CN101957375A - 呋喃它酮残留物无标记阻抗型免疫传感器及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及呋喃它酮残留物无标记的阻抗型免疫传感器，及其制备方法和应用，所说的该传感器通过金胶制备、金电极的预处理、1，4-苯二硫醇修饰金电极、单层纳米金胶的自组装和抗体的固定5个步骤而制得。其特征在于是将纳米金通过自组装方法固定于金电极表面，用来固定呋喃它酮残留物的单克隆抗体而构建得到。使用时，先建立阻抗的相对变化率%△R_ct与AMOZ浓度的关系，再根据待测样品的阻抗相对变化率%△R_ct就可确定其AMOZ浓度。采用本发明的传感器和检测方法具有快速简便的特点，解决当前呋喃它酮残留检测操作费时的缺陷。

Description

呋喃它酮残留物无标记阻抗型免疫传感器及制备方法和应用

技术领域

本发明属于药物残留检测领域；具体涉及呋喃它酮残留物无标记阻抗型免疫传感器及其制备方法和应用。

背景技术

硝基呋喃类药物是人工合成的广谱抗生素，它有非常好的抗菌作用和药理动力学特性，除了作为一种抗生素被应用于兽医医疗中外，它还曾作为猪、禽与水产品促生长的添加剂被广泛应用。但在长时间的实验室研究过程中发现，硝基呋喃类药物及其代谢产物均可以使实验动物发生癌变和基因突变，鉴于此，欧盟分别于1993年（欧盟法令2901/93）与1995年（欧盟法令1442/95）立法禁止在动物源性食品生产加工过程中使用呋喃它酮（Furaltadone）、呋喃西林(Nitrofurazone)、呋喃咀啶(Nitrofurantoin)与呋喃唑酮(Furazolidone)等四种药物。其后，美国、加拿大、澳新与日本等国均全面禁止使用硝基呋喃类药物。2002年3月我国也将硝基呋喃类药物列为禁用兽药。研究证明，硝基呋喃类药物在动物体内若干小时就会迅速分解成硝基呋喃与各种代谢产物，这些代谢产物与组织内蛋白质形成较为稳定的化合物，该化合物可以在组织中存留较长时间，所以分析此类药物残留时应该对其代谢产物进行检测分析，欧盟等国就是以检测代谢产物为手段达到检测硝基呋喃残留的目的。四种硝基呋喃类药物的代谢产物分别对应为：呋喃它酮—3-氨基-5-吗啉基-2-氧唑酮（AMOZ）；呋喃西林—氨基脲（SEM）；呋喃咀啶—1-氨基咀啶（AHD）；呋喃唑酮—3-氨基-2-氧唑酮（AOZ）。

随着我国加入世贸组织以来，欧美日等发达国家利用自身技术优势对我国出口食品及农副产品不断设置新的技术壁垒措施，以达到限制我国食品与农副产品的出口，有关这方面的贸易纠纷接踵而来，欧盟早在2000年初就开始了一项长达42个月的FoodBRAND计划(QLK1-1999-00142)，其主要目的是要求欧盟各认可实验室对食品中硝基呋喃类残留检测方法（包括ELISA与LC-MS-MS方法）进行攻关研究，以为其设置技术壁垒提供技术支持。目前，欧盟规定不得在食品中检测出硝基呋喃类药物四种代谢产物残留，鉴于此，欧盟等国家已研制出液质联用色谱仪检测分析方法，同时也有酶联免疫检测试剂盒的制备和使用，我国相关科研人员也研制成功上述检测方法。但目前已有的针对上述残留物的快速检测方法（ELISA与LC-MS-MS方法）由于均需对残留物进行衍生化处理，检测工作量大，需耗费至少24小时，所需时间较长，达不到快速检测的要求。

