一种庆大霉素抗体及其应用
技术领域
本发明涉及一种庆大霉素抗体及其应用。
背景技术
庆大霉素(gentamicin,GEN)是一种氨基糖苷类抗生素,其在治疗家畜绿脓杆菌、变形杆菌和耐青霉素金葡菌感染性疾病中发挥了重要作用,但其残留物毒副作用比较大,具有耳毒性和肾毒性。为了加强兽药残留管理工作,保证畜产品质量安全,我国农业部于2002年修订了《动物性食品中兽药最高残留限量》,其中规定牛奶中庆大霉素的最高残留限量为200μg/kg,对牛、羊、猪、鸡等动物肌肉、脂肪、肝脏、肾脏中庆大霉素残留也有规定了相应限量。
对庆大霉素残留的检测目前主要采用高效液相色谱法(HPLC)。然而,由于氨基糖苷类抗生素缺少发色基团,应用到HPLC时常要对其衍生化,样品前处理繁琐,测定方法相当复杂,需受过专门训练的人员才能操作,检测通量很小,而且仪器检测费用高,很难普及使用。微生物抑制法是一种较为常用的抗尘素筛选检测方法,其主要原理是根据抗微生物药对特异微生物的抑制作用来检测受检样品中残留的抗微生物药,主要包括杯碟法、纸片法、琼脂扩散法和氯化三苯基四氮唑法,但这些方法特异性差,耗时费力,测定结果误差很大。ELISA法是另一种目前研究较多的抗生素筛选检测方法,具有灵敏度高、检测量大、成本低等优点。
目前,用于免疫检测的抗体都是单克隆抗体或多克隆抗体。单克隆抗体或多克隆抗体的制备必须通过细胞培养获得,整个生产过程复杂,消耗时间长,费用高,且不易进行操作。单链抗体是将抗体重链可变区和轻链可变区基因通过一个短肽链连接后融合表达出来的抗体片断,具有分子量小、特异性高、结合力强、易于利用基因工程技术操作等优点。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测庆大霉素的单链抗体及其编码基因。
本发明所提供的单链抗体,由重链可变区、连接重链可变区和轻链可变区的短肽、轻链可变区依次连接组成,所述重链可变区的氨基酸序列如序列1自N末端起第11-124位氨基酸残基所示,所述轻链可变区的的氨基酸序列如序列1自N末端起第140-263位氨基酸残基所示。
上述单链抗体中,所述连接所述重链可变区和轻链可变区的短肽的氨基酸序列如序列1自N末端起第125-139位氨基酸残基所示。
所述编码基因为如下1)、2)、3)、4)或5)所示:
1)所述重链可变区的编码基因为自序列表中序列2的5′末端起第31-372位核苷酸所示的DNA分子;
2)所述轻链可变区的编码基因为自序列表中序列2的5′末端起第418-789位核苷酸所示的DNA分子;
3)所述连接重链可变区和轻链可变区的短肽的编码基因为自序列表中序列2的5′末端起第373-417位核苷酸所示的DNA分子;
4)序列表中序列2自5′末端起第31-789位核苷酸所示的DNA分子;
5)在严格条件下与1)、2)或3)或4)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子。
含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系和表达盒也属于本发明的保护范围。
上述任一所述单链抗体在检测庆大霉素中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种检测庆大霉素的免疫试剂盒。
本发明所提供的检测庆大霉素的免疫试剂盒,为下述1)、2)、3)或4)中任一所述试剂盒:
1)试剂盒中包括庆大霉素半抗原与载体蛋白的偶联物、上述任一所述单链抗体和酶标记抗抗体;其中,所述偶联物作为包被原;
2)试剂盒中包括庆大霉素半抗原的酶标记物、上述任一所述单链抗体和抗抗体;其中,所述抗抗体作为包被原;
3)试剂盒中包括庆大霉素半抗原的酶标记物、上述任一所述单链抗体;其中,所述单链抗体作为包被原;
4)试剂盒中包括庆大霉素半抗原与载体蛋白的偶联物、上述任一所述单链抗体的酶标记物;其中,所述偶联物作为包被原。
上述任一所述免疫试剂盒中,所述试剂盒中包括庆大霉素标准品溶液、洗涤液和样品浓缩液;所述庆大霉素标准品为庆大霉素;
所述庆大霉素标准品溶液为如下各浓度的溶液0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L;
每1升所述洗涤液是按照如下方法配制得到的:将10ml吐温20,5g叠氮化钠和990ml磷酸盐缓冲液混合,得到所述洗涤液;所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.005M-0.015M,具体为0.01M,pH值为7.2-7.6,具体为7.4;
所述样品浓缩液为浓度为0.03mol/L-0.05mol/L的磷酸盐缓冲液,具体为0.04mol/L的磷酸盐缓冲液;
