CN101955957B - 一株高效分泌表达植酸酶的毕赤酵母工程菌 - Google Patents
一株高效分泌表达植酸酶的毕赤酵母工程菌 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种新的植酸酶基因，其具有ID NO：1所示的大小为1236bp的DNA序列，其符合毕赤酵母的密码偏爱性，编码具有ID NO：2所示氨基酸序列的植酸酶。并提供了一种含有该植酸酶基因的表达载体pKDN-1及利用表达载体pKDN-1转化的毕氏酵母工程菌，将其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 209130。还提供了一种构建毕氏酵母菌CCTCC M 209130的方法。本发明所提供的植酸酶基因，其符合毕赤酵母的密码偏爱性，能够在毕赤酵母中高效表达，所构建的高表达工程菌CCTCC M 209130进行高密度发酵时，酶活最高可达2000U/mL。
Description
技术领域
本发明涉及一种合成的新的植酸酶基因，是一种符合毕赤酵母密码偏爱性的大肠杆菌植酸酶密码子的DNA序列；尤其还构建了一种能高效分泌表达该合成基因的毕赤酵母工程菌。属于微生物基因工程技术领域。
背景技术
植酸(肌醇六磷酸)是谷物、豆类及油料等作物中磷的主要贮存形式，其含量高达总磷量18％-88％(Reddy NR等，1982)。尽管作物植酸磷的含量很高，但是，由于单胃动物消化道内缺乏植酸酶，不能把植酸在消化道内水解成无机磷酸盐，因此植酸的利用率低。植酸酶(EC3.1.3.8)能水解植物性饲料中植酸磷，从而提高猪禽等单胃动物对磷的利用率。植酸酶的添加可使畜禽粪便中磷的排出量减少40％～75％，可大大减轻养殖业造成的江河或水域等环境污染，对发展养殖业和环境保护都有重要意义。
虽然植酸酶已在饲料工业中得到广泛使用，明显降低饲料生产成本、改善环保，产生可观的经济效益和社会效益；但是，饲用植酸酶的生产的不足是制约饲料加工业发展的因素之一。因此，用现代生物技术改造和提升产量已成为植酸酶产业化的发展方向，它也是各生物产业公司提高产品竞争力和取胜的关键因素之一。
植酸酶的来源较为广泛，如植物种子、米糠、原核生物如大肠杆菌、真菌如黑曲霉，甚至是动物肠道。由于遗传密码的简并性，不同物种间存在着密码偏爱性，这也是影响基因异源表达的重要因素。密码偏爱性改造是提高外源基因表达量的重要手段。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种新的植酸酶基因，使其符合毕赤酵母的密码偏爱性，能够在毕赤 酵母中高效分泌表达。本发明所要解决的技术问题之二在于提供一种该植酸酶基因的表达载体，并构建一种产此植酸酶的毕赤酵母工程菌，使之高效分泌表达该植酸酶基因，并可通过高密度发酵生产植酸酶用于动物饲料。
为解决上述技术问题，本发明利用人工合成基因的方法，将大肠杆菌植酸酶appA基因的密码子改造为符合毕赤酵母的密码偏爱性，为其在毕赤酵母中超水平表达奠定基础，并构建高水平表达植酸酶的毕赤酵母工程菌。本发明所采取的技术方案之一是：一种新的植酸酶基因，其符合毕赤酵母的密码偏爱性，具有大小为1236bp的下列DNA序列：
1 ATGCAATCTG AACCAGAATT GAAGTTGGAA TCTGTTGTCA TCGTCTCTAG
51 ACATGGTGTT AGAGCACCAA CCAAGGCCAC CCAACTTATG CAAGATGTCA
101 CCCCAGACGC TTGGCCAACC TGGCCAGTCA AGCTGGGTTG GTTGACACCT
151 AGAGGTGGTG AGCTCATTGC TTACTTGGGT CACTACCAAA GACAGCGTCT
201 TGTTGCCGAC GGATTGTTGG CCAAGAAGGG TTGTCCACAA TCTGGTCAAG
251 TAGCTATTAT TGCTGACGTC GACGAAAGAA CCCGTAAGAC AGGTGAAGCC
301 TTCGCCGCCG GTCTTGCTCC TGACTGTGCC ATTACCGTTC ACACCCAAGC
351 TGACACTTCT TCTCCAGATC CATTGTTCAA CCCTTTGAAG ACTGGTGTTT
401 GCCAATTGGA CAACGCTAAC GTTACTGACG CTATCTTGTC CAGAGCTGGA
451 GGATCCATTG CTGACTTCAC CGGTCACAGA CAGACTGCCT TCAGAGAGTT
501 GGAAAGAGTT CTTAACTTCC CACAATCCAA CTTGTGCCTT AAGCGTGAGA
551 AGCAAGACGA ATCCTGTTCC TTGACTCAAG CATTACCATC TGAGTTGAAG
601 GTCTCCGCCG ACAACGTCTC TTTGACCGGT GCTGTCAGCT TGGCTTCCAT
651 GTTGACTAAA ATCTTTCTTC TGCAACAAGC TCAAGGTATG CCTGAGCCAG
701 GTTGGGGTAG AATCACCGAC TCTCACCAAT GGAACACCTT GTTGTCCTTG
751 CACAACGCTC AATTCTACTT GCTGCAGAGA ACTCCAGAGG TTGCTAGATC
801 CAGAGCCACC CCATTGTTGG ACTTGATCAA GACTGCTTTG ACTCCTCACC
851 CACCTCAAAA GCAAGCCTAC GGTGTTACCT TGCCCACTTC TGTCTTGTTC
901 ATTGCCGGTC ACGATACTAA CTTGGCAAAT CTCGGCGGTG CTTTGGAGTT
951 GAACTGGACT CTTCCTGGTC AACCTGATAA CACTCCACCA GGTGGTGAGC
1001 TCGTTTTCGA AAGATGGCGT AGACTATCTG ATAACTCTCA ATGGATTCAG
1051 GTTTCGTTGG TCTTCCAAAC TTTGCAGCAG ATGAGAGACA AGACTCCACT
1101 GTCTTTGAAC ACGCCTCCAG GAGAAGTCAA ATTGACCTTG GCTGGATGTG
1151 AAGAGAGAAA TGCTCAGGGT ATGTGTTCCT TGGCTGGTTT CACTCAAATT
1201 GTTAACGAAG CTAGAATTCC AGCTTGTTCT TTGTAG。
本发明根据已报道的大肠杆菌植酸酶基因序列，按照毕赤酵母偏爱密码子表，把编码植酸酶的密码子转换成毕赤酵母偏爱的形式。上述植酸酶基因通过以下途径合成：
首先人工合成16条寡聚核苷酸引物，即正向引物8条：F1-F8，反向引物8条：R1-R8，长度分别在95～106nt之间，引物间含20~23bp的重复序列(见引物表1)。取引物F1和R1各25pmol进行PCR反应，反应体积50μL，反应条件：95℃ 4min；94℃ 40s，52℃ 40s，72℃ 20s，共25个循环；72℃延伸7min。反应后取0.1μL反应产物做为模板，以F2和R2为引物，进行第2次PCR反应，反应条件：94℃4min；94℃1min，52℃30s，72℃30s，共25个循环；72℃延伸10min。依此类推，进行其余6个PCR反应，但每个反应的延伸时间增加10s。共连续进行8次PCR反应，合成具有上述基因序列的符合毕赤酵母密码偏爱性的植酸酶基因。
一种含有上述植酸酶基因的表达载体pKDN-1，通过以下途径获得：
设计引物Phy-F和Phy-R(见引物表1)，引物两端分别引入Eco RI和Not I酶切位点；以上述合成的植酸酶基因作模板进行PCR扩增。琼脂糖凝胶回收PCR扩增产物，接着进行Eco RI和Not I双酶切反应，然后再次凝胶回收酶切产物；将此酶切产物定向连接到已Eco RI和Not I双酶切载体pPIC9K，则获得表达载体，命名为pKDN-1。