本发明旨在通过免疫传感器的制备，建立一种呋喃它酮残留快速检测方法。

发明内容

本发明的目的是为人们提供一种呋喃它酮残留物无标记阻抗型免疫传感器及其制备方法和应用。

本发明所说的呋喃它酮残留物无标记的阻抗型免疫传感器，是将纳米金通过自组装方法固定于金电极表面，用来固定呋喃它酮残留物的单克隆抗体而构建得到。

上述呋喃它酮残留物无标记的阻抗型免疫传感器具体是通过以下步骤制得：

（1）金胶的制备：制备金纳米粒子溶液；

（2）金电极的预处理：金电极先用0.3，0.05μm的三氧化二铝粉末在丝绸上抛光，然后依次用二次水和无水乙醇超声清洗；再将抛光处理好的金电极置于0.5M H2SO4溶液中，在-0.5到+1.4V范围内进行循环伏安扫描25圈，扫速为0.1V s-1；然后将电极在氮氛下干燥；

（3）1，4-苯二硫醇修饰金电极：将预处理好的金电极浸入含15 mM的1，4-苯二硫醇的无水乙醇溶液中，4oC下放置10 min，然后用无水乙醇冲洗表面，再在氮氛下干燥；

（4）单层纳米金胶的自组装：将自组装了1，4-苯二硫醇的金电极浸入金胶溶液中，放在暗处置于室温下5h后，取出后用二次水冲洗表面；

（5）抗体的固定：将纳米金修饰电极浸入含0.030 mg/mL AMOZ抗体的磷酸缓冲溶液（pH7.0）中，于4°C下放置12 h；然后将其取出后再放入10.0 mg/mL的牛血清蛋白溶液中，置于37.5oC水浴中1小时，以封闭非特异性位点；最后将取出后的电极用二次水冲洗以除去表面多余的牛血清蛋白；即制得呋喃它酮残留物无标记的阻抗型免疫传感器。

本发明还公开了使用上述呋喃它酮残留物无标记的阻抗型免疫传感器检测呋喃它酮残留物的方法，具体是：

（1）建立阻抗的相对变化率%△R_ct与AMOZ浓度的关系：测定阻抗型免疫传感器的起始阻抗值R_ct(BSA) ，以及阻抗型免疫传感器分别与不同浓度的AMOZ标准溶液进行免疫反应后阻抗值R_ct(AMOZ-Ab) ，按公式                                                

计算出阻抗的相对变化率%△R_ct；阻抗的相对变化率%△R_ct与AMOZ浓度对数在1.0 到1.0 ?? 10⁶ ng/mL范围内呈线性关系, 检测限为1.0 ng/mL；其中所说的免疫反应条件是在pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中进行，37.5°C温育3h；

（2）按照步骤（1）的方法和条件将阻抗型免疫传感器与待测物溶液进行免疫反应，测定阻抗值，计算得到抗体与AMOZ反应后引起阻抗的相对变化率%△R_ct；

（3）根据步骤（1）确定的阻抗的相对变化率%△R_ct与AMOZ浓度的关系，确定出待测物溶液中AMIOZ残留物含量。

本发明利用电化学阻抗技术，通过直接测定抗原-抗体发生免疫反应前后对阻抗测试溶液铁***和亚铁***在传感器表面发生氧化还原时电子传递阻抗的改变，制备针对呋喃它酮代谢产物呋喃它酮-3-氨基-5-吗啉基-2-氧唑酮（AMOZ）特异的快速检测无标记型免疫传感器，寻求AMOZ浓度与免疫反应前后阻抗变化率之间的关系，实现对AMOZ的快速检测。与液质联用色谱分析法相比，该方法对样品的前处理要求较低，分析过程简单，检测时间由原来的24小时缩短到3小时，而且检测灵敏度也较高，为我国畜禽产品进出口贸易中呋喃它酮残留检测提供一种高效、简便的途径。