所述庆大霉素半抗原与载体蛋白的偶联物是按照如下方法制备得到的:将每20mg庆大霉素半抗原溶于0.75mL双蒸水中,得到庆大霉素半抗原的水溶液;将每12mg载体蛋白溶于0.75mL双蒸水中,得到载体蛋白的水溶液;将庆大霉素半抗原的水溶液与载体蛋白的水溶液混合,磁力搅拌,将得到的溶液记作溶液Ⅰ;将62mg EDC溶于1.5mL双蒸水中,得到EDC的水溶液;将EDC的水溶液逐滴加入所述溶液Ⅰ中,25℃搅拌反应24h,得到所述庆大霉素半抗原和载体蛋白的偶联物;
所述庆大霉素半抗原为庆大霉素;所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、兔血清白蛋白、血蓝蛋白或卵清白蛋白;
所述抗抗体为鼠抗HIS标签单克隆抗体。
本发明的另一个目的是提供一种检测庆大霉素的胶体金试纸。
本发明所提供的检测庆大霉素的胶体金试纸,包括样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫,其依次连接;所述胶金垫包被有胶体金标记的上述任一所述单链抗体;所述反应垫上含有检测带和质控带,检测带位置包被有上述任一所述庆大霉素半抗原与载体蛋白的偶联物,质控带位置包被有鼠抗HIS标签单克隆抗体;所述庆大霉素半抗原为庆大霉素。
本发明的另一个目的是提供一种检测样品中庆大霉素的方法。
本发明所提供的检测样品中庆大霉素的方法,为如下Ⅰ)或Ⅱ)所示:
Ⅰ)检测样品中庆大霉素的方法包括如下步骤:
1)将待测样品进行前处理,得到待测样本溶液;
2)用上述任一所述免疫试剂盒对所述待测样本溶液进行检测;
所述前处理的方法为下述a)、b)、c)和d)中的任一:
a)所述待测样品为牛奶;将所述待测样品4000r/min离心10min,吸除上层脂肪,得到去除脂肪的待测样品;将每1mL所述去除脂肪的待测样品与样品稀释液混合,得到的混合溶液即为待测样本溶液;所述去除脂肪的待测样品与样品稀释液的体积比为1∶39;
b)所述待测样品为蜂蜜;将每1±0.05g所述待测样品用10mL样品稀释液溶解,20℃-25℃、4000r/min离心10min,取上清液,即得到待测样本溶液;
c)所述待测样品为鸡肝;去除所述待测样品中的脂肪,得到去除脂肪的待测样品;将每5.0±0.05g所述去除脂肪的待测样品的均质物与10mLPBST缓冲液振荡混合30min,4000r/min离心10min,取2mL上层清液;将所述2mL上层清液与3mL正己烷振荡混合5min,4000r/min离心10min,取下层清液;将所述下层清液与样品稀释液混合,得到的混合溶液即为待测样本溶液;所述下层清液与样品稀释液的体积比为1∶9;
d)所述待测样品为鸡肉;去除所述待测样品中的脂肪,得到去除脂肪的待测样品;将每2±0.05g所述去除脂肪的待测样品的均质物与8mL PBST缓冲液混合振荡混合5min,加入5mL正己烷振荡混合10min,静置1h,4000r/min离心15min,取2mL中间层溶液;将所述2mL中间层溶液与1mL正己烷振荡混合5min,4000r/min离心15min,取下层清液;将所述下层清液与样品稀释液混合,得到的混合溶液即为待测样本溶液;所述下层清液与样品稀释液的体积比为1∶9;
Ⅱ)检测样品中庆大霉素的方法包括如下步骤:
1)将待测样品进行前处理,得到待测样本溶液;
2)用上述任一所述胶体金试纸对所述待测样本溶液进行检测;
所述前处理的方法为下述a)或b):
a)所述待测样品为牛奶;将所述待测样品与样品稀释液混合,得到的混合溶液即为待测样本溶液;所述待测样品与样品稀释液的体积比为1∶(3-5)或1∶4;
b)所述待测样品为蜂蜜;将所述待测样品与样品稀释液混合,得到的混合溶液即为待测样本溶液;所述待测样品与样品稀释液的体积比为1∶(3-5)或1∶4;
所述样品稀释液为将所述样品浓缩液稀释20倍得到的。
上述试剂盒既可以为酶联免疫试剂盒,又可为发光免疫试剂盒,当为酶联免疫试剂盒时,所述试剂盒中包括底物显色液;所述底物显色液由A液和B液组成,所述A液为浓度为1.5%-2.5%的过氧化脲的水溶液,B液为浓度为0.5%-1.5%的四甲基联苯胺的水溶液;
所述A液优选为浓度为2%的过氧化脲的水溶液,B液优选为浓度为1%的四甲基联苯胺的水溶液。
本发明的单链抗体(scFv)是用基因工程方法将抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一段连接肽(Linker)连接而成的重组抗体,是保持了亲本抗体的抗原亲和活性和特异性的最小功能性抗体片段,可通过基因工程技术体外表达得到,可在细菌中很经济地大规模生产,从而使得免疫检测抗体的生产变得非常容易、简便和经济,进而大大减少检测试剂的费用,比杂交瘤细胞培养得到单抗的方法要简单得多。本发明抗体的亲和常数为4.86×109L/mol、半数抑制量(IC50)1.7ng/mL。本发明为食品中庆大霉素残留检测方法的建立提供高效价、高特异性的抗体来源。
