CN101962644A - 一种猪新基因bcl-gl多克隆抗体的制备方法 - Google Patents

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CN101962644A CN2010101983469A CN201010198346A CN101962644A CN 101962644 A CN101962644 A CN 101962644A CN 2010101983469 A CN2010101983469 A CN 2010101983469A CN 201010198346 A CN201010198346 A CN 201010198346A CN 101962644 A CN101962644 A CN 101962644A
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蒋朋飞
张德礼
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Northwest A&F University
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Northwest A&F University
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Abstract

本发明公开了一种猪新基因BCL-GL多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：A1：猪BCL-GL基因的克隆；A2：原核表达载体pET32a-BCL-GL的构建；A3：真核表达载体pEGFP-BCL-GL的构建；A4：BCL-GL蛋白的原核表达；A5：BCL-GL蛋白的纯化和豚鼠抗BCL-GL多克隆抗体的制备。

Description

一种猪新基因BCL-GL多克隆抗体的制备方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及的是一种猪新基因BCL-GL多克隆抗体的制备方法。
背景技术
细胞凋亡(apoptosis)也称为“程序性细胞死亡”或“细胞***”，近年来大量的研究工作揭示细胞凋亡与细胞增殖和分化具有同样重要的意义。对免疫***而言，细胞凋亡不仅是免疫***发育过程中必不可少的一个环节，而且是免疫***行使功能的一种方式。越来越多的研究资料表明，细胞凋亡与肿瘤发生、病毒感染细胞的清除等有密切关系，因而对细胞凋亡的研究对肿瘤、病毒病等疾病的治疗也有很大意义。细胞凋亡的发生和调控涉及到多个基因家族，其中BCL2基因家族就是一个与凋亡密切相关的基因家族，该家族成员对细胞凋亡与否起关键作用，已知BCL-G是近年来在人类、小鼠和牛等物种发现的BCL2家族的成员之一，其可变剪接体BCL-Gs和BCL-GL均为促细胞凋亡因子。而在猪体内是否含有类似的基因，还没有报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种猪新基因BCL-GL多克隆抗体的制备方法。
本发明的技术方案如下：
一种猪新基因BCL-GL多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：A1：猪BCL-GL基因的克隆；A2：原核表达载体pET32a-BCL-GL的构建；A3：真核表达载体pEGFP-BCL-GL的构建；A4：BCL-GL蛋白的原核表达；A5：BCL-GL蛋白的纯化和豚鼠抗BCL-GL多克隆抗体的制备。所述的方法，所述A1具体执行以下操作：以人BCL-GL基因cDNA序列为种子序列，在GenBank中对猪的ESTs数据库进行BLAST比对拼接，得到猪的BCL-GL基因的cDNA序列；以所述cDNA序列为参照，设计上游克隆引物P1：SEQ ID NO：1，下游克隆引物P2：SEQ ID
NO：2；取1日龄大约克夏猪脾脏组织，采用TRIzol法提取总RNA，用反转录试剂盒反转录得到总cDNA；以所述总cDNA为模板，进行PCR，同时用猪β-actin作为PCR内参；扩增得到目的序列；回收所述目的序列，连接到pMD19-T载体得到重组质粒pMD19-BCL-GL，转化到DH5α感受态细胞；通过蓝白斑筛选，选出阳性菌落，提取质粒，经过双酶切鉴定后送测序公司进行测序。