附图说明

图1是抗体浓度对抗体固定后电极阻抗的影响。

图2是配制抗体溶液的磷酸盐缓冲溶液pH对抗体固定后电极阻抗的影响。

图3是免疫反应时间对阻抗相对变化率的影响。

图4是免疫反应溶液的pH对阻抗相对变化率的影响。

图5是免疫反应温度对阻抗相对变化率的影响。

具体实施方式

实施例一 传感器的制备

（1）金胶的制备

金胶的制备可按现有技术进行。所有制备纳米金胶的玻璃器皿都需用1:3（v/v）HNO₃-HCl 溶液浸泡一段时间，使用前用二次蒸馏水冲洗干净。本实施例中金纳米粒子的制备方法如下：将100 mL 0.01%的HAuCl₄溶液加热至沸腾，在剧烈搅拌的条件下加入2.50 mL 1.0%的柠檬酸钠溶液，溶液颜色先由无色变成墨色再变成墨绿色，最后为酒红色并呈透明状即可。经透射电子显微镜观察，制备的金纳米粒子粒径约为25 nm。另外，根据纳米金胶溶液的紫外－可见吸收光谱曲线，在520 nm左右出现了纳米金胶的吸收峰，这与文献报道结果相一致。所得金纳米粒子溶液置于棕色瓶中在4°C下保存备用。

（2）金电极的预处理

   金电极首先分别用0.3，0.05μm的三氧化二铝粉末在丝绸上抛光，然后依次用二次水和无水乙醇超声清洗。然再将抛光处理好的金电极置于0.5MH₂SO₄溶液中，在-0.5到+1.4V范围内进行循环伏安扫描25圈，扫速为0.1V s^-1。然后将电极在氮氛下干燥。

（3）1，4-苯二硫醇修饰金电极

    将预处理好的金电极浸入15 mM的1，4-苯二硫醇的无水乙醇溶液中，4oC下放置10 min，然后用无水乙醇冲洗表面，然后在氮氛下干燥。

（4）单层纳米金胶的自组装

将自组装了1，4-苯二硫醇的金电极浸入金胶溶液中，放在暗处置于室温下5h后，取出后用二次水冲洗表面。

（5）抗体的固定

将纳米金修饰电极浸入含0.2 mL 0.030 mg/mL 抗AMOZ单克隆抗体的磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)中，于4°C下放置12 h。电极取出后再放入10.0 mg/mL的牛血清蛋白中，置于37.5^oC水浴中1小时，以封闭非特异性位点。最后将取出的电极用二次水冲洗以除去表面多余的牛血清蛋白。将制备好的修饰有抗体的电极浸入磷酸缓冲溶液（pH=7.0）中，置于4^oC保存备用。

本实施例中使用的抗AMOZ单克隆抗体，是由杂交瘤细胞株AMOZ-D4E10分泌的，该细胞株公开于中国专利申请第20061012 7111.4号，扬州大学兽医学院动物预防医学重点实验室制备和保存，自申请日起向公众提供20年；公众也可从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心获得，该细胞株保藏号为CGMCC No: 1792。但本领域的技术人员可发理解，本发明中不限于使用该细胞株分泌的单克隆抗体，其他抗AMOZ抗体也同样能用来制作本发明的传感器。

实施例二检测方法的建立

（1）抗体固定条件的优化

①抗体浓度的影响

   传感器对AMOZ抗原的响应与AMOZ抗体的在电极表面的固定量有关， 电极表面单位面积固定的抗体量越多，则可结合抗原的位点就越多，越有利于与抗原分子的结合。在传感器的制备中，当改变AMOZ抗体用量时，所得传感器的性能呈现明显差异。由图1可见，当抗体浓度小于0.025 mg/mL时，阻抗随着抗体浓度的增加而增大；当抗体浓度大于0.025 mg/mL，阻抗的响应基本不变。所以实验过程中选择将抗体浓度为0.030 mg/mL 。 