本发明试剂盒和胶体金试纸卡具有灵敏度高、准确度高、精密度高、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点;能同时快速检测大批量样品,可实现现场高通量快速检测。因此,本发明的抗体、试剂盒、胶体金试纸及检测方法在庆大霉素的检测中将发挥重大作用。
附图说明
图1为试剂盒标准曲线。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1、抗体的制备及功能检测
一、庆大霉素单链抗体的制备
(一)抗体的筛选
取6个月雄性Balb/c小鼠,Trizol一步法提取脾细胞总RNA,纯化得到mRNA,再逆转录得到cDNA。使用全套引物,以cDNA为模板分别扩增得到重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)基因,经叠加延伸聚合酶链式反应(Overlap-PCR)将VH、VL基因随机拼接为单链抗体基因(ScFv),然后将ScFv与载体pCANTAB5E连接得pCANTAB5E/ScFv,并转化大肠杆菌TG1,即得到鼠源非免疫单链抗体库。用ELISA方法筛选得到带有特异性的多种抗庆大霉素的单链抗体的噬菌体颗粒,通过测序得到其相应的核苷酸序列。
该单链抗体由重链可变区、连接所述重链可变区和轻链可变区的短肽、轻链可变区顺次连接组成。该抗体的氨基酸序列如序列表中序列1所示,自序列1的N端起第11-124位氨基酸残基为重链可变区的氨基酸序列,自序列1的N端起第140-263位氨基酸残基为轻链可变区的氨基酸序列,自序列1的N端起第125-139位氨基酸残基为短肽序列。
该单链抗体的编码基因序列如序列表中序列2所示,自序列2的5′末端起第31-372位核苷酸编码重链可变区,自序列2的5′末端起第418-789位核苷酸编码轻链可变区,自序列2的5′末端起第373-417位核苷酸编码短肽。
(二)抗体的制备
表达载体pET20b购自德国NOVAGEN公司;大肠杆菌BL21购自德国NOVAGEN公司;蛋白纯化用HisLinkTM Protein Purification Resin购自美国Promega公司,产品目录号为V8823。
合成序列表中序列2自5′末端起第31-789位核苷酸所示基因,并在两端引入酶切位点Xba I和Not I,用限制性内切酶Xba I和Not I酶切,回收目的基因片段;用限制性内切酶Xba I和Not I酶切表达载体pET20b,回收载体大片段;连接,连接产物转化大肠杆菌,筛选培养,挑取单克隆;将单克隆接入液体培养基进一步培养,提取质粒,酶切和测序验证,结果测得的序列如序列表中序列2自5′末端起第31-789位核苷酸所示,表明重组载体中基因***方向和序列均正确,将阳性重组载体记作重组表达载体pET20b/ScFv。
采用氯化钙法将重组表达载体pET20b/ScFv转化大肠杆菌BL21,抗性筛选,经菌液PCR及质粒酶切验证,得到含有重组表达载体pET20b/ScFv的重组大肠杆菌,记作重组大肠杆菌BL21/pET20b/ScFv。
2×TY培养液的组成:由胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl和水组成,每1升2×TY培养液中胰蛋白胨的浓度为1.6%、酵母提取物的浓度为1%、NaCl的浓度为0.5%;各百分含量均为质量百分含量。
含氨苄青霉素、氯霉素和葡萄糖的2×TY培养液是按照如下方法得到的:向2×TY培养液中添加氨苄青霉素、氯霉素和葡萄糖,使氨苄青霉素在溶液中的终浓度为100μg/ml,使氯霉素在溶液中的终浓度为34μg/ml,使葡萄糖在溶液中的终浓度为1%(质量百分含量)。