一种含有上述表达载体pKDN-1的巴斯德毕赤酵母菌KDN-1(Pichiapastoris KDN-1)，于2009年6月20日保藏在位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 209130。其通过以下途径获得：
将载体pKDN-1酶切线性化后电击导入毕氏酵母菌GS115，筛选转化植酸酶基因高拷贝数的重组毕赤酵母菌株，然后进行高密度发酵验证，最后获得高效表达植酸酶的毕赤酵母工程菌。
表1 合成植酸酶基因以及构建表达载体所用引物表
| 引物名 | 序列组成 |
| F1 | 5’-CACAATCCAACTTGTGCCTTAAGCGTGAGAAGCAAGACGAATCCTGTTCCTT GACTCAAGCATTACCATCTGAGTTGAAGGTCTCCGCCGACAACGTCTC-3’ |
| F2 | 5’-GAGGATCCATTGCTGACTTCACCGGTCACAGACAGACTGCCTTCAGAGAG TTGGAAAGAGTTCTTAACTTCCCACAATCCAACTTGTGCCTTAAGC-3’ |
| F3 | 5’-CATTGTTCAACCCTTTGAAGACTGGTGTTTGCCAATTGGACAACGCTAAC GTTACTGACGCTATCTTGTCCAGAGCTGGAGGATCCATTGCTGACTTC-3’ |
| F4 | 5’-AAGCCTTCGCCGCCGGTCTTGCTCCTGACTGTGCCATTACCGTTCACAC CCAAGCTGACACTTCTTCTCCAGATCCATTGTTCAACCCTTTGAAGAC-3’ |
| F5 | 5’-TTGTCCACAATCTGGTCAAGTAGCTATTATTGCTGACGTCGACG AAAGAACCCGTAAGACAGGTGAAGCCTTCGCCGCCGGTCTTG-3’ |
| F6 | 5’-GTGGTGAGCTCATTGCTTACTTGGGTCACTACCAAAGACAGCGTCTTG TTGCCGACGGATTGTTGGCCAAGAAGGGTTGTCCACAATCTGGTCAAG-3’ |
| F7 | 5’-CACCCAACTTATGCAAGATGTCACCCCAGACGCTTGGCCAACCTGGCCAG TCAAGCTGGGTTGGTTGACACCTAGAGGTGGTGAGCTCATTGCTTAC-3’ |
| F8 | 5’-ATGCAATCTGAACCAGAATTGAAGTTGGAATCTGTTGTCATCGTCTCTAG ACATGGTGTTAGAGCACCAACCAAGGCCACCCAACTTATGCAAGATG-3’ |
| R1 | 5’-CTCAGGCATACCTTGAGCTTGTTGCAGAAGAAAGATTTTAGTCAACAT GGAAGCCAAGCTGACAGCACCGGTCAAAGAGACGTTGTCGGCGGAGAC-3’ |
| R2 | 5’-CAGCAAGTAGAATTGAGCGTTGTGCAAGGACAACAAGGTGTTCCATTGGT GAGAGTCGGTGATTCTACCCCAACCTGGCTCAGGCATACCTTGAGCTT-3’ |
| R3 | 5’-GGTGAGGAGTCAAAGCAGTCTTGATCAAGTCCAACAATGGGGTGGCTC TGGATCTAGCAACCTCTGGAGTTCTCTGCAGCAAGTAGAATTGAGCGT-3’ |
| R4 | 5’-CCAAGTTAGTATCGTGACCGGCAATGAACAAGACAGAAGTGGGCAAGGTA ACACCGTAGGCTTGCTTTTGAGGTGGGTGAGGAGTCAAAGCAGTCTT-3’ |
| R5 | 5’-GCTCACCACCTGGTGGAGTGTTATCAGGTTGACCAGGAAGAGTCCAGT TCAACTCCAAAGCACCGCCGAGATTTGCCAAGTTAGTATCGTGACCG-3’ |
| R6 | 5’-GCAAAGTTTGGAAGACCAACGAAACCTGAATCCATTGAGAGTTATCAG ATAGTCTACGCCATCTTTCGAAAACGAGCTCACCACCTGGTGGAGTG-3’ |
| R7 | 5’-CACATCCAGCCAAGGTCAATTTGACTTCTCCTGGAGGCGTGTTCAAAG ACAGTGGAGTCTTGTCTCTCATCTGCTGCAAAGTTTGGAAGACCAAC-3’ |
| R8 | 5’-CTACAAAGAACAAGCTGGAATTCTAGCTTCGTTAACAATTTGAGTGAAACCAG CCAAGGAACACATACCCTGAGCATTTCTCTCTTCACATCCAGCCAAGGTCAAT-3’ |
| Phy -F | 5’-AAGAATTCCAATCTGAACCAGAATTGAAG-3’ |
| Phy -R | 5’-AAGCGGCCGCCTACAAAGAACAAGCTGGAAG-3’ |
一种构建上述保藏编号为CCTCC M 209130的毕氏酵母菌的方法，包括下列内容：
1、首先人工合成16条寡聚核苷酸引物，即正向引物8条，反向引物8条，连续进行8次PCR反应，合成具有前述基因序列的符合毕赤酵母密码偏爱性的植酸酶基因；
2、设计引物Phy-F和Phy-R(见引物表1)，引物两端分别引入Eco RI和Not I酶切位点；以上述合成的植酸酶基因作模板进行PCR扩增。琼脂糖凝胶回收PCR扩增产物，接着进行Eco RI和Not I双酶切反应，然后再次凝胶回收酶切产物；将此酶切产物定向连接到已Eco RI和Not I双酶切载体pPIC9K，则获得表达载体pKDN-1；
3、将载体pKDN-1酶切线性化后电击导入毕氏酵母菌GS115，筛选转化植酸酶基因高拷贝数的重组毕赤酵母菌株，获得高效表达植酸酶的毕赤酵母工程菌。
上述的构建毕氏酵母菌CCTCC M 209130的方法，具体内容如下：
1、根据大肠杆菌植酸酶的CDS编码氨基酸全序列中编码其在第23个氨基酸Gln处经酶切后形成的分子量为44.8kD、具有410个氨基酸残基的成熟蛋白质的序列，从第23位Gln残基起设计符合毕赤酵母密码偏爱性的引物，合成16条寡聚核苷酸引物，即8条正向引物F1至F8，8条反向引物R1至R8；取引物F1和R1各25pmol进行PCR反应，反应体积50μL，反应条件：95℃ 4min；94℃ 40s，52℃ 40s，72℃ 20s，共25个循环；72℃延伸7min；反应后取0.1μL反应产物做为模板，以F2和R2为引物，进行第2次PCR反应，反应条件：95℃ 4min；94℃ 1min，52℃ 30s，72℃ 30s，共25个循环；72℃ 7min；依此类推，进行其余6个PCR反应，但每个反应的延伸时间增加10s；连续进行8次PCR反应，合成符合毕赤酵母密码偏爱性的植酸酶成熟蛋白编码区DNA片段；
2、设计如表1所示引物Phy-F和Phy-R，序列如下：
Phy-F：5’-AA 
CAATCTGAACCAGAATTGAAG-3’.................Eco RI；
Phy-R：5’-AA 
CTACAAAGAACAAGCTGGAAG-3’..........Not I；
以合成的植酸酶基因为模板，以Phy-F和Phy-R为引物进行PCR扩增；PCR条件为：95℃ 4min；94℃ 40s，52℃ 40s，72℃ 1min，共30个循环；72℃延伸7min；凝胶回收PCR产物并以Eco RI和Not I双酶切；同样，以Eco RI和Not I双酶切pPIC9K；然后把酶切后两个双酶切产物连接获得重组表达质粒pKDN-1；
3、高效分泌表达毕赤酵母工程菌的筛选：
(1)重组质粒pKDN-1的线性化：重组质粒pKDN-1用Bgl II酶切电 泳鉴定后，经乙醇沉淀浓缩，测定DNA浓度，以3μg/μL浓度稀释质粒片段保存备用；