②pH对抗体固定的影响

研究了配制抗体用的磷酸盐溶液在pH在6.0到8.5范围内对抗体固定的影响（图2）。结果表明当溶液pH为7.0时阻抗达到最大，说明在此条件下抗体在纳米金表面的固定量达到最大。故固定用抗体溶液的pH选用7.0的磷酸盐缓冲液来控制。

（2）抗体-抗原免疫反应条件优化

①温育时间的影响

在免疫反应中，温育时间是衡量免疫反应检测的一个重要因素。本实验中，为了选择免疫反应最佳反应时间，将固定了抗体的电极在浓度为1.0×10³ng/mL磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)中温育，检测阻抗相对变化值。从图3可以看出，温育时间小于3小时，阻抗的相对变化随着温育时间的延长而增加。当温育时间达到3小时后，阻抗的相对变化基本不变，表明抗原的吸附量达到最大。因此，选取3小时作为免疫反应的温育时间。

②抗体-抗原反应的pH值的影响

将固定了抗体的电极分别浸入到pH为6.0，6.5，7.0，7.4，8.0和8.5的浓度同为1.0×10³ ng/mLAMOZ的磷酸盐缓冲溶液中温育3h，测量其阻抗的相对变化。结果表明，pH值从6.0到7.4，阻抗的相对变化值逐渐增大，pH值从7.4到8.5，阻抗的相对变化值逐渐减小(图4)。因此，选取pH7.4的磷酸盐缓冲液作为抗体-抗原反应的最佳缓冲液。

③抗体-抗原反应的温育温度的影响

温育温度对电极表面发生的免疫反应有一定的影响。将修饰了抗体的电极浸入浓度为1.0×10³ ng/mL AMOZ的磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)中温育3h，当温育温度从20增加到50°C时，阻抗的相对变化值在37.5°C时达到最大值（图5）。因此选取37.5°C作为免疫反应最佳温育温度。

（3）干扰试验

为了探讨该免疫传感器的特异性，使用硝基呋喃类代谢的其他三种产物作为干扰物测定对象。在浓度为1.0 ng/mLAMOZ溶液中分别加入不同浓度的干扰物质，将固定了抗体的电极浸入其中进行反应，测定其阻抗值（结果见表1）。从表1可以看出，加入干扰物质后，阻抗只有轻微的变化，其RSD小于3% 。由此可见，该免疫传感器具有良好的的特异性。

实施例三 AMOZ检测

配制不同浓度的3-氨基-5-吗啉基-2-氧唑酮（AMOZ）标准溶液，将含固定好抗体的修饰电极在上述优化得到的最佳条件下与不同浓度的AMOZ标准溶液进行免疫反应。然后将修饰电极、饱和甘汞电极和铂电极三电极体系浸入含1.0 mM Fe(CN)₆ ^3-/ 4-的0.1M KNO₃的磷酸盐缓冲溶液（pH7.4）的阻抗测试溶液中，利用Autolab电化学工作站在开路电位和正弦波电位振幅为10 mV的条件下，于10^-1 Hz到10⁶Hz频率范围测定其交流阻抗图谱，再通过等效电路拟合求得Fe(CN)₆ ^3-/ 4在修饰电极表面发生氧化还原反应时电子传递的阻抗值，并按公式（1）进行数据处理：

         （1）

式中：R_ct(AMOZ-Ab)是AMOZ与固定在电极上的抗体复合后的阻抗值，R_ct(BSA)是用牛血清蛋白封闭了特异性位点后的阻抗值。

以阻抗的相对变化率对AMOZ浓度对数做图，可得在1.0 到1.0 ?? 10⁶ ng/mL范围内呈良好的线性关系, 检测限为1.0 ng/mL。据此可进行AMIOZ残留物含量测定。

Claims (3)