发酵重组菌:将重组大肠杆菌BL21/pET20b/ScFv的单个阳性菌落接种至含氨苄青霉素、氯霉素和葡萄糖的2×TY培养液中,37℃振摇,至培养体系的A600为0.6时,收集细菌;将细菌重悬于2ml LB液体培养基中,按1∶20的体积比将菌悬液接种至50ml含相同浓度抗生素的LB液体培养基中(含相同浓度抗生素的LB液体培养基的组成:氨苄青霉素、氯霉素、酵母提取物、蛋白胨、NaCl和水组成;溶液中各成分的浓度为:酵母提取物0.5%,蛋白胨1%,NaCl 1%,氨苄青霉素100μg/ml,氯霉素34μg/ml),37℃振摇,至培养体系的A600为0.6时,加IPTG(0.7mmol/L)诱导,30℃振摇2.5h,在4℃下5000r/min离心10min,收获细菌。用洗涤液(将20mmol Tris和0.15mol NaCl用水溶解,用HCL调PH值至8.0,再用水定容至1L,得到1升洗涤液)洗涤1次,加溶菌液(将20mmol Tris、10ml Triton X-100、250μmol PMSF、62.5×104U溶菌酶用水溶解,用HCL调PH值至8.0,再用水定容至1L,得到1升溶菌液),30℃放置15min,然后在冰上超声处理(输出功率80%)10s,停10s,反复3次,至细胞不再粘稠。在4℃2000×g离心20min,分别收集上清及沉淀。将沉淀用结合缓冲液Ⅰ(将20mmol Tris、0.5mol Nacl和5mmol咪唑用水溶解,用HCL调PH值至8.0,再用水定容至1L,得到1升结合缓冲液Ⅰ)洗涤一次,而后,悬于结合缓冲液Ⅱ(将20mmol Tris、0.5mol Nacl、5mmol咪唑和6mol尿素用水溶解,用HCL调PH值至8.0,再用水定容至1L,得到1升结合缓冲液Ⅱ)中,4℃,12000×g离心20min,收集上清,经0.45mm滤膜过滤,收集滤液,得到抗体的粗制液。
纯化:利用表达载体上带有的组氨酸标签(His-tag)标记通过亲和层析纯化单链抗体蛋白。将HisLinkTM Protein Purification Resin装柱,以10倍柱体积的binding buffer(将100mmolHEPES、10mmol咪唑和500mmol NaCl用水溶解,再调节pH值至7.5,然后用水定容至1升,得到1升binding buffer)平衡纯化柱,取抗体的粗制液上样,然后用5倍柱体积的wash buffer(将100mmolHEPES、100mmol咪唑和用水溶解,再调节pH值至7.5,然后用水定容至1升,得到1升wash buffer)洗脱杂蛋白,最后用10倍柱体积的elution buffer(将100mmolHEPES、250mmol咪唑用水溶解,再调节pH值至7.5,然后用水定容至1升,得到1升elution buffer)洗脱目标蛋白,收集洗脱液,透析,得到纯化的抗体。
蛋白验证Western blot:收集上述各阶段产物,进行12%SDS-PAGE电泳;将电泳条带印迹到NC膜上,再与HRP标记的庆大霉素杂交,检测发光条带。庆大霉素购自美国Sigma-Aldrich公司,产品目录号为G1397。
同时以转入空载体pET20b的大肠杆菌BL21作为对照,并按照上述方法进行表达和纯化,和Western blot检测。
Western blot检测结果表明:1)实验组得到的蛋白具有与庆大霉素结合的功能,蛋白的分子量为30kD,与预期的蛋白分子量一致,表明目的蛋白为与庆大霉素结合的抗体。2)对照组没有检测到任何与庆大霉素结合的蛋白条带。
(三)抗体的功能检测
1、用ELISA方法,检测抗体的半抑制率(IC50):
a、将实施例2中制备得到的偶联物(GEN-BSA)用包被缓冲液溶解,得到GEN-BSA的溶液(该溶液中GEN-BSA的浓度为1μg/ml)。包被缓冲液:pH9.6、0.1mol/L的碳酸钠缓冲液。
向96孔板的孔中加入GEN-BSA的溶液,100μL每孔,37℃温育2h;倾去包被液,用PBST溶液(PBS+0.05%Tween20)洗涤3次,250μL每孔,每次30s,甩干孔中液体;
b、然后向每孔中加入200μL2%BSA封闭液,37℃温育2h,倾去孔内液体;用PBST溶液(PBS+0.05%Tween20)洗涤3次,250μL每孔,每次30s,甩干孔中液体。
c、向孔中加入单链抗体溶液和不同浓度的庆大霉素标准品溶液,各50μL每孔,37℃孵育1小时。以只加入单链抗体溶液不加入庆大霉素标准品溶液的孔作阳性对照。
单链抗体溶液的制备:用样品稀释液稀释实验(二)中的纯化抗体得到溶液,抗体在溶液中的浓度为5ng/mL;样品稀释液为0.002mol/L的磷酸盐缓冲液。
不同浓度的庆大霉素溶液的制备:用样品稀释液稀释庆大霉素得到溶液。
d、用PBST溶液(PBS,0.05%Tween20)洗涤3次,250μL每孔,甩干孔中液体,加入HRP标记的鼠抗His标签单克隆抗体,37℃孵育1小时;
e、用PBST溶液(PBS,0.05%Tween20)洗涤3次,250μL每孔;加入TMB显色,37℃反应10分钟,加入2M硫酸终止显色反应,每孔50μL,使用酶标仪进行读数。
实验设3次重复。
结果如下:
1)吸光度值与每孔所加入的标准品溶液中庆大霉素的浓度成反比;证明,所表达纯化得到的单链抗体具有针对庆大霉素的结合特异性,并呈现线性关系,说明该抗体可用于对庆大霉素的免疫检测。