(2)毕赤酵母GS115感受态细胞的制备：挑取GS115单菌落，在YPD培养基中30℃振荡培养过夜，再转移到100mL YPD培养基中，培养至OD600＝1.5，冰浴10min，4℃ 5000rpm离心3min，收集菌体。用预冷的无菌双蒸水洗涤菌体2次，然后重悬于1mL预冷的电泳缓冲液中，该缓冲液含1mM MgCl2，10mM HEPES，250mM蔗糖，pH 7.8；
(3)电击转化：在80μL感受态细胞中加入5μL线性化重组质粒pKDN-1。用1mm电击杯在EMC830电转仪转化，其电击条件为300V，16ms；最后涂布于MM平板培养，挑选重组菌株；MM培养基组分：1.34％YNB，4×10-5％生物素，0.5％甲醇；
(4)Southern Blot筛选高拷贝重组转化子：将尼龙膜转放在浸过预变性液的滤纸上孵育15min，该预变性液为50mM EDTA，2.5％β-巯基乙醇pH 9.0；然后把尼龙膜转放在浸过酶解液的滤纸上，37℃孵育4小时，该酶解液为1mg/ml Zymolyase 100T；尼龙膜转放在浸过变性液的滤纸上5min，该变性液为0.5M NaOH、1.5M NaCl混合液；将尼龙膜转放在浸过中和液的滤纸上5min，该中和液为1.5M NaCl、0.5M Tris-Cl混合液；将尼龙膜转放在浸过2×SSC(柠檬酸三钠)的滤纸上5min；然后室温干燥尼龙膜30min；将尼龙膜置于紫外灯下照射4min；进行Southern杂交，筛选获得一个杂交信号强烈的菌种，将其命名为Pichia pastoris KDN-1，其保藏编号CCTCC M 209130。
本发明所提供的植酸酶基因，其表达植酸酶目的基因的密码子符合毕赤酵母的密码偏爱性，能够在毕赤酵母中高效表达；所合成的植酸酶基因虽然其核酸序列改变了，但其编码的植酸酶的酶学性质没有改变，其最适pH值为4.5。本发明所构建的高表达工程菌CCTCC M 209130进行高密度发酵时，酶活最高可达2000U/mL。
本发明所涉及的毕赤酵母GS115和质粒pPIC9K是Invitrogen公司的产品，需要时随时可以向其购买。本发明所涉及的其他原料和试剂均为本行业常用物品。除已特别指出的外，本发明所涉及的设备、检测方法均为本行业惯用设备和方法。
附图说明
图1是植酸酶基因合成示意图；
图2是表达质粒pKDN-1结构图普；
图3大肠杆菌植酸酶蛋白SignalP-NN信号肽预测图；
图4pH对酶活的影响；
图5表达上清的SDS-PAGE检测。
具体实施方式
实施例1
大肠杆菌植酸酶蛋白的生物信息学分析：如图3所示，通过在线分析软件SignalP 3.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对大肠杆菌植酸酶的CDS编码氨基酸全序列进行信号肽预测，发现其在第23个氨基酸Gln处存在信号肽酶切位点，经酶切后形成具有410个氨基酸残基的成熟蛋白质，其分子量为44.8kD。
实施例2
植酸酶基因的人工合成
依据例1中信号预测结果，从其23位Gln残基起设计符合毕赤酵母密码偏爱性的引物，共设计16条95-106nt的寡聚核苷酸引物，通过8次连续PCR反应，获得人工合成的植酸酶成熟蛋白编码区DNA片段(简称phy基因)。具体步骤如下：
取引物F1和R1各25pmol进行PCR反应，反应体积50μL，反应条件： 95℃4min；94℃ 40s，52℃ 40s，72℃ 20s，共25个循环；72℃ 7min。反应后取0.1μL反应产物做为模板，以F2和R2为引物，进行第2次PCR反应，反应条件：95℃4min；94℃1min，52℃30s，72℃30s，共25个循环；72℃ 7min。依此类推，进行其余6个PCR反应，但每个反应的延伸时间增加10s。连续进行8次PCR反应。
(1)第一次PCR反应合成序列
利用表1所示的引物F1/R1进行PCR反应合成如下序列：
大小：176bp
CACAATCCAA CTTGTGCCTT AAGCGTGAGA AGCAAGACGA ATCCTGTTCC TTGACTCAAG
CATTACCATC TGAGTTGAAG GTCTCCGCCG ACAACGTCTC TTTGACCGGT GCTGTCAGCT
TGGCTTCCAT GTTGACTGAA ATCTTTCTTC TGCAACAAGC TCAAGGTATG CCTGAG；
(2)第二次PCR反应合成序列
以第一次PCR反应物为模板，以表1所示的F2/R2为引物进行PCR反应，合成如下序列：
大小：326bp
GAGGATCCAT TGCTGACTTC ACCGGTCACA GACAGACTGC CTTCAGAGAG TTGGAAAGAG
TTCTTAACTT CCCACAATCC AACTTGTGCC TTAAGCGTGA GAAGCAAGAC GAATCCTGTT
CCTTGACTCA AGCATTACCA TCTGAGTTGA AGGTCTCCGC CGACAACGTC TCTTTGACCG
GTGCTGTCAG CTTGGCTTCC ATGTTGACTG AAATCTTTCT TCTGCAACAA GCTCAAGGTA
TGCCTGAGCC AGGTTGGGGT AGAATCACCG ACTCTCACCA ATGGAACACC TTGTTGTCCT
TGCACAACGC TCAATTCTAC TTGCTG
(3)第三次PCR反应合成序列
以第二次PCR反应物为模板，以表1所示的F3/R3为引物进行PCR反应，合成如下序列：
大小：480bp
CATTGTTCAA CCCTTTGAAG ACTGGTGTTT GCCAATTGGA CAACGCTAAC GTTACTGACG
CTATCTTGTC CAGAGCTGGA GGATCCATTG CTGACTTCAC CGGTCACAGA CAGACTGCCT
TCAGAGAGTT GGAAAGAGTT CTTAACTTCC CACAATCCAA CTTGTGCCTT AAGCGTGAGA
AGCAAGACGA ATCCTGTTCC TTGACTCAAG CATTACCATC TGAGTTGAAG GTCTCCGCCG
ACAACGTCTC TTTGACCGGT GCTGTCAGCT TGGCTTCCAT GTTGACTGAA ATCTTTCTTC
TGCAACAAGC TCAAGGTATG CCTGAGCCAG GTTGGGGTAG AATCACCGAC TCTCACCAAT
GGAACACCTT GTTGTCCTTG CACAACGCTC AATTCTACTT GCTGCAGAGA ACTCCAGAGG
TTGCTAGATC CAGAGCCACC CCATTGTTGG ACTTGATCAA GACTGCTTTG ACTCCTCACC
(4)第四次PCR反应合成序列
以第三次PCR反应物为模板，以表1所示的F4/R4为引物进行PCR反应，合成如下序列：
大小：630bp
AAGCCTTCGC CGCCGGTCTT GCTCCTGACT GTGCCATTAC CGTTCACACC CAAGTTGACA
CTTCTTCTCC AGATCCATTG TTCAACCCTT TGAAGACTGG TGTTTGCCAA TTGGACAACG
CTAACGTTAC TGACGCTATC TTGTCCAGAG CTGGAGGATC CATTGCTGAC TTCACCGGTC
ACAGACAGAC TGCCTTCAGA GAGTTGGAAA GAGTTCTTAA CTTCCCACAA TCCAACTTGT
GCCTTAAGCG TGAGAAGCAA GACGAATCCT GTTCCTTGAC TCAAGCATTA CCATCTGAGT
TGAAGGTCTC CGCCGACAAC GTCTCTTTGA CCGGTGCTGT CAGCTTGGCT TCCATGTTGA
CTGAAATCTT TCTTCTGCAA CAAGCTCAAG GTATGCCTGA GCCAGGTTGG GGTAGAATCA
CCGACTCTCA CCAATGGAAC ACCTTGTTGT CCTTGCACAA CGCTCAATTC TACTTGCTGC