所述的制备方法，所述25μL PCR反应体系为：Premix Taq酶12.5μL，cDNA 1.25μL，引物P10.5μL，引物P20.5μL，ddH2O 10.25μL；所述PCR参数为95℃5min，然后94℃1min，53℃1min，72℃1.5min，共30个循环，然后72℃延伸10min。
所述的制备方法，所述步骤A2执行以下操作：根据所述pMD19-BCL-GL载体测序结果，设计原核表达引物，上游原核表达引物P3：SEQ ID NO：3，下游原核表达引物P4：SEQID NO：4；以所述总cDNA为模板，用上、下游原核表达引物进行PCR扩增得到目的序列；将所述目的序列和pET32-a载体进行BamH I和Hind III双酶切3h；进行电泳检测和凝胶回收；将回收产物用T4DNA连接酶于16℃连接过夜；将连接产物转化到DH5α感受态细胞；经蓝白斑筛选出阳性克隆，提取质粒进行BamH I和Hind III双酶切鉴定，重组质粒命名为pET32a-BCL-GL；然后将重组表达质粒转化到BL21感受态细胞，经双酶切鉴定后，由测序公司进行测序。
所述的制备方法，所述25μLPCR反应体系包括：Premix Taq酶12.5μL，模板1.25μL，引物P30.5μL，引物P40.5μL，ddH2O 10.25μL；所述PCR反应参数为95℃5min，然后94℃1min，60℃1min，72℃1.5min，共30个循环，然后72℃延伸10min。
所述的制备方法，所述步骤A3中真核表达载体的构建过程中，上游引物P5：SEQ IDNO：5，下游引物P6：SEQ ID NO：6；所用表达载体为pEGFP-C1，重组质粒命名为pEGFP-BCL-GL。
所述的制备方法，步骤A4中，所述BCL-GL蛋白的原核表达方法为：将转化有重组表达质粒pET32a-BCL-GL的BL21菌，接种到含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃培养过夜；次日，以1％的接种量接种到5mL含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基，扩大培养2h后，用终浓度为0.5mmol/L的IPTG进行诱导，于24℃在180r/min摇转培养7h；取菌液进行超声波裂解，离心后分别取上清和沉淀制备蛋白电泳样品，进行SDS-PAGE分析。
所述的制备方法，所述步骤A5中BCL-GL蛋白的纯化和豚鼠抗BCL-GL多克隆抗体的制备方法为：收集所述诱导后的菌体，用his-标签蛋白纯化试剂盒进行蛋白纯化，经SDS-PAGE分析鉴定纯度及大小后，-20℃保存备用；使用时将所述纯化蛋白用生理盐水稀释；选取雄性豚鼠进行多克隆抗体制备。
所述的制备方法，所述选用雄性豚鼠制备多克隆抗体的方法为：选取质量200g左右的雄性豚鼠6只进行多克隆抗体制备；初次免疫前，先各抽取1mL血液，制备血清，-20℃保存备用；初次免疫，将稀释的纯化蛋白与等体积弗氏完全佐剂充分乳化，每只豚鼠皮下免疫200μg；初免后14d进行2次免疫，与等体积弗氏不完全佐剂充分乳化，每只豚鼠皮下加强免疫150μg；23d后进行3次免疫，与等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化，每只豚鼠皮内加强免疫100μg；31d后进行4次免疫，每只豚鼠皮内加强免疫100μg；4次免疫后6d采血，制备血清，用双向琼脂糖凝胶扩散实验初步测定抗体效价；40d后5次免疫，每只豚鼠在大腿外侧肌肉注射100μg；5次免疫后6d每只豚鼠采血6mL，制备血清，分装后-20℃保存备用。
本发明根据人类BCL-GL基因序列，克隆、表达该基因，并制备多克隆抗体，利用该多克隆抗体能够检测到该目的蛋白的表达，对目的蛋白进行定位，实现了在蛋白水平对该基因表达情况的检测，为进一步研究揭示该基因在真核细胞以及动物机体中的功能奠定基础。
附图说明
图1是BCL-GLcDNA PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测，M：2 000bp marker；1：β-actin；2：BCL-GL基因的PCR产物；
图2是原核表达载体pET32a-BCL-GL的酶切鉴定，M：15 000bp DNA marker；1：pET32a-BCL-GL/BamHⅠ+Hind Ⅲ；