2)半抑制率(IC50):阳性对照孔(即不添加庆大霉素标准品溶液的孔)的吸光度值为B0,各实验孔的吸光度值为B,当B/B0为50%时所对应的庆大霉素标准品溶液的浓度即为半抑制率(IC50)。该单抗的半抑制率(IC50)为1.7ng/mL。
2、抗体的亲和常数测定
方法:取定量的一定稀释度的抗体,分别加入逐渐增加的抗原里,可使抗体的结合达到饱和,以结合部分(B)为纵坐标,抗原浓度(mol/L)为横坐标绘制饱和曲线,求出抗体饱和程度为50%时的游离抗原浓度,其倒数即为该抗体在此稀释度下的亲和常数。
结果:抗体的亲和常数为4.86×109L/mol。
实施例2、检测庆大霉素的酶联免疫试剂盒及其制备
一、酶联免疫试剂盒由下述物质组成:
1、包被庆大霉素与载体蛋白偶联物(GEN-BSA)的酶标板;
2、庆大霉素抗体:实施例1中所述单链抗体。抗体工作液的浓度为5.0ng/mL,抗体工作液是用样品稀释液稀释实施例1中的纯化抗体得到的到的;
3、庆大霉素标准品:庆大霉素标准品为庆大霉素,标准品溶液浓度分别为0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L;庆大霉素购自美国Sigma-Aldrich公司;产品目录号为G1397;用样品稀释液稀释成上述各浓度;
4、酶标二抗:辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗HIS标签单克隆抗体;购自美国Sigma-Aldrich公司,产品目录号为A7058;
5、底物显色液:由A液和B液组成,A液为2%过氧化脲的水溶液,B液为1%四甲基联苯胺的水溶液;
6、终止液:0.2M硫酸水溶液;
7、洗涤液:每1升所述洗涤液是按照如下方法配制得到的:将10ml吐温20、5g叠氮化钠和990ml磷酸盐缓冲液混合,得到所述洗涤液;所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M,pH值为7.4;
8、样品浓缩液:0.04mol/L的磷酸盐缓冲液;将其进行20倍稀释,成为样品稀释液后使用。
二、试剂盒组分的制备
(一)包被原的制备
将20mg庆大霉素(GEN)溶于0.75mL双蒸水中,得到庆大霉素的水溶液;将12mgBSA溶于0.75mL双蒸水中,得到BSA的水溶液;将庆大霉素的水溶液加入BSA的水溶液中,并放在磁力搅拌器上搅拌,将得到的溶液记作溶液Ⅰ;将62mg水溶性碳化二亚胺(EDC)溶于1.5mL双蒸水中,得到EDC的水溶液;将EDC的水溶液逐滴加入上述溶液Ⅰ中,室温(25℃)搅拌反应24h,将得到的溶液记作溶液Ⅱ,其中含有庆大霉素和BSA的偶联物(GEN-BSA);将溶液Ⅱ装入透析袋透析3d,每8h换液1次,透析后分装,于-20℃贮存。
(二)包被有包被原的酶标板及其制备
包被有合成抗原GEN-BSA的聚苯乙烯酶标板:用10mM的碳酸盐溶液将抗原作1∶50000倍稀释(6.0μg/mL),包被96孔聚苯乙烯酶标板,每孔100μL,37℃温育2h,倾去包被液,用洗涤液稀释20倍后洗涤3次,每次30s,拍干,然后在每孔中加入200μL封闭液,37℃温育2h,倾去孔内液体,干燥后用铝膜真空密封保存。
包被缓冲液:pH9.6、0.05mol/L的碳酸钠缓冲液;
封闭液:每1升封闭液按照如下方法配制:将5ml马血清、1g叠氮化钠、30g酪蛋白混合,用磷酸盐缓冲液溶解并定容至1000ml,得到封闭液;其中,磷酸盐缓冲液的浓度为0.02M,pH值为7.2。
三、试剂盒检测方法
(一)样品前处理
1、检测样本为牛奶:取牛奶样品,4000r/min离心10min,吸除上层脂肪;取1mL去除脂肪的牛奶样品至15mL玻璃管中;用样品稀释液按1∶39比例进行稀释(即50μL牛奶样品加入1950μL样品稀释液)。取50μL用于分析。
2、检测样本为蜂蜜:称取1±0.05g蜂蜜样品至50mL聚苯乙烯离心管中,加入10mL样品稀释液,用振荡器振荡10min至蜂蜜全部溶解,4000r/min、室温(20-25℃)离心10min,直至清亮,取上清液50μL进行分析。
3、检测样本为鸡肉:用均质器均质鸡肉样品;称取2±0.05g均质物至50mL聚苯乙烯离心管中,加入8mL PBST缓冲液混合振荡5min,加入正己烷5mL充分上下振荡混合10min后静置1h;4000r/min离心15min;移取2mL中间层溶液至10mL玻璃离心管中,加入1mL正己烷,用振荡器充分振荡5min,4000r/min离心15min;除去上层,取下层清液用样品稀释液按1∶9体积比进行稀释(50μL下层清液加入450μL样品稀释液);取50μL用于分析。