AGAGAACTCC AGAGGTTGCT AGATCCAGAG CCACCCCATT GTTGGACTTG ATCAAGACTG
CTTTGACTCC TCACCCACCT CAAAAGCAAG CCTACGGTGT TACCTTGCCC ACTTCTGTCT
TGTTCATTGC CGGTCACGAT ACTAACTTGG
(5)第五次PCR反应合成序列
以第四次PCR反应物为模板，以表1所示的F5/R5为引物进行PCR反应，合成如下序列：
大小：770bp
TTGTCCACAA TCTGGTCAAG TAGCTATTAT TGCTGACGTC GACGAAAGAA CCCGTAAGAC
AGGTGAAGCC TTCGCCGCCG GTCTTGCTCC TGACTGTGCC ATTACCGTTC ACACCCAAGT
TGACACTTCT TCTCCAGATC CATTGTTCAA CCCTTTGAAG ACTGGTGTTT GCCAATTGGA
CAACGCTAAC GTTACTGACG CTATCTTGTC CAGAGCTGGA GGATCCATTG CTGACTTCAC
CGGTCACAGA CAGACTGCCT TCAGAGAGTT GGAAAGAGTT CTTAACTTCC CACAATCCAA
CTTGTGCCTT AAGCGTGAGA AGCAAGACGA ATCCTGTTCC TTGACTCAAG CATTACCATC
TGAGTTGAAG GTCTCCGCCG ACAACGTCTC TTTGACCGGT GCTGTCAGCT TGGCTTCCAT
GTTGACTGAA ATCTTTCTTC TGCAACAAGC TCAAGGTATG CCTGAGCCAG GTTGGGGTAG
AATCACCGAC TCTCACCAAT GGAACACCTT GTTGTCCTTG CACAACGCTC AATTCTACTT
GCTGCAGAGA ACTCCAGAGG TTGCTAGATC CAGAGCCACC CCATTGTTGG ACTTGATCAA
GACTGCTTTG ACTCCTCACC CACCTCAAAA GCAAGCCTAC GGTGTTACCT TGCCCACTTC
TGTCTTGTTC ATTGCCGGTC ACGATACTAA CTTGGCAAAT CTCGGCGGTG CTTTGGAGTT
GAACTGGACT CTTCCTGGTC AACCTGATAA CACTCCACCA GGTGGTGAGC
(6)第六次PCR反应合成序列
以第五次PCR反应产物为模板，以表1所示的F6/R6为引物进行PCR反应，合成如下序列：
大小：921bp
GTGGTGAGCT CATTGCTTAC TTGGGTCACT ACCAAAGACA GCGTCTTGTT GCCGACGGAT
TGTTGGCCAA GAAGGGTTGT CCACAATCTG GTCAAGTAGC TATTATTGCT GACGTCGACG
AAAGAACCCG TAAGACAGGT GAAGCCTTCG CCGCCGGTCT TGCTCCTGAC TGTGCCATTA
CCGTTCACAC CCAAGTTGAC ACTTCTTCTC CAGATCCATT GTTCAACCCT TTGAAGACTG
GTGTTTGCCA ATTGGACAAC GCTAACGTTA CTGACGCTAT CTTGTCCAGA GCTGGAGGAT
CCATTGCTGA CTTCACCGGT CACAGACAGA CTGCCTTCAG AGAGTTGGAA AGAGTTCTTA
ACTTCCCACA ATCCAACTTG TGCCTTAAGC GTGAGAAGCA AGACGAATCC TGTTCCTTGA
CTCAAGCATT ACCATCTGAG TTGAAGGTCT CCGCCGACAA CGTCTCTTTG ACCGGTGCTG
TCAGCTTGGC TTCCATGTTG ACTGAAATCT TTCTTCTGCA ACAAGCTCAA GGTATGCCTG
AGCCAGGTTG GGGTAGAATC ACCGACTCTC ACCAATGGAA CACCTTGTTG TCCTTGCACA
ACGCTCAATT CTACTTGCTG CAGAGAACTC CAGAGGTTGC TAGATCCAGA GCCACCCCAT
TGTTGGACTT GATCAAGACT GCTTTGACTC CTCACCCACC TCAAAAGCAA GCCTACGGTG
TTACCTTGCC CACTTCTGTC TTGTTCATTG CCGGTCACGA TACTAACTTG GCAAATCTCG
GCGGTGCTTT GGAGTTGAAC TGGACTCTTC CTGGTCAACC TGATAACACT CCACCAGGTG
GTGAGCTCGT TTTCGAAAGA TGGCGTAGAC TATCTGATAA CTCTCAATGG ATTCAGGTTT
CGTTGGTCTT CCAAACTTTG C
(7)第七次PCR反应合成序列
以第六次PCR反应产物为模板，以表1所示的F7/R7为引物进行PCR反应，合成如下序列：
大小：1073bp
CACCCAACTT ATGCAAGATG TCACCCCAGA CGCTTGGCCA ACCTGGCCAG TCAAGCTGGG
TTGGTTGACA CCTAGAGGTG GTGAGCTCAT TGCTTACTTG GGTCACTACC AAAGACAGCG
TCTTGTTGCC GACGGATTGT TGGCCAAGAA GGGTTGTCCA CAATCTGGTC AAGTAGCTAT
TATTGCTGAC GTCGACGAAA GAACCCGTAA GACAGGTGAA GCCTTCGCCG CCGGTCTTGC
TCCTGACTGT GCCATTACCG TTCACACCCA AGTTGACACT TCTTCTCCAG ATCCATTGTT
CAACCCTTTG AAGACTGGTG TTTGCCAATT GGACAACGCT AACGTTACTG ACGCTATCTT
GTCCAGAGCT GGAGGATCCA TTGCTGACTT CACCGGTCAC AGACAGACTG CCTTCAGAGA
GTTGGAAAGA GTTCTTAACT TCCCACAATC CAACTTGTGC CTTAAGCGTG AGAAGCAAGA
CGAATCCTGT TCCTTGACTC AAGCATTACC ATCTGAGTTG AAGGTCTCCG CCGACAACGT
CTCTTTGACC GGTGCTGTCA GCTTGGCTTC CATGTTGACT GAAATCTTTC TTCTGCAACA
AGCTCAAGGT ATGCCTGAGC CAGGTTGGGG TAGAATCACC GACTCTCACC AATGGAACAC
CTTGTTGTCC TTGCACAACG CTCAATTCTA CTTGCTGCAG AGAACTCCAG AGGTTGCTAG
ATCCAGAGCC ACCCCATTGT TGGACTTGAT CAAGACTGCT TTGACTCCTC ACCCACCTCA
AAAGCAAGCC TACGGTGTTA CCTTGCCCAC TTCTGTCTTG TTCATTGCCG GTCACGATAC
TAACTTGGCA AATCTCGGCG GTGCTTTGGA GTTGAACTGG ACTCTTCCTG GTCAACCTGA
TAACACTCCA CCAGGTGGTG AGCTCGTTTT CGAAAGATGG CGTAGACTAT CTGATAACTC
TCAATGGATT CAGGTTTCGT TGGTCTTCCA AACTTTGCAG CAGATGAGAG ACAAGACTCC
ACTGTCTTTG AACACGCCTC CAGGAGAAGT CAAATTGACC TTGGCTGGAT GTG
(8)第八次PCR反应合成序列
以第七次PCR反应产物为模板，以表1所示的F8/R8为引物进行PCR反应，合成如下序列：