图3是原核表达载体pET32a-BCL-GL的酶切鉴定，M：15 000bp DNA marker；1：pET32a-BCL-GL/BamHⅠ+Hind Ⅲ；
图4是真核表达载体pEGFP-BCL-GL的酶切鉴定，M：15 000bp DNA marker；1：pEGFP-BCL-GL/Hind Ⅲ+BamHⅠ。
图5是BCL-GL原核表达的SDS-PAGE分析，M：蛋白marker；1：重组载体pET32a-BCL-GL转化的大肠杆菌BL21经IPTG诱导表达菌体裂解的上清；2：重组载体pET32a-BCL-GL转化的大肠杆菌BL21经IPTG诱导表达菌体裂解的沉淀；3：未经IPTG诱导的重组载体pET32a-BCL-GL转化的大肠杆菌BL21；4：空载体pET-32a转化的大肠杆菌BL21经IPTG诱导表达；5：未转化任何载体的大肠杆菌BL21经IPTG诱导；
图6是用多克隆抗体对猪EC细胞中BCL-GL过表达的Western blot检测，M：蛋白marker；1：GFP-BCL-GL蛋白。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。
材料：1日龄健康大约克夏猪；TRIzol试剂购自Invitrogen公司；RT-PCR反转录试剂盒购自Fermentas公司；Premix Taq DNA聚合酶、限制性内切酶以及T4 DNA连接酶均购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司；胶回收试剂盒购自Bioteke公司；质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；蛋白纯化试剂盒购自Promega公司；弗氏完全佐剂和不完全佐剂购自Sigma公司；成年实验用豚鼠购自第四军医大学实验动物中心；HRP标记的羊抗豚鼠二抗和ECL发光液购自北京博奥森生物技术有限公司；DMEM细胞培养基购自Gibco公司；6孔、24孔细胞培养板购自Costar公司；Western blot所用聚偏二氟乙烯膜(Polyvinylidene fluoride，PVDF)为美国Millipore生产；pEGFP-C1载体，pET-32a载体，大肠杆菌DH5α，BL21 均购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司；猪脐静脉血管内皮细胞(EC细胞)为申请人构建(参考资料，永生化猪脐静脉血管内皮细胞系的建立及其生物学特征分析[D]；作者：洪海霞；陕西：西北农林科技大学动物医学院，2007)。
实施例1
猪BCL-GL基因的克隆：
以人BCL-GL基因cDNA序列(登录号NM_138722)为种子序列，在GenBank中对猪的ESTs数据库进行BLAST比对拼接，得到猪的BCL-GL基因的cDNA序列。以此序列为参照，设计上游克隆引物(SEQ ID NO：1)P1：5’-TCCTTACTGCCACCTGAC-3’，下游克隆引物(SEQ ID NO：2)P2：5’-ATGCTGCCACATCCTATG-3’。
取1日龄大约克夏猪脾脏组织，采用TRIzol法提取总RNA，用反转录试剂盒反转录得到总cDNA。以此为模板，进行PCR，同时用猪β-actin作为PCR内参。25μL反应体系包括：Premix Taq酶12.5μL，cDNA 1.25μL，引物P1 0.5μL，引物P20.5μL，ddH2O 10.25μL。PCR参数为95℃5min，然后94℃1min，53℃1min，72℃1.5min，共30个循环，然后72℃延伸10min。扩增得到目的序列。回收目的序列，连接到pMD19-T载体得到重组质粒pMD19-BCL-GL，转化到DH5α感受态细胞。通过蓝白斑筛选，选出阳性菌落，提取质粒，经过双酶切鉴定后送北京奥科生物技术有限责任公司进行测序。
实施例2