4、检测样本为鸡肝:除去肝脏中的脂肪部分,用均质器均质肝脏样品;称取5.0±0.05g均质物至50mL聚苯乙烯离心管中,加入10mLPBST缓冲液混合振荡30min;4000r/min离心10min;移取2mL上层清液至10mL玻璃离心管中,加入3mL正己烷用振荡器充分振荡5min;4000r/min离心10min;除去上层,取下层清液用样品稀释液按1∶9体积比进行稀释(50μL下层清液加入450μL样品稀释液);取50μL水相进行分析。
(二)用试剂盒检测
1、标准曲线的制作
向包被有包被原的酶标板微孔中加入庆大霉素标准品溶液50μL,再加入庆大霉素抗体工作液50μL,用盖板膜封板,37℃恒温箱中反应30min,倒出孔中液体,每孔加入250μL洗涤液,30s后倒出孔中液体,如此重复操作共洗板5次,用吸水纸拍干。加入酶标二抗工作液100μL,37℃恒温箱中反应30min,倒出孔中液体,重复洗涤步骤,每孔加入底物显色液,轻轻振荡混匀,37℃恒温箱避光显色15min,每孔加入终止液50μL,轻轻振荡混匀,用酶标仪,测定每孔吸光度值。
用每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100%,得到百分吸光度值。以庆大霉素标准品浓度(μg/L)的半对数值为X轴,百分吸光度值为Y轴,绘制标准曲线图。得到的标准曲线如图1所示。
百分吸光度值(%)=(B/B0)×100%
2、样品中庆大霉素浓度的测定
向包被有包被原的酶标板微孔中加入检测样本溶液50μL,再加入庆大霉素单链抗体工作液50μL,用盖板膜封板,37℃恒温箱中反应30min,倒出孔中液体,每孔加入250μL洗板液,30s后倒出孔中液体,如此重复操作共洗板5次,用吸水纸拍干。加入辣根过氧化物酶标记的抗体工作液100μL,37℃恒温箱中反应30min,倒出孔中液体,重复洗涤步骤,每孔加入混合底物显色液100μL,轻轻振荡混匀,37℃恒温箱避光显色15min,每孔加入终止液50μL,轻轻振荡混匀,用酶标仪,测定每孔吸光度值。
结果判断:用每个检测样本溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100%,得到百分吸光度值。相对应每一个检测样本溶液的百分吸光度值,则可从标准曲线上读出检测样本溶液的吸光度值,再根据标准品溶液的浓度值换算出样本溶液中庆大霉素的残留量。
四、试剂盒检测效果评价
(一)准确度和精密度试验
向不含庆大霉素的样品(牛奶、蜂蜜、鸡肉和鸡肝)中添加庆大霉素标准品,使庆大霉素标准品在样品中的终浓度分别为5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg;将添加后的样品分别按照实验三中所述方法进行前处理,得到检测样本溶液。
从三个不同批次的试剂盒中各抽取3个试剂盒进行检测,检测方法如实验三中所述,每个实验重复5次,分别计算变异系数。结果分别见表1。
表1准确度和精密度试验结果
板内变异系数的计算方法:
板内变异系数=同一次测定的同一块板内某样本(一般为中等水平)重复测定次数所得结果的变异系数。
批内变异系数的计算方法:
批内变异系数=同一次测定中各平行样本的变异系数。
批间变异系数的计算方法:
批间变异系数=同一样本在不同批次测定结果的变异系数,取其平均值。
结果表明:所有样品的添加回收率在73.4%~96.8%,批内变异系数在5.6%~8.4%,批间变异系数在10.3%~13.1%。
(二)试剂盒保存期
试剂盒保存条件为2-8℃,经过12个月的测定,试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50%抑制浓度、庆大霉素添加实际测定值均在正常范围之内。考虑到运输和使用过程中,会有非正常保存条件出现,将试剂盒在37℃保存的条件下放置8天,进行加速老化实验,结果表明该试剂盒的各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生,将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻8天,测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2-8℃至少可以保存12个月以上。
(三)交叉反应率试验:
选择相应的物质进行交叉反应试验,通过各种标准曲线分别得到其50%抑制浓度。用下式计算试剂盒对其它类似物的交叉反应率:
表2试剂盒的特异性
实验表明,本发明试剂盒对庆大霉素的特异性好,即本发明试剂盒可以检测庆大霉素。
实施例3、检测庆大霉素的试纸及其制备与应用
一、试纸的结构
所述试纸由样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫组成;