大小：1236bp
ATGCAATCTG AACCAGAATT GAAGTTGGAA TCTGTTGTCA TCGTCTCTAG ACATGGTGTT
AGAGCACCAA CCAAGGCCAC CCAACTTATG CAAGATGTCA CCCCAGACGC TTGGCCAACC
TGGCCAGTCA AGCTGGGTTG GTTGACACCT AGAGGTGGTG AGCTCATTGC TTACTTGGGT
CACTACCAAA GACAGCGTCT TGTTGCCGAC GGATTGTTGG CCAAGAAGGG TTGTCCACAA
TCTGGTCAAG TAGCTATTAT TGCTGACGTC GACGAAAGAA CCCGTAAGAC AGGTGAAGCC
TTCGCCGCCG GTCTTGCTCC TGACTGTGCC ATTACCGTTC ACACCCAAGT TGACACTTCT
TCTCCAGATC CATTGTTCAA CCCTTTGAAG ACTGGTGTTT GCCAATTGGA CAACGCTAAC
GTTACTGACG CTATCTTGTC CAGAGCTGGA GGATCCATTG CTGACTTCAC CGGTCACAGA
CAGACTGCCT TCAGAGAGTT GGAAAGAGTT CTTAACTTCC CACAATCCAA CTTGTGCCTT
AAGCGTGAGA AGCAAGACGA ATCCTGTTCC TTGACTCAAG CATTACCATC TGAGTTGAAG
GTCTCCGCCG ACAACGTCTC TTTGACCGGT GCTGTCAGCT TGGCTTCCAT GTTGACTGAA
ATCTTTCTTC TGCAACAAGC TCAAGGTATG CCTGAGCCAG GTTGGGGTAG AATCACCGAC
TCTCACCAAT GGAACACCTT GTTGTCCTTG CACAACGCTC AATTCTACTT GCTGCAGAGA
ACTCCAGAGG TTGCTAGATC CAGAGCCACC CCATTGTTGG ACTTGATCAA GACTGCTTTG
ACTCCTCACC CACCTCAAAA GCAAGCCTAC GGTGTTACCT TGCCCACTTC TGTCTTGTTC
ATTGCCGGTC ACGATACTAA CTTGGCAAAT CTCGGCGGTG CTTTGGAGTT GAACTGGACT
CTTCCTGGTC AACCTGATAA CACTCCACCA GGTGGTGAGC TCGTTTTCGA AAGATGGCGT
AGACTATCTG ATAACTCTCA ATGGATTCAG GTTTCGTTGG TCTTCCAAAC TTTGCAGCAG
ATGAGAGACA AGACTCCACT GTCTTTGAAC ACGCCTCCAG GAGAAGTCAA ATTGACCTTG
GCTGGATGTG AAGAGAGAAA TGCTCAGGGT ATGTGTTCCT TGGCTGGTTT CACTCAAATT
GTTAACGAAG CTAGAATTCC AGCTTGTTCT TTGTAG
(9)序列分析
以毕赤酵母偏爱性密码合成了植酸酶基因。尽管合成序列与大肠杆菌的植酸酶序列(AF537219)只有74％的同源性；但是，合成的植酸酶N-端缺少了信号肽，其成熟蛋白序列的同源性为100％。其分别对比如下：
1、合成的植酸酶与大肠杆菌植酸酶核酸序列对比如下：
synthetic phytase------------------------------------------------------------
E.coli phytase ATGAAAGCGATCTTAATCCCATTTTTATCTCTTCTGATTCCGTTAACCCCGCAATCTGCA
Synthetic phytase---ATGCAATCTGAACCAGAATTGAAGTTGGAATCTGTTGTCATCGTCTCTAGACATGGT
E.coli phytase TTCGCTCAGAGTGAGCCGGAGCTGAAGCTGGAAAGTGTGGTGATTGTCAGTCGTCATGGT
** *** ** ** ***** ***** *** ** ** *** * * ******
Synthetic phytase GTTAGAGCACCAACCAAGGCCACCCAACTTATGCAAGATGTCACCCCAGACGCTTGGCCA
E.coli phytase GTGCGTGCTCCAACCAAGGCCACGCAACTGATGCAGGATGTCACCCCAGACGCATGGCCA
** * ** ************** ***** ***** ***************** ******
Synthetic phytase ACCTGGCCAGTCAAGCTGGGTTGGTTGACACCTAGAGGTGGTGAGCTCATTGCTTACTTG
E.coli phytase ACCTGGCCGGTAAAACTGGGTTGGCTGACACCGCGCGGTGGTGAGCTAATCGCCTATCTC
******** ** ** ********* ******* * *********** ** ** ** *
Synthetic phytase GGTCACTACCAAAGACAGCGTCTTGTTGCCGACGGATTGTTGGCCAAGAAGGGTTGTCCA
E.coli phytase GGACATTACCAACGCCAGCGTCTGGTAGCCGACGGATTGCTGGCGAAAAAGGGCTGCCCG
** ** ****** * ******** ** ************ **** ** ***** ** **
Synthetic phytase CAATCTGGTCAAGTAGCTATTATTGCTGACGTCGACGAAAGAACCCGTAAGACAGGTGAA
E.coli phytase CAGTCTGGTCAGGTCGCGATTATTGCTGATGTCGACGAGCGTACCCGTAAAACAGGCGAA
** ******** ** ** *********** ******** * ******** ***** ***
Synthetic phytase GCCTTCGCCGCCGGTCTTGCTCCTGACTGTGCCATTACCGTTCACACCCAAGTTGACACT
E.coli phytase GCCTTCGCCGCCGGGCTGGCACCTGACTGTGCAATAACCGTACATACCCAGGCAGATACG
************** ** ** *********** ** ***** ** ***** * ** **
Synthetic phytase TCTTCTCCAGATCCATTGTTCAACCCTTTGAAGACTGGTGTTTGCCAATTGGACAACGCT
E.coli phytase TCCAGTCCCGATCCGTTATTTAATCCTCTAAAAACTGGCGTTTGCCAACTGGATAACGCG
** *** ***** ** ** ** *** * ** ***** ********* **** *****
Synthetic phytase AACGTTACTGACGCTATCTTGTCCAGAGCTGGAGGATCCATTGCTGACTTCACCGGTCAC
E.coli phytase AACGTGACTGACGCGATCCTCAGCAGGGCAGGAGGGTCAATTGCTGACTTTACCGGGCAT
***** ******** *** * *** ** ***** ** *********** ***** **
Synthetic phytase AGACAGACTGCCTTCAGAGAGTTGGAAAGAGTTCTTAACTTCCCACAATCCAACTTGTGC