1.一种呋喃它酮残留物无标记的阻抗型免疫传感器，其特征在于是通过以下方法制备得到：

（1）金胶的制备：制备金纳米粒子溶液；

（2）金电极的预处理：金电极先分别用0.3，0.05μm的三氧化二铝粉末在丝绸上抛光，然后依次用二次水和无水乙醇超声清洗；再将抛光处理好的金电极置于0.5M H2SO4溶液中，在-0.5到+1.4V范围内进行循环伏安扫描25圈，扫速为0.1V s-1；然后将电极在氮氛下干燥；

（3）1，4-苯二硫醇修饰金电极：将预处理好的金电极浸入15 mM的1，4-苯二硫醇的无水乙醇溶液中，4oC下放置10 min，然后用无水乙醇冲洗表面，然后在氮氛下干燥；

（4）单层纳米金胶的自组装：将自组装了1，4-苯二硫醇的金电极浸入金胶溶液中，放在暗处置于室温下5h后，取出后用二次水冲洗表面；

（5）抗体的固定：将纳米金修饰电极浸入含0.030 mg/mL AMOZ抗体的磷酸缓冲溶液（pH7.0）中，于4°C下放置12 h；电极取出后再放入10.0 mg/mL的牛血清蛋白中，置于37.5^oC水浴中1小时，以封闭非特异性位点；最后再将电极取出后用二次水冲洗以除去表面多余的牛血清蛋白；即制得呋喃它酮残留物无标记的阻抗型免疫传感器。

2.一种制备呋喃它酮残留物无标记的阻抗型免疫传感器的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）金胶的制备：制备金纳米粒子溶液；

（2）金电极的预处理：金电极先分别用0.3，0.05μm的三氧化二铝粉末在丝绸上抛光，然后依次用二次水和无水乙醇超声清洗；再将抛光处理好的金电极置于0.5M H2SO4溶液中，在-0.5到+1.4V范围内进行循环伏安扫描25圈，扫速为0.1V s-1；然后将电极在氮氛下干燥；

（3）1，4-苯二硫醇修饰金电极：将预处理好的金电极浸入15 mM的1，4-苯二硫醇的无水乙醇溶液中，4oC下放置10 min，然后用无水乙醇冲洗表面，然后在氮氛下干燥；

（4）单层纳米金胶的自组装：将自组装了1，4-苯二硫醇的金电极浸入金胶溶液中，放在暗处置于室温下5h后，取出后用二次水冲洗表面；

（5）抗体的固定：将纳米金修饰电极浸入含0.030 mg/mL AMOZ抗体的磷酸缓冲溶液（pH7.0）中，于4°C下放置12 h；电极取出后再放入10.0 mg/mL的牛血清蛋白中，置于37.5^oC水浴中1小时，以封闭非特异性位点；最后再将电极取出后用二次水冲洗以除去表面多余的牛血清蛋白；即制得呋喃它酮残留物无标记的阻抗型免疫传感器。

3.用权利要求1所述阻抗型免疫传感器检测呋喃它酮残留物的方法，包括以下步骤：

（1）建立阻抗的相对变化率%△R_ct与AMOZ浓度的关系：测定阻抗型免疫传感器的起始阻抗值R_ct(BSA) ，以及阻抗型免疫传感器分别与不同浓度的AMOZ标准溶液进行免疫反应后阻抗值R_ct(AMOZ-Ab) ，按公式                                                计算出阻抗的相对变化率 %△R_ct；阻抗的相对变化率%△R_ct与AMOZ浓度对数在1.0 到1.0 ?? 10⁶ ng/mL范围内呈线性关系, 检测限为1.0 ng/mL；其中所说的免疫反应条件是在pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中进行，37.5°C温育3h；

（2）按照步骤（1）的方法和条件将阻抗型免疫传感器与待测物溶液进行免疫反应，测定阻抗值，计算得到抗体与AMOZ反应后引起阻抗的相对变化率%△R_ct；

（3）根据步骤（1）确定的阻抗的相对变化率%△R_ct与AMOZ浓度的关系，确定出待测物溶液中AMIOZ残留物含量。

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