原核表达载体pET32a-BCL-GL的构建：根据pMD19-BCL-GL载体测序结果，设计原核表达引物。上游引物(SEQ ID NO：3)P3：5’-AAGGATCCATGTGCACCACCAGC-3’，下游引物(SEQID NO：4)P4：5’-CCAAGCTTTCAGTCTACTTCTTCATGGG-3’。以总cDNA为模板，用上下游原核表达引物进行PCR，25μL反应体系包括：Premix Taq酶12.5μL，模板1.25μL，引物P30.5μL，引物P40.5μL，ddH2O 10.25μL。PCR参数为95℃5min，然后94℃1min，60℃1min，72℃1.5min，共30个循环，然后72℃延伸10min。扩增得到目的序列。将目的序列和pET32-a载体进行BamH I和Hind III双酶切3h。进行电泳检测和凝胶回收。将回收产物用T4 DNA连接酶于16℃连接过夜。将连接产物转化到DH5α感受态细胞。经蓝白斑筛选出阳性克隆，提取质粒进行BamH I和Hind III双酶切鉴定，重组质粒命名为pET32a-BCL-GL。然后将重组表达质粒转化到BL21感受态细胞，经双酶切鉴定后，由北京奥科生物技术有限责任公司进行测序。
实施例3
真核表达载体pEGFP-BCL-GL的构建：真核表达载体的构建方法与实施例2中基本相同，上游引物(SEQ ID NO：5)P5：5’-CAAAGCTTATATGTGCACCACCAGCACC-3’，下游引物(SEQ ID NO：6)P6：5’-CCGGATCCTCAGTCTACTTCTTCATGGG-3’；所用表达载体为pEGFP-C1。重组质粒命名为pEGFP-BCL-GL。
实施例4
BCL-GL蛋白的原核表达：将转化有重组表达质粒pET32a-BCL-GL的BL21菌，接种到含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃培养过夜。次日，以1％的接种量接种到5mL含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基，扩大培养2h后，用终浓度为0.5mmol/L的IPTG进行诱导，于24℃在180r/min摇转培养7h。取菌液进行超声波裂解，离心后分别取上清和沉淀制备蛋白电泳样品，进行SDS-PAGE分析。
实施例5
BCL-GL蛋白的纯化和豚鼠抗BCL-GL多克隆抗体的制备：收集诱导后的菌体，用his-标签蛋白纯化试剂盒进行蛋白纯化，经SDS-PAGE分析鉴定纯度及大小后，-20℃保存备用。使用时将纯化蛋白用生理盐水稀释。选取质量200g左右的雄性豚鼠6只进行多克隆抗体制备。初次免疫前，先各抽取1mL血液，制备血清，-20℃保存备用。初次免疫，将稀释的纯化蛋白与等体积弗氏完全佐剂充分乳化，每只豚鼠皮下免疫200μg；初免后14d进行2次免疫，与等体积弗氏不完全佐剂充分乳化，每只豚鼠皮下加强免疫150μg；23d后进行3次免疫，与等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化，每只豚鼠皮内加强免疫100μg。31d后进行4次免疫，每只豚鼠皮内加强免疫100μg。4次免疫后6d采血，制备血清，用双向琼脂糖凝胶扩散实验初步测定抗体效价，基本方法：在干净玻璃板上用18g/L的琼脂糖制备凝胶板，厚度约1mm，冷凝后打孔(中心1孔，周围6孔)，孔距为4mm，中心孔加抗原50μL，将抗血清按二倍稀释法稀释为1∶2-1∶64，在周围6孔各加50μL，待孔内液体渗入凝胶后放于湿盒中37℃下孵育24h，观察有无沉淀线产生。40d后5次免疫，每只豚鼠在大腿外侧肌肉注射100μg。5次免疫后6d每只豚鼠采血6mL，制备血清，分装后-20℃保存备用。
实施例6
豚鼠抗BCL-GL蛋白抗体的特性鉴定：(1)抗体效价测定：双向琼脂糖凝胶扩散实验和间接ELISA法测定。双向琼脂糖凝胶扩散实验方法与实施例5中相同。间接ELISA基本方法：包被抗原，用包被缓冲液稀释His-BCL-GL融合蛋白至10mg/L，每孔加0.1mL，4℃过夜；洗涤，去除包被液，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次5min(以下洗涤方法相同，简称洗涤)；包被一抗，抗血清稀释度为1∶50-1∶800，每孔加入0.2mL，37℃孵育1h；洗涤；包被二抗，HRP-羊抗豚鼠IgG，稀释度为1∶2 500，每孔加入0.1mL，37℃孵育1h；洗涤；显色，每孔加入0.1mL新配制的TMB底物液，37℃孵育10min；终止反应，每孔加入2mol/L的硫酸50μL；酶标仪测定450nm波长处的吸光值。(2)抗体特异性鉴定：Western blot检测。将转染有真核重组表达载体pEGFP-BCL-GL的猪脐静脉血管内皮细胞(EC细胞)裂解，提取上清；进行SDS-PAGE电泳；将凝聚中的蛋白转移到PVDF膜上；封闭液封闭；结合一抗，1∶500的豚鼠抗BCL-GL抗血清，37℃孵育1h；结合二抗，1∶3 000的羊抗豚鼠的HRP标记二抗，37℃孵育1h；ECL发光液显色；暗室中进行显影，定影。