E.coli phytase CGGCAAACGGCGTTTCGCGAACTGGAACGGGTGCTTAATTTTCCGCAATCAAACTTGTGC
* ** ** ** ** * ** ***** * ** ***** ** ** ***** *********
Synthetic phytase CTTAAGCGTGAGAAGCAAGACGAATCCTGTTCCTTGACTCAAGCATTACCATCTGAGTTG
E.coli phytase CTTAAACGTGAGAAACAGGACGAAAGCTGTTCATTAACGCAGGCATTACCATCGGAACTC
***** ******** ** ****** ****** ** ** ** *********** ** *
Synthetic phytase AAGGTCTCCGCCGACAACGTCTCTTTGACCGGTGCTGTCAGCTTGGCTTCCATGTTGACT
E.coli phytase AAGGTGAGCGCCGACAATGTCTCATTAACCGGTGCGGTAAGCCTCGCATCAATGCTGACG
***** ********* ***** ** ******** ** *** * ** ** *** ****
Synthetic phytase GAAATCTTTCTTCTGCAACAAGCTCAAGGTATGCCTGAGCCAGGTTGGGGTAGAATCACC
E.coli phytase AAGATATTTCTCCTGCAACAAGCACAGGGAATGCCGGAGCCGGGGTGGGGAAGGATCACC
* ** ***** *********** ** ** ***** ***** ** ***** ** ******
Synthetic phytase GACTCTCACCAATGGAACACCTTGTTGTCCTTGCACAACGCTCAATTCTACTTGCTGCAG
E.coli phytase GATTCACACCAGTGGAACACCTTGCTAAGTTTGCATAACGCGCAATTTTATTTGTTACAA
** ** ***** ************ * ***** ***** ***** ** *** * **
Synthetic phytase AGAACTCCAGAGGTTGCTAGATCCAGAGCCACCCCATTGTTGGACTTGATCAAGACTGCT
E.coli phytase CGCACGCCAGAGGTTGCCCGCAGCCGCGCCACCCCGTTATTAGATTTGATCAAGACAGCG
* ** *********** * * * ******** ** ** ** *********** **
Synthetic phytase TTGACTCCTCACCCACCTCAAAAGCAAGCCTACGGTGTTACCTTGCCCACTTCTGTCTTG
E.coli phytase TTGACGCCCCATCCACCGCAAAAACAGGCGTATGGTGTGACATTACCCACTTCAGTGCTG
***** ** ** ***** ***** ** ** ** ***** ** ** ******** ** **
Synthetic phytase TTCATTGCCGGTCACGATACTAACTTGGCAAATCTCGGCGGTGCTTTGGAGTTGAACTGG
E.coli phytase TTTATCGCCGGACACGATACTAATCTGGCAAATCTCGGCGGCGCACTGGAGCTCAACTGG
** ** ***** *********** **************** ** ***** * ******
Synthetic phytase ACTCTTCCTGGTCAACCTGATAACACTCCACCAGGTGGTGAGCTCGTTTTCGAAAGATGG
E.coli phytase ACGCTTCCCGGTCAGCCGGATAACACGCCGCCAGGTGGTGAACTGGTGTTTGAACGCTGG
** ***** ***** ** ******** ** *********** ** ** ** *** * ***
Synthetic phytase CGTAGACTATCTGATAACTCTCAATGGATTCAGGTTTCGTTGGTCTTCCAAACTTTGCAG
E.coli phytase CGTCGGCTAAGCGATAACAGCCAGTGGATTCAGGTTTCGCTGGTCTTCCAGACTTTACAG
*** * *** ****** ** *************** ********** ***** ***
Synthetic phytase CAGATGAGAGACAAGACTCCACTGTCTTTGAACACGCCTCCAGGAGAAGTCAAATTGACC
E.coli phytase CAGATGCGTGATAAAACGCCGCTGTCATTAAATACGCCGCCCGGAGAGGTGAAACTGACC
****** * ** ** ** ** ***** ** ** ***** ** ***** ** *** *****
Synthetic phytase TTGGCTGGATGTGAAGAGAGAAATGCTCAGGGTATGTGTTCCTTGGCTGGTTTCACTCAA
E.coli phytase CTGGCAGGATGTGAAGAGCGAAATGCGCAGGGCATGTGTTCGTTGGCAGGTTTTACGCAA
**** ************ ******* ***** ******** ***** ***** ** ***
Synthetic phytase ATTGTTAACGAAGCTAGAATTCCAGCTTGTTCTTTGTAG
E.coli phytase ATCGTGAATGAAGCACGCATACCGGCGTGCAGTTTGTAA
** ** ** ***** * ** ** ** ** ******。
2、合成的植酸酶与大肠杆菌植酸酶蛋白序列对比如下：
E.coli phytase MKAILIPFLSLLIPLTPQSAFAQSEPELKLESVVIVSRHGVRAPTKATQLMQDVTPDAWP
Synthetic phytase ---------------------MQSEPELKLESVVIVSRHGVRAPTKATQLMQDVTPDAWP
**************************************
E.coli phytase TWPVKLGWLTPRGGELIAYLGHYQRQRLVADGLLAKKGCPQSGQVAIIADVDERTRKTGE
Synthetic phytase TWPVKLGWLTPRGGELIAYLGHYQRQRLVADGLLAKKGCPQSGQVAIIADVDERTRKTGE
************************************************************
E.coli phytase AFAAGLAPDCAITVHTQADTSSPDPLFNPLKTGVCQLDNANVTDAILSRAGGSIADFTGH
Synthetic phytase AFAAGLAPDCAITVHTQADTSSPDPLFNPLKTGVCQLDNANVTDAILSRAGGSIADFTGH
************************************************************
E.coli phytase RQTAFRELERVLNFPQSNLCLKREKQDESCSLTQALPSELKVSADNVSLTGAVSLASMLT
Synthetic phytase RQTAFRELERVLNFPQSNLCLKREKQDESCSLTQALPSELKVSADNVSLTGAVSLASMLT