所述样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫依次按顺序连接,样品吸收垫的末端与胶体金垫的始端相连,胶体金垫的末端与反应膜的始端相连,反应膜的末端与吸水垫的始端相连;
所述胶体金垫上包被有胶体金标记的庆大霉素抗体(序列表中序列1所示蛋白);
所述反应膜上有检测区和质控区,检测区(C线)和质控区(T线)均为与所述试纸的长相垂直的条带状;检测区位于近于胶体金垫末端的一侧;质控区位于远离胶体金垫末端的一侧;检测区包被有包被原,质控区包被有鼠抗HIS标签单克隆抗体;
样品吸收垫为纤维素滤膜,反应膜为硝酸纤维素膜(NC膜);吸水垫为吸水纸;胶体金垫为包被有胶体金标记的庆大霉素抗体的玻璃纤维膜;样品孔位于试纸的顶端。
二、试纸的制备
(1)胶体金标记抗体:
胶体金溶液的制备:取0.01%氯金酸水溶液100mL用恒温电磁搅拌器加热至沸腾,持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠水溶液2.5mL,继续搅拌加热20min,溶液呈透亮的红色。室温冷却,用去离子水恢复到原体积,2-8℃保存。
0.1mol/L K2CO3调节胶体金溶液pH 8.2。将10mL胶体金溶液中加入50mL烧杯中,电磁搅拌器250r/min搅拌,逐滴加入1mL含0.35mg单链抗体溶液。逐滴加入3mL 5%BSA,持续搅拌10min。金标抗体溶液常温低速(1500r/min)离心20min,弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀。红色上清溶液2-8℃,11000r/min离心40min。溶液分为三层,透明上清,管底可流动的暗红色沉淀及管底壁上黑色致密的金颗粒层。将可流动的暗红色沉淀转移到另外一个离心管中,用含1%BSA的0.01mol/L磷酸盐缓冲液混悬至原量。平衡过夜,同上重复离心2次。最后用1%BSA的0.01mol/L PB(含0.02% NaN3)将沉淀混悬为原体积的1/40,2-8℃保存。
(2)喷金:将胶体金标记的抗体喷到玻璃纤维上,制成胶体金垫;
(3)喷膜:在反应膜上的T线和C线位置分别喷上包被原和鼠抗HIS标签单克隆抗体;
(4)组装:将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水纸按常规方法进行组装,然后切条,将试纸卡装入塑料制卡中,形成试纸卡。
三、用试纸卡进行检测
(1)样品前处理及检测
1、检测样本为新鲜牛奶;新鲜牛奶直接用样品稀释液进行稀释后检测,稀释4倍,混匀;所述待测样品与样品稀释液的体积比为1∶4。
2、检测样本为蜂蜜:直接用样品稀释液进行稀释后检测,稀释倍数4倍,混匀;所述待测样品与样品稀释液的体积比为1∶4。
取出试纸卡,开封后平放于桌面,吸取待测液逐滴加入4滴于样品孔中;5-10min判断结果,15min后的判断结果无效。
(2)结果判断
阴性:C线显色,T线肉眼可见,无论颜色深浅均判为阴性。
阳性:C线显色,T线不显色,判为阳性。
无效:C线不显色,无论T线是否显色,该试纸卡均判为无效。
四、试纸卡的效果
(1)假阳性率和假阴性率
取经确证的阴性牛奶(含庆大霉素<50.0μg/L)和阴性蜂蜜样品(含庆大霉素<50.0μg/kg)各50份,取经确证的阳性牛奶(含庆大霉素≥50.0μg/L)和阳性蜂蜜(含庆大霉素≥50.0μg/kg)样品各50份。将样品按照实验三中所述方法处理后分别用试纸卡进行检测,计算假阳性率和假阳性率。
结果:在50份阴性猪肉样品测定中,试纸卡检测出阳性样品共1份,假阳性率为2%。在50份阳性猪肉样品测定中,试纸卡检测出阴性样品0份,假阴性率为0%。
(2)试纸卡保存期
稳定性试验结果表明,本试纸卡在2-8℃或室温条件***凉干燥处可保存1年。
序列表
<110>北京维德维康生物技术有限公司
<120>一种庆大霉素抗体及其应用
<160>2
<210>1
<211>263
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
Pro Tyr Asn Ala Asp Gln Leu Ala Met Ala Gln Ala Gln Leu Glu Glu
1 5 10 15
Ser Gly Pro Gly Leu Val Ile Leu Leu Thr Ser Leu Ser His Leu Cys
20 25 30
Thr Val Arg Leu Phe Ser Thr Ile Phe Ile Gly Thr Val Arg Gly Trp
35 40 45