鉴定结果：
猪BCL-GL基因cDNA的获得及琼脂糖凝胶电泳鉴定  提取猪脾脏组织总RNA，以RT-PCR扩增得到的总cDNA为模板，进行PCR扩增，得到1 251bp的BCL-GLcDNA序列(如图1)。将cDNA序列连接到pMD19-T载体得到重组载体pMD19-BCL-GL，送北京奥科生物技术有限责任公司进行测序。将测序结果的ORF区域与电子克隆得到的contig序列比对发现相似度为99％。运用NCBI中的BLAST工具将该新基因与其他已知物种的同源基因进行比较发现，与人类、牛类和食蟹猴等物种的同源基因相似度分别81％、82％和81％。
原核表达载体的构建及酶切鉴定：
根据BCL-GLcDNA序列测序结果，在ORF两端设计一对带有BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位点的引物，以反转录总cDNA为模板进行PCR得到1 006bp的序列(如图2)。将PCR所得序列重组到原核表达载体pET32-a后，对重组载体进行BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切鉴定，质粒条带和目的基因条带大小均正确(如图3)。
真核表达载体的构建及酶切鉴定：
根据BCL-GLcDNA序列测序结果，在ORF两端设计一对带有Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切位点的引物，以反转录总cDNA为模板进行PCR得到1 008bp的序列。将PCR所得序列重组到真核表达载体pEGFP-C1，对重组pEGFP-BCL-GL载体进行Hind Ⅲ和BamHⅠ双酶切鉴定，质粒条带和目的基因条带大小均正确(如图4)。
IPTG诱导的原核表达：
转化有重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)阳性克隆在经测序鉴定读码框和序列均正确后，用IPTG诱导阳性菌落表达出His-BCL-GL融合蛋白，其相对分子质量(Mr)约为59200(如图5箭头指出)，与预测值相符。并且经裂解菌体分别制备上清和沉淀电泳检测发现，上清和沉淀中均有目的蛋白，但沉淀中的量大于上清中的量。另外未经IPTG诱导的重组载体转化菌体也有少量目的蛋白表达，而IPTG诱导的空载体转化菌体以及未转化任何载体的空菌体均没有目的蛋白表达。
豚鼠抗BCL-GL多克隆抗体的特性鉴定：
(1)抗体效价测定：双向琼脂糖凝胶扩散测定抗体效价为1∶16，ELISA法测定效价为1∶800，说明该多克隆抗体效价能够满足后续研究需要。(2)抗体特异性鉴定：在Westernblot检测的曝光胶片上，发现单一目的条带，并且与Western blot曝光蛋白Marker比较，大小完全一致，说明该多克隆抗体有较高的特异性(如图6)。
目前，国内外对BCL2家族成员研究较多，这是一类与细胞凋亡密切相关的基因。起初，对于该家族中的BCL-G基因的研究较少，仅证明它是促细胞凋亡因子。但是，近几年的研究报道指出，BCL-G基因不仅是定位于12p12染色体上的肿瘤抑制因子，而且是促凋亡因子p53新的作用靶点。另外，BCL-GS蛋白还可以与JAB1相互作用，加速线粒体途径的细胞凋亡，BCL-GL与***性红斑狼疮的发病关系密切。这些研究成果都提示我们对于BCL-G的功能研究很有必要深入进行。根据生物进化论和基因存在论，通过电子克隆的方法，得到猪的BCL-GL cDNA序列，从猪的脾脏组织中将其进行实验室克隆，并成功进行了原核表达。由于该蛋白与其他物种的相似度约为75％，所以认为它可能存在与其他物种不同的功能，为了进一步研究其在真核细胞中以及动物体内的功能和作用机制，制备了豚鼠抗猪BCL-GL的多克隆抗血清。并且，经Western blot验证其对真核细胞中BCL-GL蛋白的过表达检测具有明显效果。
本发明中采用具有活性的原核表达产物BCL-GL去免疫豚鼠制备多克隆抗血清，用于真核水平的蛋白表达检测时，具有避免和真核细胞中的其它蛋白发生交叉反应的效果，因此具有较高的特异性。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
序列表
<110>XXXXX大学
<120>一种猪新基因BCL-GL多克隆抗体的制备方法
 
