CN101949849A - 基于光纤倏逝场照明器的光激活定位显微成像*** - Google Patents

基于光纤倏逝场照明器的光激活定位显微成像*** Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于光纤倏逝场照明器的光激活定位显微成像***，激活激光器发射的激活激光依次经过中性滤光片、快门及其控制器、反射镜、二色镜、透镜入射到光纤倏逝场照明器；成像激光器发射的成像激光依次经过中性滤光片、快门及其控制器、二色镜、透镜入射到光纤倏逝场照明器；光纤倏逝场照明器固定在操控器上，光纤倏逝场照明器放置在倒置荧光显微镜的样品池内，探测器电子倍增EMCCD采集倒置荧光显微镜的物镜收集到荧光信号。本发明将照明光路和成像光路分离开，简化了光路；利用光纤倏逝场照明器进行照明，不需要高数值孔径的物镜，降低了***成本；同时通过控制光纤倏逝场照明器的位置、深度和角度，以实现对细胞样品各表面进行成像。

Description

基于光纤倏逝场照明器的光激活定位显微成像***
技术领域
本发明涉及一种基于光纤倏逝场照明器的光激活定位显微成像***，尤其是一种可以对样品进行多方位照明成像的光激活定位显微成像***。
背景技术
生物科学领域中，精确定位特定蛋白对研究蛋白的位置和功能有着重要作用。电子显微镜和非光学类扫描探针显微术可以达到纳米级的分辨率，但是其无法特异性标记研究单个蛋白分子，同时也无法用于观察研究活体。
光学显微成像可以进行无损伤性活体检测及单分子检测，并且可以提供偏振态、光谱等重要的光学信息，这些优点使光学显微成像在生物研究中有着广泛的应用。但是普通的远场光学显微成像由于受到阿贝的瑞利衍射极限的限制，宽场和共聚焦显微镜的分辨率只能达到200nm左右。由于受到有限的空间分辨率的限制，普通的远场光学显微成像无法用于微小结构的研究如蛋白质功能的研究等。近年来，随着新型荧光探针的出现及成像方式的革新，光激活定位显微技术的分辨率已经达到约20nm。
光激活定位显微技术利用光激活蛋白的光激活特性，通过控制激活光的光强以实现视野内稀疏的光激活荧光蛋白分子被激活，然后使用成像光激发激活态的荧光蛋白发出荧光，而其他未被激活的荧光蛋白则无法发出荧光，这样实现每个衍射限制区域内至多出现一个激活态的荧光蛋白。最后将采集到的单分子空间光强信息进行处理，计算出单分子精确的位置信息。这样经过多次重复，直至荧光蛋白几乎都被漂白，将所有定位信息叠加起来即可获得突破衍射极限的超分辨成像。存在的一个重要问题是，其需要探测的是单分子的光强信息，由于单分子信号很弱，并且很容易受到背景噪声的影响，所以一般光激活定位显微技术利用的是全内反射产生的倏逝场进行照明。
全内反射荧光显微术利用全内反射产生的倏逝场来照明样品，由于倏逝场只存在于百纳米级的薄层内，所以只有处于该层的荧光分子受到激发发出荧光，可以很好的抑制了背景噪声，得到很高信噪比的荧光成像。
然而，倏逝场只存在于与样品贴壁面100nm左右的范围内，所以光激活定位显微技术一般只能用于观察细胞贴壁面的浅层信息，而无法观察可能具有生物功能的细胞上表面和侧面；同时为了得到较好效果倏逝场而使用的高数值孔径的物镜增加了***的成本。
发明内容
本发明针对上述现有技术存在的不足，利用光纤倏逝场照明，设计了一种基于光纤倏逝场照明器的光激活定位显微成像***，本发明在传统的光激活定位显微成像***的基础上将照明光路和成像光路分离开，简化了光路；利用光纤倏逝场照明器进行照明，不需要高数值孔径的物镜，降低了***成本；同时通过控制光纤倏逝场照明器的位置、深度和角度，以实现对细胞样品各表面进行成像。
本发明技术方案为：
基于光纤倏逝场照明器的光激活定位显微成像***，主要由激活激光器11、成像激光器12、中性滤光片(9，10)、快门及其控制器(7，8)、反射镜6、二色镜5、透镜4、光纤倏逝场照明器1、操控器3、倒置荧光显微镜14、探测器电子倍增EMCCD13组成；激活激光器11发射的激活激光依次经过中性滤光片9、快门及其控制器7、反射镜6、二色镜5、透镜4入射到光纤倏逝场照明器1；成像激光器12发射的成像激光依次经过中性滤光片10、快门及其控制器8、二色镜5、透镜4入射到光纤倏逝场照明器1；光纤倏逝场照明器1固定在操控器3上，光纤倏逝场照明器1放置在倒置荧光显微镜14的样品池内，探测器电子倍增EMCCD13采集倒置荧光显微镜14的物镜收集到荧光信号。激活激光器11用于发射激活激光，中性滤光片9控制激活光的光强，快门及其控制器7用于控制激活激光的照射时间；成像激光器12用于发射成像激光，中性滤光片10用于控制成像激光的光强，快门及其控制器8用于控制成像激光的照射时间；反射镜6用于改变激活光方向；二色镜5能反射成像激光，而对激活激光透射，经过反射镜6和二色镜5的激活激光和经过二色镜5的成像激光的光轴重合；透镜4用于将激活激光和成像激光耦合入光纤倏逝场照明器；光纤倏逝场照明器1用于为样品提供倏逝场照明；操控器3可以对光纤倏逝场照明器进行三维位置调节，这样光纤倏逝场照明器的位置、深度及角度可自由变化；探测器EMCCD13用于接收倒置荧光显微镜14的物镜收集到荧光信号。