Thr Tyr Phe Cys Ile Arg Gln Phe Pro Gly Thr Lys Leu Glu Leu Met
50 55 60
Ala Leu Arg Glu Arg Tyr His Ala Ala Ser Lys Arg Ile Ser Val Ser
65 70 75 80
Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Ser Ser Ala Ile Leu Asn Ser Asp Cys
85 90 95
Thr Val Asn Thr Ala Thr Pro Lys Cys Ser Tyr Tyr Pro Asn Trp Cys
100 105 110
Ala Arg Ala Lys Ala Pro Leu Ser Leu Ser Pro His Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Met Gln Ile Thr
130 135 140
Gln Phe Pro Val Pro Cys Cys Ile Ser Gly Thr Gly Arg Ala Thr Ile
145 150 155 160
Ser Tyr Ala Asp Ser Tyr Ser Thr Val Asp Leu Ser Gly Thr Phe Trp
165 170 175
Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Cys Gln
180 185 190
Leu Ser Leu Tyr Gln Phe Ala Ala Ser Arg Asn Tyr Gly Ser Leu Pro
195 200 205
Gly Ser Val Ala Val Asp Leu Gly Gln Asn Ser His Ser Thr Ser Ile
210 215 220
Leu Trp Arg Lys Ser Met Leu Gln Pro Ile Thr Val Tyr Asn Pro Ser
225 230 235 240
Ser Ser Lys Leu Pro Val His Ile His Lys Leu Glu Leu Thr Asn Ala
245 250 255
Val Asp Ala Ala Ala Arg Trp
260
<210>2
<211>789
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
ccatacaatg cggaccagct ggccatggcc caggcgcagc tggaggagtc tgggcctggt 60
ctggtcatcc tactaacgtc tctgtcccac ctctgcactg tcaggctctt ctcaaccatc 120
ttcataggga cagttcgagg atggacatat ttctgcattc gacaatttcc aggaaccaaa 180
ctggagttga tggccctgag ggagcggtat cacgcagcat caaaacgaat ctctgtcagt 240
cgagacacat ccaagaacca gtcttctgca attctgaatt ctgactgtac ggtgaacaca 300
gccacaccaa aatgtagcta ttatcctaat tggtgtgcaa gagccaaggc accactctca 360
ctgtctcctc atggtggcgg cggtagcggc ggtggcggtt ctggaggcgg cggttctgat 420
atgcagatca cacagtttcc tgtcccctgc tgtatatctg gcactgggag ggccaccatc 480
tcatacgcag actcttactc aactgtcgac cttagtggga cgttttggaa ccaacagaaa 540
ccaggacagc cacccagact cctcatctat tgtcaattat cgctttacca gttcgcagcg 600
tcgcgtaact acggatcact gccaggttca gtagcagtgg atctgggaca gaattcacac 660
tcaacatcaa tcctgtggag gaagtcaatg ctgcaaccta ttactgtcta caatccatcg 720
agcagcaagc tgcccgttca tatccacaag ttggaactca cgaatgctgt cgacgcggcc 780
gcaaggtgg 789