<130>
 
<160>8
 
<170>PatentIn version 3.5
 
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>引物
 
<400>1
tccttactgc cacctgac                                                   18
 
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>引物
 
<400>2
atgctgccac atcctatg                                                   18
 
<210>3
<211>23
<212>DNA
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<220>
<223>引物
 
<400>3
aaggatccat gtgcaccacc agc                                             23
 
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<212>DNA
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<220>
<223>引物
 
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<211>28
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<223>引物
 
<400>5
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<210>6
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>引物
 
<400>6
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<210>7
<211>989
<212>DNA
<213>猪
 
<400>7
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<210>8
<211>329
<212>PRT
<213>猪
 
<400>8
Met Cys Thr Thr Ser Thr Cys Asp Leu Glu Glu Ile Pro Leu Asp Asp
1               5                   10                  15
Asp Asp Ser Asn Ser Met Glu Phe Lys Ile Leu Glu Phe Tyr Val Thr
            20                  25                  30
His His Val Phe Lys Asn Ser Ser Ala Val Phe Ser Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Arg Thr Arg Ser Leu Ser Gln Lys Gly Pro Gly Ser Trp Pro Val Lys
    50                  55                  60
Glu Ala Trp Thr Gln Gly Pro Trp Pro Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ser
65                  70                  75                  80
Glu Lys Ala Ile Asn Leu Ala Lys Lys Lys Ser Ser Trp Arg Thr Leu
                85                  90                  95
Phe Gly Val Ala Glu Lys Glu Glu Asn Ser Gln Ser Val Pro Thr Gly
            100                 105                 110
Phe Arg Phe Glu Gly Pro Arg Arg Val Glu Thr Gln Ser Gly Ser His
        115                 120                 125
Ser Gln Gln Trp Pro Arg Ser Leu Ser Asn Val Glu Gln Arg Leu Asp
    130                 135                 140
His Glu Ala Val Asp Pro Lys Val Val Ser Ile Ala Asn Arg Val Ala
145                 150                 155                 160
Glu Ile Val Tyr Ser Trp Pro Pro Leu Glu Glu Leu Gln His Gln Gly
                165                 170                 175
Gly Arg Phe Thr Pro Lys Arg Asn Arg Glu Lys Pro Cys Val Gln Leu
            180                 185                 190
Gln Gly Ser Gln Ala Arg Ala Pro Ser Ala Lys Lys Asp Gly Glu Asp
        195                 200                 205
Gln Ile Ile Ala Arg Ile Val Glu Leu Leu Lys Tyr Ser Gly Asp Gln
    210                 215                 220
Leu Glu Arg Glu Leu Lys Lys Asp Ser Ile Leu Met Thr Ser Phe Gln
225                 230                 235                 240
Asp Gly Leu Ser Tyr Ser Val Phe Lys Thr Ile Thr Asp Gln Phe Leu
                245                 250                 255
Arg Gly Val Asp Thr Arg Gly Glu Ser Glu Val Lys Ala Gln Ser Phe
            260                 265                 270
Lys Ala Ala Leu Ala Ile Asp Ala Met Ala Lys Leu Thr Thr Ile Asp
        275                 280                 285
Asn His Pro Met Asn Arg Val Leu Gly Phe Gly Thr Lys Tyr Leu Lys
    290                 295                 300
Glu Asn Phe Ser Pro Trp Val Gln Gln His Gly Gly Trp Glu Lys Val
305                 310                 315                 320
Leu Gly Thr Ser His Glu Glu Val Asp
                325

Claims (9)

