定禽类性别的方法，其特征在于所述PCR扩增的反应体系为：

模板DNA                  1μL

10×PCR缓冲液             2.5μL

dNTPs                     0.5μL

Mg²⁺                      1.5μL

引物                      各0.25μL

Taq DNA聚合酶            0.2μL

ddH₂O                     19.05μL。

3.根据权利要求1所述鉴定禽类性别的方法，其特征在于所述鸟类基因组DNA是从禽类羽毛毛囊中提取得到。

4.根据权利要求1或2或3所述鉴定禽类性别的方法，其特征在于所述禽类为鸽子、鹌鹑或鹦鹉。

Images