************************************************************
E.coli phytase KIFLLQQAQGMPEPGWGRITDSHQWNTLLSLHNAQFYLLQRTPEVARSRATPLLDLIKTA
Synthetic phytase KIFLLQQAQGMPEPGWGRITDSHQWNTLLSLHNAQFYLLQRTPEVARSRATPLLDLIKTA
************************************************************
E.coli phytase LTPHPPQKQAYGVTLPTSVLFIAGHDTNLANLGGALELNWTLPGQPDNTPPGGELVFERW
Synthetic phytase LTPHPPQKQAYGVTLPTSVLFIAGHDTNLANLGGALELNWTLPGQPDNTPPGGELVFERW
************************************************************
E.coli phytase RRLSDNSQWIQVSLVFQTLQQMRDKTPLSLNTPPGEVKLTLAGCEERNAQGMCSLAGFTQ
Synthetic phytase RRLSDNSQWIQVSLVFQTLQQMRDKTPLSLNTPPGEVKLTLAGCEERNAQGMCSLAGFTQ
************************************************************
E.coli phytase IVNEARIPACSL
Synthetic phytase IVNEARIPACSL
************
实施例3：酶学性质分析
用钒钼酸铵法测定植酸酶活性。
利用植酸酶可以水解植酸钠释放出无机磷的原理，通过加入酸性钼一钒试剂使水解反应停止，同时与水解释放出的无机磷产生颜色反应，形成 黄色的钒钼络合物，在415nm波长测定磷的含量.以标准磷为参照物，计算被测样品中植酸酶的含量.植酸酶的含量以酶活性单位表示，1植酸酶单位定义为：在37℃、pH 5.0的条件下，1min内从植酸中分解释放1μmol无机磷所需要的酶量。
最适pH值标准缓冲体系：Gly-HCl(pH1.2-3.5)，NaAc-HAc(pH4-6)，Tris-HCl(pH6-7)，Tris-HCl(pH6-8)，CHES(pH 8.64-10.18)及CAPS(pH10.8)。最适pH值的测定：用以上缓冲液代替常规酶活力测定中的NaAc-HAc缓冲液，测定酶活力，以所得最大值为100％。
实验结果如图4所示，体外表达的植酸酶的最适pH值为4.5，pH5.0时还有至少90％的酶活。
实施例4
表达载体pKDN-1的构建
设计如表1所示引物Phy-F和Phy-R，序列如下：
Phy-F：5’-AA CAATCTGAACCAGAATTGAAG-3’ ……………..Eco RI；
Phy-R：5’-AA 
CTACAAAGAACAAGCTGGAAG-3’……….Not I；
以合成的植酸酶基因为模板，以Phy-F和Phy-R为引物进行PCR扩增。PCR条件为：95℃4min；94℃ 40s，52℃ 40s，72℃ 1min，共30个循环；72℃ 7min。凝胶回收PCR产物并以Eco RI和Not I双酶切；同样，以EcoRI和Not I双酶切pPIC9K；然后把酶切后两个双酶切产物连接获得重组表达质粒pKDN-1，其图谱如图2。
实施例5
高效分泌表达毕赤酵母工程菌的筛选
(1)重组质粒pKDN-1的线性化
重组质粒pKDN-1用Bgl II酶切电泳鉴定后，经乙醇沉淀浓缩，测定DNA浓度，以3μg/μL浓度稀释质粒片段保存备用。
(2)毕赤酵母GS115感受态细胞的制备
挑取GS115单菌落，在YPD培养基中30℃振荡培养过夜，再转移到100mL YPD培养基中，培养至OD600＝1.5，冰浴10min，4℃ 5000rpm离心3min，收集菌体。用预冷的无菌双蒸水洗涤菌体2次，然后重悬于1mL预冷的电泳缓冲液中，该缓冲液含1mM MgCl2，10mM HEPES，250mM蔗糖，pH 7.8。
(3)电击转化
在80μL感受态细胞中加入5μL线性化重组质粒pKDN-1。用1mm电击杯在EMC830电转仪转化，其电击条件为300V，16ms；最后涂布于MM平板培养，挑选重组菌株；MM培养基组分：1.34％YNB，4×10-5％生物素，0.5％甲醇。
(4)Southern Blot筛选高拷贝重组转化子
将尼龙膜转放在浸过预变性液的滤纸上孵育15min，该预变性液为50mM EDTA，2.5％β-巯基乙醇pH 9.0；然后把尼龙膜转放在浸过酶解液的滤纸上，37℃孵育4小时，该酶解液为1mg/ml Zymolyase 100T；尼龙膜转放在浸过变性液的滤纸上5min，该变性液为0.5M NaOH、1.5M NaCl混合液；将尼龙膜转放在浸过中和液的滤纸上5min，该中和液为1.5MNaCl、0.5M Tris-Cl混合液；将尼龙膜转放在浸过2×SSC(柠檬酸三钠)的滤纸上5min；然后室温干燥尼龙膜30min；将尼龙膜置于紫外灯下照射4min；进行Southern杂交，筛选获得一个杂交信号强烈的菌种，将其命名为Pichia pastoris KDN-1，其保藏编号CCTCC M 209130。
实施例6：植酸酶的诱导表达
工程菌P.pastoris KD-1接种于5ml BMGY(1％酵母提取物，2％蛋白陈，1.34％ YNB，4×10-5％生物素，1％甘油)，30℃培养过夜，离心收集菌体，把菌体加入50ml BMMY诱导培养基(1％酵母提取物，2％蛋白陈，1.34％YNB，4×10-5％生物素，0.5％甲醇)，30℃下继续诱 导培养108hr，每12小时补加50μL甲醇。每12小时取样，通过SDS-PAGE检测诱导上清液的表达情况。结果显示，上清中目的蛋白表达量在不断增加，72小时达到表达高峰(图8)。将该工程菌于10吨发酵罐进行高密度发酵，诱导培养72小时，其上清酶活最高可达20000U/mL。
序列表
<110>青岛康地恩生物科技有限公司
<120>一种新的植酸酶基因及其表达载体
<160>2
<210>1
<211>1236
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>符合毕赤酵母密码偏爱性的植酸酶DNA序列
<400>1
atgcaatctg aaccagaatt gaagttggaa tctgttgtca tcgtctctag 50
acatggtgtt agagcaccaa ccaaggccac ccaacttatg caagatgtca 100
ccccagacgc ttggccaacc tggccagtca agctgggttg gttgacacct 150
agaggtggtg agctcattgc ttacttgggt cactaccaaa gacagcgtct 200
tgttgccgac ggattgttgg ccaagaaggg ttgtccacaa tctggtcaag 250
tagctattat tgctgacgtc gacgaaagaa cccgtaagac aggtgaagcc 300
ttcgccgccg gtcttgctcc tgactgtgcc attaccgttc acacccaagc 350
tgacacttct tctccagatc cattgttcaa ccctttgaag actggtgttt 400
gccaattgga caacgctaac gttactgacg ctatcttgtc cagagctgga 450
ggatccattg ctgacttcac cggtcacaga cagactgcct tcagagagtt 500
ggaaagagtt cttaacttcc cacaatccaa cttgtgcctt aagcgtgaga 550
agcaagacga atcctgttcc ttgactcaag cattaccatc tgagttgaag 600