1.一种猪新基因BCL-GL多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A1：猪BCL-GL基因的克隆；A2：原核表达载体pET32a-BCL-GL的构建；A3：真核表达载体pEGFP-BCL-CL的构建；A4：BCL-GL蛋白的原核表达；A5：BCL-GL蛋白的纯化和豚鼠抗BCL-GL多克隆抗体的制备。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述A1具体执行以下操作：以人BCL-CL基因cDNA序列为种子序列，在GenBank中对猪的ESTs数据库进行BLAST比对拼接，得到猪的BCL-GL基因的cDNA序列；以所述cDNA序列为参照，设计上游克隆引物P1：SEQ ID NO：1，下游克隆引物P2：SEQ ID NO：2；取1日龄大约克夏猪脾脏组织，采用TRIzol法提取总RNA，用反转录试剂盒反转录得到总cDNA；以所述总cDNA为模板，进行PCR，同时用猪β-actin作为PCR内参；扩增得到目的序列；回收所述目的序列，连接到pMD19-T载体得到重组质粒pMD19-BCL-GL，转化到DH5α感受态细胞；通过蓝白斑筛选，选出阳性菌落，提取质粒，经过双酶切鉴定后送测序公司进行测序。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述25μL PCR反应体系为：Premix Taq酶12.5μL，cDNA 1.25μL，引物P10.5μL，引物P20.5μL，ddH2O 10.25μL；所述PCR参数为95℃ 5min，然后94℃ 1min，53℃ 1min，72℃ 1.5min，共30个循环，然后72℃延伸10min。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述步骤A2执行以下操作：根据所述pMD19-BCL-GL载体测序结果，设计原核表达引物，上游原核表达引物P3：SEQ IDNO：3，下游原核表达引物P4：SEQ ID NO：4；以所述总cDNA为模板，用上、下游原核表达引物进行PCR扩增得到目的序列；将所述目的序列和pET32-a载体进行BamH I和HindIII双酶切3h；进行电泳检测和凝胶回收；将回收产物用T4 DNA连接酶于16℃连接过夜；将连接产物转化到DH5α感受态细胞；经蓝白斑筛选出阳性克隆，提取质粒进行BamHI和Hind III双酶切鉴定，重组质粒命名为pET32a-BCL-GL；然后将重组表达质粒转化到BL21感受态细胞，经双酶切鉴定后，由测序公司进行测序。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述25μLPCR反应体系包括：Premix Taq酶12.5μL，模板1.25μL，引物P30.5μL，引物P40.5μL，ddH2O10.25μL；所述PCR反应参数为95℃ 5min，然后94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 1.5min，共30个循环，然后72℃延伸10min。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A3中真核表达载体的构建过程中，上游引物P5：SEQ ID NO：5，下游引物P6：SEQ ID NO：6；所用表达载体为pEGFP-C1，重组质粒命名为pEGFP-BCL-GL。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤A4中，所述BCL-GL蛋白的原核表达方法为：将转化有重组表达质粒pET32a-BCL-GL的BL21菌，接种到含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃培养过夜；次日，以1％的接种量接种到5mL含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基，扩大培养2h后，用终浓度为0.5mmol/L的IPTG进行诱导，于24℃在180r/min摇转培养7h；取菌液进行超声波裂解，离心后分别取上清和沉淀制备蛋白电泳样品，进行SDS-PAGE分析。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A5中BCL-GL蛋白的纯化和豚鼠抗BCL-GL多克隆抗体的制备方法为：收集所述诱导后的菌体，用his-标签蛋白纯化试剂盒进行蛋白纯化，经SDS-PAGE分析鉴定纯度及大小后，-20℃保存备用；使用时将所述纯化蛋白用生理盐水稀释；选取雄性豚鼠进行多克隆抗体制备。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述选用雄性豚鼠制备多克隆抗体的方法为：选取质量200g左右的雄性豚鼠6只进行多克隆抗体制备；初次免疫前，先各抽取1mL血液，制备血清，-20℃保存备用；初次免疫，将稀释的纯化蛋白与等体积弗氏完全佐剂充分乳化，每只豚鼠皮下免疫200μg；初免后14d进行2次免疫，与等体积弗氏不完全佐剂充分乳化，每只豚鼠皮下加强免疫150μg；23d后进行3次免疫，与等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化，每只豚鼠皮内加强免疫100μg；31d后进行4次免疫，每只豚鼠皮内加强免疫100μg；4次免疫后6d采血，制备血清，用双向琼脂糖凝胶扩散实验初步测定抗体效价；40d后5次免疫，每只豚鼠在大腿外侧肌肉注射100μg；5次免疫后6d每只豚鼠采血6mL，制备血清，分装后-20℃保存备用。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106811470A (zh) * 2015-11-30 2017-06-09 四川农业大学 一种犬松弛素原重组蛋白及犬松弛素原多克隆抗体的制备方法
CN106866825A (zh) * 2017-03-23 2017-06-20 南阳师范学院 家蚕内参蛋白gapdh多克隆抗体及其制备方法
CN109651488A (zh) * 2018-12-21 2019-04-19 广西壮族自治区兽医研究所 猪丁型冠状病毒重组n蛋白及其多克隆抗体的制备方法

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