所述的光纤倏逝场照明器1采用专利号为200810237414.0的“光纤倏逝场照明器”。
本发明的特点为：(1)将照明光路和成像光路分离开，简化了***光路；(2)不需要大数值孔径物镜，降低了***成本；(3)通过控制光纤倏逝场照明器的位置对细胞各表面进行成像，并且调节方便。
附图说明
图1为基于光纤倏逝场照明器的光激活定位显微成像***的***结构示意图。
图2为光纤倏逝场照明器工作原理图。
图3为光激活定位成像过程中激活成像时序图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进行详细的说明：
如图1所示，本发明主要由激活激光器11、成像激光器12、中性滤光片(9，10)、快门及其控制器(7，8)、反射镜6、二色镜5、透镜4、光纤倏逝场照明器1、操控器3、倒置荧光显微镜14、探测器电子倍增EMCCD13组成；激活激光器11发射的激活激光依次经过中性滤光片9、快门及其控制器7、反射镜6、二色镜5、透镜4入射到光纤倏逝场照明器1；成像激光器12发射的成像激光依次经过中性滤光片10、快门及其控制器8、二色镜5、透镜4入射到光纤倏逝场照明器1；光纤倏逝场照明器1固定在操控器3上，光纤倏逝场照明器1放置在倒置荧光显微镜14的样品池内，探测器电子倍增EMCCD13采集倒置荧光显微镜14的物镜收集到荧光信号。激活激光器11用于发射激活激光，中性滤光片9控制激活光的光强，快门及其控制器7用于控制激活激光的照射时间；成像激光器12用于发射成像激光，中性滤光片10用于控制成像激光的光强，快门及其控制器8用于控制成像激光的照射时间；反射镜6用于改变激活光方向；二色镜5能反射成像激光，而对激活激光透射，经过反射镜6和二色镜5的激活激光和经过二色镜5的成像激光的光轴重合；透镜4用于将激活激光和成像激光耦合入光纤倏逝场照明器；光纤倏逝场照明器1用于为样品提供倏逝场照明；操控器3可以对光纤倏逝场照明器进行三维位置调节，这样光纤倏逝场照明器的位置、深度及角度可自由变化；探测器EMCCD13用于接收倒置荧光显微镜14的物镜收集到荧光信号。
所述的光纤倏逝场照明器1采用专利号为200810237414.0的“光纤倏逝场照明器”。
实施例一：利用基于光纤倏逝场照明器的光激活定位显微成像***实现生物细胞的超分辨显微成像。图1为基于光纤倏逝场照明器的光激活定位显微成像***的***结构示意图。实验细胞为mEosFP光转换荧光蛋白标记的hek293细胞BK通道。激活激光使用波长为405nm的激光，成像激光使用波长为561nm的激光。利用反射镜6和二色镜5将激活激光和成像激光的光轴调节至重合。利用透镜4将激活激光和成像激光耦合入光纤倏逝场照明器中。操控器3可以调节光纤倏逝场照明器的三维位置，以控制光纤倏逝场照明器的位置、深度和角度。
图2为光纤倏逝场照明器工作原理图。光纤的一端磨成斜面，当光从光纤芯2入射至斜面发生反射，光反射至光纤端面处，并在光纤端面发生全内反射产生倏逝场。
首先将样品放在显微镜的载物台上，移动载物台将细胞样品移入视野中，然后将光纤倏逝场照明器移入视野并贴近需要观察的细胞区域，利用倏逝场激活并激发mEosFP荧光蛋白。根据样品实际情况选取合适激活光光强，激活光照射时间，激发光光强，激发光照射时间，并通过中性滤光片(9，10)和快门及其控制器(7，8)实现上述参数的控制。成像过程激活成像时序如图3所示。根据样品实际情况选取合适的EMCCD采图参数，如曝光时间和增益等，然后开始采集一系列成像图。最后经过后期的数据处理，精确定位采集到的单分子，并进行叠加得到最终的超分辨显微成像重构图。

Claims (1)

1.基于光纤倏逝场照明器的光激活定位显微成像***，主要由激活激光器、成像激光器、中性滤光片、快门及其控制器、反射镜、二色镜、透镜、光纤倏逝场照明器、操控器、倒置荧光显微镜、探测器电子倍增EMCCD组成；激活激光器发射的激活激光依次经过中性滤光片、快门及其控制器、反射镜、二色镜、透镜入射到光纤倏逝场照明器；成像激光器发射的成像激光依次经过中性滤光片、快门及其控制器、二色镜、透镜入射到光纤倏逝场照明器；光纤倏逝场照明器固定在操控器上，光纤倏逝场照明器放置在倒置荧光显微镜的样品池内，探测器电子倍增EMCCD采集倒置荧光显微镜的物镜收集到荧光信号。
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