gtctccgccg acaacgtctc tttgaccggt gctgtcagct tggcttccat 650
gttgactaaa atctttcttc tgcaacaagc tcaaggtatg cctgagccag 700
gttggggtag aatcaccgac tctcaccaat ggaacacctt gttgtccttg 750
cacaacgctc aattctactt gctgcagaga actccagagg ttgctagatc 800
cagagccacc ccattgttgg acttgatcaa gactgctttg actcctcacc 850
cacctcaaaa gcaagcctac ggtgttacct tgcccacttc tgtcttgttc 900
attgccggtc acgatactaa cttggcaaat ctcggcggtg ctttggagtt 950
gaactggact cttcctggtc aacctgataa cactccacca ggtggtgagc 1000
tcgttttcga aagatggcgt agactatctg ataactctca atggattcag 1050
gtttcgttgg tcttccaaac tttgcagcag atgagagaca agactccact 1100
gtctttgaac acgcctccag gagaagtcaa attgaccttg gctggatgtg 1150
aagagagaaa tgctcagggt atgtgttcct tggctggttt cactcaaatt 1200
gttaacgaag ctagaattcc agcttgttct ttgtag 1236
<210>2
<211>411
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>毕赤酵母分泌表达的植酸酶
<400>2
Met Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser 16
Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln Leu Met Gln Asp 32
Val Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Trp Leu 48
Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Gln Arg 64
Gln Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys Lys Gly Cys Pro Gln 80
Ser Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys 96
Thr Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr 112
Val His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro 128
Leu Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala Asn Val Thr Asp Ala 144
Ile Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Arg 160
Gln Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser 176
Asn Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr 192
Gln Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Ser Leu 208
Thr Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Lys Ile Phe Leu Leu 224
Gln Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp 240
Ser His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Tyr 256
Leu Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu 272
Leu Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln 288
Ala Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His 304
Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr 320
Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe 336
Glu Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser 352
Leu Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser 368
Leu Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu 384
Glu Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile 390
Val Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu 411
Claims (1)
1.一株高效分泌表达植酸酶的毕赤酵母工程菌，其特征在于：所述毕赤酵母工程菌为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)KDN-1，保藏编号为CCTCC NO：M 209130，其含有能表达SEQ ID NO：1所述植酸酶基因的表达载体。
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| PB01 | Publication | ||
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Address after: Miao road Laoshan District 266061 Shandong city of Qingdao province Shandong No. 29 high building 12A07 Applicant after: Qingdao Weilan Biology Group Co., Ltd. Address before: 266111 Shandong city of Qingdao province high tech park of Laoshan district by the No. 29 Shandong Road, building 6 floor, room 607, high speed Applicant before: Qingdao Continent Biotech Co., Ltd. |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: QINGDAO CONTINENT BIOTECH CO., LTD. TO: QINGDAO WEILAN BIOLOGICAL GROUP CO., LTD. |
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |